JPH08500969A

JPH08500969A - 七面鳥の組換えヘルペスウイルス及びそれらの使用

Info

Publication number: JPH08500969A
Application number: JP6501778A
Authority: JP
Inventors: コックラン、マーク・デー
Original assignee: シントロ・コーポレーション
Priority date: 1992-06-12
Filing date: 1993-06-14
Publication date: 1996-02-06
Also published as: WO1993025665A1; AU4536293A; EP0644931A1; EP0644931A4; CA2137930A1; US5928648A; AU684046B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、七面鳥ヘルペスウイルスのゲノムＤＮＡ中に挿入された外来遺伝子を有する組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、前記外来遺伝子は、前記七面鳥ヘルペスウイルス・ゲノムＤＮＡのＵＳ２遺伝子コーディング領域における独自のＳｔｕＩ部位に挿入されており、また七面鳥ヘルペスウイルスに感染したホスト細胞内で前記外来遺伝子が発現され得る組換えヘルペスウイルスを提供する。本発明の一実施例において、前記外来遺伝子は、前記組換え七面鳥ヘルペスウイルスが導入される動物内で抗原性を有するポリペプチドをコードする。本発明はまた、七面鳥の下記組換えヘルペスウイルス構築物およびこれら構築物を含むワクチンに関する：Ｓ−ＨＶＴ−０１２，Ｓ−ＨＶＴ−０４５，Ｓ−ＨＶＴ−０４６，Ｓ−ＨＶＴ−０４７，Ｓ−ＨＶＴ−０６２，Ｓ−ＨＶＴ−０４８，Ｓ−ＨＶＴ−０４９，Ｓ−ＨＶＴ−０５０，Ｓ−ＨＶＴ−１０６，Ｓ−ＨＶＴ−０５１，Ｓ−ＨＶＴ−０５２，Ｓ−ＨＶＴ−０６６，Ｓ−ＨＶＴ−０９６。

Description

【発明の詳細な説明】七面鳥の組換えヘルペスウイルス及びそれらの使用〔発明の背景〕ＤＮＡを単離し、このように単離されたＤＮＡをバクテリアプラスミドにクローニングできることによって、ウイルスワクチンの作製に利用可能なアプローチは大きく拡大されてきている。本発明に至るために用いられる方法には、挿入、欠失、および単一もしくは複数の塩基の変更により、動物の種々の病原体からクローン化されたＤＮＡ配列を修飾し、続いてこれらの修飾配列をウイルスゲノムに挿入することが包含される。外来遺伝子を加えることの一つの有用性は、その外来配列が、動物のウイルス感染の際に発現される外来タンパク質をコードするときに達成される。こうして、得られた生ウイルス（live virus）は、宿主動物において免疫応答を引き出し、この動物に疾患に対する防御を付与するためのワクチンに用いることができる。これらの性質を有するウイルスは、外来タンパク質を宿主動物に搬送して発現させる生きたベクターとなるため、ウイルスベクターと呼ばれる。実際のところ、これは外来タンパク質の精巧なデリバリーシステムとなる。より詳細には、本発明は、疾患に対して鳥類にワクチン接種するためのウイルスベクターとして、七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）を使用することに関する。ヘルペスウイルス類の群には、ブタ、ウシ、ニワトリ、ウマ、イヌ、ネコ等の多くの標的種に感染し、疾患を引き起こす種々の病原因子が含まれる。各々のヘルペスウイルスはその宿主種に特異的であるが、それらは全て、ゲノムの構造および、複製の方式において関連しており、且つそれらが宿主動物において引き起こす病状及びウイルス感染に対する宿主免疫応答の機構においてある程度の関連を有している。組換えＤＮＡ技術を動物ウイルスに応用する歴史は、比較的新しい。加工された最初のウイルスは、最も小さいゲノムを有するものである。パポバウイルスの場合には、これらのウイルスが非常に小さく、多くの余分なＤＮＡを収容できないため、遺伝子工学においてそれらは不完全なレプリコンとして用いられている。これらのウイルスからの外来遺伝子の発現は、野生型のヘルパーウイルスを必要とし、また細胞培養系に限定される。アデノウイルスには、外来配列で置換えることができる少量の非必須ＤＮＡが存在する。アデノウイルスにおいて発現しているように思われる外来ＤＮＡは、パポバウイルス由来のＴ抗原遺伝子（Mans our, et al.. Proc.Natl.Acad.Sci.US, 1985； Thummel, et al.,Cell,1983: S colnick, et al.,Cell, 1981； Thummel、 et al.,Cell,1981）、及びヘルペス単純ウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ遺伝子（Haj-Ahmed and Graham, J. o f Virology,1986）のみである。これらの刊行物では、外来遺伝子を挿入し得るＨＶＴの非必須領域を同定しておらず、また如何にしてＨＴＶ中で外来遺伝子の発現を達成するか（例えば如何なるプロモーター配列および終始配列を用いるか）を教示してもいない。加工されているウイルスの他の群は、ポックスウイルスである。この群の一員であるワクチニアについては、外来遺伝子の発現について多くの調査がなされている。ポックスウイルスは、感染細胞の細胞質において複製する巨大ＤＮＡ含有ウイルスである。これらは、２０面体対称もしくは螺旋対称に基づくキャプシドを持たないという点で独特の構造を有している。ポックスウイルスは、おそらく、機能の損失及び変性によりバクテリア様の微生物から進化したものである。一部はこの独自性に起因するのであるが、ポックスウイルスの遺伝子工学における進歩は、ヘルペスウイルス及びＨＶＴを含む他のウイルス系に対して直接適用することはできない。下記の挿入外来遺伝子を発現するワクチニア組換えウイルス構築物が、多くの研究所で作製されている。即ち、ＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子（Mackett, et al., Proc.Natl. Acad.Sci.USA, 1982; Panicali and Paolett i,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1982）、Ｂ型肝炎表面抗原（Paoletti, etal.,Proc. Natl.Acad.Sci.USA, 1984; Smith et al.,Nature,1983）、ＨＳＶ糖タンパクＤ遺伝子、インフルエンザ・ヘマグルチニン遺伝子（Paoletti,et al., Proc. Nat l.Acad.Sci.USA, 1983; Smith et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1983 ）、マラリア抗原遺伝子（Smith, et al.,Science,1984）および水庖性口内炎糖タンパクＧ遺伝子（Mackett, et al., Science, 1986）である。ワクチニアの組換えＤＮＡ作業の一般的かつ全般的な特徴は、特に文献中に記載された技術に関連する限り、全てのウイルスについて用いられる技術に似ている（Maniatis, et al.,MolecularCloning, 1982 ）。しかしながら、細かい点では、ワクチニアの技術はヘルペスウイルス及びＨＶＴには適用することはできない。ワクチニアはヒト天然痘と緊密な関係しており、またヒトに対する公知の病原性を有するため、ワクチンベクターとしてのワクチニアの有用性は疑問視されている。したがって、宿主特異的なヘルペスウイルスＨＶＴを用いることが、家禽のワクチン接種に対するより良い解決法である。主要なヘルペスウイルスのうち、外来ＤＮＡ配列を含ませるために加工されているのは、ヒトのＨＳＶと、限られた範囲のサルのヘルペスサイミリ（herpes saimiri）のみがである。ＨＳＶの操作に組換えＤＮＡ技術を用いた最初の例は、Ｌ−Ｓ接続領域に由来するＤＮＡ断片をＨＳＶ・ＤＮＡに独特の長大領域、具体的にはチミジンキナーゼ遺伝子にクローニングすることに関連していた（Mocc arski, et al., Cell,1980）。この挿入物は、外来ＤＮＡ断片と言うよりも、むしろゲノムの他の部位で複製されるヘルペスウイルスＤＮＡの天然に存在する断片であった。このＤＮＡ断片は、タンパク質を特異的に発現するように手が加えらてはおらず、したがってこの仕事はヘルペスウイルスにおけるタンパク質の発現とは無関係である。ＨＳＶの次の操作は、組換えＤＮＡ技術とチミジンキナーゼ選別とを組み合わせることによって、ウイルスゲノム内の欠失を創出することに関連するものであった。このアプローチを用いることによって、ＨＳＶアルファ-22遺伝子が除かれ（Post,et al.,Cell,1981）、ＤＮＡの15,000塩基の配列がＨＳＶの内部の繰り返しから除かれた（Poffenberger, et al.,Proc.Natl.Acad, Sci.USA,1981）。以下の事例は、ヘルペスウイルス中にタンパク質をコードする遺伝子を挿入することに関連している。即ち、ＨＳＶ糖タンパクＣ遺伝子を、該遺伝子が自然発生的に欠失しているＨＳＶ変異体遺伝子中に挿入すること（Gibson and Spear,J ,of Virology,1983）；ＨＳＶ１型に対して、ＨＳＶ２型の糖タンパクＤを挿入すること（この遺伝子は「外来」ではないのでプロモーター配列は操作されていない）；ＨＳＶ・ＩＣＰ４プロモーターの制御下に、ＨＳＶに対してＢ型肝炎表面抗原を挿入すること（Shih,et al., Proc. Natl. Acad.Sci.USA,1984）；及びＳＶ４０プロモーターと共に、ヘルペスサイミリウイルス中にウシ成長ホルモンを挿入すること（Desrosiers, et al., 1984）（なお、この系では該プロモーターは作働せず、内部上流（endogenous upstream）が遺伝子転写の役割を果たした）である。更に、２種類の外来遺伝子（ニワトリ卵白アルブミン遺伝子及びエプスタイン−バールウイルス核抗原）がＨＳＶに挿入され（Arsenakis andRoi zman, 1984）、仮性狂犬病ウイルスの糖タンパクＸがＨＳＶに挿入されている（ Post,et al.,1985）。ヘルペスウイルスの遺伝子の欠失させ、或いはヘルペスウイルスに遺伝子を挿入したこれらの事例は、組換えＤＮＡ技術によってヘルペスウイルスのゲノムを遺伝学的に操作することが可能であることを示している。遺伝子の挿入に用いられている方法には、プラスミド中にクローニングされたウイルスＤＮＡと、これと同じ動物細胞にトランスフェクトされた精製ウイルスＤＮＡとの間の相同的組換えが含まれる。しかし、これら従来の研究では、欠失の位置及び外来遺伝子の挿入部位をどの程度一般化できるのかが不明である。本発明の目的の１つは、マレック病に対するワクチンである。マレック病ウイルス（ＭＤＶ）は、ニワトリの普通のリンパ球増殖疾患であるニワトリの脚麻痺（fowl paralysis）を含むマレック病の原因因子である。この疾患は、大抵は２ないし５月齢の若鶏に発生する。顕著な臨床的徴候は、１箇所以上の体部末端（ extremities ）の進行性の麻痺、脚の麻痺による協調不能、翼の関連症状（invo lvement ）による翼の位置の低下、及び首の筋肉の関連症状による頭の位置の低下である。急性の場合には、重篤のうつ病に見舞われることがある。腫瘍原性が高い株の場合には、特徴的な滑液包及び胸腺の萎縮が見られる。加えて、生殖腺、肺、肝臓、脾臓、腎臓及び胸腺に影響を及ぼすリンパ様腫瘍が見られる（Moha nty and Dutta, 1981 ）。ほとんどのニワトリは、それを生涯ＭＤＶから守るために、その生後１日目にＭＤＶに対するワクチン接種を受ける。本発明以前には、ＭＤＶに対する主なワクチン接種法には七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）の自然発生株の使用が含まれていた。この生後１日目のワクチン接種に他の抗原を組み込むことに利点はあるであろう。しかしながら、病原体間の競合及び免疫抑制のために、従来のワクチンを組み合わせる努力が満足し得るものであることは今日まで立証されていない。本発明において加工された多価ＨＶＴベースのワクチンは、多数の異なる病原体に対して同時にワクチン接種するための新規な方法を提示する。最初に、ＨＶＴゲノムの非必須領域に外来遺伝子が挿入された組換えＨＶＴが開示される。これらのヘルペスウイルスに対して行なわれているタイプの遺伝子操作は、バクテリア中のプラスミドヘウイルスＤＮＡの一部をクローニングし、クローニングされた状態で前記ウイルスＤＮＡを再構築して、前記ＤＮＡに特定の配列の欠失を生じさせ、さらに欠失の代わりに若しくは欠失から除かれた部位に、外来ＤＮＡを加えることからなる。ＨＶＴのゲノムへの挿入を目的とした興味の対象としての外来遺伝子は、興味対象のいかなる病原微生物からも得ることができる。典型的には、興味対象の遺伝子は、家禽産業に経済的な衝撃を与える疾患を家禽に引き起こす病原体から誘導されるであろう。これらの遺伝子は、それに対するワクチンが存在する微生物から誘導することが可能であり、ベクター操作技術（vectoring technology）の新規な利点の故に、ＨＶＴ由来のワクチンが優れているであろう。また、興味対象の遺伝子は、現時点ではそれに対するワクチンが存在しないが、疾患を制御することが要求されている病原体から誘導することもできる。典型的には、興味対象の遺伝子は、病原体の免疫原性ポリペプチドをコードし、表面タンパク質、分泌タンパク質及び構造タンパク質を発現し得る。感染性喉頭気管炎（ＩＬＴ）は、ＨＶＴベクター操作の対象である関連鳥類の病原体である。ＩＬＴはヘルペスウイルス科の一員であり、この病原体は、呼吸機能低下、喘ぎ及び血の混じった分泌物である咳を特徴とするニワトリの急性疾患を引き起こす。ウイルスの複製は気道の細胞に限られ、この際、気管では感染により組織の侵蝕及び出血が起こる。ニワトリでは、病変形成の程度の減少及び臨床的徴候の低減に有効な薬物は存在しない。細胞継代により誘導される種々の修飾された形態のＩＬＴウイルスを用いた鳥類のワクチン接種及び／又は退屈な投与管理方式により、感受性のあるニワトリに許容され得る防御が与えられている。現在のＩＬＴワクチンの弱毒化の程度の故に、防御を与えるには十分であるが、群れの中に疾患を引き起こすには十分ではないように、ウイルスのレベルが正しく維持されていることを確認しなければならない。ＨＶＴベクター操作アプローチの別の標的は、ニューキャッスル病である。これはニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）により引き起こされる、感染性で非常に蔓延性が高く、衰弱を起こす疾患である。ＮＤＶはパラミクソウイルス科の一本鎖ＲＮＡウイルスである。ＮＤＶの種々の病原型（短潜伏期性、亜病原性、長潜伏期性）は、疾患の重篤性、特異性および症状において異なるが、多くの型は呼吸器系及び神経系に感染するようである。ＮＤＶは、主として、ニワトリ、七面鳥および他の種の鳥類に感染する。歴史上、ワクチン接種は疾患を予防するために用いられているが、母系抗体妨害（maternal antibody interferences）、鳥の寿命及び投与経路のために、製造者は免疫プロトコルを特定の要求に合わせる必要がある。〔発明の概要〕本発明は、七面鳥ヘルペスウイルスのゲノムＤＮＡ中に挿入された外来遺伝子を有する組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、前記外来遺伝子は、前記七面鳥ヘルペスウイルスのゲノムＤＮＡのＵＳ２遺伝子コーディング領域における独自のＳｔｕＩ部位に挿入されており、また七面鳥ヘルペスウイルスに感染したホスト細胞内で前記外来遺伝子が発現され得るような、組換えヘルペスウイルスを提供する。本発明の一実施例において、前記外来遺伝子は、前記組換え七面鳥ヘルペスウイルスが導入される動物内で抗原性を有するポリぺプチドをコードする。本発明はまた、七面鳥の下記組換えヘルペスウイルス構築物およびこれら構築物を含むワクチンに関する：Ｓ−ＨＶＴ−０１２，Ｓ−ＨＶＴ−０４５，Ｓ−ＨＶＴ−０４６，Ｓ−ＨＶＴ−０４７，Ｓ−ＨＶＴ−０６２，Ｓ−ＨＶＴ−０４８，Ｓ−ＨＶＴ−０４９，Ｓ−ＨＶＴ−０５０，Ｓ−ＨＶＴ−１０６，Ｓ−ＨＶＴ −０５１，Ｓ−ＨＶＴ−０５２，Ｓ−ＨＶＴ−０６６，Ｓ−ＨＶＴ−０９６。〔図面の簡単な説明〕図１は、ＨＶＴ構築物の詳細およびマップデータを示している。・図１Ａは、ＨＴＶのＢａｍＨＩ制限フラグメントマップを示している。フラグメントは、寸法が小さくなる順に番号を付してある；文字は、比較される寸法が未だ決定されていない小さいフラグメントに関係している。・図１Ｂは、Ｓ−ＨＶＴ−００１におけるβガラクトシダーゼ遺伝子の挿入位置を示す、ＢａｍＨＩ＃１６フラグメントを示している。・図１Ｃは、βガラクトシダーゼ遺伝子の挿入位置を示す、ＢａｍＨＩ＃１９フラグメントを示している。・凡例：Ｂ＝ＢａｍＨＩ；Ｘ＝ＸｈｏＩ；Ｈ＝ＨｉｎｄIII；Ｐ＝ＰｓｔＩ；Ｓ＝ＳａｌＩ；Ｎ＝ＮｄｅＩ；Ｒ＝ＥｃｏＲＩ図２（図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃおよび図２Ｄからなる）は、プラスミド１９１ −４７における挿入をを示している。図３は、Ｓ−ＨＶＴ−００３構築物の詳細を示している。・図３Ａは、ＢａｍＨＩ＃１６フラグメントの領域におけるＳ−ＨＶＴ・ＤＮＡの制限マップを示している。このフラグメントは、ＨｉｎｄIII大フラグメント内に含まれている。また、図３Ａは、まず「リンカー」および標準のクローン化法を用いてＥｃｏＲＩ（Ｒ）部位に変えられたＨｈｏＩ部位を示している。図３Ａはまた、相同的組換えに用いるため、ＢａｍＨＩ＃１６フラグメント中に挿入されたベータｇａｌ遺伝子およびＩＢＶＤ遺伝子の詳細な組立てを示している。両遺伝子は、ＰＲＶ・ｇＸ遺伝子プロモータ（ｇＸ）の制御下にあった。・図３Ｂは、挿入した二つの外来遺伝子（β−ｇａｌおよびＩＢＤＶ）の位置を含めて、Ｓ−ＨＶＴ−００３ゲノムを示している。・図３における凡例：Ｈ＝ＨｉｎｄIII；Ｂ＝ＢａｍＨＩ；Ｘ＝ＸｈｏＩ；Ｒ＝ＥｃｏＲＩＸｂ＝ＸｂａＩ；Ｈｐ＝ＨｐａＩ；Ｓ＝ＳｍａＩ；ＵＬ＝独自の長領域；ＵＳ；独自の短領域；ＩＲ＝内部繰り返し領域；ＴＲ＝末端繰返し領域図４は、Ｓ−ＨＶＴ−００３感染細胞（３２ｋＤ陽性）およびＳ−ＨＶＴ−００１感染細胞（３２ｋＤ陰性）の細胞溶解物中におけるＩＢＤＶ・３２ｋＤ抗原の異なった発現を示すウエスタンブロットを示している。ＩＢＤＶ特異的ポリぺプチドは、変性ＩＢＤＶビリオンに対する高免疫ラットの高血清を用いて、該ブロットをプロービングすることによって同定された。この血清は、免疫優勢の３２ｋＤ抗原（ＶＰ３）と主に反応する。ブロット上のレーンには下記のものが含まれている：１）蛋白分子量標準；２）非感染ＣＥＦ細胞；３）Ｓ−ＨＶＴ−００１感染ＣＥＦ細胞；４），５）および６）Ｓ−ＨＶＴ−００３；７）ＩＢＤＶビリオンポリペプチド。図５は、野生型ＨＶＴウイルスまたはβ−ガラクトシダーゼを発現するＳ−ＨＶＴ−００１に感染したＣＥＦ細胞に由来する細胞溶解物中の、４２ｋＤ・ＩＢＤＶポリペプチド（ＶＰ２）産物の存在を示すウエスタンブロットである。ＩＢＤＶ特異的ポリペプチドは、ＶＰ−２特異的なウサギの抗ペプチド抗血清を用いて同定された。図のレーンには下記のものが含まれている：１）蛋白分子量標準；２）野生型ＨＶＴ感染ＣＥＦ細胞；３）Ｓ−ＨＶＴ− ００１感染ＣＥＦ細胞；４）Ｓ−ＨＶＴ−００３感染細胞；５）Ｓ−ＨＶＴ −００３感染細胞；６）ＩＢＤＶビリオンポリペプチド。図６には、Ｓ−ＨＶＴ−００４の構築の詳細が与えられている。・図６Ａは、ＢａｍＨＩ＃１６フラグメントの領域におけるＨＶＴ・ＤＮＡの制限マップである。このフラグメントは、まず「リンカー」および標準のクローン化法を用いることによりＥｃｏＲＩ（Ｒ）部位に変えられた、ＨｉｎｄII I大フラグメント内に含まれている。・図６Ｂは、相同的組換えに用いるために、ＢａｍＨＩ＃１６フラグメント中に挿入されたβｇａｌ遺伝子およびＩＢＶＤ遺伝子の組立ての詳細を示している。ＭＤＡ・ｇＡ遺伝子はそれ自身のプロモータの制御下にあったが、βｇａｌはＰＲＶ・ｇＸ遺伝子プロモータ（ｇＸ）の制御下にあった。・図６Ｃは、挿入された二つの外来遺伝子（βｇａｌ及びＭＤＶ・ｇＡ）の位置を示す、Ｓ−ＨＶＴ−００４の図である。・図６における凡例：Ｈ＝ＨｉｎｄIII；Ｂ＝ＢａｍＨＩ；Ｘ＝ＸｈｏＩ；Ｒ＝ＥｃｏＲＩＸｂ＝ＸｂａＩ；ＵＬ＝独自の長領域；ＵＳ；独自の短領域；ＩＲ＝内部繰り返し領域；ＴＲ＝末端繰返し領域図７（図７Ａおよび７Ｂからなる）は、相同性ベクター（467-22.A12）に挿入されたβガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子の詳細な説明図である。このダイアグラムは、マーカー遺伝子内に組立てられたＤＮＡフラグメントの配向（orientation）を示している。夫々のフラグメントの起源は、後述する材料および方法の章に記載されている。各フラグメント間の連結部およびマーカー遺伝子の末端に位置する配列が示されている。夫々のフラグメントを生じさせるために用いられる制限部位が、適切な連結部に示されている。また、ｌａｃＺ遺伝子コーディング領域の位置が与えられている。括弧（）内の数字はアミノ酸に関するものであり、ブラケット［］内の制限部位は、構築の間に破壊される部位の残余（remnant）を示している。以下の略号が用いられている：シュードラビーウイルス（ＰＲＶ）；ラクトースオペロンＺ遺伝子（ｌａｃＺ）；大腸菌（E. Coli）；ポリアデニル化信号（ｐＡ）；糖タンパクＸ（ｇｐＸ）。図８はＨＶＴゲノムのＢａｍＨＩ，ＮｏｔＩ制限マップである。独自の長いＵＬ領域および独自の短いＵＳ領域が示されている。この長い領域および短い領域の繰り返しは、ボックスによって示されている。これらＢａｍＨＩフラグメントは、大きさが小さくなる順に番号が付されている。プローブＰ１〜Ｐ４の位置が示されている。各プローブの起源は次の通りである：Ｐ１＝ＢａｍＨＩ＃６；Ｐ２＝ＢａｍＨＩ＃２；Ｐ３＝ＢａｍＨＩ＃１３；Ｐ４＝ＨＶＴゲノムＸｂａＩフラグメント＃５（8.0 kb）の4.0 kb ＢｇIII〜ＳｔｕＩサブフラグメント。図９は、プラスミドｐＳＹ２２９の構築手順の概略を示している。図１０（図１０Ａおよび図１０Ｂからなる）は、相同性ベクター 456-18.18 及び456-17,22に挿入されたＭＤＶ遺伝子カセットの詳細図である。ダイアグラムは、該カセット内に組立てられたＤＮＡフラグメントの配向を示している。夫々のフラグメントの起源は、後述する材料および方法の章に記載されている。各フラグメント間の連結部およびマーカー遺伝子の末端に位置する配列が示されており、これには連結部Ａ（配列ＩＤ番号３４）、連結部Ｂ（配列ＩＤ番号３５）、連結部Ｃ（配列ＩＤ番号３６）が含まれる。夫々のフラグメントを生じさせるために用いられる制限部位が、適切な連結部に示されている。また、ＭＤＶ・ｇＡおよびｇＢ遺伝子の位置も与えられている。括弧（）内の数字はアミノ酸に関するものであり、ブラケット［］内の制限部位は、構築の間に破壊される部位の残余（remnant）を示している。図１１（図１１Ａおよび図１１Ｂからなる）は、相同性ベクター 556-41.5に挿入されたＨｉｎｄIIIの詳細図である。ダイアグラムは、カセット内に組立てられたＤＮＡフラグメントの配向を示している。夫々のフラグメントの起源は、後述する材料および方法の章に記載されている。各フラグメント間の連結部およびマーカー遺伝子の末端に位置する配列が示されており、これには連結部Ａ（配列ＩＤ番号３７）、連結部Ｂ（配列ＩＤ番号３８）、連結部Ｃ（配列ＩＤ番号３９）が含まれる。夫々のフラグメントを生じさせるために用いられる制限部位が、適切な連結部に示されている。また、ＭＤＶ・ｇＤ遺伝子およびｇＩ遺伝子の位置も与えられている。括弧（）内の数字はアミノ酸に関するものであり、ブラケット［］内の制限部位は、構築の間に破壊される部位の残余（remnant）を示している。図１２（図１２Ａ，図１２Ｂおよび図１２Ｃからなる）は、相同性ベクター 255-18.B16に挿入されたＨｉｎｄIIIの詳細図である。ダイアグラムは、カセット内に組立てられたＤＮＡフラグメントの配向を示している。夫々のフラグメントの起源は、後述する材料および方法の章に記載されている。各フラグメント間の連結部およびマーカー遺伝子の末端に位置する配列が示されており、これには連結部Ａ（配列ＩＤ番号４０）、連結部Ｂ（配列ＩＤ番号４１）、連結部Ｃ（配列ＩＤ番号４２）、連結部Ｄ（配列ＩＤ番号４３）、連結部Ｅ（配列ＩＤ番号４４）、連結部Ｆ（配列ＩＤ番号４５）連結部Ｇ（配列ＩＤ番号４６）、連結部Ｈ（配列ＩＤ番号４７）含まれる。