JP3428666B2 - 組換えマレック病ウイルスおよびその製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ニワトリ細胞またはニ
ワトリ体内において外来遺伝子産物を発現させることが
可能な新規なウイルスベクターに関するものである。更
には、本ベクターを用いたニワトリ用多価生ワクチンの
作製並びにホルモンを始めとする生理活性物質の生体内
投与のための組換えマレック病ウイルス構築に関するも
のである。

【０００２】

【従来技術】現在の養鶏分野においては種鶏、産卵鶏、
及び肉用鶏の別を問わず、ワクチン接種による疾病予防
は重要な衛生対策の柱である。しかしながら、そのワク
チン接種の実態は実に過密とも言えるほど頻回であり、
したがってこれに要する人件費の大きさは養鶏家にとっ
て大きな経済的負担となっている。この点の打開策とし
て、一つには既存の数種のワクチンを単純に混合するこ
とが考えられる。しかしながら、生ワクチンの場合には
ウイルス相互の干渉という問題があり、又、不活化ワク
チン混合の場合においても容量的な限界がある。さらに
このような問題に加えて、生ワクチンと不活化ワクチン
の混合においては、ゲル（アジュバント）への生ワクチ
ン抗原の吸着による力価低下という問題があり、従来の
技術では現実的に問題が残されている。

【０００３】最近ではこのような点を踏まえ、第二の打
開策としてウイルスベクターを使用することが試みられ
つつある。すなわち、一つのウイルスに複数のワクチン
抗原の遺伝子を組み込むことで多価の生ワクチンを作製
するという方法である。この方法により、前述したよう
なウイルス相互の干渉、あるいは不活化ワクチン混合時
における接種量の増大という問題を生じない多価ワクチ
ンを作出することが可能であると考えられる。

【０００４】これまでに、ウイルスをベクターとして使
うことを目的とした研究は、既にワクシニアウイルス、
アデノウイルス、ヘルペスシンプレックスウイルス、レ
トロウイルス等で実施されており、いずれもインビトロ
の系において、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓ抗
原）あるいは狂犬病ウイルスや帯状疱疹ウイルス等の糖
蛋白抗原の発現に成功している。しかしながら、これら
のウイルスのあるものは腫瘍原性を有するウイルスに属
することから、ヒトまたは動物へ投与することは、安全
性の面から問題が多く現実的ではない。また、ウイルス
自体の安全性に問題はなくとも、本発明が目的とする鳥
類へのウイルスベクターという観点から見た場合、鳥類
が本来の宿主ではないことから、仮に鳥類へのウイルス
ベクターとして使用されたとしてもその効果に多くは期
待できない。

【０００５】このような点から、鳥類のポックスウイル
ス（例えばニワトリの鶏痘ウイルス）をベクターとして
使うことが考えられ、既にウイルスベクターとしての検
討もなされており、そのウイルスＤＮＡに外来遺伝子挿
入の可能なことが示されている。しかしながら、例え
ば、現在の養鶏分野においては、鶏痘に対する免疫は、
鶏痘ウイルスの免疫持続期間が短いことから、通常、ニ
ワトリの飼育期間中に数回のワクチンウイルス（弱毒鶏
痘ウイルスまたは鳩痘ウイルス）の接種が必要とされて
いる。このようなことから、ポックスウイルスをウイル
スベクターとして用いた場合には、仮に複数の抗原を組
み込んだウイルスベクターが作出されワクチンとして使
用されたとしても、頻回のワクチン接種が必要になると
考えられる。また、ポックスウイルスベクターの場合、
ポックスウイルス自体の増殖がポックスウイルスに対す
る移行抗体により大きく阻害され、その結果、挿入抗原
に対して充分な免疫応答が得られないことが明らかとな
っている。

【０００６】一方、マレック病は、人畜を含めて唯一ワ
クチンによってその発症が防御されている悪性腫瘍であ
るが、その防御メカニズムとしては、ワクチンウイルス
が終生持続感染することにより、鶏等鳥類体内において
マレック病ウイルスに対する液性及び細胞性免疫を惹
起、終生持続せしめ、その結果、強毒ウイルスによる腫
瘍化を制していると考えられている。また本ウイルスワ
クチンは、ウイルス感染生細胞の形で投与され、生体内
では cell to cell 感染の形で増殖するために、他のワ
クチンウイルスと異なり移行抗体の影響をほとんど受け
ず初生雛に投与できることが大きな特徴である。

【０００７】このようなマレック病ウイルスの特性に着
目し、近年、多価ワクチンの開発にマレック病ウイルス
をベクターとする研究が進められている。記述したよう
に、他のウイルスベクターをはるかに凌駕する特質をも
つマレック病ウイルスベクターを用いた多価生ワクチン
作製のためには、まず、マレック病ウイルスDNA上にお
いて、外来遺伝子を挿入することが可能な部位を見い出
すことが必須である。

【０００８】マレック病ウイルスＤＮＡ上において外来
遺伝子を挿入出来る可能性のある部位としてＴＫ遺伝子
とｇＡ抗原遺伝子が論じられている。しかしながら、Ｔ
Ｋ遺伝子の変異化によりチミジンキナーゼ活性を消失し
たマレック病ウイルスではその増殖性が低下しているこ
とが報告されており[P.Bandyopadyay et al(1987),12th
INTER- NATIONAL HERPESVIRUS WORKSHOP]、又、ＴＫ遺
伝子に外来遺伝子が挿入された組換えウイルスの報告は
ない。一方、ｇＡ抗原遺伝子にLacZ遺伝子を挿入された
組換えウイルスは不安定で純化出来ないことが報告され
ており、いずれも実用的でない［加藤 篤ら(1991),第11
1回日本獣医学会］。

【０００９】また、ｇＡは、ｇＢと共にウイルスの産生
する主要な糖蛋白質であり、動物体内に接種された場合
にｇＢのような中和抗体の産生は今のところ認められて
いないものの、ｇＡが細胞性免疫を惹起することは十分
に推定される。したがって、マレック病ウイルスにベク
ターとワクチンとしての両方の機能を持たせることを考
えた場合に、このｇＡ遺伝子に外来遺伝子を挿入しｇＡ
を変異化させることはワクチン効果の低下につながると
予想された。

【００１０】このような状況において、先に本発明者ら
は、まだあまり解析の進んでいない遺伝子についても効
果的な組換えマレック病ウイルスの作出に関して研究を
進め、マレック病Ｉ型ウイルス遺伝子のBamHI−Ｈ断片
に外来遺伝子を挿入することで組換えマレック病ウイル
スが調製可能なことを見いだしている（特願昭63-22696
0号）。

【００１１】

【発明の目的】その後さらに効果的なウイルスベクター
の開発に鋭意研究を重ねた結果、本発明者らは、マレッ
ク病ウイルス遺伝子ゲノム中に外来遺伝子を非常に効率
よく安定に組み込むことのできる部位を見いだした。更
に、そのようにして構築した組換えマレック病ウイルス
は、in vitroのみならずin vivoにおいても本来のマレ
ック病ウイルスの特性を失うことなく優れた増殖安定性
を示すことが確認され、鳥類用多価ワクチンとして用い
られるウイルスベクターとして極めて優れていることが
確認された。すなわち、本発明は、鳥類用のワクチンと
して利用することが可能な、新規な組換えマレック病ウ
イルスならびにその製法、さらにはこの組換えマレック
病ウイルスを用いた鳥類用多価生ワクチンおよびホルモ
ンを始めとする生理活性物質を鶏体内に投与のためのベ
クターを提供するものである。

