ES2935643T3 - Construcciones de virus de la enfermedad de Marek no patógeno recombinante que codifican antígenos del virus de la laringotraqueítis infecciosa y del virus de la bursitis infecciosa - Google Patents

Abstract

La presente invención describe construcciones de virus de la enfermedad de Marek no patogénicas multivalentes recombinantes novedosas que codifican y expresan antígenos proteicos del virus de la laringotraqueítis infecciosa y un antígeno proteico del virus de la enfermedad infecciosa de la bursitis, y métodos para su uso en vacunas para aves. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Construcciones de virus de la enfermedad de Marek no patógeno recombinante que codifican antígenos del virus de la laringotraqueítis infecciosa y del virus de la bursitis infecciosa

Campo de la invención

La presente invención se refiere a construcciones novedosas multivalentes de virus de la enfermedad de Marek no patógeno recombinante que codifican y expresan antígenos de proteínas del virus de la laringotraqueítis infecciosa y del virus de la bursitis infecciosa, y a métodos para su uso en vacunas para aves de corral.

Antecedentes de la invención

Los virus patógenos de las aves de corral no solo debilitan a los pollos, sino que también son costosos para los criadores de pollos porque la mayoría de las enfermedades resultantes son contagiosas y la industria avícola depende en gran medida de las instalaciones de cría confinadas a gran escala. La vacunación de pollitos jóvenes es a menudo el único medio viable para combatir estos virus. Aunque las vacunas víricas atenuadas o inactivadas para aves de corral siguen siendo importantes en el mercado, en los últimos años se han gastado recursos considerables en el desarrollo de vacunas que contienen construcciones víricas recombinantes que expresan antígenos de proteínas víricas de patógenos. Adicionalmente, se han realizado esfuerzos considerables para construir vectores de virus de la enfermedad de Marek no patógeno recombinante (abreviado como rMDV^np, del inglés recombinant non-pathogenic Marek's Disease virus) multivalentes estables y eficaces que expresen genes extraños de múltiples patógenos víricos. Dichas vacunas multivalentes servirían para minimizar el número de inyecciones administradas a los pollitos y, de ese modo, reducir las molestias y el estrés del pollito vacunado, así como reducir significativamente los costes en mano de obra y materiales. La vacunación con tales construcciones multivalentes únicas también sería preferible a las vacunas multivalentes de rMDV^np alternativas que contienen múltiples construcciones recombinantes monovalentes de rMDV^np, ya que estas vacunas alternativas, al menos hasta la fecha, han dado como resultado la protección solo contra un único patógeno vírico. El fracaso de tales vacunas alternativas se debe presumiblemente a que una de las construcciones monovalentes de rMDV^np sobrepasa a las otras construcciones de rMDV^np monovalentes, impidiendo así que estas otras construcciones de rMDV^np monovalentes induzcan una respuesta inmunitaria significativa. En cualquier caso, a pesar de los esfuerzos considerables que se realizaron en el pasado para construir vectores de rMDV^np multivalentes estables y eficaces que expresan genes extraños de múltiples patógenos víricos, de hecho, hace más de veinte años que se propusieron vacunas de este tipo [véase, por ejemplo, el documento US 5.965.138], solo recientemente se ha demostrado que una vacuna multivalente que comprende un herpesvirus de pavos recombinante (abreviado como rHVT, del inglés recombinant herpesvirus of turkeys) que codifica antígenos de más de otro patógeno es estable y eficaz (documento WO 2016/102647).

Una enfermedad vírica de aves de corral que puede controlarse mediante vacunación es la enfermedad de Marek. La enfermedad de Marek es una enfermedad patógena que afecta adversamente a los pollos en todo el mundo. La enfermedad de Marek se produce predominantemente en pollos jóvenes entre los 2 y 5 meses de edad. Los signos clínicos incluyen: parálisis progresiva de una o más de las extremidades, falta de coordinación debido a la parálisis de las patas, caída del miembro debido a la afectación del ala, y posición baja de la cabeza debido a la afectación de los músculos del cuello. En casos agudos, puede producirse una depresión grave. También se puede desarrollar atrofia bursal y tímica.

El agente etiológico de la enfermedad de Marek es el virus de la enfermedad de Marek serotipo 1 (abreviado como MDV1, del inglés Marek's disease virus serotype 1), un virus asociado a las células que tiene un genoma de ADN bicatenario. El MDV1 es un alphaherpesvirus aviar linfotrópico que: (i) infecta linfocitos B, lo que puede dar como resultado citólisis, y (ii) infecta linfocitos T de forma latente, lo que puede inducir linfoma de linfocitos T. Relacionado estrechamente con la cepa virulenta MDV1, el virus de la enfermedad de Marek serotipo 2 (abreviado como MDV2, del inglés Marek's disease virus serotype 2), anteriormente conocido como Gallid herpesvirus 3, es una cepa del MDV atenuada de forma natural que ha demostrado tener poca o ninguna acción patógena en pollos [Petherbridge et al., J. Virological Methods 158:11-17 (2009)]. SB-1 es una cepa específica del MDV2 que ha demostrado ser útil en vacunas contra el MDV1 [véase, por ejemplo, Murthy y Calnek, Infection and Immunity 26(2) 547-553 (1979)].

Otro alphaherpesvirus estrechamente relacionado, el virus de la enfermedad de Marek serotipo 3 (abreviado como MDV3, del inglés Marek's disease virus serotype 3), más ampliamente conocido como herpesvirus de los pavos (abreviado como HVT), es un virus no patógeno de los pavos domésticos [véase, por ejemplo, Kingham et al., J. of General Virology 82:1123-1135 (2001)]. Dos cepas de HVT comúnmente usadas son la cepa PB1 y la cepa FC126. Considerando que, el HVT también es no patógeno en pollos, induce una respuesta inmunitaria protectora de larga duración en pollos contra MDV1. Por consiguiente, el HVT se ha usado en vacunas para aves de corral contra el MDV1 virulento durante muchos años, generalmente en combinación con SB-1, que es más virémico que el HVT, pero se considera menos seguro. Alternativamente, cuando las aves se exponen a cepas de MDV1 particularmente virulentas, el HVT se puede combinar con la vacuna de Rispen. La vacuna de Rispen es un aislado que se originó a partir de una cepa de MDV1 levemente virulenta que posteriormente se debilitó aún más por el pasaje en células. La cepa de Rispen, sin embargo, conserva cierta virulencia hacia líneas de pollos altamente susceptibles.

La secuencia del genoma completo del HVT se ha divulgado [Afonso et al., J. Virology 75(2):971-978 (2001)], y, como la mayoría de los alphaherpesvirus, el HVT posee un número significativo de sitios potenciales de inserción no esenciales [véase, por ejemplo, los documentos US 5.187.087; U.S. 5.830.745; U.S. 5.834.305; U.S. 5.853.733; U.S.

5.928.648; U.S. 5.961.982; U.S. 6.121.043; U.S. 6.299.882 B1]. Además, se ha demostrado que el HVT es susceptible de modificación genética y, por tanto, se ha usado como un vector recombinante durante muchos años [documento WO 87/04463]. Por consiguiente, se ha informado que los vectores del HVT recombinantes expresan genes extraños que codifican antígenos de, por ejemplo, el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV, del inglés Newcastle Disease Virus), [Sondermeijer et al., Vaccine, 11:349-358 (1993); Reddy et al., Vaccine, 14:469-477 (1996)], el virus de la bursitis infecciosa (IBDV, del inglés Infectious Bursal Disease Virus), [Darteil et al., Virology, 211:481-490 (1995); Tsukamoto et al., J. of Virology 76(11):5637-5645 (2002)] y el virus de la laringotraqueítis infecciosa (ILTV, del inglés Infectious Laryngotracheitis Virus) [Johnson et al., Avian Disease, 54(4):1251-1259 (2010); los documentos WO O 92/03554; U.S. 6.875.856]. También se conoce la secuencia genómica completa de MDV2 [véase, n.° de ref. de GenBan: AB049735.1, y Petherbridge et al., citado anteriormente]. La organización genómica del MDV2 es muy similar a la del HVT, con la región US en particular, siendo idéntica a la del HVT [véase, Kingham et al., citado anteriormente].

Además, se ha construido un virus quimérico recombinante conocido como el novedoso herpesvirus aviar (NAHV, del inglés novel avian herpesvirus), en el que regiones específicas del genoma del HVT se han reemplazado por las regiones correspondientes del genoma del MDV1. El NAHV también se ha usado para expresar genes extraños que codifican antígenos de otros virus de aves de corral [documentos US 5.965.138; US 6.913.751].

Como el MDV, el virus de la laringotraqueítis infecciosa (abreviado como ILTV o ILT) es un alphaherpesvirus que afecta adversamente a los pollos, en todo el mundo [Fuchs et al., Veterinary Research 38:261-279 (2007)]. El ILTV provoca una enfermedad respiratoria aguda en pollos, que se caracteriza por depresión respiratoria, jadeo y expectoración de exudado con sangre.

La replicación vírica se limita a las células del tracto respiratorio, donde, en la tráquea, la infección da lugar a la erosión y hemorragia del tejido.

El virus de la bursitis infecciosa (abreviado como IBDV o IBD), también llamado virus de la enfermedad de Gumboro, es el agente causal de bursitis infecciosa. El IBDV provoca una infección vírica aguda y altamente contagiosa del tejido linfoide de los pollos, siendo su diana principal el órgano inmunitario esencial de las aves: la bolsa de Fabricio. La tasa de morbilidad en las parvadas susceptibles es alta, con una rápida pérdida de peso y tasas de mortalidad de moderadas a altas. Los pollitos que se recuperan de la enfermedad pueden tener deficiencias inmunitarias debido a la destrucción de (o partes de) la bolsa de Fabricio. Esto los hace particularmente vulnerables a infecciones secundarias.

EL IBDV es un miembro de la familia Birnaviridae. Los virus de esta familia tienen un genoma que consiste en dos segmentos (A y B) de ARN bicatenario. Existen dos serotipos de IBDV, el serotipo 1 y 2, que pueden diferenciarse mediante pruebas de neutralización de virus (NV). Se ha demostrado que los virus del serotipo 1 son patógenos para los pollos, mientras que los virus del serotipo 2 solo provocan enfermedades subagudas en pavos. Históricamente, los virus IBDV del serotipo 1 consistían en un solo tipo que ahora se conoce como virus IBD "clásico". Más recientemente, han surgido las llamadas cepas de IBDV "variantes". Las cepas clásicas y variantes del IBDV se pueden identificar y distinguir mediante una prueba de neutralización de virus usando un panel de anticuerpos monoclonales, o por RT-PCR [Wu et al., Avian Diseases, 51:515-526(2007)]. Las cepas IBDV clásicas bien conocidas incluyen, D78, Faragher 52/70 y STC, mientras que 89/03 es una cepa variante bien conocida. Están disponibles en el mercado muchas vacunas para el IBDV vivas o inactivadas, por ejemplo, una vacuna viva tal como NOBILISR Gumboro D78 (MSD Animal Health).