夫々のフラグメントを生じさせるために用いられる制限部位が、適切な連結部に示されている。また、ＮＤＶ・Ｆ遺伝子およびｌａｃＺ−ＮＤＶ・ＨＮハイブリッド遺伝子の位置も与えられている。括弧（）内の数字はアミノ酸に関するものであり、ブラケット［］内の制限部位は、構築の間に破壊される部位の残余（remnant）を示している。〔発明の詳細な記述〕本発明は、七面鳥ヘルペスウイルスのゲノムＤＮＡ中に挿入された外来遺伝子を有する組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、前記外来遺伝子は、前記ゲノムＤＮＡのＵＳ２遺伝子コーディング領域における独自のＳｔｕＩ部位に挿入されており、また七面鳥ヘルペスウイルスに感染したホスト細胞内で前記外来遺伝子が発現され得るような、組換えヘルペスウイルスを提供する。本発明の目的において、「ゲノムＤＮＡ」とは、天然の七面鳥ヘルペスウイルスに含まれる全体のＤＮＡを意味する。本発明の目的において、「外来遺伝子」とは、七面鳥ヘルペスウイルスのゲノムＤＮＡに関して外因性である遺伝子を意味する。本発明の目的において、「外来遺伝子」には、ポリペプチドをコードする領域に対応するＤＮＡ配列だけでなく、該ＤＮＡ配列の上流に位置した「プロモータ」も含まれる。本発明の目的において、「プロモータ」とは、外来ＲＮＡポリメラーゼが結合し、また外来ＲＮＡの転写が開始されるＤＮＡ分子上の特異的なＤＮＡ配列である。本発明は更に、組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、ＨＶＴゲノムＤＮＡのＵＳ２遺伝子コーディング領域における独自のＳｔｕＩ部位に挿入されており、七面鳥ヘルペスウイルスに感染したホスト細胞内で発現され得る前記外来遺伝子が、ポリペプチドをコードするような組換えヘルペスウイルスを提供する。本発明の一実施例において、このポリペプチドはE.coliβガラクトシダーゼである。好ましくは、この組換え七面鳥ヘルペスウイルスはＳ−ＨＶＴ−０１２と称されるものである。このＳ−ＨＶＴ−０１２ヘルペスウイルスは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規定に従って、1992年10 月15日に、ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2382の下に、アメリカ合衆国メリーランド州20 852ロックウィル・12301パークローンドライブに所在するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションの特許カルチャー寄託部に寄託された。本発明の別の実施例において、前記ポリペプチドは、組換え七面鳥ヘルペスウイルスが導入される動物内で抗原性を有する。このような抗原性ポリペプチドをコードする遺伝子は、マレック病ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、感染性喉頭気管炎ウイルス、感染性気管支炎ウイルス、又は感染性滑液嚢包病ウイルス（infectious bursal disease virus）から誘導することができる。本発明は更に、ゲノムＤＮＡ中にマレック病ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードする外来遺伝子が含まれている組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、前記外来遺伝子は、ＨＶＴゲノムＤＮＡのＵＳ２遺伝子コーディング領域における独自のＳｔｕＩ部位に挿入されており、また七面鳥ヘルペスウイルスに感染したホスト細胞内でポリペプチドをコードする前記外来遺伝子が発現され得るような、組換えヘルペスウイルスを提供する。好ましくは、この抗原性ポリペプチドはマレック病ウイルス糖タンパクｇＢ，ｇＡまたはｇＤである。上記発明の一実施例において、前記ＨＶＴゲノムＤＮＡのＵＳ２遺伝子コーディング領域における独自のＳｔｕＩ部位に挿入されたマレック病ウイルス遺伝子は、糖タンパクｇＢをコードする。好ましくは、この組換え七面鳥ヘルペスウイルスはＳ−ＨＶＴ−０４５と命名されたものである。このＳ−ＨＶＴ−０４５ヘルペスウイルスは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規定に従って、1992年10月15日に、ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2383の下に、アメリカ合衆国メリーランド州20852ロックウィル・12301パークローンドライブに所在するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションの特許カルチャー寄託部に寄託された。マレックウイルス抗原をコードする二以上の遺伝子を、七面鳥ヘルペスウイルスのゲノムＤＮＡ中に挿入することができる。例えば、マレック病ウイルス糖タンパクｇＢをコードする遺伝子と、マレック病ウイルス糖タンパクｇＡをコードする遺伝子との両者を、ＨＶＴゲノム中に挿入することができる。このような場合、本発明の目的のために、これれら遺伝子を何れもＵＳ２遺伝子コード領域における独自のＳｔｕＩ部位内に挿入することは必要とされない。本発明で必要とされるのは、これら遺伝子の一つが当該部位に挿入されることである。他の一つは、Ｂａｍ＃１６領域またはＥｃｏＲＩ＃９領域のような、ＨＶＴの別の非必須領域内に挿入することができる。しかし、本発明の好ましい実施例は、マレック病ウイルス糖タンパクｇＡ遺伝子およびマレック病ウイルス糖タンパクｇＢ遺伝子の両者が、ＵＳ２遺伝子コーディング領域における独自のＳｔｕＩ部位内に挿入されている組換え七面鳥ヘルペスウイルスである。好ましくは、この組換え七面鳥ヘルペスウイルスは、Ｓ−ＨＶＴ−０４６またはＳ−ＨＶＴ−０４７と命名されたものである。更に、上記発明の一実施例は、抗原性ポリペプチドをコードする三つの全てのマレック病ウイルス遺伝子、即ち、マレック病ウイルスの糖タンパクｇＡ遺伝子、糖タンパクｇＢ遺伝子および糖タンパクｇＤ遺伝子を含む組換え七面鳥ヘルぺスウイルスを提供する。本発明の目的のためには、これら三つの遺伝子全てが、ＵＳ２遺伝子コーディング領域における独自のＳｔｕＩ部位内に挿入されなければならない訳ではない。これら遺伝子の一つが、当該部位に挿入されれば充分である。しかしながら、本発明の好ましい実施例では、マレック病ウイルス抗原をコードする三つの遺伝子の全てが、ＵＳ２遺伝子コーディング領域における独自のＳｔｕＩ部位内に挿入されている。好ましくは、この組換え七面鳥ヘルペスウイルスは、Ｓ−ＨＶＴ−０６２と命名されたものである。本発明は更に、ゲノムＤＮＡがニューキャッスル病ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードする外来遺伝子を含んでいる組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、前記外来遺伝子はＨＶＴゲノムＤＮＡのＵＳ２遺伝子コーディング領域における独自のＳｔｕＩ部位内に挿入されており、また七面鳥ヘルペスウイルスに感染したホスト細胞内で発現され得る組換え七面鳥ヘルペスウイルスを提供する。好ましくは、このニューキャッスル病ウイルス遺伝子は、ニューキャッスル病ウイルス融合タンパク、またはニューキャッスル病ウイルス・ヘマグルチニンーノイラミニダーゼをコードする。上記発明の組換え七面鳥ヘルペスウイルスは、マレック病ウイルス糖タンパクｇＡ，ｇＢまたはｇＤのようなマレック病ウイルス抗原ポリペプチドをコードする遺伝子をも含むように、更に加工され得る。本発明の目的のためには、これら抗原をコードする遺伝子の一つ（マレック病ウイルス由来またはニューキャッスル病ウイルス由来の何れであってもよい）がＨＶＴゲノムＤＮＡのＵＳ２遺伝子コーディング領域における独自のＳｔｕＩ部位内に挿入されている限り、他の抗原性遺伝子もまた当該部位に挿入されることは必要とされない。マレック病ウイルスまたはニューキャッスル病ウイルスに由来する他の抗原性遺伝子は、Ｂａｍ＃１６領域またはＥｃｏＲＩ＃９領域のような、ＨＶＴゲノムＤＮＡの別の非必須領域内に挿入されれば充分である。上記発明の一実施例において、組換え七面鳥ヘルペスウイルスは、ＨＶＴゲノムＤＮＡのＵＳ２遺伝子コーディング領域における独自のＳｔｕＩ部位内に挿入された三つの外来遺伝子を含んでいる。即ち、ニューキャッスル病ウイルス融合タンパクをコードする遺伝子、マレック病ウイルス糖タンパクｇＢをコードする遺伝子、およびマレック病ウイルス糖タンパクｇＡをコードする遺伝子である。好ましくは、この組換え七面鳥ヘルペスウイルスはＳ−ＨＶＴ−０４８と命名されたものである。上記発明の他の実施例において、組換え七面鳥ウイルスは、次のマレック病ウイルス遺伝子およびニューキャッスル病ウイルス遺伝子（その全てがＨＶＴゲノムＤＮＡのＵＳ２遺伝子コーディング領域における独自のＳｔｕＩ部位内に挿入されている）を含んでいる。即ち、ニューキャッスル病ウイルス融合タンパクをコードする遺伝子、ニューキャッスル病ヘマグルチニンーノイラミニダーゼをコードする遺伝子、マレック病ウイルス糖タンパクｇＢをコードする遺伝子、およびマレック病ウイルス糖タンパクｇＡをコードする遺伝子である。好ましくは、この組換え七面鳥ヘルペスウイルスは、Ｓ−ＨＶＴ−０５０と命名されたものである。上記発明の更に別の実施例において、組換え七面鳥ウイルスは、マレック病ウイルスおよびニューキャッスル病ウイルスに由来する次の五つの遺伝子（その全てがＨＶＴゲノムＤＮＡのＵＳ２遺伝子コーディング領域における独自のＳｔｕＩ部位内に挿入されている）を含んでいる。即ち、ニューキャッスル病ウイルス融合タンパクをコードする遺伝子、ニューキャッスル病ヘマグルチニンーノイラミニダーゼをコードする遺伝子、マレック病ウイルス糖タンパクｇＢをコードする遺伝子、マレック病ウイルス糖タンパクｇＡをコードする遺伝子およびマレック病ウイルス糖タンパクｇＤをコードする遺伝子である。好ましくは、この組換え七面鳥ヘルペスウイルスは、Ｓ−ＨＶＴ−１０６と命名されたものである。本発明は更に、ゲノムＤＮＡが感染性喉頭気管炎ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードする外来遺伝子を含んでいる組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、前記外来遺伝子はＨＶＴゲノムＤＮＡ（７）ＵＳ２遺伝子コーディング領域における独自のＳｔｕＩ部位内に挿入されており、また七面鳥ヘルペスウイルスに感染したホスト細胞内で発現され得る組換え七面鳥ヘルペスウイルスを提供する。好ましくは、この感染性喉頭気管炎ウイルス遺伝子は、感染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパクｇＢ、または感染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパクｇＤをコードする。上記発明の一実施例において、組換え七面鳥ヘルペスウイルスは、ＨＶＴゲノムＤＮＡのＵＳ２遺伝子コーディング領域における独自のＳｔｕＩ部位内に挿入された、感染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパクｇＢ遺伝子を含んでいる。好ましくは、この組換え七面鳥ヘルペスウイルスは，Ｓ−ＨＶＴ−０５１と命名されたものである。上記発明の他の実施例において、組換え七面鳥ウイルスは、ＨＶＴゲノムＤＮＡのＵＳ２遺伝子コーディング領域における独自のＳｔｕＩ部位内に挿入された、感染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパクｇＤ遺伝子を含んでいる。好ましくは、この組換え七面鳥ヘルペスウイルスは、Ｓ−ＨＶＴ−０５２と命名されたものである。上記発明の組換え七面鳥ヘルペスウイルスは、感染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパクｇＢもしくは感染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパクｇＤまたはその両者をコードする遺伝子に加えて、マレック病ウイルス糖タンパクｇＡ，ｇＢまたはｇＤのようなマレック病ウイルス抗原ポリペプチドをコードする一以上の遺伝子をも含むように、更に加工され得る。本発明の目的のためには、これら抗原をコードする遺伝子の一つ（マレック病ウイルス由来または感染性喉頭気管炎ウイルス由来の何れであってもよい）がＨＶＴゲノムＤＮＡのＵＳ２遺伝子コーディング領域における独自のＳｔｕＩ部位内に挿入されている限り、他の抗原性遺伝子もまた当該部位に挿入されることは必要とされない。マレック病ウイルスまたは感染性喉頭気管炎ウイルスに由来する他の抗原性遺伝子は、Ｂａｍ＃１６領域またはＥｃｏＲＩ＃９領域のような、ＨＶＴゲノムＤＮＡの別の非必須領域内に挿入されていれば充分である。本発明は更に、ゲノムＤＮＡが感染性気管支炎ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードする一以上の外来遺伝子を含んでいる組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、前記外来遺伝子はＨＶＴゲノムＤＮＡのＵＳ２遺伝子コーディング領域における独自のＳｔｕＩ部位内に挿入されており、また七面鳥ヘルペスウイルスに感染したホスト細胞内で発現され得る組換え七面鳥ヘルペスウイルスを提供する。好ましくは、この感染性気管支炎ウイルス遺伝子は、感染性気管支炎ウイルスのスパイクタンパク、または感染性気管支炎ウイルスのマトリックスタンパクをコードする。上記発明の組換え七面鳥ヘルペスウイルスは、感染性気管支炎ウイルスのスパイクタンパク若しくは感染性気管支炎ウイルスの糖タンパクマトリックスタンパク又はその両者をコードする遺伝子に加えて、マレック病ウイルス糖タンパクｇＡ，ｇＢまたはｇＤのようなマレック病ウイルス抗原ポリペプチドをコードする一以上の遺伝子をも含むように、更に加工され得る。本発明の目的のためには、これら抗原をコードする遺伝子の一つ（マレック病ウイルス由来または感染性気管支炎ウイルス由来の何れであってもよい）がＨＶＴゲノムＤＮＡのＵＳ２遺伝子コーディング領域における独自のＳｔｕＩ部位内に挿入されている限り、他の抗原性遺伝子もまた当該部位に挿入れることは必要とされない。マレック病ウイルスまたは感染性気管支炎ウイルスに由来する他の抗原性遺伝子は、Ｂａｍ＃１６領域またはＥｃｏＲＩ＃９領域のような、ＨＶＴゲノムＤＮＡの別の非必須領域内に挿入されていれば充分である。上記発明の一実施例において、組換え七面鳥ヘルペスウイルスは、ＨＶＴゲノムＤＮＡのＵＳ２遺伝子コーディング領域における独自のＳｔｕＩ部位内に挿入された、次の五つの外来遺伝子を含んでいる。即ち、感染性気管支炎マトリックスタンパクをコードする遺伝子、感染性気管支炎スパイクタンパクをコードする遺伝子、マレック病ウイルス糖タンパクｇＡをコードする遺伝子、マレック病ウイルス糖タンパクｇＢをコードする遺伝子およびマレック病ウイルス糖タンパクｇＤをコードする遺伝子である。好ましくは、この組換え七面鳥ヘルペスウイルスは，Ｓ−ＨＶＴ−０６６と命名されたものである。本発明は更に、ゲノムＤＮＡが感染性滑液嚢包病ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコードする一以上の外来遺伝子を含んでいる組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、前記外来遺伝子はＨＶＴゲノムＤＮＡのＵＳ２遺伝子コーディング領域における独自のＳｔｕＩ部位内に挿入されており、また七面鳥ヘルペスウイルスに感染したホスト細胞内で発現され得る組換え七面鳥ヘルペスウイルスを提供する。好ましくは、この感染性滑液嚢包病ウイルス遺伝子は、感染性滑液嚢包病ウイルスのＶＰ２タンパクをコードする。好ましくは、この組換え七面鳥ヘルペスウイルスは、Ｓ−ＨＶＴ−０９６と命名されたものである。上記発明の組換え七面鳥ヘルペスウイルスは、感染性滑液嚢包病ウイルスのＶＰ２タンパクをコードする遺伝子に加えて、マレック病ウイルス糖タンパクｇＡ，ｇＢまたはｇＤのようなマレック病ウイルス抗原ポリペプチドをコードする一以上の遺伝子をも含むように、更に加工され得る。本発明の目的のためには、これら抗原をコードする遺伝子の一つ（マレック病ウイルス由来または感染性滑液嚢包病ウイルス由来の何れであってもよい）がＨＶＴゲノムＤＮＡのＵＳ２遺伝子コーディング領域における独自のＳｔｕＩ部位内に挿入されている限り、他の抗原性遺伝子もまた当該部位に挿入されることは必要とされない。マレック病ウイルスまたは感染性滑液嚢包病ウイルスに由来する他の抗原性遺伝子は、Ｂａｍ＃１６領域またはＥｃｏＲＩ＃９領域のような、ＨＶＴゲノムＤＮＡの別の非必須領域内に挿入されていれば充分である。挿入された外来遺伝子には、その発現を制御するプロンモータ配列が含まれる。好ましくは、該プロモータはヘルペスウイルスプロモータである。好ましくは、該プロモータはＰＲＶ・ｇＸ、ＨＳＶ−１アルファ４、直前のＨＣＭＶ（imme diate early）、ＭＤＶ・ｇＢ，ＭＤＶ・ｇＤ、ＩＬＴ・ｇＢおよびＩＬＴ・ｇＤから選択される。本発明は、七面鳥ヘルペスウイルスのゲノムＤＮＡ中に外来ＤＮＡを挿入することによって組換え七面鳥ヘルペスウイルスを製造するための、相同性ベクターを提供する。この相同性ベクターは、七面鳥ヘルペスウイルスのゲノムＤＮＡには通常存在しない二本鎖の外来ＤＮＡ分子から実質的になる二本鎖ＤＮＡを具備し、前記外来ＤＮＡの一端では、ゲノムＤＮＡに対して相同的な二本鎖の七面鳥ヘルペスウイルスＤＮＡが、七面鳥ヘルペスウイルスのＵＳ２遺伝子コーディング領域の独自のＳｔｕＩ部位の一方側に位置しており、前記外来遺伝子の他端では、ゲノムＤＮＡに対して相同的な二本鎖の七面鳥ヘルペスウイルスＤＮＡが、前記ゲノムＤＮＡの同じ部位の他方側に位置している。本発明の一実施例において、前記外来ＤＮＡはポリペプチドをコードする。本発明の一実施例において、該ポリペプチドは、前記組換え七面鳥ヘルペスウイルスが導入される動物内において抗原性である。好ましくは、前記抗原性ポリペプチドは感染性滑液嚢包病ウイルス、マレック病ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、感染性喉頭気管炎ウイルスまたは感染性気管支炎ウイルスに由来する。好ましくは、この抗原性ポリペプチドは、感染性滑液嚢包病ウイルスＶＰ２タンパク、感染性滑液嚢包病ウイルスＶＰ３タンパク、感染性滑液嚢包病ウイルスＶＰ４タンパク、マレック病ウイルス糖タンパクｇＢ、マレック病ウイルス糖タンパクｇＡ、マレック病ウイルス糖タンパクｇＤ、ニューキャッスル病ウイルス融合（Ｆ）タンパク、ニューキャッスル病ウイルスのヘマグルチニンーノイラミニダーゼ（ＨＮ）タンパク、感染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパクｇＢ、感染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパクｇＤ、感染性気管支炎ウイルスのスパイクタンパク、および感染性気管支炎ウイルスのマトリックスタンパクからなる群から選択される。本発明の一実施例において、前記ポリペプチドは検出マーカーである。好ましくは、検出マーカーの前記ポリペプチドは大腸菌のβガラクトシダーゼである。本発明の目的において、「相同性ベクター」とは、七面鳥ヘルペスウイルスゲノムの特定の部位に外来ＤＮＡを挿入するように構築されたプラスミドである。本発明の一実施例において、前記二本鎖の七面鳥ヘルペスウイルスＤＮＡは、七面鳥ヘルペスウイルスゲノムのＵＳ２遺伝子コーディング領域内に存在するＤＮＡ配列に対して相同的である。好ましくは、この相同性ベクターは435-47.1と命名されたものである。本発明は更に、有効免疫量の本発明の組換え七面鳥ヘルぺスウイルスと、適切なキャリアとを含有するワクチンを提供する。七面鳥ヘルペスウイルスのための適切なキャリアは当該技術分野において周知であり、タンパク、糖等が含まれる。このような適切なキャリアの一例は、安定化された加水分解タンパク、乳糖等のような一以上の安定下剤を含有する生理学的にバランスされた培地である。本発明の目的において、本発明の組換えヘルペスウイルスの「有効免疫量」は、１０^２〜１０^９ＰＦＵ／１回投与量の範囲内である。本発明はまた、家禽を免疫化する方法を提供する。本発明の目的において、これには感染性滑液嚢包病ウイルス、マレック病ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、感染性喉頭気管炎ウイルス、または感染性気管支炎ウイルスに対して家禽を免疫化することが含まれる。この方法は、家禽に対して、有効免疫投与量の本発明のワクチンを投与することを具備する。ワクチンは、当業者に周知の何れかの方法、例えば筋肉内注射、皮下注射、複腔内注射または静脈内注射によって投与され得る。或いは、鼻腔内投与または経口投与によってワクチンを投与してもよい。本発明はまた、組換え七面鳥ヘルペスウイルスに感染したホスト細胞を提供する。好ましくは、このホスト細胞は鳥類細胞である。本発明の目的において、「ホスト細胞」とは、ベクターの増殖およびその挿入のために用いられる細胞である。細胞を感染させることは、当照射に周知の方法、例えば、材料および方法の章における「組換えヘルペスウイルスを生じさせるためのＤＮＡトランスフェクション」の項に記載した方法によって達成される。本発明の組換え七面鳥ヘルペスウイルスは、本発明のワクチンを接種された動物を、天然に存在する野生型の感染性滑液嚢包病ウイルス、マレック病ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、感染性喉頭気管炎ウイルス、または感染性気管支炎ウイルスに感染した動物から区別する方法を提供する。これが可能なのは、組換え七面鳥ヘルペスウイルスが、対応する病原に対する保護免疫を付与するために必要な、上記ウイルスに由来する限られた数の抗原をコードする外来遺伝子を含んでいるからである。結局のところ、組換え七面鳥ヘルペスウイルスでワクチン接種されたホスト動物は、野生型ウイルスには正常に存在する抗原が欠如していることによって、野生型の感染性滑液嚢包病ウイルス、マレック病ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、感染性喉頭気管炎ウイルス、または感染性気管支炎ウイルスに感染した動物から区別することができる。組換え七面鳥ヘルペスウイルスの構築法、選別法および精製法については、以下の材料および方法の章で詳細に説明する。＜材料および方法＞七面鳥ヘルペスウイルス貯蔵サンプルの調製：２mMのグルタミン、100単位／mlのペニシリン、100単位／mlのストレプトマイシン（これら成分はアービン・サイエンティフィックしゃまたは同様の供給業者から得たものであり、以下では完全ＤＭＥ培地と言う）および１％子ウシ血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中において、0.01 ＰＦＵ／細胞での多重感染で組織培養細胞を感染させることによって、七面鳥ヘルペスウイルス貯蔵サンプルが調製された。細胞変性効果が完結した後、培地および細胞を回収し、臨床用の遠心分離器内において3000 rpmで５分間、細胞をペレット化した。20％子ウシ血清および10％ＤＭＳＯを含む完全培地中に感染細胞を再懸濁し、-70℃で凍結して保存した。七面鳥ヘルペスウイルスＤＮＡの調製：七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）の全ての操作は、ＦＣ-126株（ＡＴＣＣ＃584-C）を用いて行った。感染細胞の細胞質からＨＶＴウイルスＤＮＡを調製するため、細胞を過増殖させる前に、広範な細胞変性効果を生じるのに充分なＭＯＩで、ニワトリ一次胚繊維芽細胞を感染させた。インキュベーションは全て、湿潤化したインキュベータ内において、５％ＣＯ_２を含む39℃の空気中で行った。最良のＤＮＡ収率は、最大限に感染され且つ不完全な細胞溶解（典型的には５〜７日）を示した単層を回収することによって得られた。感染細胞は、細胞スクレーパ（商品名コースター）を用いて細胞を培地中に削ぎ落とすことにより回収された。細胞懸濁液を、ＧＳ３ローター（ソルヴォール・インスツルメント社）内において、3000rpmで１０分間、５℃ で遠心した。