【００１２】

【発明の構成および効果】現在、マレック病に対するワ
クチンとしては、弱毒マレック病Ｉ型ウイルス（ＭＤＶ
-Ｉ型）、七面鳥ヘスペスウイルス（ＨＶＴ）、または
マレック病II型ウイルスと七面鳥ヘルペスウイルスを混
合したものが存在する。マレック病自体はＩ型ウイルス
の感染により引き起こされることがわかっており、した
がって、その発症防御には、血清学的に同じ型に属する
マレック病Ｉ型ウイルス弱毒株をワクチンとして用いる
ことが基本となると考えられる。すなわち、本発明にお
いて、マレック病ワクチンも含めた多価ワクチンとして
本発明の組換えマレック病ウイルスを使用する場合に
は、マレック病Ｉ型ウイルスを使用することが好まし
い。

【００１３】今回、本発明者らが見いだした、組換えマ
レック病ウイルスの調製における外来遺伝子挿入領域と
は一つにはマレック病ウイルスゲノムのＵｓ領域であ
り、一つには反復倒置配列である。Ｕｓ領域とは、ＭＤ
Ｖ−ＤＮＡの3'端に位置し、その両端を反復倒置配列
（inverted repeat sequence）により挟まれた約12kbの
長さからなる遺伝子領域を言う。この領域中に外来遺伝
子を組み込むことにより、目的の外来遺伝子を安定に発
現し、しかもマレック病ワクチンとして必要なマレック
病ウイルスの性状を消失または低下させることなく組換
えマレック病ウイルスを調製することが可能になる。本
発明において使用するマレック病ウイルスのＵｓ領域由
来遺伝子断片は、外来遺伝子を組み込むことが可能な外
来遺伝子導入部位、例えば適当な制限酵素認識部位を有
する少なくとも約１kbpのＵｓ領域由来遺伝子断片を言
う。このようなＵｓ領域由来遺伝子断片の好ましい例と
しては、マレック病Ｉ型ウイルス遺伝子を制限酵素EcoR
Iで処理して得られる約2.8kbpの遺伝子断片でBalI部位
を有する遺伝子断片（Ａ４フラグメント）が挙げられ
る。また、本発明で開示される反復倒置配列に自発的に
存在する繰り返し配列はウイルスの増殖性に影響を与え
る事なく除去することが可能であり、上記断片と同様、
ウイルスの増殖性に影響を与える事なく外来遺伝子を挿
入することが可能な貴重な領域である。

【００１４】これまでの報告では、組換えマレック病ウ
イルスを接種した鶏において、ウイルスゲノムに挿入し
た遺伝子の産物に対して長期にわたって抗体が持続した
という報告はなく、しかもβ−ガラクトシダーゼのよう
な細胞内に発現される蛋白質に対する抗体が本発明で示
すように初生時１回の接種で４ヶ月以上にわたって持続
されるような優れた免疫方法の開発は未だかつて報告さ
れていない。したがい、本発明による免疫方法を用いて
ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）や伝染性気管支炎
ウイルス（ＩＢＶ）の膜蛋白のような感染細胞上に発現
される蛋白を鶏体内で発現させた場合には、より強力な
免疫が誘導されることが期待される。事実、本発明で開
示するようにＮＤＶ−Ｆ蛋白遺伝子を挿入された組換え
マレック病ウイルスは、接種後約４ヶ月に亘って充分に
ニュ−カッスル病を防御する効果を獲得していた。ま
た、本来細胞膜上及び膜外に発現されるべき構造をもた
ない蛋白に対しては、そのＮ末端にシグナルペプチドを
付加することで［Nucleic Adids Research, 14, p4683-
4690 (1986)］、細胞外に分泌させることが可能である
し、さらにＣ末端に疎水性アミノ酸に富むアンカー領域
を付加することで細胞膜上に発現すべく組み込む遺伝子
を構築することが可能であり、このような形で発現され
ることにより挿入した遺伝子発現産物に対してより強力
な免疫を誘導することが可能である。

【００１５】ところで、通常、外来遺伝子の挿入等によ
りその構成遺伝子の一部を不活化されたウイルスは、か
りに in vitro での増殖性が良好であっても、in vivo
における増殖性あるいは増殖性の一つの表れである病原
性は明らかに低下するとされている［Bernard Meignier
ら、The Herpes viruses 4, p265 (1985)］。従って、
作出された組換えウイルスあるいは組換えワクチンが i
n vivo 応用可能かどうかを見極めるためには、該ウイ
ルスを実際に鶏に接種し、その増殖性と免疫原生を確認
する必要がある。このような観点から、我々は作出され
た組換えウイルスの鶏接種試験を行いその効果を確認し
た。その結果、本発明に従い調製される組換えマレック
病ウイルスは、鶏体内において１６週間以上持続感染す
ることが確認され、マレック病ウイルス本来の増殖性が
失われていないことが確認された。また、その良好な免
疫原生は、マレック病ウイルスに対する抗体の持続や挿
入した遺伝子産物であるβ−ガラクトシダーゼに対する
抗体の長期持続及び組換えウイルスの優れたマレック病
予防効果及びニューカッスル病予防効果からも確認され
た。

【００１６】このように本発明で開示される技術にした
がって作出される組換えウイルスは、鶏体内で良好に増
殖かつ持続感染し、強毒マレック病ウイルスに対する発
症防御効果のみならず外来遺伝子産物に対する抗体をも
惹起することが可能である。このような良好なin vivo
の増殖性及び免疫原性を示す組換えウイルスの作出技術
は本発明において最も特筆すべきことであり、in vivo
応用すなわち、組換え多価生ワクチンの可能性を示した
初めての技術である。

【００１７】すなわち、本発明に従い、他の疾病に対す
るワクチン抗原をコードする外来遺伝子をマレック病ウ
イルスに組み込み、これを鳥類に接種した場合、本来の
マレック病ウイルスと同様な機序により本組換えウイル
ス接種個体において、長期又は終生に亘って外来遺伝子
に由来する抗原が発現され、該抗原に対する液性又は細
胞性免疫が誘導・保持されることが期待される。本発明
に従えば、鶏等の鳥類に対して初生時の一回投与のみで
マレック病のみならず多数の病原体に対して免疫を賦与
しうる多価生ワクチンを作出することが可能である。ま
た、本組換えウイルスが接種後長期間に亘り体内に於い
てβ−ガラクトシダーゼを発現していた事から示される
ように、本技術は単なる抗原投与系としてのみならず、
生体内へホルモン等生理活性物質を投与する為の貴重な
薬剤投与システムとしても利用可能である。

【００１８】以下、本発明の組換えマレック病ウイルス
の作出法についてさらに記述する。一般に、本発明のよ
うな組換えウイルスを作出するためには以下のような手
順が必要となる。 (1)ウイルスDNAの一部をプラスミドベクターにクローニ
ングする。 (2)ウイルスDNA断片がクローニングされたプラスミド
に、発現すべく構築された外来遺伝子を含む遺伝子断片
を挿入し、インサーションプラスミドを構築する。 (3)インサーションプラスミドをウイルス感染細胞に形
質導入する。 (4)適当な方法で外来遺伝子を保持する組換えウイルス
を選択する。

【００１９】ウイルスに外来遺伝子を組み込む際に用い
るインサーションプラスミドの基本構造としては、マレ
ック病ウイルス由来のＵｓ領域または反復倒置配列遺伝
子を有し、さらに動物細胞もしくは動物ウイルス由来の
プロモーターの下流に目的の外来構造遺伝子及びさらに
その下流に転写終結因子を接続した構造を有する。尚、
プロモーターおよび外来構造遺伝子さらに必要な場合に
は転写終結因子の各遺伝子が該外来遺伝子が転写翻訳さ
れるようにデザインされ組換えられた遺伝子断片を外来
遺伝子発現カセットと言い、従って、本発明に用いるイ
ンサーションプラスミドはマレック病ウイルス由来のＵ
ｓ領域または反復倒置配列遺伝子を有し、該遺伝子領域
中に外来遺伝子発現カセットが組み込まれたことを特徴
とするプラスミドとも表現できる。このようなプラスミ
ドを用いることにより、インサーションプラスミド上の
ウイルス由来遺伝子断片は相同部分においてウイルスDN
Aに置換し、その結果ウイルス遺伝子断片に挟まれてい
た外来遺伝子断片がウイルスゲノムに組み込まれる。ま
た、ここで言う動物細胞もしくは動物ウイルス由来のプ
ロモーターとは、これまでに知られる動物細胞発現用の
種々のプロモーターも含め、特定のものに限定されるも
のではない。