Como se ha indicado anteriormente, debido a que el HVT puede actuar como un antígeno que proporciona una protección significativa contra la enfermedad de Marek y como un vector recombinante, actualmente se usa como un vector plataforma para vacunas multivalentes tales como Innovax®-ILT (comercializada por Merck Animal Health), que protege contra el ILTV; Innovax®-ND-SB (vendida por Merck Animal Health) Vectormune® HVT-NDV (vendida por Ceva), que protegen contra el NDV; y Vaxxitek® h Vt IBD (Merial; anteriormente nombrado: Gallivac™ HVT-IBD) y Vectormune™ HVT-IBD (Ceva), que protegen contra el IBDV. Notablemente, Innovax®-ILT comprende dos genes extraños, es decir, gD de ILTV y gI de ILTV, que ha demostrado ser seguro, eficaz y estable. Sin embargo, estos dos genes extraños son del mismo patógeno y, además, se superponen de forma natural y deben coexpresarse para permitir una inmunización apropiada contra el ILTV. Más recientemente, se ha divulgado una vacuna recombinante multivalente segura, eficaz y estable que comprende HVT-ILTV-NDV [documentos US 8.932.604 B2 y U.S. 9.409.954 B2, cuyo contenido se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad. También se ha divulgado una primera HVT-NDV-IBDv , aunque después de pruebas prolongadas durante el desarrollo del producto correspondiente, una de las construcciones principales, HVP309, no demostró presentar una estabilidad genética adecuada ni una expresión sostenida de los insertos heterólogos [documento WO 2013/057.235]. Posteriormente, se desarrolló una construcción más estable y eficaz [documento WO 2016/102647].

El documento WO 2013/057236 describe construcciones de vectores de rHVT que comprenden como inserto heterólogo el gen Fusión (F) del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) y los genes gD/gl del ILTV. Como realización, D1 describe que el rHVT se puede combinar con un antígeno vacunal adicional, en donde el antígeno adicional puede ser un virus IBD, por ejemplo, una cepa viva atenuada del IBDV. Sin embargo, '236 no describe ni sugiere sustituir la cepa vacunal viva atenuada adicional del IBDV por el antígeno de la proteína vírica 2 (VP2) del IBDV, y expresar el gen VP2 mediante el vector de rHVT, o insertar el VP2 en el locus US2 o UL54.5, ni tampoco eliminar el gen F del NDV.

El documento WO 2013/057235 describe un rHVT que tiene el gen F del NDV y el gen VP2 del IBDV como insertos. '235 no se refiere a '236, ni sugiere insertar los genes de gD/gI del ILTV, o eliminar el gen F.

El documento US 2008/0233146 describe construcciones de rHVT que comprenden genes heterólogos tales como de VP2 del IBDV o de gB del ILTV, dirigidos por promotores del genoma de m DV1.

Por lo tanto, a pesar de las claras ventajas de las construcciones recombinantes estables y multivalentes de MDV^np que pueden expresar eficazmente antígenos heterólogos de dos o más patógenos distintos, y los considerables esfuerzos para diseñarlas, hasta ahora, han sido escasas e incluso una de esas pocas ha demostrado ser incapaz de cumplir todos los requisitos exigidos. Por consiguiente, la idoneidad de cualquier MDV^np recombinante polivalente dado como vacuna sigue siendo impredecible cuando el MDV^np recombinante comprende una combinación de antígenos heterólogos que se obtienen de un conjunto singular de dos o más virus de aves de corral. Por lo tanto, existe una clara necesidad de superar los fracasos colectivos de la industria, construyendo vectores de MDV^np recombinantes estables y nuevos que puedan utilizarse en vacunas multivalentes como único activo para proteger frente a dos o más patógenos víricos de aves de corral distintos del virus MDV1.

Sumario de la invención

Por consiguiente, la presente invención proporciona un virus de la enfermedad de Marek recombinante no patógeno (rMDV^np) estable y eficaz novedoso, para su uso como vector para expresar genes extraños de múltiples patógenos víricos, en donde el rMDV^np es un herpesvirus de pavos recombinante (rHVT). Un rMDV^np, por ejemplo, puede utilizarse un rHVT en vacunas contra virus patógenos de aves de corral.

El rMDV^np comprende un primer ácido nucleico heterólogo situado en un primer sitio no esencial en el genoma del rMDV^np y un segundo ácido nucleico heterólogo situado en un segundo sitio no esencial en el genoma del rMDV^np. El primer ácido nucleico heterólogo comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína gD del virus de la laringotraqueítis infecciosa (ILTV) y una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Ig del virus de la laringotraqueítis infecciosa (ILTV). El segundo ácido nucleico heterólogo comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína vírica 2 (VP2) del virus de la bursitis infecciosa (IBDV). En realizaciones específicas de este tipo, el primer ácido nucleico heterólogo comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 9 y el segundo ácido nucleico heterólogo comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 5. En realizaciones específicas, el rMDV^np es un rHVT.

El primer sitio no esencial y el segundo sitio no esencial del rMDV^np son los mismos. En realizaciones específicas de este tipo, el primer ácido nucleico heterólogo y el segundo ácido nucleico heterólogo se construyen realmente como parte de la misma molécula de ADN, que se inserta en un sitio no esencial del rMDV^np. Dicha molécula de ADN puede ser un casete de expresión que codifica una proteína gD del virus de la laringotraqueítis infecciosa (ILTV), una proteína gl del virus de la laringotraqueítis infecciosa (ILTV) y una VP2 del virus de la bursitis infecciosa (IBDV). En realizaciones particulares de este tipo, la molécula de ADN comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 15. En otras realizaciones de este tipo, la molécula de ADN comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 16. En todavía otras realizaciones de este tipo, la molécula de ADN comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 17. En aún otras realizaciones de este tipo, la molécula de ADN comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 18. En realizaciones específicas, el rMDV^np es un rHVT.

Por consiguiente, en realizaciones particulares, el primer sitio no esencial y el segundo sitio no esencial del rMDV^np son el sitio US2. En otras realizaciones, el primer sitio no esencial y el segundo sitio no esencial del rMDV^np son el sitio UL54.5.

El rMDV^np es un rHVT.

Las secuencias de nucleótidos que codifican la proteína gD del ILTV, la proteína gl del ILTV y la proteína VP2 del IBDV pueden estar operativamente bajo el control de promotores exógenos, es decir, promotores que no se encuentran de forma natural en el MDV^np. Estas tres secuencias de nucleótidos están operativamente bajo el control de distintos promotores, es decir, la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína gD del ILTV está operativamente bajo el control de un primer promotor, la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína gI del ILTV está operativamente bajo el control de un segundo promotor y la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína VP2 del IBDV está operativamente bajo el control de un tercer promotor. En realizaciones particulares, el promotor de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína gD del ILTV es el promotor de gD del ILTV endógeno. En determinadas realizaciones, el promotor de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína gI del ILTV es el promotor de gI del ILTV endógeno. En realizaciones particulares de este tipo, el promotor de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína gD del ILTV es el promotor de gD del ILTV endógeno y el promotor de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína gl del ILTV es el promotor de gl del ILTV endógeno. El rMDV^np es un rHVT.

En determinadas realizaciones, al menos uno de los promotores unido operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína gD del ILTV, la proteína gl del ILTV o la proteína VP2 del IBDV es el promotor temprano inmediato del citomegalovirus murino (mCMV IE, del inglés murine cytomegalovirus immediate early). En realizaciones relacionadas, al menos uno de los promotores unido operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína gD del ILTV, la proteína gI del ILTV, o la proteína VP2 del IBDV es el promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (hCMV IE, del inglés human cytomegalovirus immediate early) o un derivado del mismo (por ejemplo, de la cepa AD169). En otras realizaciones, al menos uno de los promotores unido operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína gD del ILTV, la proteína gI del ILTV, o la proteína VP2 del IBDV es el promotor de la p-actina de pollo. En todavía otras realizaciones, al menos uno de los promotores unido operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína gD del ILTV, la proteína gI del ILTV o la proteína VP2 del IBDV es el promotor de gpX del virus de la seudorrabia (PRV, del inglés pseudorabies virus).

En realizaciones particulares, el promotor para la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína VP2 del IBDV es el promotor mCMV IE. En realizaciones relacionadas, el promotor para la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína VP2 del IBDV es el promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (hCMV IE) o un derivado del mismo (por ejemplo, de la cepa AD169). En otras realizaciones, el promotor para la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína VP2 del IBDV es promotor del gen de la beta-actina de pollo. En realizaciones específicas, el promotor para la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína VP2 del IBDV es el promotor mCMV IE, el promotor de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína gD del ILTV es el promotor de gD del ILTV endógeno, y el promotor de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína gl del ILTV es el promotor de gl del ILTV endógeno. En otras realizaciones específicas, el promotor para la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína VP2 del IBDV es el promotor hCMV IE (o un derivado del mismo), el promotor de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína gD del ILTV es el promotor de gD del ILTV endógeno, y el promotor de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína gl del ILTV es el promotor de gl del ILTV endógeno. En aún otras realizaciones específicas, el promotor para la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína VP2 del IBDV es el promotor de la p-actina de pollo, el promotor de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína gD del ILTV es el promotor de gD del ILTV endógeno, y el promotor de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína gl del ILTV es el promotor de gl del ILTV endógeno.

En determinadas realizaciones, un rMDV^np de la presente invención que incluye inserciones de secuencias de nucleótidos que codifican la proteína gD del ILTV, la proteína gl del ILTV, y la proteína VP2 del IBDV también incluye una o más secuencias terminadoras de la transcripción exógenas. En realizaciones específicas de este tipo, una secuencia terminadora de la transcripción está secuencia abajo de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína VP2 del IBDV. En realizaciones particulares, las secuencias de nucleótidos que codifican la proteína gD del ILTV y la proteína gI del ILTV comparten una secuencia terminadora de la transcripción y la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína VP2 del IBDV tiene otra. En realizaciones particulares, al menos una de las secuencias terminadoras de la transcripción comprende una secuencia de poliadenilación del herpesvirus felino US-9 (FHV US-9). En realizaciones relacionadas, al menos una de las secuencias terminadoras de la transcripción comprende una secuencia de poliadenilación de la timidina cinasa del virus del herpes simple (TK del HSV (del inglés Herpes Simplex Virus)). El rMDV^np es un rHVT.