ＰＢＳをデカントした後、４ml／ローラボトルのＲＳＢ緩衝液（１０mM Tris pH 7.5，1mM EDTA，および1.5 mM MgCl2）中に細胞ペレットを再懸濁した。ＮＰ４０（Nonidet P-40；シグマ社）を最終濃度が0.5％になるまでサンプルに添加し、時々撹拌しながら氷上で１５分間インキュベートした。このサンプルを冷却しながら3000rpmで１０分間遠心して核をペレット化し、細胞砕片を除去した。上清液を注意深く 15mlのコレックス遠心管に移した。ＥＤＴＡ（0. 5M，pH 8.0）およびＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム；ストック20％）を、最終濃度が夫々5mMおよび１％になるまでサンプルに添加した。サンプル４ml当たり1 00μｌのプロテナーゼＫ（proteinase-K；10mg/ml；ベーリンガー・マンハイム社）を添加し、混合し、４５℃で１〜２時間インキュベートした。このインキュベーション期間を経過した後、等容量の水飽和させたフェノールをサンプルに添加し、手で穏やかに混合した。このサンプルを臨床用の遠心器で５分間、3000rp mで回転させて層分離させた。その水層に対して、ＮａＡｃを最終濃度が0.3Mになるまで添加し（ストック溶液3M,pH 5.2）、また2.5容量の冷アブソリュートエタノールを添加した後、-70℃で３０分間、核酸を沈殿させた。サンプル中のＤＮＡは、５℃のＨＢ−４ロータ中において２０分間、8000rpmまで回転させることによってペレット化された。上清を注意深く除去し、ＤＮＡペレットを20mlの80%エタノールで洗浄した。このＤＮＡペレットを減圧下で簡単に乾燥し（２〜３分間）、ローラボトルの感染細胞当たり50 μｌのＴＥ緩衝液（10mM Tris pH7.5,1mM EDTA）中に再懸濁させた。ウイルスＤＮＡの収量は、典型的には5-10μｇ／ローラボトルの感染細胞の範囲である。全てのウイルスＤＮＡは約１０℃で貯蔵される。ポリメラーゼ充填反応： 50mM Trls pH7.4, 50mM KCl, 5mM MgCl2, 及び４種類のデオキシヌクレオチドを夫々400ミリモルを含有する緩衝液中にＤＮＡを再分散した。次いで、クレノウＤＮＡポリメラーゼ（ＢＲＬ社）を添加し、室温で１５分間反応させた。次いでＤＮＡをフェノール抽出し、上記のようにしてエタノール沈殿させた。ＤＮＡ配列決定：配列決定は、ＵＳＢシーケナーゼ・キットおよび³⁵Ｓ−ｄＡＴＰ（ＮＥＮ）を用いて行われた。圧縮領域(areas ofcompression)を明瞭にするために、ｄＧＴＰ混合物およびｄＩＴＰ混合物を用いた反応が行われた。或いは、圧縮領域はフォルムアミドゲル上で分離された。テンプレートは二本鎖プラスミド・サブクローン、または一本鎖Ｍ１３サブクローンであった。プライマー類は、配列決定されるべき挿入物の直ぐ外側のベクター、または予め得られた配列に対して作製された。得られた配列は組み立てられ、またドナスター・ソフトウエア(Dnastar software)を用いて比較された。得られた配列の操作および比較は、コーラル・ソフトウエア社(Coral Software)のスーパークローンおよびスーパーシー・ソフトウエア(Superclone and Supersee pro grams)を用いて行われた。分子生物学的技術：制限エンドヌクレアーゼでの消化、ゲル電気泳動、ゲルからのＤＮＡの切り出し、ライゲーション、キナーゼを用いたリン酸化、ホスファターゼでの処理、バクテリア培養物の増殖、ＤＮＡを用いたバクテリアの形質転換、および他の分子生物学的方法のような方法を含む、バクテリアおよびＤＮＡを扱うための技術は、マニアティス等（Maniatis et al.,1982）およびサンブルック等（Sambrook et al., 1989）によって説明されている。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、種々のＤＮＡ類の取扱いに便利な制限部位を導入するために用いられた。ここで用いられた方法は、インニス等（Inniset al, 1990）によって説明されている。一般の増幅されたフラグメントは大きさが500塩基対よりも小さく、また増幅されたフラグメントの重要な領域はＤＮＡ配列決定によって確認された。特に注記したものを除き、これら技術は軽微な変更を伴って用いられた。ＤＮＡのサザンブロッティング：サザンブロッティングの一般的手順は、マニアティス等（1982）から援用した。ＤＮＡは２０ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ＝0.15M NaCl, 0.015Mのクエン塩酸ナトリウム，pH 7.0）中のニトロセルロース・フィルター（Ｓ＆Ｓ・ＢＡ８５）にブロットされた後に、30％ホルムアミド、１ｘデンハート溶液(Denhardt's soluti on) [0.02％ポリビニルピロリドン(PVP), 0.02％ウシ血清アルブミン(BSA), 0.0 2％フィコール]、６ｘＳＳＣ、50mM NaH2PO4 pH 6.8、200μｇ／mlのサケ精子ＤＮＡからなるハイブリダイゼーション溶液中において、５５℃で４〜２４時間、予備ハイブリダイズされた。ベテスダ(Bethesda)・リサーチ・ラボラトリーズ（ＢＲＬ）から得たキット及び³²ｐラベルされた１種類のヌクレオチドを用いたニック翻訳(nick translation)によりラベルされた、標識プローブＤＮＡを添加した。このプローブＤＮＡを、ＮＡＣＳカラム（ＢＲＬ）またはセファデックスＧ 50カラム（ファルマシア社）によって、未取り込みヌクレオチドから分離した。５５℃で一晩ハイブリダイズした後、フィルターを室温において２ｘＳＳＣで１回洗浄し、続いて５５℃で３０分間、0.1ｘＳＳＣ、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で２回洗浄した。このフィルターを乾燥し、オートラジオグラフにかけた。ｃＤＮＡクローニング法：ｃＤＮＡクローニングとは、ＲＮＡ分子をＤＮＡ分子に転換するために用いられる方法をいう。出願人の方法は、（Gubler and＞に記載されている。＾Ｚ＾ＡｄＶＴウイルスは、ＨＶＴウイルスＤＮＡと、ヘルペスウイルスの適切なクローン化配列に隣接した所望の外来ＤＮＡを含むプラスミド相同性ベクターとの間の相同性組換えに依存する。トランスフェクションは、50％集密状態のニワトリ一次胚遷移が細胞（ＣＥＦ）の６cmプレート（コーニング・プラスチック社）内で行われた。この細胞は前日に、４μｇ／mlのポリブレン（polybrene ；ストックは１ｘＨＢＳＳ中の４mg／ml）を含むＣＥＦ増殖培地（１ｘＦ10/199 、５％子ウシ血清、２％グルタミン、１％非必須アミノ酸、および２％ペニシリン／ストレプトマイシン）に撒かれた。ＣＥＦ細胞へのコトランスフェクション (cotransfection)のために、５μｇのプラスミド相同性ベクターを５μｇの完全なＨＶＴ・ＤＮＡと混合し、３０μｇ／mlのポリブレン（ストックは１ｘＨＢＳＳ中の４mg／ml）を含む１mlのＣＥＦ培地中に懸濁させた。次いで、このＤＮＡ −ポリブレン懸濁液（１ｍｌ）をＣＥＦ細胞の６ｃｍプレートに添加し、培地を吸引し、３９℃で３０分問インキュベートした。この間、プレートを周期的に揺動させて接種物を再分布させた。その後、４mlのＣＥＦ増殖培地を直接添加してプレートを洗い、39℃で更に2.5時間インキュベートした。この時、各プレートから培地を除去し、室温で４分間、細胞を１ｘＨＢＳＳ中の２mlの30％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド；J.T.Baker Chemical Co.）で刺激した。30％ＤＭＳＯを注意深く除去し、室温において、単層を１ｘＨＢＳＳで１回洗浄した。次いで、５mlのＣＥＦ増殖培地を添加した後、この細胞を３９℃でインキュベートした。次の日に培地を交換し、痕跡量のＤＭＳＯを除去し、細胞増殖を刺激した。６日以内に、ウイルス由来の細胞変性効果が現れた。通常はこの日から１週間以内に、高力価のストック（80％〜90％ＣＰＥ）を発生させることができる。ＨＶＴストックサンプルは、この感染細胞を、20％子ウシ血清および10 ％ＤＭＳＯを含むＣＥＦ増殖培地中に再懸濁させることによって調製され、-70 ℃で保存された。サブゲノムＤＮＡフラグメントから組換えヘルペスウイルスを生じさせる方法：クローン化されたオーバーラッピングサブゲノムフラグメント(overlapping subgenomic fragments)のコトランスフェクションによってヘルペスウイルスを生じさせる能力は、シュードラビーウイルス(pseudorabies virus)について立証されている(Zijl et al.,1988)。コトランスフェクションに先立って、サブゲノムフラグメントに欠失および／または挿入が加工されるならば、この方法によって高頻度でゲノム変化を含むウイルスがもたらされ、組換えウイルスの精製に必要なスクリーニングの量を大幅に減少させることになる。我々は、この方法を用いて組換えＨＴＶを構築した。オーバーラッピングＨＶＴサブゲノムフラグメントを含むサブクローンのライブラリーは、次のようにして作製された。アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションからＨＶＴ・ＤＮＡを入手した（ＦＣ-126 (“Calnek”)）。これを切断し、van Zijl et al.,(1988)に記載されているようにしてグリセロール勾配上で大きさを選別し、挿入ポピュレーションとして40-50kbのフラグメントを選択した。プールされた画分をＴＥで２倍に稀釈し、1/10容量の３M ＮａＡｃおよび 2.5容量のエタノールを加え、ベックマンＳＷ41ロータ」内において 30K rpm で１時間、ＤＮＡを沈殿させた。まずＴ4 ＤＮＡポリメラーゼを用いて処理し（低ＤＮＴＰ濃度を用いて３´オーバーハング除去を促進する）、続いてクレノウポリメラーゼを用いて、凹んだ３´末端を充填することによって、切断されたフラグメントには平滑末端が与えられた。次いで、これら挿入フラグメントはｐＷＥ15コスミドベクター（ストラタジーン社）にライゲートされた。このコスミドベクターは、予めＢａｍＨＩで消化され、ウシ腸ホスファターゼで処理され、クレノウポリメラーゼで平滑末端にされたものである。ライゲートされた混合物は、次いで、ギガパック(Gigapack)ＸＬパッケージング抽出物（ストラタジーン社）を用いてパッケージ化された。ライゲーション及びパッケージ化は、製造業者の推奨に従って行われた。酵素ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄIIIおよびＸｈｏＩの刊行物に記載された制限マップは、サブクローン化されたフラグメントを、ゲノムに広がるサブクローン類についてコスミドライブラリーをスクリーニングするための特異的プローブとして使用することを可能にする。プローブ類は、サブクローン化された制限フラグメント類から作製された。次いで、フラグメント類は非放射能系（ジェニウス(Gen ius)、ベーリンガーマンハイム社）を用いてラベルされた。コロニーを培地に拾い、一晩増殖させることによって、スクリーニングは容易になる。５個のフィルター及びマスタプレートのセットが、マイクロタイター皿からスタンプされ、再び一晩増殖された。グリセロールを15％までウエルに添加し、プレートを-20℃ で凍結して各コロニーのストック培養物を得た。フィルターは、バイオラッド・コロニー・リフト・メンブラン(BioRad ColonyLift Membranes)であり、製造業者の指示書に従って処理およびハイブリダイズされ、0.1ｘＳＳＣおよび0.1％ＳＤＳ中において６５℃で洗浄された。非放射性プローブとハイブリダイズしたクローン類は、ジェニウス・キットの指示書に従って検出された。コロニーは、二以上の特異的プローブに対するそのハイブリダイゼーションに基づいて、更なる分析のために選別された。次いで、これらはＢａｍＨＩで消化され、刊行物に記載されたＨＶＴのマップ（Buckmaster et al.,1988）と比較された。この方法によって、三つのコスミド類（407-32.2C3、407-32.IG7および40 7-32.5G6）を得た。各クローンの詳細な説明については後述する。これらクローンからＤＮＡの合理的な収量を達成するためには、クロラムフェニコール増幅（ Maniatis el al., 1982）を必要とすることが分かった。加えて、一つのコスミドクローン（407-32.5G6）は不安定であり、充分なＤＮＡ標本を得るためには、元の凍結ストックから増殖させなければならない。ｐＷＥ１５ベクターは、ＮｏｔＩでの挿入物の切り出しを可能にする。しかし、ＨＶＴゲノムには四つのＮｏｔＩ部位が存在するので、これら部位に亘って広がる挿入物をＮｏｔＩで切り出すことはできない。二つのＮｏｔＩ部位がＨＶＴのＢａｍＨＩ＃２に存在し、このフラグメントはｐＳＰ64に直接クローン化された。他の二つの部位は、ＢａｍＨＩ＃１フラグメント内の独自の短領域内に存在する。このフラグメントはｐＷＥ15ベクター中に直接クローン化された。上記三つの切断されたコスミド及び二つのＢａｍＨＩフラグメントは、ＨＶＴゲノム末端の小部分を全てカバーしている。これら領域はゲノムの内部部分で繰り返されているため、遺伝子情報の全てを入手できる。ＨＶＴ・ＵＳＡ２遺伝子内のＳｔｕＩ部位は、「組換えヘルペスウイルスを作製するための相同的組換え法」（例６を参照のこと）を利用した外来ＤＮＡ挿入のための有用な部位であることが確立された。このＨＶＴ・ＵＳ２遺伝子は、５つのＳｔｕＩ部位を含むＢａｍＨＩ＃１フラグメント内に位している。この部位を外来ＤＮＡの挿入に使用することを容易にするために、ＵＳ２遺伝子内のＳｔｕＩ部位は独自のＨｉｎｄIII部位に変換された。これは、ＢａｍＨＩ＃１サブクローンをＳｔｕＩで部分的に消化し、次いで、ＨｉｎｄIIIリンカーを用いて、カナマイシン耐性（Ｎｅｏ^R）を付与する 10kbのフラグメントを当該部位に挿入することにより達成された。このカナマイシン耐性遺伝子は、組換え体クローンの陽性選別を可能にする。このＮｅｏ^Rフラグメントは、ＨｉｎｄIIIで消化することによって除去され、続いて再ライゲーションによってクローン403-84.215 を作製した。再構築実験のために、サブクローンをＨＶＴ挿入物の外側または隣接位置で切断する酵素出制限消化することによって、ＤＮＡが調製された。幾つかの場合において、一つのコスミドが消化されないで再構成に用いられた。消化されたＤＮＡ類はフェノールで１回抽出され、エタノールで沈殿された。ＤＮＡは0.5〜１μｇ／mlの濃度で再懸濁された。ウイルスの再構築実験は、トランスフェクションを媒介するためにリポフェクチン（ＢＲＬ）を用いて行われた。２〜３μｇの夫々のサブクローンを、１％の非必須アミノ酸及び２％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充した0.5mlのＭＥＭ培地（Earle's salts）（ＭＥＭ⁺）に添加した。対照群は、ＤＮＡを含まないＭＥＭ⁺、数μｇのＨＶＴ・ＤＮＡを含むＭＥＭ⁺または、５つのサブクローンの内の４つを含むＭＥＭ⁺からなっていた。これとは別に、別のＭＥＭ⁺ 0.5mlに対して30μｌのリポフェクチンを添加した。次いで、これら二つの混合物を合体して、室温で１５分間インキュベートした。トランスフェクションのために、ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）は次のようにして調製された。６ウエル皿を用い、１％の非必須アミノ酸、２％のペニシリン／ストレプトマイシンおよび５％の子ウシ血清を含むＦ10／Ｍ199(1:1)培地中において、ＣＥＦ類（スパファス(Spafas)社）を３９℃で増殖させた（ＣＥＦ⁺ ）。細胞は、90〜95％の集密度においてトランスフェクトされた。トランスフェクションのために、ウエルを吸引し、ＭＥＭ⁺で３回濯ぎ、次いで１mlの上記フリポフェクチン／ＤＮＡ混合物と共に３９℃で４時間インキュベートした。次いで、１ml以上のＣＥＦ⁺をウエルに添加し、細胞を一晩インキュベートし、ＣＥＦ⁺を供給した。その後、プラークの出現についてプレートを毎日試験した。対照ＨＶＴ・ＤＮＡとリポフェクチンとの組み合わせでは、５日以内にプラークの出現がもたらされた。５つのサブクローンのうちの４つのみを用いたときには、プラークは得られなかった。ＨＶＴの５つのオーバーラッピングゲノムフラグメントを用いてウイルスを再構築したときには、最初のリポフェクチン後の５〜１９日の何れにおいてもプラークが出現した。プラークの出現が遅い場合は、最初は感染された単層上にプラークは見られず、単層を継代して大きな表面に再プレートした後にのみプラークが出現した。継代の後、プラークは一般に３日以内に出現した。組換えウイルスは略３回プラーク精製され、次いで外来ＤＮＡ類の挿入について分析された。組換えヘルペスウイルスのブルオガル・スクリーニング：外来遺伝子がβガラクトシダーゼ酵素をコードしたときは、この外遺伝子を含むプラークはもっと容易に可視化された。化学物質のブルオガル^TM(Bluogal; べテスダ・リサーチ・ラボラトリーズ社）を、200〜300μｇ／mlのレベルでアガロース上層中に含ませると、活性βガラクトシダーゼを発現するプラークは青色に変わった。青色のプラークを取り出し、再度の青色プラーク単離によって精製した。他の外来遺伝子は、これら外来遺伝子がβガラクトシダーゼ遺伝子を置換するような相同性組換えによって挿入された。この場合は、組換えウイルスの精製のために、青色でないプラークが取り出される。黒色プラーク試験を用いた、組換えＨＶＴにおける外来遺伝子発現のスクリーニング：組換えＨＶＴウイルスにより発現された外来抗原の発現を分析するために、単層のＣＥＦ細胞を組換えＨＶＴウイルスに感染させ、栄養アガロース培地を上層し、３９℃で４〜５日間インキュベートする。プラークが発生したら、アガロース上層を皿から除去し、単層をＰＢＳで１回洗浄し、100％エタノールを用いて室温で１０分間固定し、細胞を乾燥させる。プレートをＰＢＳで再度水和した後、一次抗原をＰＢＳで適切な稀釈度にまで稀釈し、細胞単層と共に室温で２時間から一晩インキュベートする。次いで、ＰＢＳを用いて室温で３回洗浄することにより、未結合抗体を細胞から除去する。アルカリホスファターゼを結合させた二次抗体をＰＢＳで稀釈し、細胞と共に室温で２時間インキュベートする。次いで、室温において細胞をＰＢＳで３回洗浄することにより、未結合の二次抗体を除去する。次いで、単層を発色用緩衝液（100 mM Tris pH 9.5／ 100 mM NaCl ／ 5 mM MgCl2）中でリンスし、室温において１０分から一晩、新鮮な基質溶液（発色用緩衝液中の0.3 mg/mlのニトロブルーテトラゾリウム＋ 0.15 mg/mlの５ −ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファターゼ）と共にインキュベートする。最後に、基質溶液をＴＥ（10 mM Tris,pH7.5 ／ 1 mM EDTA）で置換することによって反応を停止する。正しい抗原を発現しているプラークは黒色に染色される。組換えＨＶＴストックの純度を試験するためのプラークハイブリダイゼーション法：組換えＨＶＴウイルス中の特定の抗原の存在を検出する適切な免疫学的試薬が存在しないときは、ストックの純度を試験するために、プラークハイブリダイゼーションを用いることができる。最初に、ＣＥＦ細胞の単層を、50〜100プラーク／10 cm皿を与える種々の稀釈度のウイルス・ストックで感染させ、栄養アガロース培地を上層し、３９℃で４〜５日間インキュベーソする。プラークの形成が生じたら、各プラークの位置を皿の底にマークする。次いで、アガロース上層を除去し、プレートをＰＢＳで洗浄し、残りのＣＥＦ単層を予めＰＢＳで湿潤化したＮＣ膜またはバイオラッド社のナイロン膜上に移す（皿に対する膜の位置をマークする）。次いで、膜を1.5 mlの1.5 M NaClおよび0.5 M NaOH中に５分間置くことによって、ＮＣ膜上の細胞を溶解させる。この膜を、 1.5 mlの３Ｍ酢酸ナトリウム（pH 5.2）中に５分間置くことによって中和する。次いで、８０℃で１時間ベーキングすることにより、溶解細胞に由来するＤＮＡをＮＣ膜に結合させる。その後、６ｘＳＳＣ、３％スキンミルク、0.5％ＳＤＳおよび（±）サケ精子ＤＮＡ（50μｇ／ml）を含む溶液中において、６５℃で１時間、膜の予備ハイブリダイゼーションを行う。次いで、放射性ラベルされたプローブＤＮＡ（アルファ³²Ｐ−ｄＣＴＰ）を添加し、膜を６５℃で一晩（１２時間）インキュベートする。ハイブリダイゼーションの後、６５℃においてＮＣ膜を２ｘＳＳＣで２回（夫々３０分間）洗浄し、続いて、６５℃において0.5ｘＳＳＣで更に２回洗浄する。次いでこのＮＣ膜を乾燥し、-70 ℃で12時間、Ｘ線フィルム（コダック社X-OMAT, AR ）に対して露光させる。陽性シグナルを皿上のプラーク位置に重ね、全体に対する陽性プラークのパーセントとしてストックの純度が記録される。ＨＶＴ・ＵＳ２遺伝子中にβガラクトシダーゼ遺伝子を挿入するための相同性ベクターの構築： β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子は、ＨＶＴ・ＥｃｏＲＩ＃７フラブメントの独自のＳｔｕＩ部位に挿入された。このマーカー遺伝子は、ＵＳ２遺伝子と同じ向きに配向される。このマーカー遺伝子の詳細は図７に与えられている。これは、標準的な組換えＤＮＡ技術（Maniatis el al,1982および Sambrook et al, 1989 ）を用い、以下の供給源からの制限フラグメントを、図７に示した合成ＤＮＡ配列と連結することによって構築される。フラグメント１は略 413 塩基対であり、ＰＲＶ・ＢａｍＨＩ制限フラグメント１０（Lomniczi et al.,19 84）のＳａｌＩ〜ＢａｍＨＩ制限サブフラグメントである。また、フラグメント２は、略3010塩基対であり、プラスミドｐＪＦ751 （Ferrari el al.,1985）のＢａｍＨＩ〜ＰｖｕII制限フラグメントである。更に、フラグメント３は略 754 塩基対であり、ＰＲＶ・ＢａｍＨＩ制限フラグメント＃７（Lomniczi et al.,19 84）のＮｄｅＩ〜ＳａｌＩ制限サブフラグメントである。サブゲノムクローン 172-07.BA2 ：プラスミド 172-07.BA2は、組換えＨＶＴを作製する目的で構築された。これは、ゲノムＨＶＴ・ＤＮＡの略25,000塩基対の領域を含んでいる。これは、組換えＨＶＴを構築するために、「オーバーラッピングサブゲノムフラグメントから組換えヘルペスウイルスを作製するための方法」に従って、他のサブゲノムクローン類と組み合わせて用いられ得る。このプラスミドは、標準的な組換えＤＮＡ技術（Maniatis e tal, 1982および Sambrook et al, 1989 ）を用い、以下の供給源からの二つの制限フラグメントを連結することによって構築され得る。第一のフラグメントは略2999塩基対であり、ｐＳＰ６４（プロメガ社）のＢａｍＨＩ〜ＢａｍＨＩ制限フラグメントである。第二のフラグメントは略25,000塩基対であり、ＨＶＴ（Bu ckmaster et al.,1988）のＢａｍＨＩ＃２フラグメントである。相同性ベクター 172-29.31 ：プラスミド172-29.31は、ＨＶＴ中に外来ＤＮＡを挿入する目的で構築された。これは、外来遺伝子が挿入される独自のＸｈｏＩ制限酵素部位を含んでいる。ＸｈｏＩ部位に外来ＤＮＡ挿入物を含むプラスミドを、「組換えヘルペスウイルスを作製するためのＤＮＡコトランスフェクション」または「オーバーラッピングサブゲノムフラグメントから組換えヘルペスウイルスを作製するための方法」に従って用いれば、外来ＤＮＡを含むウイルスが得られるであろう。このプラスミドは、標準的な組換えＤＮＡ技術（Maniatis et al, 1982および Sambrook et al, 1989）を用い、以下の供給源からの二つの制限フラグメントを連結することにより構築され得る。第一のフラグメントは略2999塩基対であり、ｐＳＰ６４（プロメガ社）のＢａｍＨＩ〜ＢａｍＨＩ制限フラグメントである。第二のフラグメントは、略3300塩基対であり、ＨＶＴ（Buckmaster et al.,1988）のＢａｍＨＩ＃１６フラグメントである。ＢａｍＨＩ＃１６フラグメントの完全な配列は、配列ＩＤ番号３に与えられている。なお、該フラグメントは、ＵＬ４３・ＯＲＦがｐＳＰ６４・βラクタマーゼ遺伝子に対して反対の転写向きになるようにクローン化される。相同性ベクター 172-63.l ：プラスミド 172-63.1 は、ＨＶＴ中に外来ＤＮＡを挿入する目的で構築された。これは、外来遺伝子が挿入される独自のＸｈｏＩ制限酵素部位を含んでいる。