【００２０】本発明では、まず、(1)として、ウイルスDN
Aを制限酵素で切断し、アガロースゲル電気泳動によ
り、各断片を分離したのちゲルより回収し、各断片をプ
ラスミドにクローニングする。

【００２１】次に、(2)としては、プラスミドにクロー
ニングされた各ウイルス断片を任意な酵素で一箇所切断
または一部欠損させたものへ動物細胞内で機能するプロ
モーターを発現されるべき構造遺伝子の上流にもつ形で
外来遺伝子を挿入する。

【００２２】(3)のウイルスDNAへの外来遺伝子を含むウ
イルス断片の相同組換えであるが、通常は感染性ウイル
スＤＮＡとインサーションプラスミドを同時に細胞に形
質導入する方法がとられるが、本発明では、培養細胞に
ウイルスを感染させた後、インサーションプラスミドを
導入するという方法が用いられる。従って、本法は非常
に簡便な組換えの方法であり、かつ、形質導入の方法と
してエレクトロポーレーション法を用いることで非常に
高い効率で組換えウイルスを得ることが可能である。

【００２３】このとき、マレック病ウイルスのゲノムに
組み込まれる外来遺伝子としては、ウイルス性疾病、細
菌性疾病、寄生虫病等各種鶏病疾病のワクチン抗原とな
り得る蛋白質をコードする種々の遺伝子が挙げられる。
例えば鶏を対象とした多価ワクチンの調製においては、
その組み込む外来遺伝子として、ニューカッスル病ウイ
ルス（ＮＤＶ）抗原をコードする遺伝子、例えばＮＤＶ
−Ｆ蛋白またはＨＮ蛋白をコードする遺伝子、鶏伝染性
喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）の糖蛋白をコードする
遺伝子、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤ
Ｖ）のウイルス構造蛋白をコードする遺伝子、例えばＶ
Ｐ２をコードする遺伝子、伝染性気管支炎ウイルス（Ｉ
ＢＶ）のスパイク蛋白をコードする遺伝子並びに伝染性
コリーザの原因菌であるヘモフィラス・パラガリナルム
（Heamophilus paragallinarum）のＨＡ蛋白をコードす
る遺伝子等が挙げられる。

【００２４】本発明では、組換え生ワクチンの具体的な
作製例として、ニューカッスル病を防御する組換えマレ
ック病ウイルスの構築法並びにその効果について言及す
るが、挿入するニューカッスル病ウイルスの遺伝子とし
ては、超弱毒株Ｄ−２６由来のｃＤＮＡが用いられる。
ニューカッスル病ウイルスの病原性は、Ｆ蛋白が強毒型
であるか否か、あるいは又ＨＮ蛋白が強毒型であるか否
かで決定される。従って、強毒型のＦまたはＨＮ遺伝子
を用いて組換えウイルスを作出した場合、ベクターウイ
ルスが本来有していなかった新たな病原性を獲得する危
険性がある。そのような可能性をなくすために、本発明
では、いずれの遺伝子も弱毒型の超弱毒株Ｄ−２６由来
のものが用いられる。すなわち、本発明に従へば、従来
のニューカッスル病ワクチンにない効果の長期持続に加
えて、安全性も兼ね備えた極めて優れた生ワクチンが作
出される。

【００２５】マレック病ウイルスベクターは、これら感
染防御抗原のみならず、鶏の成長ホルモン或いは免疫賦
活物質等を投与するためのベクターとしても有用であ
る。さらに種々の有用な抗体を卵に賦与するために、種
鶏を免疫するための抗原投与にも有用である。すなわち
ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）としてのマレッ
ク病ウイルスベクターにこれらの遺伝子を組み込むこと
が考えられる。

【００２６】(4)の組換えウイルスの選択方法に関して
は、発現させるべくウイルスに組み込まれた外来遺伝子
に応じた測定系が使用される。例えば、ニューカッスル
病ワクチンとの多価ワクチンを目的とし、ニューカッス
ル病ウイルスＦ抗原を発現する組換えマレック病ウイル
スを調製する場合には、ＮＤＶ−Ｆ抗原性の検出を行う
ことにより目的のニューカッスル病ワクチンとなり得る
組換えマレック病ウイルスを選択することが出来る。ま
た、酵素の遺伝子を組み込んだ場合にはその酵素活性を
指標として組換えマレック病ウイルスのスクリーニング
を行うことができる。その具体例として、本実施例に示
すようにβ−ガラクトシダーゼ（β-gal）をコードする
遺伝子（LacＺ遺伝子）をマレック病ウイルスに組み込
み、β−ガラクトシダーゼを発現している組換えウイル
スを選出する場合には、β−ガラクトシダーゼに対する
基質［例えばＸ-Gal（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル
β-D-ガラクトピラノシド）］を細胞シートに重層する
寒天液中に添加することで、β-ガラクトシダーゼ活性
をもつウイルスのプラークを識別することが可能であ
る。

【００２７】さらに、本発明で開示されるｃｅｌｌ ｆ
ｒｅｅウイルス産生型のＬａｃＺ（＋）マレック病ウイ
ルスを親株とし、相同組換えによりＬａｃＺ遺伝子を目
的遺伝子に置換し（以下、リバース法と言う）、Ｌａｃ
Ｚ（−）のプラークを選択しクローニングすることによ
り、目的の外来遺伝子が組み込まれた組換えマレック病
ウイルスを容易に調製することが可能となる。このリバ
ース法は、目的の外来遺伝子が組み込まれた組換えマレ
ック病ウイルスの調製において優れた調製法となる。従
来のマレック病Ｉ型ウイルスにおいては、ｃｅｌｌｆｒ
ｅｅウイルスの産生が殆どなかった為、このようなリバ
ース法を適用することは不可能であったが、本発明のｃ
ｅｌｌ ｆｒｅｅウイルス産生型のマレック病ウイルス
を用いることによりその問題が解決される。

【００２８】以下、調製例および実施例に従い、本発明
をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定さ
れるものではない。

【調製例】ウイルス株 野外より分離したＩ型のウイルス61-554株を用いた。本
株はマレック病ワクチンを接種されていない50日齢のブ
ロイラーより1986年に分離されたウイルスである。SPF
１日齢ヒナの腹腔に2X10 ³ 接種した試験では、10週間の
観察期間中発症・死亡はなく、剖検においても腫瘍病変
を始めとする異常は認められなかった。

【００２９】ウイルスＤＮＡの精製 ウイルスを鶏胚繊維芽細胞（CEF）に接種後、細胞変性
効果(CPE)を強く呈した時点でウイルス感染細胞をハー
ベストし、平井らの方法［J.gen.Virol.,45,p119(197
9)］に従って、ウイルスDNAを精製した。すなわち、ま
ずCPEを強く呈したウイルス感染細胞に2倍量の 1%-NP40
溶液（0.01M-Tris-HCl,pH7.4,0.01M-NaCl,0.0015M-MgCl
₂ ）を加えて30分間氷冷した後、ピペッティングした。
この溶液を2500回転で10分間遠心し、 その上清を40%ー
60%（w/w）のショ糖溶液（0.02M-Tris-HCl,pH7.4,0.15M
-NaCl）に重層、175kGで2時間遠心後、40%ショ糖溶液と
60%ショ糖溶液の中間に形成されたマレック病ウイルス
に由来するカプシドの層を分取した。さらに、この中間
層を再度0.02M-Tris-HCl,pH7.4,0.15M-NaCl溶液に懸濁
し、160kGで1時間遠心してペレッティングさせた。この
ペレットを、プロテイネースK（ベーリンガー・マンハ
イム山之内）を0.1%に含む1%ーSDS溶液（0.1%-Tris-HC
l,pH7.4, 0.01M-EDTA,1%-Sarcocinate;半井化学）に浮
遊させ、37℃で一晩放置した。その後、フェノール処
理、エタノール沈澱によりDNAを回収し、TE緩衝液（10m
M-Tris-HCl,pH8.0,1mM-EDTA）に溶解し、10%ー30%のグ
リセロールグラディエント溶液に重層後、175kGで4時間
遠心した。次に管底より溶液を分画し、ウイルスDNAを
含む画分をとり、10%ートリクロル酢酸を加えて、DNAを
沈澱させ回収した。