La presente invención proporciona un ácido nucleico recombinante que comprende en dirección 5' a 3' en el siguiente orden, (i) un promotor temprano inmediato de citomegalovirus murino (mCMV IE), (ii) una secuencia codificante de la proteína VP2 del IBDV, (iii) una secuencia terminadora de la transcripción (iv) un promotor de gD del ILTV, (v) una secuencia codificante de la proteína gD del ILTV, (vi) un promotor de gl del ILTV, y (vii) una secuencia codificante de la proteína gl del ILTV. En una realización particular de este tipo, el ácido nucleico recombinante comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 15. En el presente documento se describe un ácido nucleico recombinante que comprende en dirección 5' a 3' en el siguiente orden, (i) un promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano (hCMV IE) o derivado del mismo, (ii) una secuencia codificante de la proteína VP2 del IBDV, (iii) una secuencia terminadora de la transcripción (iv) un promotor de gD del ILTV, (v) una secuencia codificante de la proteína gD del ILTV, (vi) un promotor de gl del ILTV, y (vii) una secuencia codificante de la proteína gl del ILTV. En el presente documento se describe además un ácido nucleico recombinante que comprende en dirección 5' a 3' en el siguiente orden, (i) un promotor de la p-actina de pollo, (ii) una secuencia codificante de la proteína VP2 del IBDV, (iii) una secuencia terminadora de la transcripción (iv) un promotor de gD del ILTV, (v) una secuencia codificante de la proteína gD del ILTV, (vi) un promotor de gl del ILTV, y (vii) una secuencia codificante de la proteína gl del ILTV.

La divulgación proporciona además un ácido nucleico recombinante que comprende en dirección 5' a 3' en el siguiente orden, (i) un promotor de gD del virus de la laringotraqueítis infecciosa (ILTV), (ii) una secuencia codificante de la proteína gD del ILTV, (iii) un promotor de gI del ILTV, (iv) una secuencia codificante de la proteína gl del ILTV, (v) un promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano (hCMV IE), un derivado del mismo (por ejemplo, de la cepa AD169), o uno mCMV IE, (vi) una secuencia codificante de la proteína VP2 de IBDV, y (vii) una secuencia terminadora de la transcripción. En una realización específica de este tipo, el ácido nucleico recombinante comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 17.

La presente invención proporciona además un rMDV^np en el que un ácido nucleico recombinante de la presente invención se ha insertado en un sitio de inserción no esencial del rMDV^np. En determinadas realizaciones de este tipo, el rMDV^np incluye un inserto en un sitio no esencial que comprende un ácido nucleico recombinante que comprende en la dirección 5' a 3' en el siguiente orden (i) un promotor temprano inmediato de citomegalovirus murino (mCMV IE), (ii) una secuencia codificante de la proteína VP2 del IBDV, (iii) una secuencia terminadora de la transcripción (iv) un promotor de gD del ILTV, (v) una secuencia codificante de la proteína gD del ILTV, (vi) un promotor de gl del ILTV, y (vii) una secuencia codificante de la proteína gl del ILTV. En realizaciones específicas, también pueden incluirse secuencias de nucleótidos intermedias, tales como enlazadores, secuencias espaciadoras y/o secuencias codificantes extrañas, véase el Ejemplo 1, más adelante. En una realización particular, el rHVT comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 15 insertada en un sitio no esencial. En realizaciones particulares de estos tipos, el sitio no esencial es el sitio US2. En otras de tales realizaciones, el sitio no esencial es el sitio UL54.5.

El rMDV^np es un rHVT.

En el presente documento se divulgan, pero no forman parte de la invención, métodos de fabricación de un rMDV^np de la presente invención. En determinadas realizaciones, se construye un ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína gD del ILTV, una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína gI del ILTV, y una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de VP2 del IBDV. El ácido nucleico heterólogo se inserta luego en un sitio no esencial de un rMDV^np de la presente invención. En determinadas realizaciones, el ácido nucleico heterólogo es un casete de expresión. En realizaciones particulares de este tipo, el casete de expresión comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 15. En otras realizaciones, se construye un primer ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína gD del ILTV y una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína gl del ILTV; y se construye un segundo ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína VP2 del IBDV. El primer ácido nucleico heterólogo se inserta en un sitio US2 de un rMDV^np y el segundo ácido nucleico heterólogo se inserta en un sitio alternativo no esencial del rMDV^np. En determinadas realizaciones, tales ácidos nucleicos heterólogos son casetes de expresión. En realizaciones particulares de este tipo, el primer ácido nucleico heterólogo comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 9, y el segundo ácido nucleico heterólogo comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 5. En otras realizaciones de este tipo, el primer ácido nucleico heterólogo comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 5, y el segundo ácido nucleico heterólogo comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 9. En realizaciones específicas, el método de fabricación de un rMDV^np es un método para fabricación de un rHVT.

La presente invención proporciona además composiciones inmunogénicas y/o vacunas que comprenden cualquier rMDV^np de la presente invención. El rMDV^np es un rHVT. En el presente documento se divulgan, pero no forman parte de la invención, métodos para ayudar en la protección de las aves de corral frente a una enfermedad provocada por el ILTV y/o el IBDV y/o el MDV1 mediante la administración de tal vacuna y/o composición inmunogénica de la presente invención. En realizaciones específicas, tales métodos ayudan en la protección de un pollo. En realizaciones particulares de este tipo, una vacuna de la presente invención se administra por vía subcutánea. En otras realizaciones, una vacuna de la presente invención se administra en el huevo.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención proporciona composiciones inmunogénicas y/o vacunas que comprenden un rMDV^np de la presente invención. En realizaciones particulares, estas composiciones inmunogénicas y/o vacunas son estables, seguras y tienen una expresión antigénica y/o una eficacia relativamente fuertes. Como alternativa, o además, las composiciones inmunogénicas y/o vacunas que comprenden un rMDV^np de la presente invención ayudan en la protección de un pollo contra una enfermedad provocada por el ILTV y/o el IBDV y/o el MDV1, después de la administración de las composiciones inmunogénicas y/o vacunas al pollo.

Las composiciones inmunogénicas y/o vacunas que comprenden cualquier rMDV^np de la presente invención se pueden combinar con un antígeno de IBDV, ILTV y/o MDV adicional para mejorar y ampliar la inmunogenicidad proporcionada. Además, las composiciones inmunogénicas y/o vacunas que comprenden cualquier rMDV^np de la presente invención se pueden combinar además con un antígeno de un patógeno distinto del m Dv , ILTV o NDV. En una realización particular de este tipo, el antígeno es un IBDV variante vivo o leve atenuado (por ejemplo, IBDV 89/03). En otra realización particular de este tipo, el antígeno es un virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) atenuado (o vivo leve), por ejemplo, C2 del NDV. En el presente documento se divulgan, pero no forman parte de la invención, métodos para ayudar en la protección de las aves de corral frente a una enfermedad provocada por el ILTV y/o el IBDV y/o el MDV1 y/o el NDV mediante la administración de tal vacuna y/o composición inmunogénica a las aves de corral (por ejemplo, pollo). En realizaciones particulares de este tipo, una vacuna de la presente invención se administra por vía subcutánea. En otras realizaciones, una vacuna de la presente invención se administra en el huevo.

En determinadas realizaciones, las composiciones inmunogénicas y/o vacunas de la presente invención comprenden un rHVT que comprende como una inserción en su sitio US2 de un ácido nucleico recombinante que comprende 5' a 3': (i) un promotor de gD del virus de la laringotraqueítis infecciosa (ILTV); (ii) una secuencia codificante de la proteína gD del ILTV; (iii) un promotor de gI del ILTV; (iv) una secuencia codificante de la proteína gl del ILTV; (v) un promotor temprano inmediato de citomegalovirus murino (mCMV IE); (vi) una secuencia codificante de la proteína VP2 del virus de la bursitis infecciosa (V2 del IBDV); y (vii) una secuencia terminadora de la transcripción. En realizaciones aún más particulares de este tipo, el ácido nucleico recombinante tiene la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 17. En realizaciones específicas de este tipo, las composiciones inmunogénicas y/o vacunas comprenden además un virus de la bursitis infecciosa (IBDV) variante atenuado (o vivo leve), por ejemplo, el IBDV es 89/03.

Las composiciones inmunogénicas y/o vacunas que comprenden cualquier rMDV^{n p} de la presente invención se pueden combinar con un antígeno del IBDV, del ILTV y/o del m Dv adicional, y un patógeno que no sea el MDV, el ILTV o el IBDV.

Estos y otros aspectos de la presente invención se apreciarán mejor haciendo referencia a las siguientes Figuras y a la descripción detallada.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un dibujo esquemático del genoma del HVT (FC126), que consiste en una región larga única (UL, del inglés unique long) y una región corta única (US, del inglés unique short), cada una indicada por líneas rectas, y que están flanqueadas por regiones repetidas, indicadas como recuadros. Debajo del esquema del genoma, hay una barra que indica la ubicación de los fragmentos de digestión con la enzima de restricción BamHI, con respecto a su posición genómica, y la nomenclatura de letras asociada con cada fragmento. (Al fragmento más grande se le asignó la letra "A", al siguiente más grande se le asignó la letra "B", y así sucesivamente). Las posiciones de cada fragmento subgenómico clonado (y su designación) usadas para reconstruir los virus HVT (FC126) o los rHVT/ILT/IBDV se indican debajo del mapa de restricción de BamHI. El asterisco (*) indica la posición de los sitios de inserción: UL54.5 en 484-1050-2641-10859; US2 en 228509-ILT-435Vec6, 1333-85.B6 o 1386-04.4 n.° 1.

La Figura 2 es un esquema de cuatro HVT recombinantes distintos, que representa los genes insertados en la cadena principal del HVT y el sitio de su inserción. Innovax^®-ILT es un rHVT que incluye un casete de expresión que codifica los genes de gD del ILTV y gI del ILTV insertados en el sitio UL54.5 del rHVT. 1386-48 es un rHVT que incluye un casete de expresión que codifica los genes de gD del ILTV, gI del ILTV y de la proteína vírica 2 del IBDV insertados en el sitio US2 del rHVT. 1386-134 es un rHVT que también incluye un casete de expresión que codifica gD del ILTV y gI del ILTV, y los genes de la proteína vírica 2 del IBDV insertados en el sitio US2, pero el orden del casete está cambiado (es decir, VP2, luego gD y gl de ILT). HVT/ILT/IBDV 484 es un rHVT que incluye un casete de expresión que codifica los genes de la proteína vírica 2 del IBDV, de gD del ILTV y de gI del ILT^v insertados en el sitio UL54.5 del rHVT.