ＸｈｏＩ部位に外来ＤＮＡ挿入物を含むプラスミドを、「組換えヘルペスウイルスを作製するためのＤＮＡコトランスフェクション」または「オーバーラッピングサブゲノムフラグメントから組換えヘルペスウイルスを作製するための方法」に従って用いれば、外来ＤＮＡを含むウイルスが得られるであろう。このプラスミドは、標準的な組換えＤＮＡ技術（Maniatis et al, 1982および Sambrook et al, 1989）を利用して、以下の供給源から得られる二つの制限フラグメントを連結することによって構築され得る。第一のフラグメントは略2999塩基対であり、ｐＳＰ６４（プロメガ社）のＥｃｏＲＩ〜ＥｃｏＲＩ制限フラグメントである。第二のフラグメントは略5500塩基対であり、ＨＶＴのＥｃｏＲＩ＃９フラグメントである。なお、このＥｃｏＲＩフラグメントは、独自のＸｈｏＩ部位がｐＳＰ６４ベクター中の独自のＨｉｎｄIIIに最も近接するようにクローン化される。相同性ベクター 255-18.B16 ：プラスミド 255-18.B16は、ＨＶＴ中にＮＤＶ・ＨＮ遺伝子およびＦ遺伝子を挿入する目的で構築された。ＮＤＶ・ＨＮ遺伝子およびＦ遺伝子は、ＳａｌＩフラグメントとして、相同性ベクター 172-29.31のＸｈｏＩ部位に挿入された。ＮＤＶ・ＨＮ遺伝子およびＦ遺伝子は、親相同性ベクターにおけるＵＬ４３・ＯＲＦと同様の転写向きで挿入された。このＳａｌＩフラグメントの詳細な説明は図１２に示されている。挿入されたＳａｌＩフラグメントは、標準的な組換えＤＮＡ技術（Maniatis et al, 1982およびSambrook et al, 1989）を利用して、以下の供給源から得られる制限フラグメントを図１２に示した合成ＤＮＡ配列と連結することによって構築され得る。フラグメント１は略416 塩基対であり、ＰＲＶ・ＢａｍＨＩ制限フラグメント１０（Lomniczi et al.,1984）のＳａｌＩ〜ＢａｍＨＩ制限サブフラグメントである。また、フラグメント２は、略3009塩基対であり、プラスミドｐＪＦ751 （Ferrari et al.,1985）のＢａｍＨＩ〜ＰｖｕI Iフラグメントである。更に、フラグメント３は略1200塩基対であり、完全長ＮＤＶ・ＨＮ・ｃＤＮＡのＡｖａII〜ＥｃｏＲＩ制限フラグメントである。フラグメント４は略179塩基対であり、ｐＳＰ６４（プロメガ社）のＥｃｏＲＩ〜ＰｖｕII制限フラグメントである。フラグメント５は略357塩基対であり、ＨＳＶ-1 ・ＢａｍＨＩ制限フラグメントＮのＳｍａＩ〜ＢａｍＨＩ制限サブフラグメントである。フラグメント６は略1812塩基対であり、完全長ＮＤＶ・Ｆ・ｃＤＮＡのＢａｍＨＩ〜ＰｓｔＩ制限フラグメントである。フラグメント７は略235 塩基対であり、プラスミドｐＢＲ322のＰｓｒＩ〜ＳｃａＩ制限フラグメントである。サブゲノムクローン 378-50.BAI ：コスミド 378-50.BAI は、組換えＨＶＴを作製する目的で構築された。これは、ゲノムＨＶＴ・ＤＮＡの略29,500塩基対の領域を含んでいる。これは、組換えＨＶＴを構築するために、「オーバーラッピングサブゲノムフラグメントから組換えヘルペスウイルスを作製するための方法」に従って、他のサブゲノムクローン類と組み合わせて用いられ得る。このコスミドは、以下の供給源からの二つの制限フラグメントを連結することによって構築され得る。第一のフラグメントは略8164塩基対であり、ｐＷＥ１５（ストラタジーン社）のＢａｍＨＩ〜ＢａｍＨＩ制限フラグメントである。第二のフラグメントは略29,500塩基対であり、ＨＶＴ（Buckmaster et al.,1988）のＢａｍＨＩ＃１フラグメントである。サブゲノムクローン 407-32.1C1 ：コスミド 407-32.1C1 は、組換えＨＶＴを作製する目的で構築された。これには、ゲノムＨＶＴ・ＤＮＡの略38,850塩基対の領域が含まれている（図８参照）。この領域には、ＢａｍＨＩフラグメント１１，７，８，２１，６，１８，並びにフラグメント１３の略1250塩基対およびフラグメント１の略6,700塩基対が含まれている。これは、組換えＨＶＴを構築するために、「オーバーラッビングサブゲノムフラグメントから組換えヘルペスウイルスを作製するための方法」に従って、他のサブゲノムクローン類と組み合わせて用いられ得る。このコスミドは、上記の「オーバーラッピングサブゲノムフラグメントから組換えヘルペスウイルスを作製するための方法」に記載したようにして構築され得る。これはプローブＰ１およびＰ４（図８に記載した）を用いてスクリーニングすることにより、切断されたＤＮＡライブラリーから単離された。このコスミドを含むバクテリア株は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規定に従って、1993年３月３日に、ＡＴＣＣ受付番号第75428 号の下に、アメリカ合衆国メリーランド州20852ロックウィル・12301 パークローンドライブに所在するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションの特許カルチャー寄託部に寄託された。サブゲノムクローン 407-32.2C3 ：コスミド 407-32.2C3 は、組換えＨＶＴを作製する目的で構築された。これには、ゲノムＨＶＴ・ＤＮＡの略40,170塩基対の領域が含まれている（図８参照）。この領域には、ＢａｍＨＩフラグメント１０，１４，１９，１７，５およびフラグメント２の略2,100 塩基対が含まれている。これは、組換えＨＶＴを構築するために、「オーバーラッピングサブゲノムフラグメントから組換えヘルペスウイルスを作製するための方法」に従って、他のサブゲノムクローン類と組み合わせて用いられ得る。このコスミドは、上記の「オーバーラッピングサブゲノムフラグメントから組換えヘルペスウイルスを作製するための方法」に記載したようにして構築され得る。これはプローブＰ１およびＰ２（図８に記載した）を用いてスクリーニングすることにより、切断されたＤＮＡライブラリーから単離された。このコスミドを含むバクテリア株は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規定に従って、ＡＴＣＣ受付番号第75430 号の下に、アメリカ合衆国メリーランド州20852 ロックウィル・12301 パークローンドライブに所在するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションの特許カルチャー寄託部に寄託された。サブゲノムクローン 407-32.5G6 ：コスミド 407-32.5G6 は、組換えＨＶＴを作製する目的で構築された。これには、ゲノムＨＶＴ・ＤＮＡの略40,000塩基対の領域が含まれている（図８参照）。この領域には、ＢａｍＨＩフラグメント９，３，２０，１２，１６，１３，並びにフラグメント２の略1,650 塩基対およびフラグメント１１の略4,000 塩基対が含まれている。これは、組換えＨＶＴを構築するために、「オーバーラッピングサブゲノムフラグメントから組換えヘルペスウイルスを作製するための方法」に従って、他のサブゲノムクローン類と組み合わせて用いられ得る。このコスミドは、上記の「オーバーラッピングサブゲノムフラグメントから組換えヘルペスウイルスを作製するための方法」に記載したようにして構築され得る。これはプローブＰ２およびＰ３（図８に記載した）を用いてスクリーニングすることにより、切断されたＤＮＡライブラリーから単離された。このコスミドを含むバクテリア株は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規定に従って、1993年３月３日に、ＡＴＣＣ受付番号第75427号の下に、アメリカ合衆国メリーランド州20852ロックウィル・12301パークローンドライブに所在するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションの特許カルチャー寄託部に寄託された。相同性ベクター 435-47.1 ：プラスミド 435-47.1 は、ＨＶＴ中に外来ＤＮＡを挿入する目的で構築された。これは、外来遺伝子が挿入され得る独自のＨｉｎｄIII制限酵素部位を含んでいる。ＨｉｎｄIII部位に外来ＤＮＡ挿入物を含むプラスミドを、「組換えヘルペスウイルスを作製するためのＤＮＡコトランスフェクション」または「オーバーラッピングサブゲノムフラグメントから組換えヘルペスウイルスを作製するための方法」に従って用いれば、外来ＤＮＡを含むウイルスが得られるであろう。このプラスミドは、標準的な組換えＤＮＡ技術（Maniatis el al, 1982および Sambrook el al, 1989）を用い、以下の供給源からの二つの制限フラグメントを連結することにより構築され得る。第一のフラグメントは略2999塩基対であり、ｐＳＰ６４（プロメガ社）のＥｃｏＲＩ〜ＥｃｏＲＩ制限フラグメントである。第二のフラグメントは略7300塩基対であり、ＨＶＴのＥｃｏＲＩ＃７フラグメントである。なお、ｐＳＰ６４ベクターのＨｉｎｄIII部位は、サブクローンをＨｉｎｄIIIで消化し、続いてクレノウ充填反応および再ライゲーションを行うことによって除去された。次いで、合成ＨｉｎｄIII リンカー（ＣＡＡＧＣＴＴＧ）をＥｃｏＲＩ＃７フラグメントの独自のＳｔｕＩ部位に挿入する。サブゲノムクローン 437-26.24 ：プラスミド 437-26.24は、組換えＨＶＴを作製する目的で構築された。これには、ゲノムＨＶＴ・ＤＮＡの略13,600塩基対領域が含まれている。これは、組換えＨＶＴを構築するために、「オーバーラッピングサブゲノムフラグメントから組換えヘルペスウイルスを作製するための方法」に従って、他のサブゲノムクローン類と組み合わせて用いられ得る。このプラスミドは、標準的な組換えＤＮＡ技術（Maniatis etal, 1982および Sambrook et al, 1989）を利用して、以下の供給源から得られる二つの制限フラグメントを連結することによって構築され得る。第一のフラグメントは略2970塩基対であり、ｐＳＰ６４（プロメガ社）のＨｉｎｄIII〜ＢａｍＨＩ制限フラグメントである。また、第二のフラグメントは略13,600塩基対であり、ＨＶＴ（Buckmaster el al.,1988）ＢａｍＨＩ＃２フラグメントのＢａｍＨＩ〜ＳｔｕＩサブフラグメントである。なお、このＢａｍＨＩ＃２フラグメントは５つのＳｔｕＩ部位を含んでおり、このサブクローニングに利用される部位は、「オーバーラッピングサブゲノムフラグメントから組換えヘルペスウイルスを作製するための方法」に記載したようにして、ＨｉｎｄII Iに変換された。サブゲノムクローン 437-26.26 ：プラスミド 437-26.26は、組換えＨＶＴを作製する目的で構築された。これには、ゲノムＨＶＴ・ＤＮＡの略15,300塩基対領域が含まれている。これは、組換えＨＶＴを構築するために、「オーバーラッピングサブゲノムフラグメントから組換えヘルペスウイルスを作製するための方法」に従って、他のサブゲノムクローン類と組み合わせて用いられ得る。このプラスミドは、標準的な組換えＤＮＡ技術（Maniatis etal, 1982および Sambrook et al, 1989）を利用して、以下の供給源から得られる二つの制限フラグメントを連結することによって構築され得る。第一のフラグメントは略2970塩基対であり、ｐＳＰ６４（プロメガ社）のＨｉｎｄIII〜ＢａｍＨＩ制限フラグメントである。また、第二のフラグメントは略15,300塩基対であり、ＨＶＴの（Buckmaster et al.,1988）ＢａｍＨＩ＃２フラグメント（Buckmaster et al.,1988）のＢａｍＨＩ〜ＳｔｕＩサブフラグメントである。なお、このＢａｍＨＩ＃２フラグメントは５つのＳｔｕＩ部位を含んでおり、このサブクローニングに利用される部位は、「オーバーラッピングサブゲノムフラグメントから組換えヘルペスウイルスを作製するための方法」に記載したようにして、ＨｉｎｄIIIに変換された。相同性ベクター 456-18.18及び456-17.22 ：プラスミド 456-18.18及び 456-17.22は、ＨＶＴ中にＭＤＶ・ｇＡおよびｇＢ遺伝子を挿入する目的で構築された。このＭＤＶ遺伝子類は、相同性ベクター 435-47.1 の独自のＨｉｎｄIII部位にカセットとして挿入された。また、このＭＤＶ遺伝子類は、平滑末端のＰｓｔＩ〜ＥｃｏＲＩフラグメントとして、平滑末端化されたＨｉｎｄIII部位に挿入された（図１０参照）。ＨｉｎｄIIIおよびＥｃｏＲＩ部位は、クレノウ充填反応によって平滑末端化された。ＰｓｔＩ部位は、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ反応によって平滑末端化された。なお、ＭＤＶカセットは両方の配向性で挿入された。プラスミド 456-18.18は、親の相同性ベクター中のＵＳ２遺伝子に対して反対の転写向きに挿入されたＭＤＶ遺伝子類を含んでいる。プラスミド 456-17.22は、親の相同性ベクター中のＵＳ２遺伝子と同じ転写向きに挿入されたＭＤＶ遺伝子類を含んでいる。ＭＤＶカセットの詳細な説明は、図１０に与えられている。これは標準的な組換えＤＮＡ技術（Maniatis et al,1982および Sa mbrook et al, 1989）を利用して、以下の供給源から得られる制限フラグメントを、図１０に示した合成ＤＮＡ配列と連結することによって構築され得る。フラグメント１は略2178塩基対であり、ＭＤＶ・ＥｃｏＲＩ・6.9KBゲノム制限フラグメント（Ihara et al.,1989）のＰｖｕII〜ＥｃｏＲＶ制限サブフラグメントである。フラグメント２は略3898塩基対であり、ＳａｌＩ〜ＥｃｏＲＩ・ゲノムＭＤＶフラグメント（Ross, et al.,1989）である。相同性ベクター 528-03.37 ：プラスミド 528-03.37は、ＨＶＴ中に感染性喉頭気管炎（ＩＬＴ）ウイルスｇＤ遺伝子を挿入する目的で構築された。このｇＤ遺伝子とこれに続くＰＲＶ・ｇＸポリアデニレーション信号は、カセットとして、相同性ベクター 435-47.1の独自のＨｉｎｄIII部位に挿入された。このカセットは標準的な組換えＤＮＡ技術（Maniatis et al, 1982及び Sambrooket al, 1989）を利用して、以下の供給源から得られる制限フラグメント類を連結することによって構築され得る。第一のフラグメントは略20 60塩基対であり、ＩＬＴ・ＫｐｎＩゲノム制限フラグメント＃８（10.6 KB）のＥｃｏＲＩ〜ＢｃｌＩ制限サブフラグメントである。第二のフラグメントは略75 4塩基対であり、ＰＲＶ・ＢａｍＨＩ制限フラグメント＃７（Lonmiczi et al.,1 984）のＮｄｅＩ〜ＳａｌＩ制限サブフラグメントである。なお、これらフラグメントはＢｃｌＩ部位およびＮｄｅＩ部位が隣接するように配向される。相同性ベクター 528-11.43 ：プラスミド 528-11.43は、ＨＶＴ中に感染性喉頭気管炎（ＩＬＴ）ウイルスｇＢ遺伝子（A.M.Grifin, 1991）を挿入する目的で構築された。このｇＢ遺伝子は、ＥｃｏＲＩフラグメントとして、相同性ベクター 435-47.1の独自のＨｉｎｄIII部位に挿入された。このｇＢ遺伝子は、平滑末端化されたＥｃｏＲＩフラグメントとして、平滑末端化されたＨｉｎｄIII部位に挿入された。ＨｉｎｄIII 部位およびＥｃｏＲＩ部位は、クレノウ充填反応によって平滑末端化された。ｇＢ遺伝子は、親相同性ベクター中のＵＳ２遺伝子と同じ転写向きで挿入された。ＥｃｏＲＩフラグメントは、3.0 KBのＩＬＴウイルス・ゲノムフラグメントとして得られる。相同性ベクター 518-46.B3 ：プラスミド 518-46.B3は、ＨＶＴ中に外来ＤＮＡを挿入する目的で構築された。これは、外来遺伝子が挿入され得る独自のＨｉｎｄIII制限酵素部位を含んでいる。ＨｉｎｄIII部位に外来ＤＮＡ挿入物を含むプラスミドを、「組換えヘルペスウイルスを作製するためのＤＮＡコトランスフェクション」または「オーバーラッピングサブゲノムフラグメントから組換えヘルペスウイルスを作製するための方法」に従って用いれば、外来ＤＮＡを含むウイルスが得られるであろう。このプラスミドは、標準的な組換えＤＮＡ技術（Maniatis et al,1982および Sambrook et al, 1989 ）を利用して、以下の供給源から得られる三つの制限フラグメントを連結することにより構築され得る。第一のフラグメントは略1649塩基対であり、ｐＳＰ６４（プロメガ社）のＰｖｕＩ〜ＳａｌＩ制限フラグメントである。第二のフラグメントは略1368塩基対であり、ｐＳＰ６５（プロメガ社）のＰｖｕＩ〜ＳａｌＩ制限フラグメントである。第三のフラグメントは略3400塩基対であり、プラスミド437-47.1のＸｈｏＩ〜ＸｈｏＩフラグメントである。相同性ベクター 535-70.3：プラスミド 535-70.3 は、ＨＶＴ中にＭＤＶ・ｇＢおよびｇＡ遺伝子、並びにＮＤＶ・Ｆ遺伝子を挿入する目的で構築された。Ｆ遺伝子はカセットとして、相同性ベクター 456-17.22のＭＤＶ・ｇＡおよびｇＢ遺伝子の間に位置する独自のＨｉｎｄIII部位に挿入された（図１０Ａの連結部Ｂを参照のこと）。このＦ遺伝子は、ＨＣＭＶの即時型初期プロモータ(immediate early promoter)の制御下にあり、またＨＳＶ-1・ＴＫポリアデニル化信号が続いている。このＦ遺伝子は、親の相同性ベクター中のＵＳ２遺伝子と同じ転写向きに挿入された。このカセットは標準的な組換えＤＮＡ技術（Mani atis et al,1982および Sambrook et al, 1989 ）を利用して、以下の供給源から得られる制限フラグメント類を連結することによって構築され得る。第一のフラグメントは略1191塩基対であり、ＨＣＭＶゲノムＸｂａＩ・Ｅフラグメント（ D.R.Thomsen et al.,1981）のＰｓｔＩ〜ＡｖａII制限サブフラグメントである。第二のフラグメントは略1812塩基対であり、完全長ＮＤＶ・Ｆ・ｃＤＮＡクローン（Ｂ１株）のＢａｍＨＩ〜ＰｓｔＩ制限フラグメントである。最後のフラグメントは略 784塩基対であり、ＨＳＶ-1・ＢａｍＨＩ制限フラグメントＱ（McGe och et al.,1985）のＳｍａＩ〜ＳｍａＩ制限サブフラグメントである。相同性ベクター 549-24.15 ：プラスミド 549-24.15は、ＨＶＴ中に、ＭＤＶ・ｇＢおよびｇＡ遺伝子、並びにＮＤＶ・ＨＮおよびＦ遺伝子を挿入する目的で構築された。ＨＮおよびＦ遺伝子はカセットとして、相同性ベクター 456-17.22のＭＤＶ・ｇＡおよびｇＢ遺伝子の間に位置する独自のＨｉｎｄIII部位に挿入された（図１０Ａの連結部Ｂを参照のこと）。このＨＮおよびＦ遺伝子は、夫々ＰＲＶ・ｇｐＸおよびＨＣＭＶの即時型初期プロモータ（immediate early promoter）の制御下にある。ＨＮおよびＦ遺伝子には夫々、ＲＰＶ・ｇＸポリおよびＨＳＶ-1・ＴＫアデニル化信号が続いている。このカセットは、標準的な組換えＤＮＡ技術（ Maniatis et al, 1982および Sambrooket al,1989 ）を利用して、以下の供給源から得られる制限フラグメント類を連結することによって構築され得る。第一のフラグメントは略413塩基対であり、ＰＲＶ・ＢａｍＨＩフラグメント＃１０（L omniczi et al.,1984）のＳａｌＩ〜ＢａｍＨＩ制限サブフラグメントである。第二のフラグメントは略1811塩基対であり、完全長ＮＤＶ・ＨＮ・ｃＤＮＡクローン（Ｂ１株）のＡｖａII〜ＮａｅＩ制限フラグメントである。第三のフラグメントは略754 塩基対であり、ＰＲＶ・ＢａｍＨＩ制限フラグメント＃７（Lomnic zi et al,,1984）のＮｄｅＩ〜ＳａｌＩ制限サブフラグメントである。第四のフラグメントは略1191塩基対であり、ＨＣＭＶゲノムＸｂａＩ・Ｅフラグメント（ D.R. Thomsen et al.,1981）のＰｓｔＩ〜ＡｖａII制限サブフラグメントである。第五のフラグメントは略1812塩基対であり、完全長ＮＤＶ・Ｆ・ｃＤＮＡクローン（Ｂ１株）のＢａｍＨＩ〜ＰｓｔＩ制限フラグメントである。最後のフラグメントは略 784塩基対であり、ＨＳＶ-1・ＢａｍＨＩ制限フラグメントＱ（McGe och et al.,1985）のＳｍａＩ〜ＳｍａＩ制限サブフラグメントである。相同性ベクター 549-62.10 ：プラスミド 549-62.10は、ＨＶＴ中に、ＭＤＶ・ｇＢおよびｇＡ遺伝子、並びにＮＤＶ・ＨＮ遺伝子を挿入する目的で構築された。ＨＮ遺伝子はカセットとして、相同性ベクター 456-17.22のＭＤＶ・ｇＡおよびｇＢ遺伝子の間に位置するＨｉｎｄIII部位に挿入された（図１０Ａの連結部Ｂを参照のこと）。このＨＮ遺伝子は、ＰＲＶ・ｇｐＸプロモータの制御下にあり、またＲＰＶ・ｇＸポリアデニル化信号が続いている。ＨＮ遺伝子は、親相同性ベクター内のＵＳ２遺伝子と同じ転写向きで挿入された。このカセットは、標準的な組換えＤＮＡ技術（ Maniatis et al, 1982および Sambrook etal,1989）を利用して、以下の供給源から得られる制限フラグメント類を連結することによって構築され得る。第一のフラグメントは略413 塩基対であり、ＰＲＶ・ＢａｍＨＩフラグメント＃１０（ Lomniczi et al.,1984）のＳａｌＩ〜ＢａｍＨＩ制限サブフラグメントである。第二のフラグメントは略1811塩基対であり、完全長ＮＤＶ・ＨＮ・ｃＤＮＡクローン（Ｂ１株）のＡｖａII〜ＮａｅＩ制限フラグメントである。最後のフラグメントは略754 塩基対であり、ＰＲＶ・ＢａｍＨＩ制限フラグメント＃７（Lomnic zi et al.,1984）のＮｄｅＩ〜ＳａｌＩ制限サブフラグメントである。サブゲノムクローン 550-60.6 ：プラスミド 550-60.6 は、組換えＨＶＴを作製する目的で構築された。これには、ゲノムＨＶＴ・ＤＮＡの略12,300塩基対領域が含まれている。これは、組換えＨＶＴを構築するために、「オーバーラッピングサブゲノムフラグメントから組換えヘルペスウイルスを作製するための方法」に従って、他のサブゲノムクローン類と組み合わせて用いられ得る。このプラスミドは、標準的な組換えＤＮＡ技術（Maniatis etal, 1982および Sambrook et al, 1989）を利用して、以下の供給源から得られる二つの制限フラグメントを連結することによって構築され得る。第一のフラグメントは略4176塩基対であり、ｐＢＲ322のＥｃｏＲＶ〜ＢａｍＨＩ制限フラグメントである。また、第二のフラグメントは略12,300塩基対であり、ＨＶＴのＢａｍＨＩ＃２フラグメント（Buckmasteret al.,1988）のＢａｍＨＩ〜ＳｔｕＩサブフラグメントである。このフラグメントは次のようにして作製された。プラスミド 437-26.26をＨｉｎｄIIIで線形化し、次いでＥｘｏI IIムングビーン (Mung Bean) 削除キット（ストラタジーン社）で再切断した。３分および４分の反応から得られたサンプルを合体し、ＢａｍＨＩで消化して、 12,300塩基対の所望のサブフラグメントを得た。このポピュレーションをｐＢＲ 322フラグメント中にクローン化し、得られたクローンを適切な寸法および制限マップについてスクリーニングした。偶然にも、クローン 550-60.6を生じる再切断されたサブフラグメントは、ｐＢＲ322 のＥｃｏＲＶ部位（ＡＴＣＣ）にライゲートされたときに第二のＢａｍＨＩ部位を生じるヌクレオチドＧＧで終端していた。このプラスミを含むバクテリア株は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規定に従って、1993年３月３日に、ＡＴＣＣ受付番号第75429号の下に、アメリカ合衆国メリーランド州20852 ロックウィル・1 2301 パークローンドライブに所在するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションの特許カルチャー寄託部に寄託された。相同性ベクター 566-41.5 ：プラスミド566-41.5は、ＭＤＶ・ｇＡ、ｇＢおよびｇＤ遺伝子を、ＨＶＴ中に挿入する目的で構築された。ＭＤＶ・ｇＤ遺伝子は、ＨｉｎｄIIIフラグメントとして、相同性ベクター 456-17.22中のＭＤＶ・ｇＡおよびｇＢ遺伝子の間に位置するＨｉｎｄIII部位に挿入された（図１０参照）。このＭＤＶ遺伝子は、親相同性ベクター内のｇＡおよびｇＢ遺伝子と同じ転写向きで挿入された。このＭＤＶ・ｇＤ遺伝子を含むＨｉｎｄIIIフラグメントの詳細な説明は、図１１に示されている。なお、このｇＤ遺伝子カセットにはヘルペスウイルス・ポリアデニル化信号が付加された。挿入されたＨｉｎｄIIIフラグメントは標準的な組換えＤＮＡ技術（Maniatis etal,1982および Sambrook et al, 1989）を利用して、以下の供給源から得られる制限フラグメントを、図１１に示した合成ＤＮＡ配列と連結することによって構築され得る。