【００３０】ウイルスＤＮＡのクローニング 精製したマレック病ウイルスDNA１μgを制限酵素で切断
し、0.7%-アガロースゲル電気泳動で各断片を分離後、
エレクトロエリューション法によりゲルから溶出し、フ
ェノール処理、エタノール沈澱により回収した。このよ
うにして得た断片をpUC又はPBRにT4DNAリガーゼを用い
て挿入し、適当なコンピテントセル（例えばJM109）に
形質導入し、形質転換大腸菌を得た。次に、100μg/ml
にアンピシリンを含むＬＢ培地で培養した後、アルカリ
法によって菌体内のプラスミドを回収した。

【００３１】塩基配列の決定 遺伝子断片をpUC119のポリリンカーにクローニングした
後、JM109（宝酒造）に形質導入した。得られたトラン
スフォーマントをLB培地で一夜培養した後、その30μl
にM13ファージ（10⁹／ml以上）を60μl感染させ、さら
に一夜振盪培養した。遠心により菌体を除去後上清より
ファージを回収し、常法に従い目的遺伝子断片の塩基配
列を含む一本鎖DNA（ssDNA）を調製した。得られたssDN
AをSEQUENASEV2.0(TOYOBO) を用い、添付のプロトコー
ルに従い塩基配列の決定を行った。なお必要に応じ、プ
ラスミド上の遺伝子断片をKilo-Sequence用Deletion Ki
t（Takara、cat.No.6030）を用いて段階的に短くしたプ
ラスミドを構築し、同様にssDNAを調製した。

【００３２】組換えウイルスの作出 37℃で一晩培養した初代CEFをEDTA-トリプシン溶液でハ
ーベスト，洗浄後、5%牛血清(BS)添加イーグルーMEM（E
-MEM；日水）培地に20万個/mlの細胞濃度で浮遊し、そ
の40mlをファルコン社製組織培養フラスコ（NO.3028）
に入れ、これにマレック病ウイルス感染CEFを約80万個
接種し、37℃で4時間培養した。その後再びEDTA-トリプ
シン溶液で細胞をハーベストし、PBS-で2度細胞を洗浄
し、このうち500万個の細胞をバイオラッド製ジーンパ
ルサー(cat.No.165-2075)のキュベットに移し、インサ
ーションプラスミドを加え、添付のプロトコールに従っ
てパルスを加え、ウイルス感染細胞にインサーションプ
ラスミドの導入を行った。次に、5%BS添加E-MEM（日
水）15mlに浮遊させ、径10cmのシャーレ(ファルコン社
製No.3003）に移し、37℃で培養した。翌日、生着して
いない死亡細胞を培地とともに除去し、新たに前日培養
した初代CEFをハーベストしたもの(2nd CEF)を50万個／
mlに浮遊させた5%ーBS加E-MEMを15ml添加した。37℃で4
ないし7日間培養した後、クロロフェノールレッドβ-D-
カ゛ラクトピラノシド（生化学工業）を100μg/mlの濃
度で含む1%-アガロース/E-MEM液（フェノールレッド不
含）を重層した。

【００３３】5分から60分以内に出現したβ-gal活性を
示す赤色プラークをプラーククローニングすることによ
り次代に継代した。この操作を数回繰り返した後、ウイ
ルス感染細胞を超音波破砕機を用いて緩やかに壊し、ウ
イルスをcell freeの状態にした後、4時間培養したCEF
に接種後数日培養し、さらにプラッククローニングを2
〜3回行って組換えウイルスを純化した。

【００３４】サザンハイブリダイゼーション ベーリンガー・マンハイム山之内社製のDIG-DNA labeli
ng Kit(cat.No.150350)及び TROPIX社製Southern-light
(cat.No.SL100) を用い、添付のプロトコールに従って
プローブの作製並びにハイブリダイゼーションを行っ
た。簡単には、線状化したDNAを加熱変性し、ランダム
プライマーを用いてKlenow fragment によりジゴキシゲ
ニンラベル化dUTPを含むdNTPsを基質としてプローブDNA
を合成した。

【００３５】本プローブを、目的DNAをトランスファー
したハイボンドN+(アマシャムジャパン、cat.No.RPN.303
B)にプロトコールに従いハイブリダイゼーションさせ、
アルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニンヒツジ
IgGを用いて検出を行った。アルカリフォスファターゼ
の基質としてはAMPPDを用い、生じた特異発光をＸ線フ
イルム（FUJIXEROX,X-OMAT)を用いて検出した。

【００３６】組換えウイルスＤＮＡの回収 ウイルスを接種したシャーレ（ファルコン社、cat.No.1
50350)が全面にCPEを呈した時点で上清を吸引し、プロ
ティネースＫ溶液（プロティネースＫ1mg／ml、0.1M-Tr
is・HCl.pH9.0、0.1M-NaCl、 0.001M-EDTA、1%SDS)を2m
l注ぎ、37℃−1時間処理した後、コニカルチューブ（フ
ァルコン、cat.No.2099）に移し37℃で一夜処理した。
その後、フェノール処理した上清をエタノール沈澱し、
乾燥後100μlのTE(10mM-Tris・HCl.pH8.0、1mM-EDTA)に
溶解した。サザンハイブリダイゼーションにはこのうち
の2μlを制限酵素で切断して用いた。

【００３７】鶏体内よりのウイルス回収 ヘパリンを吸引した注射器で1mlの血液を採血した後、P
BS-を加えて4mlとし、これをコニカルチューブ（ファル
コン、cat.No.2099）に入れたFicoll-Paque（ファルマ
シア）3mlの上に静かに重層し、1500rpm×30分遠心した
(KUBOTA、KN-30F)。リンパ球・単球よりなる中間層(Buf
fy coat)を分取し、再びEDTAを0.01%に含むPBS-に懸濁
した後、1000rpm×5分遠心して回収し、これを４時間培
養した2ndCEFに接種し、４日〜７日観察した。MDVのCPE
が認められなかったものに関してはさらに3代目まで継
代を重ね判定を行った。

【００３８】蛍光抗体法（ＦＡ） ６１−５５４株１０ ^４ ＰＦＵをＣＦＦ１０ ^７ ｃｅｌｌと
共にカバーグラス（ＭＡＴＵＮＡＭＩ．Ｎｏ．１，１８
ｘ１８ｍｍ）３枚の入った径５ｃｍのシャーレに接種
し、２日間培養した後カバーグラスを取り出し、室温で
２０分間アセトン固定後、−８０℃に保存した。又、抗
β−ｇａｌ抗体検出用としてβ−アクチンプロモーター
の下流にＬａｃＺ遺伝子を接続されたプラスミドｐＡＳ
ＬａｃＺ（特願昭６３−２２６９６０号）をＢＭＴ−１
０細胞にエレクトロポーレーションにより導入し、２日
間培養した後、同様にアセトン固定して−８０℃に保存
した。

【００３９】鶏血清をPBS-で10倍希釈し、4℃で一夜反
応させた後、FITC標識抗ニワトリIgGヤギ抗体(KIRKEGAA
RD & PERRY Lab., cat.No.031506)をPBS-で20倍希釈し
たものを37℃で1時間反応させ洗浄後蛍光顕微鏡下で観
察を行った。