Descripción detallada de la invención

La presente invención supera el impedimento anterior de poder construir un único vector de rMDV^np que codifique y exprese antígenos tanto del ILTV como del IBDV. En realizaciones particulares, un rMDV^np de la presente invención codifica y expresa antígenos extraños de ILTV y IBDV solamente, y están diseñados para ayudar en la protección frente al virus de la enfermedad de Marek, de la bursitis infecciosa (enfermedad de Gumboro) y de la laringotraqueítis infecciosa. El rMDV^np es un rHVT.

Antes de la presente invención, ya se había construido un vector del HVT que contenía un gen del NDV insertado en la región US10. Se demostró que este vector de HVT-NDV es estable y que expresa niveles suficientes del producto génico del NDV correspondiente, la proteína F del NDV, para proteger a los pollos vacunados frente a una exposición a NDV virulento. Además, ya se había construido un vector de HVT que contenía una pareja de genes del ILTV insertados en la región UL54.5 del HVT. Se demostró que este vector de HVT-ILTV es estable y que expresa niveles suficientes de los productos génicos del ILTV correspondientes, las proteínas gI y gD del ILTV, para proteger a los pollos vacunados frente a una exposición al ILTV virulento.

Anteriormente, se diseñó una construcción del HVT multivalente para proteger tanto frente al NDV como al ILTV basándose en las construcciones exitosas anteriores, es decir, insertando el gen F del NDV en el sitio US10 e insertando los genes gD y gl del ILTV en el sitio UL54.5 [véase, el documento US 8.932.604 B2]. Inesperadamente, sin embargo, después del pase de esta construcción en cultivo de tejidos, el virus recombinante perdió su capacidad para expresar las proteínas gD del ILTV, gI del ILTV y F del NDV. Esto demostró ser cierto con una serie de construcciones del HVT recombinantes duplicadas. De hecho, estos virus recombinantes eran inestables e inadecuados para su posterior desarrollo como vacunas. Estos resultados demuestran que el diseño de un único vector de rHVT multivalente que puede expresar de manera estable tanto la proteína F del NDV como las proteínas gD del ILTV y gI del ILTV no era un proceso simple que pueda extrapolarse de la información existente. De hecho, si fueran posibles tales vectores multivalentes rHVT tan estables y eficaces, su diseño debía basarse en un conjunto impredecible de interacciones complejas que implicaban mínimamente la relación entre los sitios de inserción usados y secuencias de nucleótidos extrañas a insertar. Por consiguiente, el diseño de construcciones de rHVT sigue siendo impredecible a partir de la técnica conocida.

Por lo tanto, la presente invención, proporciona vectores de MDV^np recombinantes en los que se han insertado dos genes del ILTV y un gen del IBDV. En una realización particular de la presente invención, los tres genes se insertaron en la región US2 del genoma del HVT. En otra realización de la presente invención, los tres genes se insertaron en el sitio UL54.5 del genoma del HVT. Por consiguiente, tales vectores de rMDV^np deben poder utilizarse para proporcionar protección frente a infecciones tanto por IBDV como por ILTV. Anteriormente, se necesitaban dos vectores de rHVT distintos para proteger frente a estos dos virus, a saber, uno para la protección frente al ILTV y el otro para la protección frente al IBDV.

Por lo tanto, la presente invención, es ventajosa con respecto a los métodos actuales porque debería ser capaz de proporcionar protección simultánea contra el ILTV e el IBDV mediante la inoculación de aves de corral y/o de huevos de aves de corral con un único MDV^np recombinante. En particular, esto permite que se administren vacunas adicionales a través de la vía en el huevo, porque hay un límite en el volumen que puede inyectarse en un huevo, y además ahorra en costes de fabricación porque sólo se necesita uno en lugar de dos vectores. Además, esto puede permitir que se incluyan antígenos adicionales en la vacuna, tal como un NDV atenuado y/o vivo leve, por ejemplo, la cepa C2.

Adicionalmente, en el presente documento se divulgan, pero que no forman parte de la invención, realizaciones que comprenden distintas construcciones de rMDV^np en la misma vacuna y/o composiciones inmunogénicas. En determinadas realizaciones de este tipo, la vacuna y/o la composición inmunogénica comprenden tanto un rMDV2 como un rHVT, cada uno de los cuales codifica uno o más antígenos extraños. De hecho, a diferencia de la combinación de dos rHVT, lo que inevitablemente conduce a que una construcción sobrepase considerablemente a la otra, la combinación de un rHVT con un rMDV2 no conduce a un rebasamiento excesivo tan considerable. Por lo tanto, en realizaciones específicas, una vacuna de la presente invención comprende un rHVT que codifica una proteína gD del ILTV, una proteína gI del ILTV y una proteína VP2 del IBDV con un rMDV2 que codifica otro antígeno vírico de aves de corral, por ejemplo, la proteína F del NDV.

Para comprender más completamente la presente invención, se proporcionan las siguientes definiciones. El uso de términos singulares por conveniencia en la descripción no pretende de ninguna manera ser tan limitante. Por tanto, por ejemplo, la referencia a una composición que comprende "un polipéptido" incluye una referencia a uno o más de tales polipéptidos.

Como se usa en el presente documento, un "virus de la enfermedad de Marek no patógeno" o "MDV^np" o "npMDV" es un virus de la familia del MDV que muestra poca o ninguna patogenicidad en aves de corral. En realizaciones de la invención, el MDV^np es un HVT

Como se usa en el presente documento, un MDV^np que se ha modificado genéticamente para codificar una secuencia de nucleótidos heteróloga (por ejemplo, un gen extraño) se define como un "MDV^np recombinante" o "rMDV^np".

Como se usa en el presente documento, un "sitio no esencial" es un sitio en el genoma del MDV^np en el que una inserción de una secuencia de nucleótidos heteróloga en ese sitio no evita que el MDV^np se replique en una célula hospedadora. Los sitios no esenciales generalmente se identifican por el gen en el que se encuentran, por ejemplo, el sitio US2. El uso de la expresión "sitio no esencial" no pretende en modo alguno sugerir siquiera que sólo hay una única posición nucleotídica en la secuencia de nucleótidos de un gen dado (o en la región entre dos genes) en la que debe realizarse una inserción de un ácido nucleico heterólogo para que el MDV^np mantenga su capacidad de replicarse en una célula hospedadora.

Como se usa en el presente documento, cuando se dice que un rMDV^np comprende un ácido nucleico dado "insertado" en un sitio no esencial en el genoma del rMDV^np, significa que el ácido nucleico dado es un ácido nucleico heterólogo que se ubica en ese sitio no esencial del MDV^np. Por consiguiente, un rMDV^np que comprende un primer ácido nucleico insertado en un primer sitio no esencial en el genoma del rMDV^np y un segundo ácido nucleico insertado en un segundo sitio no esencial en el genoma del rMDV^np es equivalente a un rMDV^np que comprende un primer ácido nucleico heterólogo situado en un primer sitio no esencial en el genoma del rMDV^np y un segundo ácido nucleico heterólogo situado en un segundo sitio no esencial en el genoma del rMDV^np, y viceversa.

Como se usa en el presente documento, la expresión "aves de corral" puede incluir pollos, pavos, patos, gansos, codornices y faisanes.

Como se usa en el presente documento, una "vacuna" es una composición que es adecuada para la aplicación a un animal (incluidos, en determinadas realizaciones, seres humanos, mientras que en otras realizaciones no es específicamente para seres humanos) que comprende uno o más antígenos normalmente combinados con un transportador farmacéuticamente aceptable tal como un líquido que contenga agua, que al administrarse al animal induce una respuesta inmunitaria lo suficientemente fuerte como para ayudar mínimamente en la protección frente a una enfermedad clínica que surge de una infección con un microorganismo de tipo silvestre, es decir, lo suficientemente intensa como para ayudar en la prevención de la enfermedad clínica, y/o prevenir, mejorar o curar la enfermedad clínica. Según lo establecido por la USDA y codificado en el Título 9 del Código de Regulaciones Federales, parte 113 (9CFR 113) "Requisitos normativos para los productos de origen animal" las vacunas de virus vivos deben proporcionar al menos el 90 % de protección, en el caso del NDV, el IBDV y el ILTV, y al menos el 80 % en el caso del MDV, frente a los signos clínicos o lesiones asociadas a la enfermedad para obtener una autorización.

Como se usa en el presente documento, una "vacuna multivalente" es una vacuna que comprende dos o más antígenos distintos. En una realización particular de este tipo, la vacuna multivalente estimula el sistema inmunitario del receptor frente a dos o más patógenos distintos.

Como se usa en el presente documento, la expresión "ayuda en la protección" no requiere una protección completa frente a cualquier indicación de infección. Por ejemplo, "ayuda en la protección" puede significar que la protección es suficiente para que, tras el estímulo, se reduzcan al menos los síntomas de la infección subyacente, y/o que se reduzcan y/o eliminen una o más de las causas o mecanismos celulares, fisiológicos o bioquímicos subyacentes causantes de los síntomas. Se comprende que "reducido", como se usa en este contexto, significa, con respecto al estado de la infección, incluido el estado molecular de la infección, no solo el estado fisiológico de la infección.

Como se usa en el presente documento, un "adyuvante" es una sustancia que puede favorecer o amplificar la cascada de sucesos inmunológicos, lo que lleva en última instancia a una mejor respuesta inmunitaria, es decir, la respuesta corporal integrada frente a un antígeno. En general, no se precisa un adyuvante para que se produzca la respuesta inmunitaria, pero favorece o amplifica esta respuesta.

Como se usa en el presente documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" se utiliza adjetivalmente para referirse a que el sustantivo modificado es apropiado para su uso en un producto farmacéutico. Cuando se usa, por ejemplo, para describir un excipiente en una vacuna farmacéutica, caracteriza al excipiente como compatible con los otros ingredientes de la composición y no desventajosamente perjudicial para el receptor deseado.

Como se usa en el presente documento, "administración sistémica" es la administración en el sistema circulatorio del organismo (que comprende el sistema cardiovascular y linfático), afectando así al organismo en su totalidad más bien que a un lugar específico, tal como el tracto gastrointestinal (mediante, por ejemplo, administración oral o rectal) y el sistema respiratorio (mediante, por ejemplo, administración intranasal). La administración sistémica se puede realizar, por ejemplo, mediante la administración en el tejido muscular (intramuscular), en la dermis (intradérmica o transdérmica), debajo de la piel (subcutánea), debajo de la mucosa (submucosa), en las venas (intravenosa), etc.