フラグメント１は略784 塩基対であり、ＨＳＶ-1・ＢａｍＨＩ制限フラグメントＱ（McGeoch et al.,1988）のＳｍａＩ〜ＳｍａＩ制限サブフラグメントである。なお、このフラグメントは、ポリアデニル化配列（ＡＡＴＡＡＡ）が連結部Ｂに最も近接して位置するように配向されている。フラグメント２は略2177塩基対であり、ＭＤＶ・ＢｇｌII・4.2KB ゲノム制限フラグメント（Ross, et al.,1991 ）のＳａｌＩ〜ＮｃｏＩサブフラグメントである。相同性ベクター 567-72.ID ：プラスミド567-72.IDは、ＭＤＶのｇＢ、ｇＡおよびｇＤ遺伝子、ならびに感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）のマトリックスおよびスパイク遺伝子を、ＨＶＴ中に挿入する目的で構築された。このＩＢＶ遺伝子類はカセットとして、相同性ベクター 566-41.5 中のＭＤＶ・ｇＤＢ遺伝子の上流に位置する独自のＮｏｔＩ部位に挿入された（図１１Ｂの連結部Ｃを参照のこと）。ＩＢＶ・スパイクおよびマトリックス遺伝子は夫々、ＨＣＭＶの即時型初期プロモータ（immediateearly promoter）およびＰＲＶ・ｇｐＸプロモータの制御下にある。ＩＢＶ・スパイクおよびマトリックス遺伝子には夫々、ＨＳＶ-1・ＴＫおよびＲＰＶ・ｇＸポリアデニル化信号が続いている。このＩＢＶ遺伝子類は、親相同性ベクター内のＵＳ２遺伝子と同じ転写向きで挿入された。このカセットは標準的な組換えＤＮＡ技術（Maniatis et al, 1982およびSambrook et al, 1989）を利用して、以下の供給源から得られる制限フラグメント類を連結することによって構築され得る。第一のフラグメントは略413 塩基対であり、ＰＲＶ・ＢａｍＨＩ制限フラグメント＃１０（Lomniczi et al.,1984 ）のＳａｌＩ〜ＢａｍＨＩ制限サブフラグメントである。第二のフラグメントは、ＩＢＶマトリックス遺伝子のアミノ酸１〜223 を含んでいる。このコーディング領域は、ＩＢＶのアルカンザス株ｃＤＮＡクローンから得られた。第三のフラグメントは略754 塩基対であり、ＰＲＶ・ＢａｍＨＩ制限フラグメント＃７（Lo mniczi et al.,1984）のＮｄｅＩ〜ＳａｌＩ制限サブフラグメントである。第四のフラグメントは、略1191塩基対であり、ＨＣＭＶゲノムＸｂａＩ・Ｅフラグメント（D.R. Thomsen et al.,1981）のＰｓｔＩ〜ＡｖａII制限サブフラグメントである。第五のフラグメントは、ＩＢＶスパイク遺伝子のアミノ酸４〜1126を含んでいる。このコーディング領域は、ＩＢＶのアルカンザス株ｃＤＮＡクローンから得られた。最後のフラグメントは、略784 塩基対であり、ＨＳＶ-1・ＢａｍＨＩ制限フラグメントＱ（McGeoch et al., 1985）のＳｍａＩ〜ＳｍａＩ制限サブフラグメントである。相同性ベクター 603-57.F1 ：プラスミド 603-57.F1は、ＩＢＤＶ・ＶＰ２遺伝子をＨＶＴ中に挿入する目的で構築された。このＩＢＤＶ・ＶＰ２遺伝子はカセットとして、相同性ベクター 435-47.1中の独自のＨｉｎｄIII部位に挿入された。このＩＢＤＶ・ＶＰ２遺伝子は、ＨＣＭＶの即時型初期プロモータ（immediate earlypromoter）の制御下にあり、またＨＳＶ-1・ＴＫポリアデニル化信号が続いている。ＩＢＤＶ・ＶＰ２遺伝子は、親相同性ベクター内のＵＳ２遺伝子と同じ転写向きで挿入された。このカセットは標準的な組換えＤＮＡ技術（Maniatis et al,1982および Samb rook et al, 1989）を利用して、以下の供給源から得られる制限フラグメント類を連結することによって構築され得る。第一のフラグメントは略1191塩基対であり、ＨＣＭＶゲノムＸｂａＩ・Ｅフラグメント（D.R. Thomsen et al.,1981）のＰｓｔＩ〜ＡｖａII制限サブフラグメントである。第二のフラグメントは略1081 塩基対であり、完全長ＩＢＤＶ・ｃＤＮＡクローン（配列ＩＤ番号１を参照のこと）のＢｃｌＩ〜ＢａｍＨＩ制限サブフラグメントである。なお、ＢｃｌＩ部位は、配列ＣＧＣＡＧＣをＴＧＡＴＣＡに変換することによって、該ｃＤＮＡクローン中のＶＰ２開始メチオニンの直ぐ上流に導入された。上記第一および第二のフラグメントは、ＡｖａII部位およびＢｃｌＩ部位が隣接するように配向されている。第三のフラグメントは略784 塩基対であり、ＨＳＶ-1・ＢａｍＨＩ制限フラグメントＱ（McGeoch et al., 1985）のＳｍａＩ〜ＳｍａＩ制限サブフラグメントである。相同性ベクター 633-13.27 ：プラスミド 633-13.27は、ＭＤＶのｇＢ、ｇＡおよびｇＤ遺伝子、ならびにＮＤＶのＨＮおよびＦ遺伝子を、ＨＶＴ中に挿入する目的で構築された。このＨＮおよびＦ遺伝子は夫々、ＰＲＶ・ｇｐＸプロモータおよびＨＣＭＶの即時型初期プロモータ（immediate early promoter）の制御下にある。ＮＨおよびＦ遺伝子類には夫々、ＲＰＶ・ｇＸポリおよびＨＳＶ-1・ＴＫアデニル化信号が続いている。５つの全ての遺伝子類は、親相同性ベクター内のＵＳ２遺伝子と同じ転写向きで挿入された。これら遺伝子類は、ＭＤＶ・ｇａ、ＮＤＶ・ＨＮ、ＮＤＶ・Ｆ、ＮＤＶ・ｇＤおよびＭＤＶ・ｇＢの順で挿入された。相同性ベクター 634-29.16 ：プラスミド 634-29.16は、ＩＴＬウイルスのｇＢおよびｇＤ遺伝子をＨＶＴ中に挿入する目的で構築された。ｌａｃＺマーカー遺伝子に続くＩＴＬ・ｇＢおよびｇＤ遺伝子はカセットとして、相同性ベクター 172-29.31中の独自のＸｈｏＩ部位に挿入された。このカセットは標準的な組換えＤＮＡ技術（Maniatis et al, 1982および Sambrook et al, 1989）を利用して、以下の供給源から得られる制限フラグメント類を連結することによって構築され得る。第一のフラグメントは略4229塩基対であり、図７に示した上記ｌａｃＺマーカー遺伝子から誘導されたＳａｌＩ〜ＳａｌＩ制限フラグメントである。第二のフラグメントは略2060塩基対であり、ＩＬＴ・ＫｐｎＩゲノム制限フラグメント＃８（10.6 KB）のＥｃｏＲＩ〜ＢｃｌＩ制限サブフラグメントである。第三のフラグメントは略754 塩基対であり、ＰＲＶ・ＢａｍＨＩ制限フラグメント＃７（ Lomniczi et al.,1984）のＮｄｅＩ〜ＳａｌＩ制限サブフラグメントである。なお、第二および第三のフラグメントは、ＢｃｌＩ部位およびＮｄｅＩ部位が隣接するように配向されている。第四のフラグメントは、ｇＢ遺伝子を含む 3.0 KB のＩＬＴウイルスゲノムＥｃｏＲＩフラグメントである。３つの全ての遺伝子は、ＵＬ４３遺伝子と同じ転写向きである。〔実施例〕例１S-HVT-001 S-HVT-001は、七面鳥ヘルペスウィルス（ＨＶＴ）ゲノムの独自の長領域（u nique long region）に大腸菌βガラクトシダーゼ遺伝子（E.coli β-galactosi dase gene）を挿入したものである。ＨＶＴの制限酵素切断地図は公知であった（T.Igarashi et al., 1985）。この情報は、ＨＶＴに外来遺伝子を人工的に挿入するための出発点として用いられた。ＨＶＴの BamHI制限酵素切断地図を図１Ａに示す。これらのデータをもとに、外来遺伝子の挿入が可能な、ＨＶＴ・ＤＮＡの何箇所かの異なった領域に標的を定めた。挿入用に選ばれた外来遺伝子は大腸菌βガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）であり、我々はこれをＰＲＶ中で用いた。プロモーターは、ＰＲＶ・ｇｐｘプロモーターであった。ｌａｃＺ遺伝子は、ＨＶＴの独自の長領域に、正確には BamHI #16（3329bp）断片内の XhoI 部位に挿入された。そして、その遺伝子はブルオガル（Bluogal）^TM基質（Bethesd a Research Labs社製）を用いた時にブループラークを形成することから、ＨＶＴ組み換え体中で発現されることが明らかにされた。同様にして、ｌａｃＺ遺伝子は BamHI #19 （900bp）断片内に含まれる繰り返し領域内のＳａｌＩ部位に挿入された。これらの実験によって、ＨＶＴは、ヘルペスウィルス内に外来遺伝子を挿入し発現させるための本出願に開示された方法に従うことが示された。特に、外来ＤＮＡを挿入するのに適した２つの部位が同定された（図１Ｂおよび１Ｃ）。例２S-HVT-003 S-HVT-003は、七面鳥のヘルペスウィルス（ＨＶＴ）ゲノムの独自の長領域に、大腸菌βガラクトシダーゼ（lacZ）遺伝子と、感染性滑液嚢疾病ウィルス（ＩＢＤＶ）S40747株のＲＮＡ大断片（ｃＤＮＡ複製として）を挿入したものである。このＩＢＤＶ・ＤＮＡは、３つのタンパク質（5' VP2- VP4-VP3 3'）をコードする１つのオープンリーディングフレームを有しており、そのうちの２つのタンパク質はニワトリのＩＢＤＶ感染に対する防御反応をもたらす抗原である。β ガラクトシダーゼとＩＢＤＶポリプロテインの両方をコードする遺伝子の発現は、シュードラビースウィルス（Pseudorabiesvirus；ＰＲＶ）ｇｐＸ遺伝子プロモーターの制御下にある。S-HVT-003（ＡＴＣＣ受入れ番号No. VR 2178で寄託されている）は、相同的に組み換えにより作製された。ＩＢＤＶ遺伝子は、ｃＤＮＡクローニング手法によりクローン化された。ＩＢＤＶのゲノムに相当するクローンは、真のＩＢＤＶ・ＲＮＡを含むブロットに対してＤＮＡのサザンブロッティング法を用いることにより選択された。次にポジティブクローンは、クローンのグループを同定するために制限酵素切断地図を作製することにより、特性が明らかにされた。２つのクローンが同定された。それらはともにＲＮＡのＩＢＤＶ大断片（3.3kb dsRNA）を完全にコードする領域であることがわかった。第１のｃＤＮＡクローン（2-84）は、ＩＢＤＶ遺伝子の前半部分に相当する約2500塩基対の断片を含んでいた。第２のクローン（2-40）は、ＩＢＤＶ遺伝子の後半部分に相当する約2000塩基対の断片を含んでいた。完全なＩＢＤＶ遺伝子に相当するプラスミド 2-84/2-40は、重複している配列内に存在する PvuII部位で、クローン2-84とクローン2-40を連結することにより構築された。ＩＢＤＶゲノムは約3400塩基対の SmaI から HpaI までの断片として、プラスミド 2-84/2-40から得ることができる。ＩＢＤＶ遺伝子によりコードされているタンパク質の特性の確認は、大腸菌内でクローン（2-84/2-4 0）を発現させることにより、またウエスタンブロット上で精製したＩＢＤＶキャプシドタンパクに対して作られた抗血清を用いて VP3抗原を検出することにより行った。ＩＢＤＶ抗原をコードする出願人の大ＤＮＡ断片の配列は、配列 ID #1と命名された。この配列は、以下においてＩＢＤＶ遺伝子と称する１つのオープンリーディングフレームを示している。本出願人の配列と高い相同性を示す配列を有する、オーストラリアＩＢＤＶ株の配列は既に公表されていた（Hudson e l al., 1986）。これらの２種のウィルス間でのアミノ酸組成の比較により、101 2アミノ酸をコードする領域内で29アミノ酸が異なることが明らかとなった。VP4 タンパクについて推定されたアミノ酸の相違はわずか３アミノ酸、VP3 タンパクではわずか８アミノ酸の相違であった。対照的に、VP2 タンパクでは18アミノ酸の相違が見られ、そのうち14アミノ酸の相異はアミノ酸139 からアミノ酸332 までに偏在していた。ＨＶＴゲノム中に挿入するために、ＩＢＤＶ遺伝子をコードする領域がＰＲＶ・ｇｐＸプロモーターとＨＳＶ・ＴＫ・ポリＡシグナル配列の間にクローニングされて、プラスミド191-23が作製された。相同的組み換えによって作製したＩＢＤＶ遺伝子を含むＨＶＴ組み換え体の同定を助けるために、プロモーターｇｐＸにより発現させたプラスミド 191-23 由来のＩＢＤＶ断片が、ｇｐＸプロモーター制御下のｌａｃＺ遺伝子の下流に（一列に並んで）挿入された。結果として生じたプラスミド 191-47 は、個別のＰＲＶ・ｇｐＸプロモーターの制御下にある大腸菌ｌａｃＺ遺伝子とＩＢＤＶ遺伝子とを含んでいる。プラスミド 191-47 を構築する際、天然に存在する制限酵素部位、または合成リンカーＤＮＡを用いたＤＮＡ組み換え技術により、種々のＤＮＡ断片が連結された。プラスミド 191-4 7 に含まれるこれらの遺伝子の構築に関する詳細は、図２に示されている。ＤＮＡの第１セグメント（図２のセグメント１）は、ｇｐＸ遺伝子の初めから７番目までのアミノ酸をコードするアミノ酸残基を有するｇｐＸプロモーター領域を含んでおり、また約800 塩基対の SalI から BamHIまでの断片である PRV BamHI # 10断片のサブクローニングによって得られた。ＤＮＡの第２セグメント（図２のセグメント２）は、アミノ酸10からアミノ酸1024までの大腸菌βガラクトシダーゼをコードする領域を含んでおり、また約40塩基対の Aval から SmaI までの断片を伴う約3300塩基対のBamHI からBalIまでの断片として、プラスミドpJF751（ Jim Hoch, Scripps Clinic and Research Foundationから得た）から誘導された。ＤＮＡの第３セグメント（図２のセグメント３）は、ｇｐＸ・ポリＡシグナル配列を含んでおり、それは約700 塩基対の NdeI から Stu I までの断片からなるPRV BamHI #7断片のサブクローンから得られた。第３セグメントは、ポリメラーゼ充填反応により埋められた NdeI 末端とのライゲーションにより、第２セグメントの SmaI 部位に連結された。ＤＮＡの第４セグメント（図２のセグメント４）は、ｇｐＸ・プロモーター（TATAボックス（TATA box）とキャップ部位（cap site））を含んでおり、それは約330 塩基対のNaeI から AluI までの断片からなる PRV BamHI #10断片のサブクローンから得られた。更に、第４セグメントは PstIから BglIIまでの断片からなる約36塩基対の HSV TK 5'非翻訳リーダー配列を含んでいる。この断片中で、 PstI 部位は、合成ＤＮＡリンカー（Mcknight and kingbury, 1982）を使用して AluI 部位に連結させられた。ＤＮＡの第４から第６セグメントは、ｇｐＸ・ポリＡシグナル配列の 3 ' 末端に位置する第３セグメントの独自の kpnI 部位に、１ユニットとして挿入された。ＤＮＡの第５セグメント（図２のセグメント５）は、約3400塩基対の S maI から HpaI までの断片からなる、ＲＮＡのＩＢＤＶ大断片（ｃＤＮＡクローン）の全てをコードする領域を含んでいる。第５セグメントの SmaI 部位は、ポリメラーゼ充填反応により埋められた第４セグメントの BglII部位に融合させられた。ＩＢＤＶ遺伝子（5' VP2- VP4- VP3 3' ）の発現は、ｇｐＸプロモーター（セグメント４）の制御下にあるが、それ自体がもともともっている開始及び終始コドンを使用している。ＤＮＡの第６セグメント（図２のセグメント６）は、約800 塩基対の SmaI 断片（シカゴ大学、Bernard Roizman より取得）としての、ＨＳＶ・ＴＫ・ポリＡシグナル配列を含んでいる。第５セグメントの HpaI 部位は、合成ＤＮＡリンカーを用いることにより、第６セグメントの SmaI 部位に融合させられた。要約すると、S-HVT-003 （プラスミド 191-47）を作製するのに用いられた構築物には以下のものが含まれる（5'から3'の順）。即ち、ＰＲＶプロモーター、ｇｐＸ TATA ボックス、ｇｐＸキャッブ部位、ｇｐＸの初めから７つめまでのアミノ酸、大腸菌βガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子、ＰＲＶ・ポリＡシグナル配列、ＰＲＶ・ｇｐＸプロモーター、ｇｐＸ TATA ボックス、ｇｐＸキャプ部位、ｇｐＸ非翻訳5'リーダー配列からＩＢＤＶ遺伝子までの中での融合物、ＩＢＤＶ開始コドン、ＩＢＤＶ非翻訳3'末端からＨＳＶ・ＴＫ・非翻訳3'末端までの中での融合物、ＴＫ・ポリＡシグナル配列である。これらの遺伝子を含むカセットは、２つの EcoRI制限酵素部位の間に配置されるように作られた。その結果、EcoRI で消化することにより、ｌａｃＺ遺伝子とＩＢＤＶ遺伝子の両方を含む約9100塩基対の断片を得ることができた。以後、9161塩基対の EcoRI断片を、ＩＢＤＶ／ｌａｃＺカセットと称する。相同的組み換えによって S-HVT-003を構築するために、以下の手法が用いられた。ＩＢＤＶ／ｌａｃＺカセットは、HVT BamHI #16 断片のサブクローン内に存在する独自の XhoI 部位に挿入された。これを達成するために、まず EcoRIリンカーを使用して、 XhoI 部位を EcoRI部位に変換した。この部位はＨＶＴにおいて必須ではないことが、以前に lacZ （S-HVT-001）の挿入によって示されていた。またBamHI #16 断片内の隣接する相同性領域（flanking homol ogyregions）が、相同的組み換えで有効であることも示された。図３に示すとおり、BamHI #16 断片のゲノムの位置がＨＶＴの独自の長領域（unique long regi on）内にマップされた。約3329塩基対の BamHI #16断片の完全なヌクレオチド配列は、配列ID #3 として示されている。ＨＶＴ・ＤＮＡは、ヘルペスウィルスＤＮＡの調製手順（PREPARATION OF HERPESVIRUSDNA Procedure）により調製された。ヒナの１次繊維芽細胞（ＣＥＦ）へのＨＶＴ・ＤＮＡとプラスミドＤＮＡの同時トランスフェクション（cotransfections）は、ヘルペスウィルス組み換え体生成のためのＤＮＡトランスフェクション（DNATRANSFECTION FOR GENERATING RECOMBINANT HERPESVIRUS）に従って行われた。同時トランスフェクションストックから生じた組み換えウィルスは、ヘルペスウィルス組み換え体用のブルオガル・スクリーン手法（BLUOGAL SCREEN FOR RECOMBINANT HERPESVIRUS procedure ）を用いた３回のプラーク精製により精製された。プラークの100 ％が青色になったときに、そのＤＮＡはサザンブロッティング法によりＩＢＤＶ遺伝子の有無が分析された。EcoRI で消化した S-HVT-003 DNAを、ＩＢＤＶに特異的なニック翻訳（nick translation）されたプローブ（プラスミド 2-84/2-40）で調べるサザンブロットによって、9100塩基対のEcoRI 断片の存在が確認された。この結果から、S-HVT-003 はゲノムに取り込まれたｌａｃＺ遺伝子とＩＢＤＶ遺伝子の両方を含んでいることが確認された。さらに BamHI #16に特異的なプローブを用いてサザンブロットを行ったところ、相同的な組み換えはBamHI #16 の適切な位置に生じ、欠失は起こっていないことが確認された。野生株のウィルス（S-HV T-000）との比較において、S-HVT-003 のin vitroでの増殖には相違が見られなかった。 S-HVT-003 由来のＩＢＤＶ特異的タンパクの発現が、ウエスタンブロッティング法を用いてin vitroで分析された。細胞溶解物は、ヘルペスウィルス細胞溶解物の調製法で示したようにして調製された。簡単に言うと、S-HVT-003 の細胞溶解物に含まれているタンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロース（フィルター）へ移し、変性させた精製ＩＢＤＶキャプシドタンパクに対して作られた抗血清、または予想されるIBDV 40 Kd （VPZ）の免疫優勢領域（immuno dominant region）に相当する合成ペプチドに対して作られた抗血清を用いた検査した。フィルターは洗浄され、結合した抗体の位置を検出するために［¹²⁵Ｉ］タンパクＡにて処理された。図４は、変性させた精製ＩＢＤＶキャプシドタンパクに対して作られた抗血清を用いて得られた結果を示す。この抗血清は、主にＶＰ３（32 Kd タンパク）と反応することが出願人によって示されている。図から分かるように、S-HVT-003 は、完全なＩＢＤＶ成熟ウィルス粒子由来の真のＶＰ３タンパクから免疫学的に区別できないタンパクを生成する。更に、真のＶＰ３タンパクとコマイグレート（comigrates）するＶＰ３タンパク種が生成されることからみて、ポリプロテインは正確にプロセッシングされるらしい。オーストラリアＩＢＤＶ株を用いた最近の証拠によって、ＶＰ４は、前駆ポリプロテインが成熟したＶＰ２及びＶＰ３タンパク種にプロセッシングされることに関与していることが示された（J ag adish et al., 1988）。図５は、ＩＢＤＶ・ＶＰ２（40 kd）キャプシドタンパクの14アミノ酸領域に相同性を有する合成ペプチドに対して作られた、ウサギ抗血清を用いて得られた結果を示している。図から分かるように、S-HVT-003 は真のウィルス性ＶＰ２タンパクから免疫学的に区別し得ないタンパクを生成する。さらに、S-HVT-003 から作られたＶＰ２タンパクは、完全な（手を加えていない）ＩＢＤＶウィルス性粒子から単離されたＶＰ２の 40kd タンパク種とコマイグレイト（comigrates）する。このタンパク種は、感染性の（完全な）ウィルス性粒子の主要成分である。要約すると、S-HVT-003 由来のＩＢＤＶ特異的タンパクの発現を分析することにより、ポリプロテインはＣＥＦ細胞培養中でプロセッシングされて、ウエスタンブロット上でＶＰ２またはＶＰ３タンパクの何れかに対して特異的な免疫学的試薬と反応する適切な大きさのタンパクを生じることがわかつた。以下の一連の実験は、S-HVT-003 内に含まれるＩＢＤＶ遺伝子のin vivo発現（血清変換データ、血清中性化の結果、およびＩＢＤＶ抗原投与からの防御によって決定される）を解析するために、ニワトリを用いて実行された。最初の実験は、S-HVT-003 をワクチン注射された直後の、ＩＢＤＶに対するニワトリの血清変換を明らかにするために設計された。ＨＶＴとＩＢＤＶに対する血清反応が陰性である11週齢のニワトリ11羽を、SPAFAS Inc. から入手した。このうちの６羽は、S-HVT-003 （40,000 PFU/ml）を含むＣＥＦ細胞の細胞懸濁液 0.5mlを腹部の皮下にワクチン注射された。血清サンプルは、この研究に用いた全ニワトリについて、７日ごとに８週間採取された。28日目（４週目）に、これらのニワトリのうち３羽が S-HVT-003の追加免疫を受け、これに対して別の３羽は、0.5ml の不活化ＩＢＤＶワクチンを頚部に皮下注射された。さらに別の３羽のニワトリは、28日目に不活化ワクチンのみが投与された。残りの２羽のニワトリは接触コントロール（contact controls）とし、ワクチン接種は受けなかった。56日目に、全てのニワトリは殺されて、血清分析に供された。表１は、ＩＢＤＶに対する血清中性化分析（serum neutralization assay）の結果を示す。S-HV T-003 のみ与えられたニワトリではＳＮ活性は検出されなかった。更に、不活化ワクチンのみを与えられた３羽のうちの１羽のみが、低いながらも検出可能なＳＮ活性を示した。S-HVT-003に続いて不活化ＩＢＤＶワクチンの追加免疫を受けた３羽のうちの１羽でも、ＳＮ価が検出された。これらの力価は、不活化ＩＢＤＶワクチンのみを用いたものよりもかなり高いレベルであった。これらの結果は、S-HVT-003 はニワトリにＩＢＤＶに対する２次反応を引き起こさせる引き金となることを示唆している。ウエスタンブロッティングによる血清サンプルの in vitro での分析により、S-HVT-003 でのワクチン接種によるＩＢＤＶに対するニワトリの血清変換は、28日目に投与された追加免疫の前または後の何れにおいても確認された。第２の実験では、25羽の１日齢ＳＰＦヒナが、S-HVT-003でワクチン接種された（20羽については0.2ml の皮下接種、５羽については両眼に滴下（bilateral eyedrop）接種）。20羽のヒナがコントロールとして飼育された。感染後４日目及び７日目に、ワクチンを接種された５羽とコントロールの２羽が殺され、ウィルス単離のために脾臓を摘出された。脾臓細胞の懸濁液は標準的な方法により調製され、１×１０⁶ の細胞を含むヒナの胎芽繊維芽細胞（ＣＥＦ）生育培地３mlが直接２次細胞に接種された。培養液は６〜７日間インキュベートされ、細胞の形態を観察することにより決定される細胞変性効果（ＣＰＥ）が記録された。培養液は再度のインキュベート後（passed a second time）、再びＣＰＥを記録した。