【００４０】ＥＬＩＳＡ β-gal（東洋紡code No.GAH-201)20mlを96well平底プレ
−ト（ヌンク社cat.No.473768）にwell当り100μlずつ
分注し、4℃で一夜反応させ、0.15M-PBS(pH7.3)で洗浄
後、1%BSA／0.15M-PBSで37℃-2時間ブロッキングを行っ
た。

【００４１】被検血清をPBS-で800倍に希釈後、その100
μlを加え37℃で1時間反応させ、以降常法に従い、5000
倍希釈した抗ニワトリIgG POD標識ウサギ抗体（ノルデ
ィック社）及びTMBZ（同仁化学、cat.No.346-04031）を
反応させ、1N-H₂SO₄で反応を停止させた後、OD450nm/63
0nmの吸光度を測定し、450nmから630nmの吸光度を差し
引いた値をELISA値とした。

【００４２】

【実施例】実施例１：61-554株DNAのクローニング 61-554株DNA 1μgをHindIIIで切断後 0.7%-アガロース
ゲル電気泳動を行い、17kbの断片（以下HindIIIB断片）
を切り出した後pBR322にクローニングした。 このHindI
II-B断片をEcoRIで切断した後、マルチクローニングサ
イト(MCS)においてBamHＩサイトからHindIIIサイトまで
を削除されたプラスミドpUC119（以降Δpuc119）にサブ
クローニングした(pKHB)。pKHBの EcoRI切断パターンを
図１に示した。

【００４３】61-554株のEcoRI断片、KA3(5.2Kb),KA4(2.
8Kb),KA5(2.1Kb、)KA6(2.4Kb)の位置を図２に示した。
各断片をもつプラスミドをそれぞれpKA3,pKA4,pKA5,pKA
6と命名した。これらのうち、A5,A6断片はウイルス間で
長さが異なることが示された（表１）。

【００４４】

【表１】

【００４５】実施例２：K-A4BLの作出 pKA4のBalＩサイトに、pCH110（ファルマシアcat.No.27
-4508-01）よりBamHＩ及びTthlllＩにより切り出し、平
滑末端化した4.2Kbの断片(SV40-LacZ)を挿入した(pKA4B
L,図３）。

【００４６】次pKA4BLをKpnＩで切断・線状化した後、
組換えウイルスの作出に従ってK-A4BLを作出した。本ウ
イルスは親株61-554と同等の良好なin vitro増殖性を示
した。

【００４７】K-A4BLにおけるLacZ遺伝子の挿入位置を確
認する為に、K-A4BL感染CEFより抽出したDNAをEcoRＩで
切断後サザンハイブリダイゼーションを行った。KA4断
片及びpCH110よりHindIII及びBamHＩで切り出したLacZ
遺伝子(3.7K)をプローブとしたサザンハイブリダイゼー
ションの結果を図４に示した。KA4断片（レーン２）、L
acZ遺伝子（レーン１）いずれのプローブを用いた場合
でも期待されたサイズのバンドのみが検出され、LacZ遺
伝子の挿入が相同組換えによっていること、及び組換え
ウイルスが純化されていることが確認された。

【００４８】K-A4BL 7000PFUを接種したSPF1日齢ヒナに
おけるウイルス回収試験及び抗MDVFA抗体検査成績を表
２に示した。接種後1週目及び6週目のウイルス回収はそ
れぞれ4/5及び5/5(+)であり、又6週目の抗MDVFA抗体は
7/7(+)であった。一方、7週目の血清について抗β-gal
抗体価を ELISAにより測定した。図５に示したように７
例全例が対照群（HVT+SB-1接種群）よりも高値を示し、
これらすべてが、抗体の検出系としてはより感度の劣る
β-galを抗原とするFAにおいても陽性であり、K-A4BL接
種鶏において抗β-gal抗体が産生されていることを確認
した。さらに、抗β−ｇａｌ抗体は16週目においても全
例陽性であり、ウイルス回収も16週目では2/7(+)と良好
な成績であった。この時、ＨＶＴまたはＣＶＩ９８８cl
oneＣを20,000PFU接種された鶏からのウイルス回収率は
いずれも2/12(+)であった［Witterら、 Avian Diseases
31, p829-840 (1987)］。すなわち、今回の成績により
本A4BLは本来のマレック病ワクチンウイルス株と同等以
上の持続感染性を有し、ベクターとして極めて好ましい
性質を保持していることが証明された。また驚くべきこ
とに、β−ｇａｌに対する抗体は接種後４週目で既に全
例陽転した後、４ヶ月以上に亘って１６０倍以上と言う
高い抗体価（ＦＡ価）で持続しており、本システムがワ
クチン投与系として極めてすぐれていることが実証され
た。

【００４９】さらに、６週目の末梢血より回収された組
換えウイルスのプラークはすべてβ-ガラクトシダーゼ
活性を保持しており、本ベクターが単なる一過性の抗原
投与系にとどまらず、酵素やホルモン等を持続的に体内
で産生するＤＤＳとしても極めて優れたシステムである
ことが証明された。

【００５０】

【表２】

【００５１】一方、組換えウイルス接種群と同一アイソ
レーター内で飼育されたウイルス非接種鶏からのウイル
ス回収及び抗価体は陰性であり、本組換えウイルスが同
居感染性を欠如することが明らかとなった。すなわち、
組換えウイルスが接種個体に留まると言う点で、非常に
実用的であることが示された。

【００５２】次に、K-A4BLのマレック病ワクチン効果を
確認する目的で、一日齢ヒナの腹腔内にK-A4BLを2000 P
FUまたは6000 PFU接種し、一週後に強毒マレック病ウイ
ルスアラバマ(alabama)株5000 PFUで腹腔内に攻撃し
た。１０週間飼育・観察し、期間中のマレック病に起因
する死亡または脚麻ひの発生及び１０週後の剖検におけ
る腫瘍病変の有無を指標として効果の判定を行った。そ
の結果、表３に示したように非免疫対照群では１０羽全
例が死亡または発症したのに対し、K-A4BL接種群では20
00 PFU接種群において一例の発症が認められたのみであ
り、本組換えウイルスがマレック病ワクチンとして十分
な免疫原性を持つことが確認された。

【００５３】

【表３】

【００５４】実施例３：組換えウイルス作出用インサー
ションベクターpKA4Bの構築 pUC119をMflＩで消化後、１％-アガロースゲルで泳動
し、マルチクローニングサイトのうち、HindIIIサイト
からXbaＩサイト（以下、クローニングサイトと言う）
を含む1.0kbの断片をゲルから切り出し、pSV2-dhfr（AT
CC No. 371464）のBglIIサイトへ挿入した（pSV2-dl
n）。本プラスミドより、polyＡ付加シグナルの上流に
クローニングサイトを持つ形でHindIII及びBamHIにより
1.0kbの断片を切り出し、これをpCH110のSV40初期遺伝
子プロモーターの下流にLacＺ遺伝子と置換する形で挿
入した（pSVEA）。pSVEAをPvuII及びBamHIで切断後、SV
40初期遺伝子プロモータークローニングサイト及びpoly
Ａ付加シグナルを有する1.3kbの断片を平滑末端化した
後、pKA4のBalＩサイトに挿入しpKA4B（図６）を構築し
た。

【００５５】本pKA4Bのクローニングサイトに発現すべ
き遺伝子をクローニング後、組換ウイルスの作出及び実
施例２に従って相同組換えを行うことにより、該遺伝子
を持つ組換えマレック病ウイルスを容易に作出すること
が出来る。また、該組換えウイルスを培養細胞または鶏
に感染させることにより、該遺伝子にコードされる蛋白
質をSV40初期遺伝子プロモーター及びpolyＡ付加シグナ
ルを用いて効率よく発現させることが可能である。