Como se usa en el presente documento, la expresión "administración parenteral" incluye inyecciones subcutáneas, inyecciones submucosas, inyecciones intravenosas, inyecciones intramusculares, inyecciones intradérmicas e infusiones.

El término "aproximadamente" se usa indistintamente con el término "alrededor de" y significa que un valor está dentro del veinticinco por ciento del valor indicado, es decir, un péptido que contiene "aproximadamente" 100 restos de aminoácidos puede contener entre 75 y 125 restos de aminoácidos.

Como se usa en el presente documento, el término, "polipéptido" se usa indistintamente con los términos "proteína" y "péptido" e indica un polímero que comprende dos o más aminoácidos conectados por enlaces peptídicos. El término "polipéptido" como se usa en el presente documento incluye un fragmento o segmento significativo, y abarca un tramo de restos de aminoácidos de al menos aproximadamente 8 aminoácidos, generalmente al menos aproximadamente 12 aminoácidos, normalmente al menos aproximadamente 16 aminoácidos, preferentemente al menos aproximadamente 20 aminoácidos, y, en realizaciones particularmente preferidas, al menos aproximadamente 30 o más aminoácidos, por ejemplo, 35, 40, 45, 50, etc. Dichos fragmentos pueden tener extremos que comienzan y/o terminan en prácticamente todas las posiciones, por ejemplo, que comienzan en los restos 1,2, 3, etc., y que terminan en, por ejemplo, 155, 154, 153, etc., en todas las combinaciones prácticas.

Opcionalmente, un polipéptido puede carecer de determinados restos de aminoácidos que están codificados por un gen o por un ARNm. Por ejemplo, un gen o una molécula de ARNm puede codificar una secuencia de restos de aminoácidos en el extremo N de un polipéptido (es decir, una secuencia señal) que se escinde de y, por lo tanto, puede no ser parte de la proteína final.

Como se usa en el presente documento, la expresión "fragmento antigénico" con respecto a una proteína particular (por ejemplo, un antígeno proteico) es un fragmento de la proteína (incluidos grandes fragmentos a los que les falta tan sólo un aminoácido de la proteína completa) que es antigénico, es decir, capaz de interactuar específicamente con una molécula de reconocimiento de antígenos del sistema inmunitario, tal como una inmunoglobulina (anticuerpo) o un receptor de antígeno de linfocito T. Por ejemplo, un fragmento antigénico de una proteína VP2 del IBDV es un fragmento de la proteína VP2 que es antigénico. Preferentemente, un fragmento antigénico de la presente invención es inmunodominante para el reconocimiento de anticuerpos y/o receptores de linfocitos T.

Como se usa en el presente documento, una secuencia de aminoácidos es el 100% "homóloga" a una segunda secuencia de aminoácidos si las dos secuencias de aminoácidos son idénticas, y/o difieren solo en sustituciones neutras o conservativas como se define a continuación. Por consiguiente, una secuencia de aminoácidos es aproximadamente el 80 % "homóloga" a una segunda secuencia de aminoácidos si aproximadamente el 80 % de las dos secuencias de aminoácidos son idénticas, y/o difieren solo en sustituciones neutras o conservativas.

Los restos de aminoácidos funcionalmente equivalentes a menudo pueden sustituirse por restos dentro de la secuencia, lo que da como resultado una sustitución conservativa de aminoácidos. Dichas modificaciones definen la expresión "una sustitución conservativa" como se usa en el presente documento. Por ejemplo, uno o más restos de aminoácidos dentro de la secuencia pueden ser sustituidos por otro aminoácido de polaridad similar, que actúa como un equivalente funcional, lo que da como resultado una modificación silenciosa. Las sustituciones de un aminoácido dentro de la secuencia pueden seleccionarse de entre otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos que contienen estructuras de anillos aromáticos son fenilalanina, triptófano y tirosina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. No se espera que tales modificaciones afecten al peso molecular aparente, determinado por electroforesis en gel de poliacrilamida, o al punto isoeléctrico.

Las sustituciones conservativas particularmente preferentes son: Lys por Arg y viceversa, de manera que se puede mantener una carga positiva; Glu por Asp y viceversa de manera que se pueda mantener una carga negativa; Ser por Thr de manera que se pueda mantener un --OH libre; y Gln por Asn de manera que se pueda mantener un NH² libre. Los aminoácidos también se pueden ubicar en los siguientes grupos de similitud: (1) prolina, alanina, glicina, serina y treonina; (2) glutamina, asparagina, ácido glutámico y ácido aspártico; (3) histidina, lisina y arginina; (4) cisteína; (5) valina, leucina, isoleucina, metionina; y (6) fenilalanina, tirosina y triptófano.

En una realización relacionada, dos secuencias de ADN altamente homólogas pueden identificarse por su propia homología, o la homología de los aminoácidos que codifican. Dicha comparación de las secuencias se puede realizar usando el software convencional disponible en los bancos de datos de secuencias. En una realización particular, dos secuencias de ADN altamente homólogas codifican secuencias de aminoácidos que tienen aproximadamente el 80 % de identidad, más preferentemente aproximadamente el 90 % de identidad e incluso más preferentemente aproximadamente el 95 % de identidad. Más particularmente, dos secuencias de aminoácidos altamente homólogas tienen aproximadamente el 80 % de identidad, incluso más preferentemente aproximadamente el 90 % de identidad e incluso más preferentemente aproximadamente el 95 % de identidad.

Como se usa en el presente documento, el porcentaje de identidad de secuencia de ADN y de proteínas se puede determinar usando un software como tal MacVector v9, disponible en el mercado en Accelrys (Burlington, Massachusetts) y el algoritmo Clustal W con los parámetros predeterminados de alineamiento y los parámetros predeterminados para la identidad. Véase, por ejemplo, Thompson, et al,. 1994. Nucleic Acids Res. 22:4673-4680. ClustalW se puede descargar gratuitamente para las plataformas Dos, Macintosh y Unix de, por ejemplo, EMBLI, el Instituto Europeo de Bioinformática. El enlace de descarga actual se encuentra en http://www.ebi.ac.uk/clustalw/. Estos y otros programas disponibles también se pueden usar para determinar la similitud de secuencia usando los mismos parámetros predeterminados o unos análogos.

Como se usa en el presente documento, los términos "polinucleótido", o un "ácido nucleico" o una "molécula de ácido nucleico" se usan indistintamente e indican una molécula que comprende nucleótidos que incluyen, pero sin limitación, ARN, ADNc, ADN genómico e incluso secuencias de ADN sintético. Los términos también se contemplan para abarcar moléculas de ácido nucleico que incluyen cualquiera de los análogos de base conocidos de ADN y ARN.

Una "secuencia codificante" de ácido nucleico o una "secuencia que codifica" una proteína o péptido particular, es una secuencia de nucleótidos que se transcribe y traduce a un polipéptido in vitro o in vivo cuando se coloca bajo el control de elementos reguladores apropiados.

Los límites de la secuencia codificante se determinan mediante un codón de iniciación en el extremo 5' y un codón de terminación de la traducción en el extremo 3'. Una secuencia codificante puede incluir, pero sin limitación, secuencias procarióticas, ADNc de ARNm eucariótico, secuencias de ADN genómico de ADN eucariótico (por ejemplo, aviar) e incluso secuencias de ADN sintético. Una secuencia de terminación de la transcripción se puede ubicar a 3' de la secuencia codificante.

" Unido operativamente" se refiere a una disposición de elementos en donde los componentes así descritos están configurados para realizar su función habitual. Por tanto, los elementos de control unidos operativamente a una secuencia codificante son capaces de efectuar la expresión de la secuencia codificante. Los elementos de control no necesitan estar contiguos a la secuencia codificante, siempre que funcionen dirigiendo la expresión de los mismos. Por tanto, por ejemplo, entre un promotor y la secuencia codificante pueden existir secuencias intercaladas no traducidas pero transcritas, y el promotor aún puede considerarse "unido operativamente" a la secuencia codificante.

Como se usa en el presente documento, la expresión "secuencia terminadora de la transcripción" se usa indistintamente con la expresión "elemento regulador de la poliadenilación" y es una secuencia que generalmente está secuencia abajo de una región codificante de ADN y que puede ser necesaria para la terminación completa de la transcripción de esa secuencia codificante de ADN. Un terminador de la transcripción es un elemento de ADN regulador implicado en la terminación de la transcripción de una región codificante en ARN. En general, tal elemento codifica una sección, por ejemplo, una estructura en horquilla, que tiene una estructura secundaria que puede hacer que el complejo de la ARN polimerasa detenga la transcripción. Por lo tanto, un terminador de la transcripción siempre se encuentra secuencia abajo del codón de terminación de la región a traducir, la región 3' no traducida.

Como se usa en el presente documento, un "casete de expresión" es un ácido nucleico recombinante que comprende mínimamente un promotor y una secuencia codificante heteróloga unida operativamente a ese promotor. En muchas de estas realizaciones, el casete de expresión comprende además una secuencia terminadora de la transcripción. Por consiguiente, la inserción de un casete de expresión en un sitio no esencial del genoma del rMDV^np puede conducir a la expresión de la secuencia codificante heteróloga por el rMDV^np. En realizaciones específicas, el rMDV^np es un rHVT.

Una "secuencia de nucleótidos heteróloga", como se usa en el presente documento, es una secuencia de nucleótidos que se añade a una secuencia de nucleótidos de la presente invención mediante métodos recombinantes para formar un ácido nucleico que no se forma naturalmente en la naturaleza. En realizaciones específicas, una "secuencia de nucleótidos heteróloga" de la presente invención puede codificar un antígeno proteico tal como la proteína VP2 del IBDV, la proteína gl del ILTV y/o la proteína gD del ILTV. Las secuencias de nucleótidos heterólogas también pueden codificar proteínas de fusión (por ejemplo, quiméricas). Además, una secuencia de nucleótidos heteróloga puede codificar péptidos y/o proteínas que contienen propiedades reguladoras y/o estructurales. En otras de tales realizaciones, una secuencia de nucleótidos heteróloga puede codificar una proteína o péptido que actúa como medio de detección de la proteína o péptido codificado por la secuencia de nucleótidos de la presente invención después de que se exprese el ácido nucleico recombinante. En aún otra realización, la secuencia de nucleótidos heteróloga puede actuar como un medio de detección de una secuencia de nucleótidos de la presente invención. Una secuencia de nucleótidos heteróloga puede comprender secuencias no codificantes que incluyen sitios de restricción, sitios reguladores, promotores y similares. Un "ácido nucleico heterólogo" comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga.