この結果を表２に示す。ワクチン接種していない全てのコントロールのヒナでは、４日目と７日目のいずれの脾臓細胞単離物についてもＨＶＴに対して陰性のままであった。S-HVT-003 をワクチン接種された５羽のうち４羽は、４日目には１回目及び２回目（の検査）のいずれにおいてもＨＶＴに対し陽性であった。残りの１羽ではウィルスが生成されていなかった。このことはワクチン接種の失敗を示しているかもしれない。５羽のヒナのうち５羽ともが、７日目には１回目及び２回目（の検査）でＨＶＴに対し陽性であった。全体的にみて、ベクターの回収実験により、S-HVT-003 はin vivo における野生株ＨＶＴウィルスと同様に複製されること、そしてBamHI #16 の XhoI 部位にＩＢＤＶ／ｌａｃＺカセットを挿入することによってウィルスの検出可能な弱化は生じなかったことが明らかとなった。これに続くヘルペスウィルス組み換え体用ブルオガル・スクリーン法（BLUOGAL SCREEN FOR RECOMBINANT HERPESVIRUS Procedure）によって回収されたウィルスを調べる実験は、ウィルスの100%でβガラクトシダーゼの発現が示されたことにより、S-HVT-003 のin vivo での安定性が確認された。感染後０、４、７、１４、２１日目に、ＩＢＤＶに対するウィルス中性化テスト（virus neutralizing tests）のため、またＩＢＤＶとＨＶＴ抗原に対する血清エリザ価の測定のために、残りのニワトリから血液サンプルを採取した。さらに感染後21日目に、５羽のコントロールと14羽のワクチン接種されたヒナは、両眼への滴下（10 3.8 EID50）（接種）により病原性のＩＢＤＶを抗原投与（challenge）された。全てのニワトリが抗原投与後６日目に殺され、体重に対する滑液包嚢の割合が計算された。この結果の要約を表５と表６にそれぞれ示す。表３に示すように、ワクチン接種後21-27 日目以前には、エリザ法によりＨＶＴ抗原に対して検出された抗体はなかった。ニワトリでは孵化後の最初の２週間の免疫応答は未熟であり、親（ドリ）に抑圧された（parentally suppressed）状態にある。それ故、これらの結果は全体的に予期できないものではない。対照的に、ＩＢＤＶエリザ価はワクチン接種後21日目までは陰性であった。そして、それは27日目の抗原投与後わずかに検出された。ワクチン接種後27日目にみられたエリザ価のレベルは、ＩＢＤＶに対する初期の応答を示している。表３Ｉでは、抗原投与されたコントロールとワクチン接種後抗原投与されたグループ間での体重に対する滑液包嚢の割合が比較されており、これらの間には有意な差がないことを示している。このような状況下でのS-HVT-00 3 によるワクチン接種は、ワクチン接種された４羽が抗原投与後死亡したことに示されるように、ワクチン接種ヒナでのＩＢＤＶ抗原投与による感染を防げなかった。Ｃ＝対照，Ｔ＝ワクチン接種区，ＣＣ＝ワクチン未接種対照，ＣＴ＝ワクチン接種−抗原投与区，エリザ価はＧＭＴ_Sであり、０〜９の範囲にある。数値は平均値である。抗原投与されたニワトリはあまり餌を食べなかったので、コントロールグループとは体重が異なる。ワクチン接種後に抗原投与された（ch allenged-treated）４羽のニワトリは死亡した。３番目の実験は実験２の繰り返しであるが、免疫学的に応答可能なヒナ（３週齢）を実験に用いた。６羽の３週齢のＳＰＦレグホン種ニワトリは、S-HVT-003 0.2ml を組織内にワクチン接種された（夫々の目に１滴（接種））。血清サンプルは６週間７日ごとに採取され、ワクチン接種後43日目に、ニワトリは病原性ＵＳＤＡ標準免疫テスト用ＩＢＤＶウィルス（virulent USDA standard challenge IBDV virus）で抗原投与された。抗原投与後６日目に、コントロールグループ、ワクチン接種後抗原投与されたグループ（vaccinated-challenged）、及び抗原投与（challenged）されたグループは殺され、それらの滑液包嚢が、抗-IBDV モノクローナル抗体（MAB）（バージニア−マリーランド地域獣医科大学（Virgi nia-Maryland Regional College of Veterinary Medicine）のDavidSnyder博士より提供された）で調べるために集められた。滑液包嚢のホモジュネートは、１つの滑液包嚢あたり 0.5% のＮＰ40を１ml混ぜ合わせることにより調製された。滑液包嚢はその後すりつぶされ、短時間超音波処理された。ホモジュネート由来の上清液は、タンパクＡとの結合を経て96穴エリザプレートに固定されたR63 MA B と反応させられた。インキュベートの後、ビオチンでラベルされたR63 MAB の調製溶液（biotin labeled preparation）が加えられた。洗浄後に、アビジン− 西洋ワサビパ−オキシダーゼ結合体（avidin-horseradish peroxidase conjugat e）を加えインキュベートした。テスト液は、トリス・マルケイト（Tris-malcat e）緩衝液（ＴＭＢ）＋過酸化水素基質を用いて発色された。このテストの結果を表５に示す。このデータは、ワクチン接種後抗原投与（vaccinated-chall enged）されたグループ、抗原投与（challenged）されたグループの全ての滑液包嚢でＩＢＤＶ抗原のレベルが高かったことを示している。コントロールではＩＢＤＶ抗原は検出されなかった。ＩＢＤＶの特異的抗原は1/1000以上の希釈溶液で検出することができた。ワクチン接種後抗原投与（vaccinated-challenged）されたグループ、ワクチン接種されずに抗原投与（non-vaccinated challenged ）されたグループの間において差は見られなかった。エリザ法によって測定されたＨＶＴ価は、ワクチン接種された６羽のうち４羽では７日目めに初めて検出可能となった。14日目までに、ワクチン接種された６羽のうち６羽ともＨＶＴに対する力価を示した。６羽の全てが実験期間中にＨＶＴ力価を示し続けた。抗原投与（challenge）の前にＩＢＤＶ・ＳＮ価が認められることはなかった。対照的に、これらの同じ血清サンプルのウエスタンブロッティング法による分析により、ウィルスの抗原投与以前にS-HVT-003 をワクチン接種されたニワトリが、ＩＢＤＶに対する血清変換を示すことがわかった。しかしながら、応答のレベルは追加免疫しない限り低いままである。ワクチン接種後抗原投与（vaccinated-chall enged）されたグループと抗原投与（challenged）のみ行われたグループの間で比較すると、ウエスタンブロットによる反応レベルは、ワクチン接種後抗原投与（vaccinated-challenged）されたグループにおいてずっと高いことが明白である。これらの結果から、S-HVT-003 はワクチン接種されたニワトリをＩＢＤＶに対して血清変換しており、またＩＢＤＶの特異的な発現のレベルは、それらのニワトリで中性化反応を誘導するのに充分なまでには高くないことを示唆している。 S-HVT-003 は、本出願人が発明したワクチン（ウィルス作製の）アプローチの利点を示している。ＨＶＴは外来抗原（βガラクトシダーゼおよびＩＢＤＶ抗原）を同時に発現させるために加工されており、これら外来抗原は、これらタンパク質に向けられた免疫応答によって宿主内で認識される。例３S-HVT-004 S-HVT-004 は、独自の長領域（long unique region）に組み込まれたマレック病ウィルス（ＭＤＶ）グリコプロテインＡ（ｇｐＡ）遺伝子と、これもまた独自の長領域に組み込まれたβガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子を有する七面鳥ヘルペスウィルスの組み換え体である。ＭＤＶ抗原はＨＶＴの等価抗原よりも適切な抗原反応を誘導するらしい。ＭＤＶ・ｇｐＡ遺伝子は、標準的なｇｐＡ（遺伝子）ＤＮＡクローニング手法によりクローニングされた。EcoRI 制限酵素切断断片中にＭＤＶ・ｇｐＡ遺伝子が含まれることが報告されており（Isfort et al.. 1984）、この断片はＤＮＡクローンの大きさにより同定された。ｇｐＡ遺伝子を含むと報告されているＤＮＡ領域は、本出願人により配列が決定され、期待どおり糖タンパクの遺伝子を有することが発見された。この遺伝子由来のＤＮＡは、ＤＮＡのサザンブロッティング法により、ＨＶＴ中における対応の遺伝子を見いだすのに用いられ、非常に似かよった配列を含むＨＶＴ中の遺伝子が同定された。この遺伝子は、以前ｇｐＡと呼ばていたものと同じ遺伝子である（Isfort et al., 1984）。 MDV gpA 遺伝子は、すでに十分なヘルペスウィルスのシグナル配列を持っているので、ＨＶＴゲノムに挿入するためにそのまま用いられらた。図６Ａおよび図６Ｂで示すように、ｌａｃＺ遺伝子はBamHI #16 断片の XhoI フラグメントに挿入され、MDV gpA 遺伝子はｌａｃＺの下流に挿入された。また、BamHI #16 断片のフランキング領域は相同的組み換えに用いられた。ヘルペスウィルス組み換え体を生成するためのＤＮＡトランスフェクション法（DNA TR ANSFECTION FOR GENERATING RECOMBINANT HERPESVIRUS procedure）に従い、ＨＶＴ・ＤＮＡとプラスミドＤＮＡは、ヒナの１次胚芽繊維芽（ＣＥＦ）細胞に同時トランスフェクトなされた。トランスフェクションストック由来のウィルスは、ヘルペスウィルス組換え体用ブルオガルスクリーン法（BLUOGAL SCREEN FOR R ECOMBINANT HERPESVIRUS procedure）を用いて連続的なプラーク精製により精製された。この手法の終わりに、プラークの100%が青色になったとき、ＤＮＡはMD V gpA 遺伝子の存在について分析された。S-HVT-004 は、ゲノムに組み込まれた βガラクトシダーゼ遺伝子と、MDV gpA 遺伝子との両方を有する組み換えウィルスである。図６Ｃは、S-HVT-004 の構造を示している。例４ニューキャッスル病ウィルスニューキャッスル病ウィルス（ＮＤＶ）は、全体的な構造において、PI-3と非常に関連がある。我々はＩＢＲ（ref）中で発現させるために、PI-3の赤血球凝集素（HN）遺伝子と融合（F）遺伝子を人為的に加工した。同様に我々は、ヘルペスウィルス・デリバリーシステム（herpesvirus delivery system）（七面鳥のヘルペスウィルス，ＨＶＴ）中に用いるために、ＮＤＶ由来の赤血球凝集素（HN）遺伝子と融合（F）遺伝子をクローニングした。遺伝子発現のためのヘルペスウィルス制御配列の構築に我々が利用した方法が、ＮＤＶに対して応用された。感染性気管支炎ウィルス感染性気管支炎ウィルス（ＩＢＶ）は、ＴＧＥの全体的な構造と密接に関係したニワトリのウィルスである。我々はＰＲＶ（ｒｆ）中で発現させるために、ＴＧＥの主要な中性化抗原（neutralizing antigen）を加工した。同様にして、我々はヘルペスウィルス・デリバリーシステム（ＨＶＴ）中で用いるために、ＩＢＶの３種類の株；マサチューセッツ（配列 ID 番号１４）、コネチカット（配列 ID 番号１６）及びアーカンサス-99 （配列 ID 番号１８）に由来する主要な中性化抗原遺伝子をクローニングした。遺伝子発現のためのヘルペスウィルス制御配列の構築に我々が利用した方法が、ＩＢＶに対して応用された。例５S-HVT-045 S-HVT-045は、独自の短領域（short unique region）に組み込まれたマレック病ウィルス（ＭＤＶ）糖タンパクＢ（ｇｐＢ）を有する七面鳥ヘルペスウィルスの組み換え体である。ＭＤＶ抗原は、ＨＶＴの等価抗原よりも適切な抗原反応を導き出すらしい。S-HVT-045 は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規定に従って、1992年10月15日に、ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ 2383の下に、アメリカ合衆国メリーランド州20852 ロックウィル・12301 パークローンドライブに所在するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションの特許カルチャー寄託部に寄託された。ＭＤＶ・ｇｐＢ遺伝子は、標準的なＤＮＡクローニング法によりクローニングされた。既知の幾つかのヘルペスウィルスｇＢ遺伝子の間で保存されていることが分かっている領域内におけるＨＳＶ・ｇＢ配列に基づいて、オリゴヌクレオチドプローブを用いることによって、ＭＤＶ・ｇｐＢ遺伝子は3.9 kb の EcoRI-Sa lI 断片に位置していることがわかった。この 3.9 kb の EcoRI-SalI 断片の制限酵素地図は、既に発表されている地図に類似していた（Ross et al., 1989）。 MDV gpB 遺伝子がすでに十分なヘルペスウィルスのシグナル配列を持っているので、ＨＶＴゲノムに挿入させるために、MDV gpB 遺伝子はそのまま用いられらた。MDV gpB 遺伝子は、HVT BamHI #1 断片由来の 17.15kbのBamHI - EcoRI 断片からなるクローンに挿入された。挿入に用いられた部位は、以前 S-HVT-012の構築に利用された HVT US2内の StuI 部位であった。この部位は、最初に独自の HindIIIリンカーを挿入して修飾されており、MDV gpB 遺伝子は標準的なＤＮＡクローニング法により挿入された。17.5 Kb のBamHI-EcoRI 断片内のフランキング領域は、「重複したサブゲム断片から組み換えヘルペスウィルスを生成するための方法」（PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT HERPESVIRUS FROM OVERLA PPINGSUBGENOMIC FRAGMENTS）を用いてクローン化したＨＶＴ断片の残りとともに用いられた。トランスフェクションストックから得られたウィルスはプラーク精製され、DNA はMDV gpB 遺伝子の有無を分析された。S-HVT-045 は、HVT US2 遺伝子の StuI 部位でゲノムに組み込まれたMDV gpB 遺伝子を有する組み換えウィルスである。組み換えS-HVT-045 のテスト病原性のマレック病ウィルスでの抗原投与に対する防御において、これらの組み換えＨＶＴ／ＭＤＶウィルスの効果を示すために２つの実験が行われた。実験Ａでは、１日齢の無菌（ＳＰＦ）ニワトリが、S-HVT-045 またはS-HVT-046 のいずれかでワクチン接種された。ワクチン接種後の７日目に、ワクチン接種されたヒナ、ワクチン未接種のヒナ、対照のヒナは、高い病原性を有するマレック病ウィルスのMD-5株で抗原投与された。抗原投与後、６週間にわたるマレック病に典型的な臨床兆候を観察する期間に続いて、全てのヒナは殺され、マレック病を示す損傷が検査された。表６に示すこの結果は、２種の組み換えウィルスの両者が、ワクチン未接種の対照ヒナの90% にマレック病を引き起こした抗原投与に対して、完全な防御をもたらしたことを示している。２番目の実験では、１日齢のニワトリが、S-HVT-045 またはS-HVT-047 のいずれかでワクチン接種された。第３グループのヒナは、ＵＳＤＡにライセンスされた、ＨＶＴウイルス及びＳＢ−１ウィルスからなる従来型のワクチンを接種された。ワクチン接種後の５日目に、ワクチン接種されたヒナ、ワクチン未接種のグループ、即ち対照ヒナは、高い病原性をもつマレック病ウィルスの RBIB 株で抗原投与された。ヒナは８週間マレック病の臨床的兆候（の出現）を観察され、それから殺され、マレック病を示す損傷が検査された。この実験によって、HVT-04 5 および HVT-046は、抗原投与に対して100%の防御をもたらす能力をもつことが示された（表１）。市販のワクチンは96% の防御をもたらし、ワクチン未接種のヒナでは79% がマレック病になった。例６S-HVT-012 S-HVT-012は、独自の短領域（short unique region）に挿入された大腸菌β -ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子を有する七面鳥ヘルペスウィルスの組み換え体である。このｌａｃＺ遺伝子は、ＨＶＴ［ATCC F-126 （'Calnek'）］における該挿入部位の安定性を確かめるために用いられたものである。S-HVT-012 は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規定に従って、1992年10月15日に、ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2382の下に、アメリカ合衆国メリーランド州20852 ロックウィル・12301 パークローンドライブに所在するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションの特許カルチャー寄託部に寄託された。ＨＶＴのゲノムに挿入させるために、βガラクトシダーゼ遺伝子は、クローン化された HTV EcoRI #7 断片（即ち、ＨＶのＵＳ２遺伝子内に独自の StuI 部位を含む断片）の独自の StuI 部位に導入された（方法および材料の項を参照のこと）。EcoRI #7 断片のフランキング領域は、相同的組み換えを行うために用いられた。ＨＶＴ・ＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡは、「組み換えウィルス生成のためのトランスフェクション法（DNA TRANSFECTION OF GENERATING RECOMBINA NT VIRUS Procedure）」に従い、ヒナの１次胚芽繊維芽細胞（ＣＥＦ）に同時トランスフェクションされた。トランスフェクトされたストックから得られた青色プラークは、ヘルペスウィルス組み換え体用ブルオガルスクリーン法（BLUOGAL S CREEN FOR RECOMBINANT HERPESVIRUS）を用いた連続的プラーク精製により精製された。この方法の終点において、プラークの100%が青色になったときに、ＤＮＡはｌａｃＺ遺伝子の存在について分析された。S-HVT-012 は、ＨＶＴのＵＳ２遺伝子内の StuI 部位において、ゲノムに組み込まれたｌａｃＺ遺伝子を含む組み換えウィルスである。組み換え S-HVT-012のテスト S-HVT-012 は、S-HVT-045 と同様の方法でワクチンとして調製された。ニワトリに投与された時、そのワクチンはマレック病ウィルスに対する防御をもたらした。例７ＨＶＴに外来ＤＮＡを挿入するための部位外来ＤＮＡの挿入に適切な部位を明らかにするために、ＨＶＴの BamHIおよび EcoRI制限酵素切断フラグメントのライブラリーが作られた。これらの制限酵素切断フラグメントの幾つか（BamHI #16 及び#13 断片， EcoRI #6，#7，及び# 9断片，図１参照）が、制限酵素切断地図の解析に用いられた。夫々の断片において、１つの独自の制限酵素部位が外来ＤＮＡを挿入可能な部位として同定された。このような部位としては、BamHI 断片 #13及び#16 あるいは EcoRI断片 #9 内における XhoI 部位、EcoRI断片 #6 内における SalI 部位、並びに EcoRI断片 #7 内における StuI 部位が含まれる。βガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）マーカー遺伝子は、それぞれの挿入可能な部位に挿入された。このような外来遺伝子挿入物を含むプラスミドは、外来ＤＮＡを含む「ＨＶＴを構築するためのヘルペスウィルス組み換え体の生成に関するＤＮＡ同時トランスフェクション（DNA COTRANSFECTION FOR GENERATING RECOMBINANT HERPESVIRUSES）法」に従って用いられ得る。この方法を成功させるためには、挿入部位がＨＶＴの複製に必須でない領域にあること、並びにこの挿入部位がウィルスＤＮＡとプラスミドＤＮＡの間の相同的組み換えを媒介するのに適したＨＶＴ・ＤＮＡに挟まれていることが重要である。ｌａｃＺマーカー遺伝子を含むこのプラスミドは、「ヘルペスウィルス組み換え体生成に関するＤＮＡの同時トランスフェクション（DNA COTRANSFECTION FOR GENERATING RECOMBINANT HERPESVIRUSES）法」に利用された。組み換えウィルスの生成は、組換えヘルペスウィルス用のブルオガルスクリーン（BLUOGAL SCREEN FOR RECOMBINANT HERPESVIRUS）により確認された。５つの部位のうちの３つの部位で、組み換えウィルスの生成が成功した。各々のケースにおいて、得られたウィルスは 100% にまで容易に精製され、それらの部位が外来ＤＮＡの挿入に適した部位であることが明らかとなった。これらの部位の決定に用いられた３つの相同性ベクターを以下に示す。例７Ａ相同性ベクター 172-29.31 相同性ベクター 172-29.31は、HVT BamHI #16 断片を含んでおり、ＨＶＴに外来ＤＮＡを挿入するために有用である。プラスミド 172-29.31は、その中に外来遺伝子がクローニングされうる独自の XhoI 制限酵素部位を有する。相同性ベクター 172-29.31内の XhoI 部位は、少なくとも３つのＨＶＴ組み換え体の構築により、ＨＶＴに外来遺伝子を挿入させるのに用いられうることを我々は示した（例１〜３を参照のこと）。相同性ベクター 172-29.31は、ＤＮＡ配列解析によって更に特性づけられた。BamHI #16 断片の完全な配列が決定された。隣接する約2092塩基対のBamHI #1 3断片もまた、配列が決定された（配列ＩＤ番号３参照）。この配列は、ＨＶＴグリコプロテインＡ（ｇＡ）をコードするオープンリーディングフレームが Bam HI #16−BamHI #13 連結部の間に亘っていることを示している。ＨＶＴ・ｇＡ遺伝子は、ＨＳＶ−１グリコプロテインＣ（ｇＣ）と相同性がある。上記 XhoI 部位は、ＨＶＴ・ｇＡ遺伝子の直接上流に位置するＯＲＦを中断している。このＯＲＦは、PRV p43 及び VZV遺伝子15に対して相同的なアミノ酸配列を示す。PRV およびVZV 遺伝子は、HSV-1 UL43に対して相同的である。HVT UL43が HSV-1 UL4 3に対して直接的な相同性を示さないことは注目されるべきである。HVT UL43は HVT gC 相同体の上流に位置しているが、HVT UL43は、HVT gAとして同じＤＮＡ鎖上にコードされている。一方、 HSV-1 UL43 は、 HSV-1 gC とは反対の鎖上に位置している。 XhoI 部位は、 UL43 を約６アミノ酸のところで中断させているが、そのことは UL43 遺伝子がＨＶＴ複製に関しては必須ではないことを示唆している。例７Ｂ相同性ベクター 435-47.R17 相同性ベクター 435-47.R17 は、HVT EcoRI #7断片を含んでおり、ＨＶＴに外来遺伝子を挿入させるのに有用である。プラスミド 435-47.R17 は、その中に外来ＤＮＡがクローニングされうる独自の HindIII制限酵素部位を有している。この HindIII部位は、EcoRI #7断片に自然に存在する StuI 部位中に、HindII I リンカーを挿入することによって作製された。我々は、少なくとも25個のＨＶＴ組み換え体を構築することによって、相同性ベクター 435-47.R17 内の Hind III部位がＨＶＴに外来ＤＮＡを挿入するために用いられ得ることを示した。 StuI におけるＤＮＡ配列の解析の結果は、この断片が、US 10 、 US 2及びUS 3に対するオープンリーディングフレームを有することを示した。 StuI 部位は約124 アミノ酸のところで US 2 を中断させているが、そのことは US 2 遺伝子がＨＶＴの複製に必須ではないことを示唆している。例７Ｃ相同性ベクター 172-63.1 相同性ベクター172-63, 1 はHVT EcoRI #9断片を含んでおり、HVT に外来遺伝子を挿入させるのに有用である。プラスミド 172-63, 1は（その中に）外来DN A がクローニングされうるユニークな（unique）XhoI制限酵素部位を有する。相同性ベクター172-63, 1 内のXhoI部位は、S-HVT-014 の構築によりHVT に外来DN A を挿入させるのに用いられ得ることを我々は示した（例８参照）。例８S-HVT-014 S-HVT-014 は、独自の長領域（long unique region）内に挿入された大腸菌のβガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子を有する七面鳥ヘルペスウィルスの組み換え体である。