【００５６】実施例４：Ｋ−Ａ４ＢＦの作出 ｐＳＶＬ（ファルマシア、Ｃｏｄｅ Ｎｏ．２７−４５
０９−０１）のＳｍａＩサイトに超弱毒ＮＤＶ，Ｄ−２
６株由来のｆｕｓｉｏｎ 蛋白遺伝子（Ｆ遺伝子：Ｈ．
Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ ７，２４１−２５５（１９８７））を挿入した（ｐ
ＳＶＬＦ）。 本プラスミドをＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ
で消化後、エレクトロエリューション法により４．３ｋ
ｂの断片を回収し、平滑末端化した後ｐＫＡ４のＢａｌ
Ｉサイトに挿入してインサーションプラスミドｐＫＡ４
ＢＦを構築した（図７）。

【００５７】同プラスミドをＰｖｕＩで線状化した後、
組換えウイルスの作出の手順に従って組換えを実施し
た。但し、組換えウイルスのクローニングはＦ蛋白を認
識するモノクローナル抗体＃８３及び＃３１３［Ｙ．Ｕ
ｍｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｇｅｎ．ｖｉｒｏｌ．，
７１，ｐ１１８９（１９９０）］を用いた免疫染色によ
り行った。

【００５８】組換えウイルスの免疫染色によるクローニ
ング法を以下に示す。組換えから数日のち、プラークの
出現したシャーレをＥ−ＭＥＭ培地で洗浄後、モノクロ
ーナル抗体＃８３及び＃３１３を含む等張液を加え室温
で１０分〜６０分反応させた。洗浄後、等張液で１００
倍〜２００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウス
抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ｃｏｄｅ Ｎｏ．１７２−１０
１１）を加えてさらに室温で１０分〜６０分反応させ
た。洗浄後、１０ｍｌあたり３，３−Ｄｉａｍｉｎｏｂ
ｅｎｚｉｄｉｎｅ Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉ
ｄｅ（ＤＡＢ、和光、ｃｏｄｅ Ｎｏ．３４３−００９
０１）５ｍｇと過酸化水素水（三菱瓦斯化学、Ｈ _２ Ｏ _２
３１％含有）１．６μｌを含む０．１Ｍ−トリス緩衝液
（ｐＨ７．５）を加えて室温で５分〜６０分反応させ、
組換えウイルスのプラークを染色した。褐色に染色され
たプラークの周囲をリング状の物で囲い、同リング内の
みを０．１％にＥＤＴＡを含むトリプシン液で消化する
ことにより組換えウイルス感染細胞を回収し、新たなＣ
ＥＦと同時培養することにより組換えウイルスの純化を
実施した。本操作及び超音波処理によるｃｅｌｌ ｆｒ
ｅｅ化を数回繰り返して組換えウイルスを純化した。純
化された組換えウイルスは、親株同等の良好なｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ増殖性を示した。

【００５９】K-A4BFのニューカッスル病（ＮＤ）に対す
る防御効果を見るために、免疫試験を実施した。一日齢
雛の腹腔内にK-A4BFを１０³接種後、３、９及び１６週
目に強毒NDV佐藤株１０ ⁴ 致死量で下腿部筋肉内に攻撃し
た。その結果、２週間の観察期間中、非免疫対照群が全
て発症または死亡したのに対しK-A4BF接種群は一羽の発
症・死亡もなく、本組換えウイルスがニューカッスル病
に対して充分なワクチン効果を持つことが示された（表
４）。

【００６０】

【表４】

【００６１】実施例５：K-A4BHNの作出 pSVLのSmaIサイトにD-26株由来のＨＮ蛋白遺伝子を挿入
した。本プラスミドをEcoRI及びSalIで部分的に消化
後、エレクトロエリューション法により4.5kbの断片を
回収し、平滑末端化した後pKA4のBalIサイトに挿入して
インサーションプラスミドpKA4BFを構築した（図８）。

【００６２】同プラスミドをPvuIで線状化した後、組換
えウイルスの作出の手順に従って組換えを実施した。但
し、組換えウイルスのクローニングはＨＮ蛋白を認識す
るモノクローナル抗体＃１９３、＃１４２及び＃２６５
［Y.Umino et al.,J.gen.virol.,71,p1189(1990)］を用
い、K-A4BF作出の方法に準じて行った。純化された組換
えウイルスは、親株同等の良好なin vitro増殖性を示し
た。

【００６３】実施例６：K-A3VLの作出 pKA3のEcoRVサイトにSV40-LacZを挿入した（図９）。こ
れをKpnＩで切断・線状化した後、組換えウイルスの作
出に従ってK-A3VLの作出を行った。

【００６４】LacZ遺伝子の挿入位置を確認する為に、K-
A3VL感染CEFより抽出したDNAをEcoRＩで切断後サザンハ
イブリダイゼーションを行った（図１０）。KA3断片及
びLacZ遺伝子をプローブとした結果、何れにおいても期
待したサイズのバンドのみが検出され、LacZ遺伝子の挿
入が相同組換えによっていること及び組換えウイルスの
純化がされていることが確認された。また、K-A3VLのプ
ラークは組換え前の本来のウイルスのプラークに比較し
て小さく、明らかに増殖性が阻害されていた。

【００６５】実施例７：IRs及びTRsにおける繰り返し配
列の塩基配列決定 pKA5をStuIにより切断後、切り出された約２２０ｂから
なる断片をpUC119のSmaIサイトにクローニングし、塩基
配列の決定をおこなった。その結果をＧＡ株の塩基配列
（GenBank Accession Number M80595、M.Sakaguchi）と
比較したところ、塩基番号614から822に相当する領域が
２回繰り返していることが明らかとなった。一方、pKA6
の塩基配列を調べた結果、該領域が５回繰り返してい
た。

【００６６】また、BC-1株のA6に相当する断片の塩基配
列を決定した。その結果、KA6とほぼ同様TRsにおいて、
鶏白血病ウイルス（ALV、RAV2）のDNAと88%のホモロジ
ーを示す278bの塩基配列が組み込まれ、かつ３．５回繰
り返していることが確認された。図１１に繰り返し配列
の位置を示した。配列表：配列番号１にBC-1株のA6断片
の塩基配列を示した。配列表：配列番号１中の853番目
の核酸から5'側（小さい塩基番号の方向）がＵｓ領域遺
伝子、854番目の核酸から3'側（塩基の番号が増す方
向）がＴＲｓ領域の遺伝子に相当する。以上の結果よ
り、ＩＲｓ及びＴＲｓのＵＳ領域に接する部分には、ウ
イルスの増殖性に影響を与えず遺伝子の挿入が可能な部
位のあることが明らかとなった。

【００６７】実施例８：K-A5SLの作出 US領域を挟むTRs及びIRsに外来遺伝子の挿入可能な部位
の存在することが確認されたことより、pKA5をもちいて
インサーションプラスミドの構築をおこなった。まず、
pKA5をStuＩで切断することにより約220bpのリピート配
列を切り放し、アガロースゲル電気泳動により5.1kbの
断片を回収後、アルカリフォスファターゼにより脱燐酸
した。次にpCH110（ファルマシアcat.No.27-4508-01）
よりBamHＩ及びTthlllＩにより切り出し、平滑末端化し
た4.2Kbの断片(SV40-LacZ)を挿入してインサーションプ
ラスミドpKA5SL（図１２）を構築した。

【００６８】本プラスミドをKpnＩで切断・線状化した
後、組換えウイルスの作出の手順に従って組換えを実施
した。純化された組換えウイルスは、親株同等の良好な
in vitro増殖性を示した。

【００６９】実施例９：KA4の塩基配列決定 pKA4をBalIおよびSmaIにより切断し、1.1kbおよび4.9kb
の断片に分けそれぞれを回収した。1.1kbの断片は再び
Δpuc119のSmaIサイトにクローニングし、また4.9kbの
断片はセルフライゲーション後、同様に塩基配列の決定
に準じてssDNAの調製を行い、塩基配列の決定をおこな
った。その結果を配列表：配列番号２及び図１３に示
す。この塩基配列中には639個の塩基からなるORFが認め
られた（US639）。