La inserción de un ácido nucleico que codifica un antígeno en un vector de rMDV^np se logra fácilmente cuando los extremos tanto del ácido nucleico como del vector comprenden sitios de restricción compatibles. Si esto no se puede hacer, puede ser necesario modificar los extremos de la secuencia de nucleótidos y/o el vector mediante la digestión de las protuberancias de ácido nucleico monocatenarias (por ejemplo, protuberancias de ADN) generadas por la escisión de endonucleasas de restricción para producir extremos romos, o para lograr el mismo resultado rellenando los extremos monocatenarios con una polimerasa adecuada. Alternativamente, se pueden producir los sitios deseados, por ejemplo, mediante el ligamiento de secuencias de nucleótidos (enlazadores) en los extremos. Dichos enlazadores pueden comprender secuencias de oligonucleótidos específicas que definen los sitios de restricción deseados. Los sitios de restricción también pueden generarse mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (RCP). [Véase, por ejemplo, Saiki et al., Science 239:487-491 (1988)]. El vector escindido y los fragmentos de ADN también pueden modificarse, si es necesario, mediante colas homopoliméricas.

Antígenos proteicos y ácidos nucleicos que codifican los antígenos proteicos

El gen de gD del ILTV parece codificar una glucoproteína de 434 aminoácidos de longitud que tiene un peso molecular de 48.477 daltons, aunque se ha sugerido que un codón de iniciación secuencia abajo, que conduce a una proteína gD del ILTV que comprende solo 377 restos de aminoácidos, es el verdadero codón de iniciación [Wild et al., Virus Genes 12:104 - 116 (1996)]. El gen de gI del ILTV codifica una glucoproteína de 362 aminoácidos de longitud que tiene un peso molecular de 39.753 daltons [documento US 6.875.856]. Los ácidos nucleicos que codifican variantes naturales y/u obtenidas en el laboratorio de la gD del ILTV y la gI del ILTV pueden sustituirse por los ejemplificados actualmente.

En realizaciones particulares de la presente invención, un rMDV^np comprende un ácido nucleico recombinante (por ejemplo, un casete de expresión) que codifica una proteína gD del ILTV que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2 o un fragmento antigénico de la misma. En realizaciones relacionadas, el rMDV^np comprende un ácido nucleico recombinante que codifica una proteína gD del ILTV que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene más del 90 % y/o más del 95 % y/o más del 98 % y/o más del 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2. En realizaciones particulares, la proteína gD del ILTV está codificada por la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 1. El rMDV^np es un rHVT.

En determinadas realizaciones de la presente invención, un rMDV^np comprende un ácido nucleico recombinante (por ejemplo, un casete de expresión) que codifica una proteína gI del ILTV que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 4 o un fragmento antigénico de la misma. En realizaciones relacionadas, el rMDV^np comprende un ácido nucleico recombinante que codifica una proteína gl del ILTV que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene más del 90 % y/o más del 95 % y/o más del 98 % y/o más del 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 4. En realizaciones particulares, la proteína gI del ILTV está codificada por la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 3. El rMDV^np es un rHVT.

Como se ha mencionado anteriormente, EL IBDV es un miembro de la familia Birnaviridae, que tiene un genoma que consiste en dos segmentos (A y B) de ARN bicatenario. El segmento más grande A codifica una poliproteína de 110 kDa, que posteriormente se escinde por autoproteólisis para formar las proteínas víricas maduras VP2, VP3 y VP4. De estas, VP2 y VP3 son las proteínas estructurales de la cápside del virión, siendo la proteína VP2 el principal inmunógeno protector del hospedador. En el caso del IBDV, existen dos serotipos, los serotipos 1 y 2, que pueden distinguirse mediante pruebas de neutralización del virus (NV). Se ha demostrado que los virus del serotipo 1 son patógenos para los pollos, mientras que el IBDV de serotipo 2 solo provoca enfermedad subaguda en pavos. Históricamente, los virus IBDV del serotipo 1 consistían en un solo tipo que se conoce como virus IBD "clásico", pero posteriormente, han surgido las llamadas cepas de IBDV "variantes". En realizaciones particulares de la presente invención, el gen de la VP2 de IBDV codifica una proteína VP2 de un IBDV que es del tipo clásico. Dichos genes son bien conocidos y la información de su secuencia está fácilmente disponible, [véase, por ejemplo, n.° de acc. de GenBank: D00869 (F52/70), D00499 (STC) o AF499929 (D78)]. Alternativamente, este gen se puede obtener del genoma del IBDV clásico aislado de la naturaleza, usando técnicas de rutina para manipular un Birnavirus. Los IBDV de tipo clásico se pueden identificar fácilmente mediante serología o biología molecular.

En realizaciones particulares de la presente invención, un rMDV^np comprende un ácido nucleico recombinante (por ejemplo, un casete de expresión) que codifica una proteína VP2 del IBDV que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 6 o un fragmento antigénico de la misma. En realizaciones relacionadas, el rMDV^np comprende un ácido nucleico recombinante que codifica una proteína VP2 del IBDV que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene más del 90 % y/o más del 95 % y/o más del 98 % y/o más del 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 6. En realizaciones específicas, la proteína VP2 del IBDV está codificada por la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 5. El rMDV^np es un rHVT.

Las vacunas de rutina frente al IBDV se realizan lo antes posible en la vida de las aves de corral utilizando cepas atenuadas del IBDV, pero estas solo se pueden aplicar cuando el nivel de AOM contra el IBDV ha disminuido lo suficiente, lo que comúnmente es en algún lugar entre 15 y 20 días después de la eclosión. Están disponibles en el mercado muchas vacunas para el IBDV "vivas" o inactivadas, por ejemplo, una vacuna "viva" tal como Nobilis™ Gumboro D78 (Merck Animal Health).

El virus de la enfermedad de Newcastle tiene un genoma de ARN monocatenario, de sentido negativo y no segmentado, que tiene un tamaño aproximado de 15 kb, y contiene seis genes, entre los cuales se encuentra el gen de la proteína F del NDV que codifica la llamada glucoproteína de "fusión" (proteína F). La proteína F está implicada en la unión y la entrada del NDV en las células hospedadoras y, como proteína inmunodominante, puede ser la base de una respuesta inmunitaria eficaz contra el NDV. La proteína F del NDV se expresa como una proteína F0 nativa, que se activa tras la escisión por peptidasas extracelulares.

Un gen de la proteína F del NDV, por ejemplo, se puede obtener del NDV Clon 30, una cepa de vacuna de NDV lentogénico común. Los ácidos nucleicos que codifican variantes naturales y/u obtenidas en el laboratorio del gen de la proteína F serían igualmente aplicables, ya sea del NDV lentogénico, mesogénico o velogénico, ya que la propia secuencia del gen de la proteína F está altamente conservada en estos distintos patotipos del NDV.

Promotores y elementos reguladores de la poliadenilación

Un promotor es una región funcional en el genoma de un organismo que dirige la transcripción de una región codificante secuencia abajo. Por lo tanto, un promotor se sitúa secuencia arriba de la región codificante de un gen. La síntesis de ARNm dirigida por el promotor comienza desde el "sitio de inicio de la transcripción" (SIT). El ARNm producido se traduce a su vez en proteína a partir del codón de iniciación del gen, que es la primera secuencia ATG en el marco de lectura abierto (el primer AUG en el ARNm). Por lo general, el SIT se encuentra a 30-40 nucleótidos secuencia arriba del codón de iniciación. Una SIT se puede determinar secuenciando el extremo 5' del ARNm de un gen, por ejemplo, por la técnica RACE. En general, los promotores están comprendidos dentro de aproximadamente 1000 nucleótidos secuencia arriba de la posición de la A del codón de iniciación, lo que generalmente se indica como A+1, y la mayoría de los promotores están situados entre los nucleótidos -500 y A+1.

La nomenclatura de un promotor se basa comúnmente en el nombre del gen del que controla la expresión. Por ejemplo, el promotor del gen temprano inmediato del citomegalovirus murino 1 (mCMV-IE1) "promotor del gen mCMV-IE1", se refiere al promotor que dirige naturalmente la expresión del gen 1 temprano (gen IE1) del mCMV y, en consecuencia, está situado inmediatamente secuencia arriba de ese gen. Debido a que el gen de IE1 es un gen tan bien documentado y claramente reconocible, y debido a que se han secuenciado los genomas de varios mCMV (en su totalidad o en parte), tal promotor puede identificarse fácilmente mediante técnicas rutinarias. Por ejemplo, en un protocolo básico, se puede obtener un promotor subclonando aproximadamente la región entre dos genes consecutivos, por ejemplo, desde la señal poliA de un gen secuencia arriba hasta el SIT de un gen secuencia abajo. Entonces, el promotor puede identificarse mediante pruebas convencionales, por ejemplo, mediante la expresión de un gen marcador por cortes progresivamente más pequeñas de un presunto promotor.

En general, los promotores contienen una serie de regiones reguladoras reconocibles, tales como una región potenciadora, que interviene en la unión de factores reguladores que influyen en el tiempo, la duración, las condiciones y el nivel de transcripción. Mientras que la región potenciadora normalmente está situada secuencia arriba, un promotor también contiene una región más secuencia abajo que está implicada en la unión de factores de transcripción y en la dirección de la propia ARN polimerasa. Esta región secuencia abajo generalmente contiene una serie de elementos de la secuencia promotora conservados, tales como la caja TATA, la caja CAAT y la caja GC.

Un promotor que comprende tanto el potenciador como la región secuencia abajo se denomina promotor "completo", mientras que un promotor que comprende solo la región secuencia abajo, se denomina promotor "central".

Un promotor para la expresión de un gen (heterólogo) en un vector (de virus) debe ser capaz de dirigir eficazmente la transcripción de esa secuencia codificante secuencia abajo. Esto generalmente se denomina promotor que está "ligado operativamente" a la secuencia codificante, de forma que el gen está "bajo el control" del promotor, o es "dirigido por" el promotor. Esto generalmente significa que, en un casete de expresión, el promotor y la secuencia codificante del gen se encuentran en el mismo ácido nucleico, en proximidad efectiva, y sin señales o secuencias entre ellos que pudieran intervenir en la transcripción efectiva de la secuencia codificante.