このｌａｃＺ遺伝子は、ＨＶＴ［ATCC F-126 （'Calnek'）］におけるこの挿入部位の安定性を確認するために用いられた。ＨＶＴゲノムに挿入するために、βガラクトシダーゼ遺伝子が、クローン化された EcoRI #9 断片の独自の XhoI 部位に導入された（方法と材料で示されたとおり）。EcoRI #8断片のフランキング領域は、相同的組み換えのために用いられた。ＨＶＴ・ＤＮＡとプラスミドは、「組み換えウィルスの生成のためのＤＮＡトランスフェクション法（DNA TRANSFECTION FOR GENERATING RECOMBINANT VIRU S Procedure）」に従い、ヒナの１次胚芽繊維芽細胞（ＣＥＦ）へ同時トランスフェクトされた。トランスフェクションストックから得られた青色ウィルスは、ヘルペスウィルス組み換え体用ブルオガルスクリーン法（BLUOGAL SCREEN FOR R ECOMBINANT HERPESVIRUS Procedure）を用いた連続的なプラーク精製により精製された。この方法の終点で、 100% のプラークが青色になったときに、ＤＮＡはｌａｃＺ遺伝子の存在について分析された。S-HVT-014 は、ＨＶＴの EcoRI #9 断片内の XhoI 部位においてゲノムに組み込まれたｌａｃＺ遺伝子を有する組み換えウィルスである。組み換え S-HVT-014のテスト S-HVT-014 は、S-HVT-045 と同様の方法でワクチンとして処方されうる。ニワトリに投与した時に、これらのワクチンはマレック病に対する防御をもたらす。例９S-HVT-005 S-HVT-005 は、独自の長領域（long unique region）へ挿入された大腸菌β ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子を有する七面鳥ヘルペスウィルスの組み換え体である。ｌａｃＺ遺伝子は、ＨＶＴ［ATCC F-126 （'Calnek'）］におけるこの挿入部位の安定性を確認するために用いられた。ＨＶＴゲノムに挿入するために、βガラクトシダーゼ遺伝子は、ＨＶＴの Xho I #9断片における約1300塩基対欠失部分に導入された。独自の MluI 部位と Eco RV部位との間にある欠失により、ＨＶＴ・ｇＡ遺伝子をコードする全領域が取り除かれる（配列ＩＤ番号３を参照のこと）。XhoI #9 断片のフランキング領域は相同的組み換えに用いられた。ＨＶＴ・ＤＮＡとプラスミドＤＮＡは、「組み換えウィルス生成のためのＤＮＡトランスフェクション法（DNA TRANSFECTION FOR GENERATING RECOMBINANT VIRUS Procedure）」に従い、ヒナの１次胚芽繊維芽細胞に（ＣＥＦ）同時トランスフェクトされた。トランスフェクションストックから得られた青色ウィルスは、ヘルペスウィルス組み換え体用のブルオガルスクリーン法（BLUOGAL SCREEN FOR RECOMBINANT HERPESVIRUS Procedure）を用いた連続的プラーク精製により精製された。この方法の終点で 100% のプラークが青色になったとき、ＤＮＡはｌａｃＺ遺伝子の存在について分析された。S-HVT-005 は、ＨＶＴの欠失されたｇＡ遺伝子の代わりにゲノムに組み込まれたｌａｃＺ遺伝子を含む組み換えウィルスである。組み換え S-HVT-005のテスト S-HVT-005 は、S-HVT-045 と同様の方法でワクチンとして処方されうる。ニワトリに投与した時に、これらのワクチンはマレック病に対する防御をもたらす。例１０マレック病ワクチンマレック病ウィルス由来の糖タンパクを発現する組み換えＨＶＴは、マレック病に対する優れたワクチンを生成する。我々は、ＭＤＶ糖タンパクを発現する数種類の組み換えＨＶＴを構築した。即ち、 S-HVT-004（例３）、 S-HVT-005（例９）、 S-HVT-045（例５）、 S-HVT-046（例１０Ａ）、S-HVT-047（例１０Ｂ）、 S-HVT-062（例１０Ｃ）である。例１０Ａ：S-HVT-046 S-HVT-046 は、独自の短領域（short unique region）へ挿入されたマレック病ウィルス（ＭＤＶ）の糖タンパクＢ（ｇＢ）及び糖タンパクＡ（ｇＡ）遺伝子を有する、七面鳥ヘルペスウィルスの組み換え体である。このＭＤＶ遺伝子類は、ＵＳ２遺伝子と同じ転写方向で挿入された。これらＭＤＶ抗原類は、ＨＶＴの等価抗原よりも適切な抗原反応を示すらしい。 S-HVT-046 は、「サブゲノムＤＮＡ断片から組み換えヘルペスウィルスを生成する方法（PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT HERPESVIRUS FROM SUBGENOM IC DNA FRAGMENTS）」に従って構築された。以下に示すサブゲノムクローンと酵素の組み合わせが用いられた。即ち、407-32.2C3には NotI 、172-07.BA2には B amHI、407-32.5G6には NotI 、407-32.1C1には NotI 、437-26.24 には BamHIと HindIII、437-26.26には BamHIと HindIII、及びカットしない456-17.22 である。適切なＤＮＡの挿入がなされたかどうかが、サザンブロット分析で確かめられた。例１０ＢS-HVT-047 S-HVT-047 は独自の短領域（short unique region）へ挿入されたＭＤＶ・ｇＢおよびｇＡ遺伝子を有する、七面鳥ヘルペスウィルスの組み換え体である。このＭＤＶ遺伝子類は、ＵＳ２遺伝子と同じ転写方向で挿入された。該ＭＤＶ抗原類は、ＨＶＴの等価抗原よりも適切な抗原反応を示すらしい。 S-HVT-047 は、「サブゲノムＤＮＡ断片から組み換えヘルペスウィルスを生成する方法（PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT HERPESVIRUS FROM SUBGENOM IC DNA FRAGMENTS）」に従って構築された。以下に示すサブゲノムクローンと酵素との組み合わせが用いられた。即ち、407-32.2C3には NotI 、172-07.BA2 には BamHI、 407-32.5G6 には NotI 、407-32.1C1 には NotI 、437-26.24 には BamHIと HindIII、437-26.26 には BamHIと HindIII、およびカットしない456-1 7.18 である。適切なＤＮＡの挿入がなされたかどうかは、サザンブロット分析で確かめられた。例１０ＣS-HVT-062 S-HVT-062は、独自の短領域（short unique region）へ挿入されたｇＢ、糖タンパクＤ（ｇＤ）及びｇＡ遺伝子を有する、七面鳥ヘルペスウィルスの組み換え体である。これらＭＤＶ遺伝子類は、ＵＳ２遺伝子と同じ転写方向で挿入された。このＭＤＶ抗原類は、ＨＶＴの等価抗原類よりも適切な抗原反応を示すらしい。S-HVT-062 は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規定に従って、1993年２月23日に、ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2401の下に、アメリカ合衆国メリーランド州20852 ロックウィル・12301 パークローンドライブに所在するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションの特許カルチャー寄託部に寄託された。 S-HVT-046 は、「サブゲノムＤＮＡ断片から組み換えヘルペスウィルスを生成する方法（PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT HERPESVIRUS FROM SUBGENOM IC DNA FRAGMENTS）」に従って構築された。以下に示すサブゲノムクローンと酵素との組み合わせが用いられた。即ち、407-32.2C3には NotI 、172-07.BA2 には BamHI、 407-32.5G6 には NotI 、407-32.1C1 には NotI 、437-26.24 には BamHIと HindIII、556-60.6 には BamHIと HindIII、及びカットしない456-17.2 2 である。適切なＤＮＡの挿入がなされたかどうかはサザンブロット分析で確かめられた。ＭＤＶ抗原を発現するＨＶＴ組み換え体のテストこれらの組み換えＨＶＴ／ＭＤＶウィルスの、病原性マレック病ウィルスの抗原投与に対する防御における有効性を示すために、２つの実験が行われた。第１の実験においては、１日齢の無菌（ＳＰＦ）ヒナが、S-HVT-045, S-HVT-046またはS-HVT-047 のいずれかでワクチン接種された。ワクチン接種後の５日目に、ワクチン接種したヒナ及びワクチン未接種のヒナ（即ち対照ヒナ）に対してＭＤＶを抗原投与した。抗原投与後の６週間にわたるマレック病に典型的な臨床兆候の観察に続いて、全てのヒナは殺され、マレック病に特有の損傷が検査された。表７の結果は、これらの組み換えウィルスが、ワクチン未接種の対照ヒナの84% にマレック病を引き起こした抗原投与に対して、完全な防御をもたらしたことを表している。第２の実験では、１日齢のヒナがS-HVT-062 でワクチン接種された。さらに２つヒナのグループが、ＨＶＴからなる従来型ワクチンであるUSDA認可品（USDA-l icensed）（市販品）及びＨＶＴとＳＢ−１ウィルスの混合物によりワクチン接種された。ワクチン接種後の５日目に、ワクチン接種したヒナ、ワクチン未接種のヒナ（対照ヒナ）に対してＭＤＶ抗原投与を行った。ヒナは、マレック病の臨床兆候を８週間観察された後、全てのヒナは殺され、マレック病の損傷が検査された。本実験によって、S-HVT-062 は抗原投与に対して100%の防御をもたらす能力を有することがわかった（表７）。市販のワクチンは、各々81% および95% の防御をもたらし、ワクチン未接種のヒナでは 100% がマレック病を発症した。例１１ニューキャッスル病とマレック病に対する２価ワクチンＮＤＶ由来タンパク質を発現する組み換えＨＶＴは、マレック病とニューカッスル病の両方に対して防御効果を有する２価のワクチンを作り出す。我々は、ＮＤＶタンパク質のS-HVT-007（例１１Ａ）、 S-HVT-048（例１１Ｂ）、 S-HVT- 049（例１１Ｃ）、 S-HVT-050（例１１Ｄ）及び S-HVT-106（例１１Ｅ）を発現させる数種の組み換えＨＶＴを構築した。例１１ＡS-HVT-007 S-HVT-007 は、独自の長領域（long unique region）に挿入された PRV gX プロモーター制御下にあるハイブリッド大腸菌のｌａｃＺ・ＮＤＶ・ＨＮハイブリッドタンパク遺伝子と、 HSV-1 a4 プロモーターの制御下にあるＮＤＶ・Ｆ遺伝子を有する、七面鳥ヘルペスウィルスの組み換え体である。ＮＤＶ遺伝子は、ＵＬ４３遺伝子と同じ転写方向で挿入されている。 S-HVT-007 を構築するために、HVT DNA およびプラスミド255-18.B16 が、「組み換えウィルスの生成のためのＤＮＡトランスフェクション法（DNA TRANSFEC TION FOR GENERATINGRECOMBINANT VIRUS procedure）」に従い、ヒナの１次胚芽繊維芽細胞（ＣＥＦ）へ同時トランスフェクトされた。トランスフェクションストックから得られた青色プラークは、ヘルペスウィルス組み換え体用ブルオガルスクリーン法（BLUOGAL SCREEN FOR RECOMBINANT HERPESVIRUS Procedure）を用いた連続的なプラーク精製により精製された。この方法の終点で、100%のプラークがブルーになったときに、ＤＮＡは上記挿入遺伝子の存在について分析された。例１１ＢS-HVT-048 S-HVT-048 は、独自の短領域（short unique region）に挿入された、ＨＣＭＶに隣接した即時型初期プロモーター（immediate early promoter）制御下にあるＭＤＶ・ｇＢおよびｇＡ遺伝子ならびにＮＤＶ・Ｆ遺伝子を有する、七面鳥ヘルペスウィルスの組み換え体である。ＭＤＶ遺伝子およびＮＤＶ遺伝子は、ＵＳ２遺伝子と同じ転写方向で挿入されている。 S-HVT-048 は、「サブゲノムＤＮＡ断片から組み換えヘルペスウィルスを生成する方法（PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT HERPESVIRUS FROM SUBGENOM IC DNA FRAGMENTS）」に従って構築された。以下に示すサブゲムクローンと酵素との組み合わせが用いられた。即ち、407-32.2C3 には NotI 、172-07.BA2 には BamHI、 407-32.5G6 には NotI 、407-32.1C1 には NotI 、437-26.24 には Ba mHIと HindIII、437-26.26 には BamHIと HindIII、及びカットされない535-70. 3である。適切なＤＮＡの挿入がなされたかどうかはサザンブロット分析で確かめられた。例１１ＣS-HVT-049 S-HVT-049 は、独自の短（short unique region）に挿入された PRV gX プロモーターの制御下にあるＭＤＶ・ｇＢ及びｇＡ遺伝子と、ＮＤＶ・ＨＮ遺伝子を有する七面鳥ヘルペスウィルスの組み換え体である。ＭＤＶ及びＮＤＶ遺伝子は、ＵＳ２遺伝子と同じ転写方向で挿入されている。 S-HVT-049 は、「サブゲムＤＮＡ断片から組み換えヘルペスウィルスを生成する方法（PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT HERPESVIRUS FROM SUBGENOMIC DNA FRAGMENTS）」に従って構築された。以下に示すサブゲムクローンと酵素との組み合わせが用いられた。即ち、 407-32.2C3 には NotI 、172-07.BA2 には BamHI、 407-32.5G6 には NotI 、407-32.1C1 には NotI 、437-26.24 には Bam HIと HindIII、437-26.26 には BamHIと HindIII、及びカットされない549-62.1 0 である。適切なＤＮＡの挿入がなされたかどうかはサザンブロット分析で確かめられた。例１１ＤS-HVT-050 S-HVT-050 は、ＭＤＶ・ｇＢ及びｇＡ遺伝子と、ＮＤＶ・ＨＮ及びＦ遺伝子を有する七面鳥ヘルペスウィルスの組み換え体である。ＮＤＶの２つの遺伝子は、夫々ＰＲＶ・ｇＸとＨＣＭＶに隣接したプロモーターの制御下にある。４つの全ての遺伝子は、ＵＳ２遺伝子と同じ転写方向で独自の短領域（short unique r egion）に挿入されている。 S-HVT-005 は、「サブゲムＤＮＡ断片から組み換えヘルペスウィルスを生成する方法（PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT HERPESVIRUS FROM SUBGENOMIC DNA FRAGMENTS）」に従って構築された。以下に示すサブゲノムクローンと酵素との組み合わせが用いられた。即ち、407-32.2C3 には NotI 、172-07.BA2 には BamHI、 407-32.5G6 には NotI 、407-32.1C1 には NotI 、437-26.24 には BamHIと HindIII、437
- 26.26 には BamHIと HindIII、およびカットされない549-24.15 である。適切なＤＮＡの挿入がなされたかどうかは、サザンブロット分析で確かめられた。S-HV T-050 は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規定に従って、1993年２月23日に、ＡＴＣＣ受付番号ＶＲ2400の下に、アメリカ合衆国メリーランド州20852 ロックウィル・12301 パークローンドライブに所在するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションの特許カルチャー寄託部に寄託された。例１１ＥS-HVT-106 S-HVT-106 は、ＭＤＶ・ｇＡ，ｇＢ及びｇＤ遺伝子と、ＮＤＶ・ＨＮ及びＦ遺伝子を有する七面鳥ヘルペスウィルスの組み換え体である。ＮＤＶの２つの遺伝子は、夫々ＰＲＶ・ｇＸ及びＨＣＭＶに隣接したプロモーターの制御下にある。５つの全ての遺伝子は、ＵＳ２遺伝子と同じ転写方向で独自の短領域（short unique region）に挿入されている。 S-HVT-050 は、「サブゲノムＤＮＡ断片から組み換えヘルペスウィルスを生成する方法（PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT HERPESVIRUS FROM SUBGENOM IC DNA FRAGMENTS）」に従って構築された。以下に示すサブゲノムクローンと酵素との組み合わせが用いられた。即ち、407-32.2C3には NotI 、172-07.BA2 には BamHI、 407-32.5G6 には NotI 、407-32.1C1 には NotI 、437-26.24 には Bam HIと HindIII、437-26.26 には BamHIと HindIII、及びカットされない633-13.2 7 である。ＮＤＶ抗原を発現する組み換えＨＶＴのテストこれらの組み換えＨＶＴ／ＭＤＶ／ＮＤＶウィルスの、病原性ニューカッスル病ウイルス及びマレック病ウィルスの抗原投与（Challenge）に対する防御有効性を示すために、２つの実験がなされた。第１の実験においては、１日齢の無菌（specific pathogen free）（ＳＰＦ）のヒナは、S-HVT-048，S-HVT-049，S- HVT-050，またはNDV B1/B1 ウィルスからなる従来型のワクチンであるUSDA認可品（USDA-licensed）の何れかでワクチン接種された。ワクチン接種後の３週間に、ワクチン接種されたヒナ及びワクチン未接種のヒナ（対照ヒナ）にはＮＤＶの抗原投与（challenge）が行われた。次いで、ヒナは疾病の臨床兆候を観察された。表８の結果では、これらの組み換えウィルス（S-HVT-048 及び S-HVT-050 ）がワクチン未接種の対照ヒナの100%でニューカッスル病を引き起こした抗原投与（challenge）に対して、完全な防御効果をもたらしたことを示している。組み換えウィルス S-HVT-049は、ニューカッスル病に対する部分的な防御を提供した。第２の実験では、１日齢のヒナを、S-HVT-050 でワクチン接種した。更に、２つのヒナのグループがＨＶＴからなる従来型のワクチンであるＵＳＤＡ認可品（ USDA-licensed）、並びにＨＶＴ及びＳＢ−１ウィルスの混合物によりワクチン接種された。ワクチン接種後の５日目に、ワクチン接種されたヒナ、及びワクチン未接種のヒナ（対照ヒナに）に対してＭＤＶの抗原投与（challenge）が行われた。次いで、ヒナは８週間マレック病の臨床兆候を観察された後に殺され、マレック病の損傷が検査された。本実験により、S-HVT-050 は市販のマレック病ワクチンよりもかなり、マレック病を防御する効能があることがわかった。例１２感染性喉頭気管炎及びマレック病に対する２価ワクチンＩＬＴウィルス由来の糖タンパクを発現する組み換えＨＶＴは、マレック病および感染性喉頭気管炎の両方に対して防御をもたらす２価ワクチンを生成する。我々は、ＩＬＴウィルス糖タンパク S-HVT-051（例１２Ａ）、 S-HVT-052（例１２Ｂ）及び S-HVT-104（例１１Ｃ）を発現する数種の組み換えＨＶＴを構築した。例１２ＡS-HVT-051 S-HVT-051 は、独自の短領域（short unique region）に挿入されたＩＬＴウィルスｇＢ遺伝子を有する、七面鳥ヘルペスウィルスの組み換え体である。ＩＬＴ遺伝子はＵＳ２遺伝子と同じ転写方向で挿入された。 S-HVT-051 は、「サブゲノムＤＮＡ断片から組み換えヘルペスウィルスを生成する方法（PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT HERPESVIRUS FROM SUBGENOM IC DNA FRAGMENTS）」に従って構築された。以下に示すサブゲノムクローンと酵素との組み合わせが用いられた。即ち、407-32.2C3には NotI 、172-07.BA2 には BamHI、 407-32.5G6 には NotI 、407-32.1C1 には NotI 、437-26.24 には BamHIと HindIII、437-26.26 には BamHIと HindIII、及びカットされない528-1 1.34 である。適切なＤＮＡが挿入されたどうかは、サザンブロット分析で確かめられた。例１２ＢS-HVT-052 S-HVT-052 は、独自の短領域（short unique region）へ挿入されたＩＬＴウィルスｇＤ遺伝子を有する七面鳥ヘルペスウィルスの組み換え体である。ＩＬＴ遺伝子は、ＵＳ２遺伝子と反対の転写方向で挿入された。 S-HVT-052 は、「サブゲノムＤＮＡ断片から組み換えヘルペスウィルスを生成する方法（PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT HERPESVIRUS FROM SUBGENOM IC DNA FRAGMENTS）」に従い構築された。以下に示すサブゲノムクローンと酵素との組み合わせが用いられた。即ち、 407-32.2C3 には NotI 、172-07.BA2 には BamHI、 407-32.5G6 には NotI 、407-32.1C1 には NotI 、437-26.24 には BamHIと HindIII、437-26.26 には BamHIと HindIII、及びカットされない528-0 3.37 である。適切なＤＮＡの挿入がなされたどうかは、サザンブロット分析で確かめられた。例１２ＣS-HVT-104 S-HVT-104 は、６つの外来遺伝子を含む七面鳥ヘルペスウィルスの組み換え体である。ＭＤＶ・ｇＡ，ｇＢ及びｇＤ遺伝子は、ＵＳ２遺伝子と同じ転写方向で独自の短領域（unique short region）に挿入された。大腸菌ｌａｃＺマーカー遺伝子とＩＬＴ・ｇＢ及びｇＤ遺伝子は、ＵＬ４３遺伝子と同じ転写方向で、 BamHI #16 断片に挿入された。 S-HVT-104 を構築するために、S-HVT-062 及びプラスミド 634-29.16 からのＤＮＡが、「組み換えウィルス生成のためのＤＮＡトランスフェクション法（DNA TRANSFECTION FOR GENERATING RECOMBINANT VIRUS procedur e）」に従い、ヒナの１次胚芽繊維芽細胞（ＣＥＦ）へ同時トランスフェクションされた。ＩＬＴ抗原を発現するＨＶＴ組み換え体のテスト以下に述べる実験は、これらの組み換えＨＶＴ／ＩＬＴウィルスの、病原性の感染性喉頭気管炎ウィルスの抗原投与（Challenge）に対する防御の有効性を示すために行われた。１日齢の無菌（ＳＰＦ）ヒナが、 S-HVT-051、 S-HVT-052 、S-HVT-051 及び S-HVT-052の混合物、並びにＩＬＴウィルスからなる従来型のワクチンであるUSDA認可品（USDA-licensed）のいずれかでワクチン接種された。ワクチン接種後の２〜３週間、ワクチン接種したヒナ、ワクチン未接種のヒナ（即ち対照ヒナ）ＩＬＴで抗原投与された。その後、ヒナは疾病の臨床的兆候が観察された。表９の結果にから、これらの組み換えウィルス（S-HVT-051 及び S -HVT-052）が、市販のＩＬＴワクチンに匹敵する程の、ＩＬＴウィルスの抗原投与に対する防御をもたらすことが示された。ここに示されたワクチンでワクチン接種された動物は、病原性ＩＬＴに感染した動物から容易に識別し得る。この識別は、識別したいヒナを、ｇＢまたはｇＤ以外の何れかのＩＬＴ抗原に対する抗体を検査する事により可能である。このような抗原の例としては、ＩＬＴ糖タンパクＣ，Ｅ，及びＧがある。ワクチン接種された未感染のヒナはこれら抗原に対し陰性を示すであろうが、感染しているヒナは陽性を示すであろう。例１３感染性滑液包嚢疾病とマレック病に対する２価ワクチンＩＢＤＶ由来のタンパクを発現させる組み換えＨＶＴは、マレック病と感染性滑液包嚢疾病の両方に対する防御をもたらす２価ワクチンを生成する。我々はＩＢＤＶタンパクを発現させる数種の組み換えＨＶＴを構築した。これらのウィルスには、 S-HVT-003（例２）及び S-HVT-096が含まれる。 