【００７０】実施例１０：cell freeウイルス産生型Ｋ
−Ａ４ＢＬの作出 K-A4BL感染細胞10万ＰＦＵを初代ＣＥＦ3000万個ととも
に径10cmのシャーレに接種後、ＣＰＥを全面に呈した４
日目にその上清を採取した。その上清を1500 rpm×10分
遠心（KUBOTA KN-30F）したものに初代ＣＥＦ3000万個
とＢＳを５％添加後、0.7％重炭酸ソーダ水溶液でｐＨ
を7.4前後に修正した後、径10cmのシャーレに接種して
培養した。本操作を５回繰り返した後、さらにその上清
を５％ＢＳ加Ｅ−ＭＥＭで10倍に希釈し、2nd CEFを50
万個/mlになるように添加した後、100μlずつ96穴プレ
ートに接種してさらに培養した。５日後、シングルプラ
ークの出現したウェルより細胞を回収し、初代ＣＥＦ10
00万個とともに径５cmのシャーレに接種した。その上清
を96穴プレートに接種し、シングルプラークの出現した
ウェルの上清を同様に３回処理して、cell freeウイル
ス高産生型のクローンを得た。本ウイルスを１万ＰＦＵ
接種後５日間培養されたＣＥＦ上清中には、200〜500Ｐ
ＦＵ／mlのＬａｃＺ(+)ウイルスが産生されていた。こ
れに対し、同様の条件で培養されたワクチン株であるＣ
ＶＩ９８８感染細胞の上清中には２〜10ＰＦＵ／ｍｌの
ウイルスが産生されているのみであった。

【００７１】通常相同組換えによる組換え効率は、0.1
％前後とされている。したがって、200〜500ＰＦＵ／ml
のcell freeウイルスを産生するK-A4BLを親株として用
いることにより、はじめてリバース法による効率的なウ
イルスの作出が可能となる。

【００７２】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３００１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 起源 生物名：マレック病ウイルス 配列 GAATTCCTTC CTTTAAAATG AAAGATGTCC AGGTAGACGA TGCGGGATTG TATGTGGTTG 60 TGGCTTTATA TAATGGACGT CCAAGTGCAT GGACTTACAT TTATTTGTCA ACCGGTGAAA 120 CACTATCNTT AAATGTGGAA TGTATATGAA AACTACCACA AGCCGGGATT TGGGTATAAA 180 TCATTTCTAC AGAACAGTAG TATCATCGAC GAAAATGAGG CTAGCGATTG GTCCAGCTCG 240 TCCATTAAAC GGAGAAATAA TGGTACTATC CTTTATGATA TTTTACTCAC ATCGCTATCA 300 ATTGGGGCGA TTATTATCGT CATAGTAGGG GGTGTTTGTA TTGCCATATT AATTAGGCGT 360 AGGAGACGAC GTCGCACGCG GGGGTTATTC GATGAATATC CCAAATATAT GACGCTACCA 420 GGAAACGATC TGGGGGGCAT GAATGTTCCG TATGATAATG CATGCTCTGG TAACCAAGTT 480 GAATATTATC AAGAAAAGTC GGATAAAATG AAAAGAATGG GTTCGGGTTA TACCGCTTGG 540 CTAAAAAATG ATATNCCGAA ATTNGNAACC CCTAGATTTA ATCCCACTGA TATGNACANA 600 TTTAAACTTA ATGGGATATA GTATATGGAC GTCTATATGA CGAGAGTAAA TAAACTGACA 660 CTGCAAATGA AGCTGATCTA TATTGTGCTT TATATTGGGA CAAACCACTC GCACAAGCTC 720 ATTCAACACA TCCACTCTTG GACAGCTTCA TGTTAAAATA AACTGTAAAT CATTCAATGA 780 TAATGGGAGA AGAATGTGAG CAAGGATCCA TGGTGTCTGC TTTTTATAGT ATCTACCGCA 840 ATGCTACATA TAAAATAAAA ATATACCTCT ACCCAAAAAT GGGCGGTATG AGATGCACGG 900 GGAAAATACG CAGCTGTTCT CATATCCCCT GAACCGTACT CTTTTTCCCC TCTCCGCCCC 960 GCGGACCCCG AGGCCTCGTG GGGCACCTAT TTGCGCGGAG GAAGGCACGG TTCCTTTTTT 1020 TTTTGGGGGG GGGGGACCCA TCTGCGTAGA NAAAGGCACG GTTCCTCTTT TTTTTTTCCT 1080 ACAACATCTC GTTTGCATAT GCAAGCTCTG AGAACTTCCC TCTACCTCAA AGCGCCGTAG 1140 GGAACTGAGG TCTAATATTC AATCCTAGGC CACTCGCCAA TATAAGAGGG ACTTCCCCCC 1200 GCCTATAGAG AGAGGCAGCC CGAAAATGGA GCAGTGTAAA GCAGTACATG GGTGGTGGTA 1260 TGAAACTTGC GAATCGGGCT GTAACGGGGC AAGGCTTGAC TGAGGGGACC ATAGTATGTA 1320 TAGGCNAAAG GCGGGGCTTC GGTTGTANGC GGTTAGGAGT CCCCTCAGGA TACAGTAGTT 1380 GCGCTTTTGC ATAGGGAGGG GGAAATGTAG TCAAATAGAG CCAGAGGCAA CTTGAATAGC 1440 CTAAAGACCA AATAAGGAAA AAGCAAGACA TTCCATATGC TCATTGGTGG CGACTAGATA 1500 AGGAAGGAAT GACGCAAGGA CATATGGGCG TAGACGAAGC TATGTACGAT TATATAAGCT 1560 GTTGCCACCA TCAAAATAAA ACGCCATTTT ACCATTCACC ACATTGGTGT GCACCTGGGT 1620 AGATGGACAG ACCGTTGAGT CCCTAACGAT TGCGAACACC TGAATGAAGC AGAAGGCTTC 1680 ATTAATGTAG TCAAATAGAG CCAGAGGCAA CTTGAATAGC CTAAAGACCA AATAAGGAAA 1740 AAGCAAGACA TTCCATATGC TCATTGGTGG CGACTAGATA AGGAAGGAAT GACGCAAGGA 1800 CATATGGGCG TAGACGAAGC TATGTACGAT TATATAAGCT GTTCCACCAT CAAATAAACG 1860 CCATTTTACC ATTCACCACA TTGGTGTGCA CCTGGGTAGA TGGACAGACC GTTGAGTCCC 1920 TAACGATTGC GAACACCTGA ATGAAGGAGA AGGCCTCATT AATGTAGTCA AATAGAGCCA 1980 GAGGCAACTT GAATAGCCTA AAGACCAAAT AAGGGAAAAG CAAGACATTC CATATGCTCA 2040 TTGGTGGCGA CTAGATAAGG AAGGAATGAC GCAAGGACAT ATGGGCGTAG ACGAAGCTAT 2100 GTACGATTAT ATAAGCTGTT GCCACCATCA AATAAACGCC ATTTTACCAT TCACCACATT 2160 GGTGTGCACC TGGGTAGATG GACAGACCGN TGAGTCCCTN ACGATTGCGN ACACCTNAAT 2220 GAAGNNGAAG GCCTCATTAA TGNAGTCAAA TAGAGCCAGA GGCTAACTTG AATAGCCTAA 2280 AGGACCAAAT AAGGAAAAAG CAAGACATTC CATATGCTCA TTGGTGGCGA CTAGATAAGG 2340 AAGGAATGAC GCAAGGACAT ATGGGCGTAG ACGAAGCTAT GTACGATTAT ATAAGCTAAA 2400 CCCAGGAGAC ACGCTGTGGT TAGCTCGTCG ATTCAGTATC CCCCCCNAAN GGCCCCCCCT 2460 TTTTNGGCCC CNGGTTTNCC NNAANCNTTG NCCAAAAANC CTAGCCCAAA AGCNNCGTAA 2520 NNCTTGGGAT NNTAAAAAAA ANGGAGAACN CGTAAGGCCA AAAAANCTAT TTTAATGGGT 2580 CCCCGACAAA NATAAACACA CTCCCCCCTC CCCCTTNCCC CTGTTCAAGT CAGNAAACCC 2640 GTCGNAAGAT TAATTCTCAA AATCCCAATN CGGCGAGCAT GTAAGACCCC GGCCAATCGT 2700 ACAGAACCCC GAGTTTTGTT TACTTGCAGA TATGCACCGC CCTTCCTTGA CGTGNCAAAC 2760 AAACTAAGCT GTGTTTATAT AAAACGGCAC CCNACCCATA TACTCGTATA CTTGTACGAA 2820 CCAGTGGTTT TTTTATGTGG GGGAGGGAGA AGGACAAATT AAAACATTGN ACTTGCCTGG 2880 GCTACAATTC CCTTTTGGCT CGAGCTATGT CGGAGAGTNC CGGTGGACCC GNGGTTGTGC 2940 TTTGGGCTGA AGGAANTCGA GNTNGGTACC CGGGGANCCT CTAGAGTCGA CCCTGAAAGC 3000 T 3001