El promotor del gen mCMV-IE1 es bien conocido en la técnica y se puede obtener fácilmente de diversas fuentes comerciales, tal como de proveedores de plásmidos comerciales para clonación y expresión. El gen IE1 también se denomina "gen IE principal". La proteína mCMV-IE1 también se ha denominado pp89. Dorsch-Hasler et al. [Proc. Nat. Acad. Sci., 82:8325-8329 (1985)] describieron el promotor del gen IE1 de mCMV en 1985, y el uso de este promotor en la expresión heteróloga también se describe en los documentos WO 87/03.905 y EP 728.842. La secuencia de nucleótidos del locus de mCMV IE completo está disponible en GenBank con el n.° de ref. L06816.1 (desde marzo de 2004). El mCMV en sí está disponible en la ATCC: inicialmente bajo el n.° de ref. VR-194, y más recientemente ha continuado bajo el n.° de ref. v R-1399.

En una realización de la invención, el promotor del gen mCMV-IE1 es un promotor completo, que comprende tanto la región promotora central, así como la región potenciadora del gen mCMV-IE1. El promotor del gen mCMV-IE1 completo tiene un tamaño de aproximadamente 1,4 kb. Sin embargo, la presente invención también permite alguna variación en la longitud no solo del promotor del gen IE1 de mCMV, sino también de los demás elementos que componen el casete de expresión de ADN recombinante empleado en la presente invención. Esto puede deberse a diferencias en las condiciones exactas que se utilizan para la clonación y la construcción. Por ejemplo, esta variación puede surgir del uso de distintos sitios de enzimas de restricción, cebadores de clonación de PCR, o distintas condiciones para adaptar los extremos de las moléculas de clonación utilizadas. Como consecuencia, puede producirse alguna variación en la longitud -menor o mayor- de los elementos que lo constituyen, sin afectar la estabilidad, y la expresión antigénica relativamente fuerte y/o la eficacia del casete de expresión global. En ese caso, estas diferencias de longitud son irrelevantes y están dentro del alcance de la invención. Por lo tanto, un promotor del gen mCMV-IE1 de "aproximadamente 1,4 kb" es de: 1,4 kb ± aproximadamente el 25 %. En realizaciones particulares el promotor es de 1,4 kb ± aproximadamente el 20 %. En todavía otras realizaciones, la varianza puede ser de 1,4 kb ± aproximadamente el 15%, 1,4 kb ± aproximadamente el 12%, 1,4 kb ± aproximadamente el 10%, 1,4 kb ± aproximadamente el 8%, 1,4 kb ± aproximadamente el 6% , 1,4 kb ± aproximadamente el 5%, 1,4 kb ± aproximadamente el 4 %, 1,4 kb ± aproximadamente el 3 %, 1,4 kb ± aproximadamente el 2 %, o incluso 1,4 kb ± aproximadamente el 1 %.

De forma similar, pueden usarse homólogos o variantes del elemento promotor que sean igualmente eficaces y estables. Por lo tanto, en determinadas realizaciones, el promotor del gen mCMV-IE1 de la presente invención puede ser una molécula de ADN de aproximadamente 1,4 kb que comprende una secuencia de nucleótidos con al menos el 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o incluso el 99 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 10. En una realización particular, el promotor del gen mCMV-IE1 consiste en la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 10.

Se pueden usar muchos promotores alternativos para dirigir la expresión de un gen heterólogo que codifica un antígeno proteico o un fragmento antigénico del mismo en un rMDV^np de la presente invención. Los ejemplos incluyen el promotor gpx del virus de la seudorrabia (PRV) [véase, el documento WO 87/04463], el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous, el promotor del gen temprano del SV40, el pollo del gen de la beta-actina que comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 11, el promotor hCMV IE de la cepa Towne, un derivado del promotor hCMV IE (de la cepa AD169) que comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 12, un promotor de gD del ILTV que comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 7, y un promotor de gI del ILTV que comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 8, [véase, por ejemplo, el documento US 6.183.753 B1], el promotor del gen temprano inmediato del citomegalovirus humano 1 (hCMV IE1) [documento US 5.830.745; documento US 5.980.906] y el promotor del gen de la beta-actina del pollo [documento EP 1298 139 B1]. Un promotor heterólogo particular para el gen de VP2 de IBDV es el promotor de citomegalovirus murino (mCMV IE1). En una realización particular de este tipo, el mCMV IE1 comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 10 [véase, por ejemplo, los documentos EP 728.842; PCT/EP2015/081121].

Se precisa a menudo la inclusión de un elemento regulador de la poliadenilación secuencia abajo de una región codificante de ADN para terminar la transcripción de la secuencia de ADN codificante. Por consiguiente, muchos genes comprenden un elemento regulador de la poliadenilación en el extremo secuencia abajo de su secuencia codificante. Muchos de tales elementos reguladores se han identificado y se pueden usar en un rMDV^np de la presente invención. Los ejemplos específicos de elementos reguladores de la poliadenilación como se ejemplifican en el presente documento, incluyen una señal de la poliadenilación US-9 del FHV que comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 13, y la señal de poliadenilación de la timidina cinasa del HSV que comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 14.

Vacunas y composiciones inmunogénicas

En el presente documento se divulga, pero no forma parte de la invención, el uso del MDV^np recombinante, las moléculas de ácido nucleico usadas para construir el MDV^np, o las células hospedadoras para cultivarlos o cualquier combinación de los mismos, para la fabricación de una vacuna para aves de corral. Por consiguiente, la presente invención proporciona vacunas y/o composiciones inmunogénicas que incluyen un MDV^np recombinante multivalente de la presente invención. Dichas vacunas pueden usarse para ayudar en la prevención y/o prevenir la bursitis infecciosa (enfermedad de Gumboto) y/o la enfermedad de Marek, y/o enfermedades asociadas con infecciones por ILTV. Una vacuna de acuerdo con la presente invención puede usarse para tratamiento profiláctico y/o terapéutico, y por tanto puede interferir con el establecimiento y/o con la progresión de una infección y/o sus síntomas clínicos de enfermedad.

Un MDV^np recombinante de la presente invención se puede cultivar mediante distintos medios actualmente practicados en el campo. Por ejemplo, un MDV^np recombinante de la presente invención se puede cultivar mediante el uso de cultivos in vitro de células de pollo primarias, véase, por ejemplo, los Ejemplos a continuación en los que se usaron fibroblastos de embrión de pollo (los CEF, del inglés embryo fibroblast cells). Los CEF se pueden preparar mediante tratamiento con tripsina de embriones de pollo. Los CEF también pueden sembrarse en placas en monocapas y luego infectarse con el MDV^np. La escala de este procedimiento particular puede ampliarse fácilmente a la producción industrial.

Por lo tanto, en el presente documento se divulga, pero no forma parte de la invención, un método para la preparación de la vacuna de acuerdo con la invención que comprende las etapas de infectar células hospedadoras con un MDV^np recombinante de la presente invención, recoger las células hospedadoras infectadas y luego mezclar las células hospedadoras infectadas recogidas con un transportador farmacéuticamente aceptable. Los métodos adecuados para la infección, el cultivo y la recogida son muy conocidos en la técnica y se describen y ejemplifican en el presente documento.

Normalmente, las células hospedadoras infectadas se recogen mientras están todavía intactas para obtener el MDV^np recombinante en su forma asociada a la célula. Estas células se pueden tomar en una composición de transportador apropiada para proporcionar estabilización para el almacenamiento y la congelación. Las células infectadas pueden llenarse en ampollas de vidrio, que se sellan, se congelan y se almacenan en nitrógeno líquido. Por consiguiente, en determinadas realizaciones, las vacunas y/o las composiciones inmunogénicas de la presente invención se almacenan congeladas y, por consiguiente, comprenden un crioconservante, tal como dimetilsulfóxido (DMSO), para conservar las células infectadas congeladas.

Alternativamente, debido a que el MDV^np recombinante es un HVT recombinante, se puede aislar de su célula hospedadora, por ejemplo, a través del tratamiento con ultrasonidos al final del cultivo, y luego se recoge en un estabilizador, y se seca por congelación (liofiliza) para un almacenamiento estable o se reduce de otra manera en DRAKEOL 6VR, polímeros de bloque, ISCOM (complejos inmunoestimulantes), vitaminas y minerales (incluidos, pero sin limitación: vitamina E, vitamina A, selenio y vitamina B12) y CARBOPOL^® .

Otros adyuvantes adecuados, que a veces se han denominado estimulantes inmunitarios, incluyen, pero sin limitación: citocinas, factores de crecimiento, quimiocinas, sobrenadantes de cultivos celulares de linfocitos, monocitos, células de órganos linfoides, preparaciones celulares y/o extractos de plantas, bacterias o parásitos (preparaciones de Staphylococcus aureus o lipopolisacáridos) o mitógenos. En general, un adyuvante se administra al mismo tiempo que un antígeno de la presente invención. Sin embargo, los adyuvantes pueden administrarse también o como alternativa dentro de un período de dos semanas antes de la vacunación, y/o durante un período de tiempo después de la vacunación, es decir, mientras el antígeno, por ejemplo, un MDV^np recombinante de la presente invención, persiste en los tejidos.

Las vacunas y/o composiciones inmunogénicas de la presente invención pueden administrarse mediante cualquier vía tal como en el huevo, mediante administración parenteral, incluyendo inyección intramuscular, inyección subcutánea, inyección intravenosa, inyección intradérmica, por escarificación, mediante administración oral o mediante cualquier combinación de las mismas.

Adicionalmente, el MDV^np recombinante multivalente de la presente invención se puede usar y/o combinar con antígenos del IBDV, ILTV y/o MDV adicionales para mejorar y expandir la inmunogenicidad proporcionada, y/o con antígenos de otros patógenos, para proporcionar protección inmunitaria contra tales otros patógenos. Estos antígenos adicionales pueden ser microorganismos completos vivos o muertos, otros vectores recombinantes, homogeneizado celulares, extractos, proteínas o cualquier otro derivado de este tipo, siempre que no interfieran negativamente con la seguridad, y la estabilidad con una expresión de antígeno relativamente fuerte y/o eficacia de la vacuna de acuerdo con la presente invención.

La combinación de un MDV^np recombinante multivalente de la presente invención con un antígeno adicional de MDV, IBDV y/o ILTV puede ser ventajosa en los casos en los que prevalecen cepas de campo muy virulentas de MDV, IBDV o ILTV, por ejemplo, en una región geográfica particular. En este sentido, la combinación de un MDVnp recombinante multivalente de la presente invención con un MDV1, MDV2 o HTV incluye la cepa Rispens (MDV1), la cepa SB1 (MDV2), la cepa FC-126 (HTV) y/o la cepa PB1 (HTV). Para mejorar la respuesta frente al IBDV, el MDVnp recombinante multivalente puede combinarse con una cepa vacunal del IBDV, tal como la cepa vacunal del IBDV vivo leve, por ejemplo, D78 (cepa intermedia clonada), PBG98, Cu-1, ST-12 (una cepa intermedia) u 89/03 (una cepa variante de Delaware vivo) en una vacuna multivalente.