S-HVT-096 は、独自の短領域（short unique region）に挿入されたＨＣＭＶに隣接した即時型初期プロモーター（immediate early promoter）の制御下にあるＩＢＤＶ・ＶＰ２遺伝子を有する七面鳥ヘルペスウィルスの組み換え体である。こんＩＢＤＶ遺伝子は、ＵＳ２遺伝子と同じ転写方向で挿入されている。 S-HVT-096 は、「サブゲノムＤＮＡ断片から組み換えヘルペスウィルスを生成する方法（PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT HERPESVIRUS FROM SUBGENOM IC DNA FRAGMENTS）」に従って構築された。以下に示すサブゲノムクローンと酵素の組み合わせが用いられた。即ち、 407-32.2C3 にはNotI、172-07.BA2 には BamHI、 407-32.5G6 には NotI 、407-32.1C1 には NotI 、437-26.24 には Bam HIと HindIII、556-60.6 には BamHI、及びカットしない 602-57.F1である。適切なＤＮＡの挿入がなされたかどうかは、サザンブロット分析で確かめられた。ＩＢＤＶ抗原を発現する組み換えＨＶＴのテスト S-HVT-096 は、黒色プラーク及びウエスタンブロット分析によるＶＰ２の発現によって分析された。何れの分析によっても、ウィルスはＩＢＤＶ中性化（ne utralizing）モノクローナル抗体と特異的に反応する高次のタンパクを発現させていることが示された。このウィルスは、感染性滑液包嚢疾病に対するワクチンとして有効であろう。例１４感染性気管支炎及びマレック病に対する２価ワクチン S-HVT-066 は、ＭＤＶ・ｇＢ，ｇＤ，及びｇＡ遺伝子と、ＩＢＶ・スパイク（spike）及びマトリックス（matrix）遺伝子を含む七面鳥ヘルペスウィルスの組み換え体である。ＩＢＶ・スパイク及びマトリックス遺伝子は、夫々ＨＣＭＶに隣接する即時型初期プロモーター（immediate early promoter）及びＰＲＶ・ｇＸプロモーターの制御下にある。５つの全ての遺伝子は、独自の短領域に挿入されている。ＭＤＶ遺伝子及びＩＢＶ遺伝子は、ＵＳ２遺伝子と同じ転写方向で挿入されている。 S-HVT-066 は、「サブゲノムＤＮＡ断片から組み換えヘルペスウィルスを生成する方法（PROCEDURE FOR GENERATING RECOMBINANT HERPESVIRUS FROM SUBGENOM IC DNA FRAGMENTS）」に従って構築された。以下に示すサブゲノムクローンと酵素の組み合わせが用いられた。即ち、 407-32.2C3 には NotI 、172-07.BA2 には BamHI、 407-32.5G6 には NotI 、407-32.1C1 には NotI 、437-26.24 には BamHIと HindIII、 556-60.6 には BamHI、及びカットしない 567-72.1Dである。適切なＤＮＡの挿入がなされたかどうかは、サザンブロット分析で確かめられた。ＩＢＶ抗原を発現するＨＶＴ組み換え体のテスト S-HVT-066 は、黒色プラーク及びウエスタンブロット分析によるＩＢＶスパイクタンパクの発現によって分析された。何れの分析によっても、該ウィルスはＩＢＶ中性化（neutralizing）モノクローナル抗体と特異的に反応する高次のタンパク質を発現させていることが示された。このウィルスは、感染性気管支炎に対するワクチンとして有効であろう。例２１種々の病原体由来の抗原を発現するＨＶＴを利用したワクチン我々は、以下に示す病原体由来の抗原についても、飼鳥類のワクチンの開発に利用され得ると期待している。即ち、ニワトリヒナ貧血病原体（anemia agent ）、鳥類の脳脊髄炎ウィルス、鳥類のレオウィルス、鳥類のパラミクソウィルス、鳥類のインフルエンザウィルス、鳥類のアデノウィルス、鶏痘ウィルス、鳥類のコロナウィルス、鳥類のローダウィルス、サルモネラ菌（Salmonella spp）、大腸菌（E.coli）、パスツレラ菌（Pasteurella spp）、ハエモフィラス菌（Hae mophilusspp）、クラミジア菌（Chlamydia spp）、マイコプラズマ菌（Mycoplas ma spp）、カンピロバクター菌（campylobacter spp）、ボルデテラ菌（百日咳菌）（Bordetella spp）、飼鳥の線虫、サナダムシ、吸虫、飼鳥のダニ／シラミ、飼育鳥の原生動物（イメリア原虫（Eimeria spp）、ヒストモナス原虫（Histomonas spp）、トリコモナス原虫（Trichomonas spp））である。参照文献

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 39/265 9284−4Ｃ 39/295 ＡＦＥ 9284−4ＣＣ１２Ｎ 7/00 8931−4Ｂ //(Ａ６１Ｋ 39/295 39:255 39:17 39:265） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ

Claims

【特許請求の範囲】１．七面鳥ヘルペスウイルスのゲノムＤＮＡ中に挿入された外来遺伝子を有する組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、前記外来遺伝子は、（ａ）前記七面鳥ヘルペスウイルスのゲノムＤＮＡのＵＳ２遺伝子コーディング領域における独自のＳｔｕＩ部位に挿入されており、また（ｂ）七面鳥ヘルペスウイルスに感染したホスト細胞内で前記外来遺伝子が発現され得る、組換え七面鳥ヘルペスウイルス。２．請求項１に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、前記外来遺伝子がポリペプチドをコードする組換え七面鳥ヘルペスウイルス。３．請求項２に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、前記ポリペプチドが、前記組換えヘルペスウイルスを導入される動物において抗原性である組換え七面鳥ヘルペスウイルス。４．請求項２に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、前記ポリペプチドが、大腸菌（E.coli）βガラクトシダーゼである組換え七面鳥ヘルペスウイルス。５．請求項４に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、Ｓ−ＨＶＴ− ０１２と命名された組換え七面鳥ヘルペスウイルス。６．請求項３に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、前記抗原性ポリペプチドをコードする外来遺伝子が、マレック病ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、感染性喉頭気管炎ウイルス、感染性気管支炎ウイルス、又は感染性滑液嚢包病ウイルスに由来する組換え七面鳥ヘルペスウイルス。７．請求項６に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、抗原性ポリペプチドをコードする前記外来遺伝子がマレック病ウイルス由来であり、マレック病ウイルス糖タンパクｇＡ、マレック病ウイルス糖タンパクｇＢまたはマレック病ウイルス糖タンパクｇＤをコードする組換え七面鳥ヘルペスウイルス。８．請求項７に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、前記抗原性ポリペプチドがマレック病ウイルス糖タンパクｇＢである組換え七面鳥ヘルペスウイルス。９．請求項８に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、Ｓ−ＨＶＴ− ０４５と命名された組換え七面鳥ヘルペスウイルス。１０．請求項８に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、更に、マレック病ウイルス糖タンパクｇＡをコードする外来遺伝子を具備する組換え七面鳥ヘルペスウイルス。１１．請求項１０に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、Ｓ−ＨＶＴ−０４６と命名された組換え七面鳥ヘルペスウイルス。１２．請求項１０に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、Ｓ−ＨＶＴ−０４７と命名された組換え七面鳥ヘルペスウイルス。１３．請求項１０に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、更に、マレック病ウイルス糖タンパクｇＤをコードする外来遺伝子を具備する組換え七面鳥ヘルペスウイルス。１４．請求項１３に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、Ｓ−ＨＶＴ−０６２と命名された組換え七面鳥ヘルペスウイルス。１５．請求項６に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、前記外来遺伝子がニューキャッスル病ウイルス由来であり、ニューキャッスル病ウイルス融合タンパクまたはニューキャッスル病ウイルス・ヘマグルチニンノイラミニダーゼをコードする組換え七面鳥ヘルペスウイルス。１６．請求項１５に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、前記抗原性ポリペプチドがニューキャッスル病ウイルス融合タンパクである組換え七面鳥ヘルペスウイルス。１７．請求項１５に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、前記抗原性ポリペプチドがニューキャッスル病ウイルス・ヘマグルチニンノイラミニダーゼである組換え七面鳥ヘルペスウイルス。１８．請求項１５に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、更に、マレック病ウイルス由来の外来遺伝子を具備し、この外来遺伝子はマレック病ウイルス糖タンパクｇＡ、マレック病ウイルス糖タンパクｇＢまたはマレック病ウイルス糖タンパクｇＤをコードする組換え七面鳥ヘルペスウイルス。１９．請求項１６に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、更に、マレック病ウイルス糖タンパクｇＡをコードする外来遺伝子およびマレック病ウイルス糖タンパクｇＢをコードする外来遺伝子を具備し、これらマレック病ウイルス遺伝子は両者共に、前記七面鳥ヘルペスウイルスゲノムのＵＳ２遺伝子コーディング領域における独自のＳｔｕＩ部位に挿入される組換え七面鳥ヘルペスウイルス。２０．請求項１９に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、Ｓ−ＨＶＴ−０４８と命名された組換え七面鳥ヘルペスウイルス。２１．請求項１７に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、更に、マレック病ウイルス糖タンパクｇＢをコードする外来遺伝子およびマレック病ウイルス糖タンバクｇＡをコードする外来遺伝子を具備し、これらマレック病ウイルス遺伝子は両者共に、前記七面鳥ヘルペスウイルスゲノムのＵＳ２遺伝子コーディング領域における独自のＳｔｕＩ部位に挿入される組換え七面鳥ヘルペスウイルス。２２．請求項２１に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、Ｓ−ＨＶＴ−０４９と命名された組換え七面鳥ヘルペスウイルス。２３．請求項１６に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、更に、ニューキャッスル病ウイルス・ヘマグルチニンノイラミニダーゼをコードする外来遺伝子を具備し、このヘマグルチニンノイラミニダーゼ遺伝子は、前記七面鳥ヘルペスウイルスゲノムのＵＳ２遺伝子コーディング領域における独自のＳｔｕＩ部位に挿入される組換え七面鳥ヘルペスウイルス。２４．請求項２３に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、更に、マレック病ウイルス糖タンパクｇＡをコードする外来遺伝子およびマレック病ウイルス糖タンパクｇＢをコードする外来遺伝子を具備し、これらマレック病ウイルス遺伝子は両者共に、前記七面鳥ヘルペスウイルスゲノムのＵＳ２遺伝子コーディング領域における独自のＳｔｕＩ部位に挿入される組換え七面鳥ヘルペスウイルス。２５．請求項２６に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、Ｓ−ＨＶＴ−０５０と命名された組換え七面鳥ヘルペスウイルス。２６．請求項２４に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、更に、前記七面鳥ヘルペスウイルスゲノムのＵＳ２遺伝子コーディング領域における独自のＳｔｕＩ部位に挿入された、マレック病ウイルス糖タンパクｇＤをコードする外来遺伝子を具備した組換え七面鳥ヘルペスウイルス。２７．請求項２６に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、Ｓ−ＨＶＴ−１０６と命名された組換え七面鳥ヘルペスウイルス。２８．請求項６に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、前記抗原性の外来遺伝子は感染性喉頭気管炎ウイルス由来であり、感染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパクｇＢ、または感染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパクｇＤをコードする組換え七面鳥ヘルペスウイルス。２９．請求項２８に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、前記外来遺伝子が感染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパクｇＢをコードする組換え七面鳥ヘルペスウイルス。３０．請求項２９に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、Ｓ−ＨＶＴ−０５１と命名された組換え七面鳥ヘルペスウイルス。３１．請求項２８に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、前記外来遺伝子が感染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパクｇＤをコードする組換え七面鳥ヘルペスウイルス。３２．請求項３１に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、Ｓ−ＨＶＴ−０５２と命名された組換え七面鳥ヘルペスウイルス。３３．請求項３１に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、更に、前記七面鳥ヘルペスウイルスゲノムのＵＳ２遺伝子コーディング領域における独自のＳｔｕＩ部位に挿入された、感染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパクｇＢをコードする外来遺伝子を具備した組換え七面鳥ヘルペスウイルス。３４．請求項２８に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、更に、マレック病ウイルス由来の外来遺伝子を具備し、この外来遺伝子がマレック病ウイルス糖タンパクｇＡ、マレック病ウイルス糖タンパクｇＢまたはマレック病ウイルス糖タンパクｇＤをコードする組換え七面鳥ヘルペスウイルス。３５．請求項６に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、前記外来遺伝子が感染性気管支炎ウイルス由来であり、感染性気管支炎ウイルスのスパイクタンパク、または感染性気管支炎ウイルスのマトリックスタンパクをコードする組換え七面鳥ヘルペスウイルス。３６．請求項３５に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、前記外来遺伝子が、感染性気管支炎ウイルスのスパイクタンパクをコードする組換え七面鳥ヘルペスウイルス。３７．請求項３６に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、更に、前記七面鳥ヘルペスウイルスゲノムのＵＳ２遺伝子コーディング領域における独自のＳｔｕＩ部位に挿入された、感染性気管支炎ウイルスのマトリックスタンパクをコードする外来遺伝子を具備する組換え七面鳥ヘルペスウイルス。３８．請求項３７に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、更に、マレック病ウイルス由来の外来遺伝子を具備し、この外来遺伝子がマレック病ウイルス糖タンパクｇＡ、マレック病ウイルス糖タンパクｇＢまたはマレック病ウイルス糖タンパクｇＤをコードする組換え七面鳥ヘルペスウイルス。３９．請求項３７に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、更に、マレック病ウイルス糖タンパクｇＡ、マレック病ウイルス糖タンパクｇＢまたはマレック病ウイルス糖タンパクｇＤをコードする外来遺伝子を具備し、このマレック病ウイルス遺伝子は前記七面鳥ヘルペスウイルスゲノムのＵＳ２遺伝子コーディング領域における独自のＳｔｕＩ部位に挿入されている組換え七面鳥ヘルペスウイルス。４０．請求項３９に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、Ｓ−ＨＶＴ−０６６と命名された組換え七面鳥ヘルペスウイルス。４１．請求項６に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、前記外来遺伝子が感染性滑液嚢包病ウイルス由来である組換え七面鳥ヘルペスウイルス。４２．請求項４１に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、前記外来遺伝子が、感染性滑液嚢包病ウイルスＶＰ２遺伝子をエンコードする組換え七面鳥ヘルペスウイルス。４３．請求項４２に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、Ｓ−ＨＶＴ−０９６と命名された組換え七面鳥ヘルペスウイルス。４４．請求項４１に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、更に、マレック病ウイルス由来の外来遺伝子を具備し、この外来遺伝子はマレック病ウイルス糖タンパクｇＡ、マレック病ウイルス糖タンパクｇＢまたはマレック病ウイルス糖タンバクｇＤをコードする組換え七面鳥ヘルペスウイルス。４５．請求項１に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、前記外来遺伝子がヘルペスウイルス・プロモータの制御下にある組換え七面鳥ヘルペスウイルス。４６．請求項４５に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスであって、前記プロモータがＰＲＶ−・ｇＸ、ＨＳＶ−１、アルファ４、ＨＣＭＶ即時型初期、ＭＤＶ−ｇＡ、ＭＤＶ・ｇＢ、ＭＤＶ・ｇＤ、ＩＬＴ・ｇＢおよびＩＬＴ・ｇＤから選択される組換え七面鳥ヘルペスウイルス。４７．七面鳥ヘルペスウイルスのゲノムＤＮＡ中に外来遺伝子を挿入することにより、組換え七面鳥ヘルペスウイルスを製造するための相同性ベクターであって、ａ）通常は七面鳥ヘルペスウイルス・ゲノムＤＮＡ内に存在しない二本鎖の外来ＤＮＡと、ｂ）前記外来ＤＮＡの一端において、七面鳥ヘルペスウイルス・ゲノムＤＮＡのＵＳ２遺伝子コーディング領域における独自のＳｔｕＩ部位の一方側に位置したゲノムＤＮＡに対して相同的な、二本鎖の七面鳥ヘルペスウイルスＤＮＡと、ｃ）前記外来遺伝子の他端において、七面鳥ヘルペスウイルス・ゲノムＤＮＡのＵＳ２遺伝子コーディング領域における独自のＳｔｕＩ部位の他方側に位置したゲノムＤＮＡに対して相同的な、二本鎖の七面鳥ヘルペスウイルスＤＮＡとから実質的になる二本鎖ＤＮＡ分子を具備した相同性べクター。４８．請求項４７に記載の相同性べクターであって、前記ポリペプチドが、前記組換え七面鳥ヘルペスウイルスが導入される動物内において抗原性である相同性ベクター。４９．請求項４８に記載の相同性ベクターであって、前記抗原性ポリペプチドが滑液嚢包病ウイルス、マレック病ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、感染性喉頭気管炎ウイルス、または感染性気管支炎ウイルス由来である相同性ベクター。５０．請求項４９に記載の相同性ベクターであって、前記抗原性ポリペプチドが、感染性滑液嚢包病ウイルスポリタンパク、感染性滑液嚢包病ウイルスＶＰ２タンパク、マレック病ウイルス糖タンパクｇＢ、マレック病ウイルス糖タンパクｇＡ、マレック病ウイルス糖タンパクｇＤ、ニューキャッスル病ウイルス融合タンパク、ニューキャッスル病ウイルスのヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ、感染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパクｇＢ、感染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパクｇＤ、感染性気管支炎ウイルスのスパイクタンパク、または感染性気管支炎ウイルスのマトリックスタンパクである相同性ベクター。５１．請求項４７に記載の相同性ベクターであって、前記検出マーカーが大腸菌（E.coli）βガラクトシダーゼである相同性ベクター。５２．４３５−４７．１と命名された、請求項４５に記載の相同性ベクター。５３．マレック病ウイルスに対して鳥類を免疫化するために有用なワクチンであって、免疫化に有効なの請求項７，９，１０，１１，１２，１３または１４に記載の組換え七面鳥へルペスウイルスと、適切なキャリアとを含有するワクチン。５４．マレック病ウイルスおよびニューキャッスル病ウイルスに対して鳥類を免疫化するために有用な多価ワクチンであって、免疫化に有効な量の請求項５，１５，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６または２７に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスを含有する多価ワクチン。５５．マレック病ウイルスおよび感染性喉頭気管炎ウイルスに対して鳥類を免疫化するために有用な多価ワクチンであって、免疫化に有効な量の請求項２８，３０，３２，３３または３４に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスと、適切なキャリアとを含有する多価ワクチン。５６．マレック病ウイルスおよび感染性気管支炎ウイルスに対して鳥類を免疫化するために有用な多価ワクチンであって、免疫化に有効な量の請求項３５，３７，３８，３９または４０に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスを含有する多価ワクチン。５７．マレック病ウイルスおよび感染性滑液嚢包病ウイルスに対して鳥類を免疫化するために有用な多価ワクチンであって、免疫化に有効な量の請求項４２，４３または４４に記載の組換え七面鳥ヘルペスウイルスと、適切なキャリアとを含有する多価ワクチン。５８．マレック病ウイルスに対して鳥類を免疫化する方法であって、鳥類に対して、免疫化に有効な量の請求項５３のワクチンを投与することを具備した方法。５９．マレック病ウイルスおよびニューキャッスル病ウイルスに対して鳥類を免疫化する方法であって、鳥類に対して、免疫化に有効な量の請求項５４のワクチンを投与することを具備した方法。６０．マレック病ウイルスおよび感染性喉頭気管炎ウイルスに対して鳥類を免疫化する方法であって、鳥類に対して、免疫化に有効な量の請求項５５のワクチンを投与することを具備した方法。６１．マレック病ウイルスおよび感染性気管支炎Ｔウイルスに対して鳥類を免疫化する方法であって、鳥類に対して、免疫化に有効な量の請求項５６のワクチンを投与することを具備した方法。６２．マレック病ウイルスおよび感染性滑液嚢包病ウイルスに対して鳥類を免疫化する方法であって、鳥類に対して、免疫化に有効な量の請求項５７のワクチンを投与することを具備した方法。６３．請求項１の組換え七面鳥ヘルペスウイルスに感染させたホスト細胞。６４．ホスト細胞が鳥類細胞である、請求項６３に記載のホスト細胞。