【００７３】

【配列表】

配列番号：２ 配列の長さ：９００ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 起源 生物名：マレック病ウイルス 配列 TGTTGCCTTT TTGTTGTATA TGAAGATATT TAATGTGGCG TTGAGCCTAA TGAGAGGAGA 60 ACGTGTTTGA ACACTGGAGA CGAGCGCCGT GTAAGATTAA AACATATTGG AGAGGTATGG 120 CCATGTGGTC TCTACGGCGC AAATCTAGCA GGAGTGTGCA ACTCCGGGTA GATTCTCCAA 180 AAGAACAGAG TTATGATATA CTTTCTGCCG GCGGGGAACA TGTTGCGCTA TTGCCTAAAT 240 CTGTACGCAG TCTAGCCAGG ACCATATTAA CCGCCGCTAC GATCTCCCAG GCTGCTATGA 300 AAGCTGGAAA ACCACCATCG TCTCGTTTGT GGGGTGAGAT ATTCGACAGA ATGACTGTCA 360 CGCTTAACGA ATATGATATT TCTGCTTCGC CATTCCACCC GACAGACCCG ACGAGAAAAA 420 TTGTAGGCCG GGCTTTACGG TGTATTGAAC GTGCTCCTCT TACACACGAA GAAATGGACA 480 CTCGGTTTAC TATCATGATG TATTGGTGTT GTCTTGGACA TGCTGGATAC TGTACTGTTT 540 CGCGCTTATA TGAGAAGAAT GTCCGTCTTA TGGACATAGT AGGTTCGGCA ACGGGCTGTG 600 GAATAAGTCC ACTCCCCGAA ATAGAGTCTT ATTGGAAACC TTTATGTCGT GCCGTCGCTA 660 CTAAGGGGAA TGCAGCAATC GGTGATGATG CTGAATTGGC ACATTATCTG ACAAATCTTC 720 GGGAATCGCC AACAGGAGAC GGGGAATCCT ACTTATAACT AATCGCACAA TTATTAATAG 780 GATTTTAGGA AAAACTGCTA CTAACGTTGT TTAAATAATA AAATTTTATT TTCAATAAGG 840 CATTACAGTG TTGTCATGAT TGTATGTATT ATATGGGGTA TGCATGAGGA TTACTTCGAT 900

【図面の簡単な説明】

【図１】 pKHBのEcoRI切断パターンの模式図を示す。

【図２】 61-554株A3,A4,A5及びA6各断片のゲノム上の
位置を示す。

【図３】 K-A4BL作出に用いたインサーションプラスミ
ドpKA4BLの構成を示す。

【図４】 K-A4BL感染CEFより抽出したDNAをEcoRIで切
断した後、 LacZ遺伝子(レーン1) 及び KA4断片(レーン
2)をプローブとして行ったサザンハイブリダイゼーショ
ンの結果の模式図を示す。

【図５】 1日齢にK-A4BL 7000PFUを接種された鶏の、7
週齢における血清中の抗β-gal ELISA抗体価を示す。
（○印は通常のマレック二価ワクチンを接種された鶏の
7週齢における血清を測定した値を示す）

【図６】 本発明に用いるインサーションベクターpKA4
Bの構築を示す。

【図７】 本発明に用いるインサーションプラスミドpK
A4BFの構成を示す。

【図８】 本発明に用いるインサーションプラスミドpK
A4BHNの構成を示す。

【図９】 K-A3VL作出に用いたインサーションプラスミ
ドpKA3VLの構成を示す。

【図１０】 K-A3VL感染CEFより抽出したDNAをEcoRIで
切断した後、LacZ遺伝子(レーン1)及びKA3断片(レーン
2)をプローブとして行ったサザンハイブリダイゼーショ
ンの結果の模式図を示す。

【図１１】 K-554株、A5断片における繰り返し配列の
位置、並びにK-554株及BC-1株のA6断片における繰り返
し配列の位置を示す。

【図１２】 本発明に用いるインサーションプラスミド
pKA5SLの構成を示す。

【図１３】 61-554株、A4断片におけるBalIサイトを含
むＯＲＦ、ＵＳ６３９近傍の塩基配列を示す。

フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記(１)または（２）の遺伝子断
   片を有し、動物細胞若しくは動物ウイルス由来のプロモ
   ーター下流に外来遺伝子を接続した外来遺伝子発現カセ
   ットが該遺伝子断片中に組込まれたプラスミドを用い
   て、マレック病１型ウイルスゲノムに該外来遺伝子発現
   カセットを組込むことを特徴とする組換えマレック病ウ
   イルスの調製法。 （１）マレック病１型ウイルス遺伝子をHindIIIで処理
   して得られるUs領域を含むHindIII−Ｂ断片を、更にEco
   RIで処理して得られる、約2.8Kbpからなる遺伝子断片 （２）マレック病１型ウイルス遺伝子をHindIIIで処理
   して得られるUs領域を含むHindIII−Ｂ断片を、更にEco
   RIで処理して得られる、IRｓとUsまたはTRｓとUsの境界
   を含む遺伝子断片
2. 【請求項２】 下記(１)または（２）の遺伝子断
   片部位に、動物細胞若しくは動物ウイルス由来のプロモ
   ーター下流に外来遺伝子を接続した外来遺伝子発現カセ
   ットが組込まれた組換えマレック病１型ウイルス。 （１）マレック病１型ウイルス遺伝子をHindIIIで処理
   して得られるUs領域を含むHindIII−Ｂ断片を、更にEco
   RIで処理して得られる、約2.8Kbpからなる遺伝子断片 （２）マレック病１型ウイルス遺伝子をHindIIIで処理
   して得られるUs領域を含むHindIII−Ｂ断片を、更にEco
   RIで処理して得られる、IRｓとUsまたはTRｓとUsの境界
   を含む遺伝子断片
3. 【請求項３】 外来遺伝子が、マレック病以外の
   ワクチン用抗原をコードする遺伝子である請求項２記載
   の組換えマレック病１型ウイルス。
4. 【請求項４】 外来遺伝子がニューカッスル病ウ
   イルス抗原遺伝子である請求項２記載の組換えマレック
   病１型ウイルス。
5. 【請求項５】 ニューカッスル病ウイルス抗原遺
   伝子が、弱毒型ニューカッスル病ウイルス由来の遺伝子
   である請求項４記載の組換えマレック病１型ウイルス。
6. 【請求項６】 請求項２ないし５記載のいずれか
   の組換えマレック病１型ウイルスを主成分として含有す
   ることを特徴とする鳥類用多価ワクチン。
7. 【請求項７】 鳥類がニワトリである請求項６記
   載の鳥類用多価ワクチン。
8. 【請求項８】 外来遺伝子が生理活性物質をコー
   ドする遺伝子である請求項２記載の組換えマレック病ウ
   イルス。
9. 【請求項９】 請求項８記載の組換えマレック病
   ウイルスをベクターとして鳥類に接種することを特徴と
   する生理活性物質の投与方法。