Los ejemplos de otros microorganismos que pueden usarse como antígenos junto con el MDVnp recombinante multivalente de la presente invención incluyen: (i) virus tales como el virus de la bronquitis infecciosa, adenovirus, el virus del síndrome de la caída del huevo, el virus de la bursitis infecciosa, el virus de la anemia de pollo, el virus de la encefalomielitis aviar, el virus de la viruela aviar, el virus de la rinotraqueítis del pavo, el virus de la peste del pato (enteritis vírica del pato), el virus de la viruela de la paloma, el virus de la leucosis aviar, el neumovirus aviar y el reovirus, (ii) bacterias, tales como Escherichia coli, Salmonella spec., Ornitobacterium rhinotracheale, Haemophilis paragallinarum, Pasteurella multocida, Erysipelothrix rhusiopathiae, Erysipelas spec., especies de Mycoplasma y especies de Clostridium, (iii) parásitos tales como especies de Eimeria, y (iv) hongos, tales como especies de Aspergillus. En realizaciones particulares de la presente invención, un MDVnp recombinante de la presente invención se puede combinar con una cepa vacunal del NDV viva leve tal como la cepa vacunal C2. Muchas de estas cepas se usan en vacunas comerciales.

La vacuna de combinación se puede fabricar de diversas formas, incluida la combinación del MDVnp recombinante de la presente invención con preparaciones de virus, o bacterias, u hongos, o parásitos, o células hospedadoras, o una mezcla de cualquiera y/o todas estas. En realizaciones particulares, los componentes para tal vacuna de combinación se producen oportunamente por separado y luego se combinan y rellenan en el mismo recipiente de vacuna.

Como se ha descrito anteriormente, una vacuna de acuerdo con la invención se puede usar ventajosamente para proporcionar protección inmunitaria segura y eficaz en aves de corral frente a múltiples enfermedades, mediante una única inoculación a muy temprana edad o en el huevo. Alternativamente, como resultará evidente para cualquier experto en la materia de las vacunas para aves de corral, las combinaciones descritas anteriormente también podrían incluir programas de vacunación en los que el MDVnp recombinante multivalente de la presente invención y el antígeno adicional no se apliquen simultáneamente; por ejemplo, el MDVnp recombinante puede aplicarse en el huevo y la C2 del NDV y/o la cepa de IBDV (por ejemplo, 89/03) podrían aplicarse en una fecha/hora posterior.

Por consiguiente, las vacunas de la presente invención pueden administrarse al sujeto aviar en una dosis única o en dosis múltiples. Por ejemplo, una vacuna de la presente invención se puede aplicar el día de la eclosión y/o en el huevo en el día DE (día embrionario) 16-18. Cuando se administran dosis múltiples, pueden administrarse al mismo tiempo o secuencialmente, de una manera y tiempo compatibles con la formulación de la vacuna, y en una cantidad que sea inmunológicamente eficaz. Por lo tanto, una vacuna de la presente invención puede servir eficazmente como una primovacunación, que más tarde puede ir seguida y amplificarse con una vacunación de refuerzo de la misma vacuna, o con una preparación vacunal distinta, por ejemplo, una vacuna de virus completo clásica con adyuvante e inactivada.

El volumen por dosis de una vacuna de la presente invención se puede optimizar de acuerdo con la vía de aplicación prevista: la inoculación en el huevo se aplica comúnmente con un volumen de entre 0,05 y 0,5 ml/huevo, y la inyección parenteral se realiza comúnmente con un volumen de entre 0,1 y 1 ml/aviar. En cualquier caso, la optimización del volumen de dosis de la vacuna está dentro de las capacidades del experto en la técnica.

TABLAS DE SECUENCIAS

continuación

La presente invención puede entenderse mejor con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes, que se proporcionan como ilustrativos de la presente invención. Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar más completamente las realizaciones de la invención y de ninguna manera deben interpretarse como una limitación del amplio alcance de la invención.

Ejemplos

EJEMPLO 1

CONSTRUCCIÓN DE VECTORES DE VIRUS HVT/ ILTV/IBDV RECOMBINANTES

Se prepararon construcciones de virus de la enfermedad de Marek no patógeno multivalente recombinante que codifican y expresan antígenos proteicos tanto del virus de la laringotraqueítis infecciosa como del virus de la bursitis infecciosa. La presente invención supera el problema de la interferencia de vacunas que se encuentra cuando dos vacunas para el HVT recombinantes, tales como Innovax®-ILT (vendida por Merck Animal Health) y Vaxxitek® (vendida por Merial) se proporcionan al mismo animal.

Se crearon construcciones de virus recombinantes en las que el material donante antigénico de dos patógenos de aves de corral, el virus de la laringotraqueítis infecciosa (ILTV) y el virus de la bursitis infecciosa (IBDV) se insertan en un vector del herpesvirus del pavo (HVT) [véanse, además, los documentos US 8.932.604 B2, WO 2013/057235 y WO 2016/102647, cuyo contenido se incorpora en el presente documento a modo de referencia en su totalidad]. Los materiales donantes incluyen un fragmento de Sall-Hindll de 3,563 kb del ILTV, cepa de exposición NVSL, lote n.° 83­ 2 [pos. 10532-14094; Wild et al., Virus Genes 12:104-116(1996): n.° de ref. U28832], que codifica los genes de longitud completa de la glucoproteína D (gD) y la glucoproteína I (gl), más las regiones codificantes parciales de la glucoproteína E (aminoácidos 1-101) y ORF5 (aminoácidos 734-985); y un casete de expresión que consiste en la región codificante del gen de la proteína vírica 2 (vp2) del IBDV, cepa Faragher tipo F52/70, dirigido por un promotor eucariótico o vírico y seguido por una secuencia terminadora. En la presente realización, el promotor que dirige la expresión de VP2 puede provenir del gen temprano inmediato (IE) del citomegalovirus humano (hCMV), cepa AD 169, del gen de la beta-actina de pollo (cp-act) o del gen IE de la cepa ATCC VR-194 del citomegalovirus de ratón (mCMV). El terminador y la secuencia de poliadenilación pueden provenir del virus del herpes simple humano (HSV), el gen de la timidina cinasa (TK), del gen de la glucoproteína B (gB) del herpesvirus felino (FHV), del gen temprano inmediato (IE) del citomegalovirus humano (hCMV), cepa AD 169 o del virus de simio 40 (SV40). El material donante se puede insertar en uno de dos sitios no esenciales en el vector de HVT, el sitio US2 [pos. 140540/140541, Afonso et al., J. Virology 75(2):971-978 (2001); n.° de ref. AF291866, entre los restos de aminoácidos 124 y 125], o en el sitio UL54.5 [pos. 111240/111241, Afonso et al., 2001, citado anteriormente; n.° de ref. AF291866, entre los restos de aminoácidos 21 y 22], o un inserto en cada sitio.

La estabilidad genética y fenotípica es un componente principal de la seguridad y la expresión de antígeno relativamente fuerte, y/o el perfil de eficacia de cualquier nuevo candidato a vacuna vírica recombinante. Los casetes de expresión de IBDV e ILTv insertados en la cadena principal del HVT no son intrínsecamente necesarios para la replicación vírica y, por tanto, pueden perderse debido a la mutación durante la amplificación de la reserva de virus en los pases en cultivo de tejidos. Un candidato a vacuna satisfactorio no debe mutar fácilmente para perder la expresión del inserto del gen extraño. Una vacuna candidata se considera estable si se puede demostrar que al menos el 90 % de las placas vírica expresan la proteína antigénica extraña insertada después de más de 10 pases en cultivo de tejidos.

EJEMPLO 2

CONSTRUCCIÓN DE VECTORES DE VIRUS HVT/ILTV/IBDV RECOMBINANTES

La capacidad de generar herpesvirus por este método se ha demostrado previamente para el virus de la seudorrabia [van Zijl et al., J. Virology 62:2191-2195 (1988)]. Este procedimiento se empleó posteriormente para construir vectores de HVT recombinantes [véase, el documento U.S. 5.853.733, con respecto a la metodología divulgada sobre la construcción de vectores de HVT recombinantes] y se usó para construir los vectores de HVT/ILTV/IBDV recombinantes de la presente invención. En el presente método, todo el genoma del HVT se clona en vectores bacterianos como varios fragmentos subgenómicos grandes solapantes construidos utilizando técnicas de ADN recombinante convencionales [ Maniatis et al., (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1982); y Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989)]. Se obtuvo una biblioteca de cósmidos de la cepa FC126 del HVT a partir de ADN vírico fragmentado en el vector cósmido pWE15 (Stratagene, ahora Agilent Technologies de Santa Clara, Calif.). Además, se aislaron varios fragmentos grandes de ADN genómico mediante digestión de restricción con la enzima, BamHI, y se clonaron en pWE15 o en el vector plasmídico pSP64 (Promega, Madison WI). Como se describe en el documento US 5.853.733, la cotransfección de estos fragmentos en células de fibroblastos de embrión de pollo (CEF) da como resultado la regeneración del genoma del HVT mediada por recombinación homóloga a través de las regiones solapantes de los fragmentos. Si una inserción se genomodifica directamente en uno o más de los fragmentos subgenómicos antes de la cotransfección, este procedimiento da como resultado una alta frecuencia de virus que contienen la inserción. Se precisan cinco clones subgenómicos solapantes para generar HVT/FC126 de HVT, y sirvieron como base para crear todos los virus recombinantes de HVT/ⁱL^t V/IBDV.

Construcción del HVT/ILT/IBDV 1386-134.1-2: [véase, 1386-134 representado en la Figura 2]

La regeneración de cósmidos de HVT/ILT/IBDV 1386-134.1-2 se realizó esencialmente como se describe en el documento US 5.853.733 [por ejemplo, la Figura 8 del documento US 5.853.733; redibujado, al menos en parte, en la Figura 1, en el presente documento]. Para permitir la integración en la región US del genoma del HVT FC126, la región cubierta por el cósmido n.° 378-50 en el documento US 5.853.733, se proporcionó ahora a partir de tres plásmidos más pequeños: pSY640 y 556-60.6, y un plásmido de transferencia (228509-ILT-435Vec6), superpuesto a estos dos, y que contienen los casetes de expresión de IBDV/ILTV en el locus del gen US2. El conjunto de siete construcciones linealizadas: 3 cósmidos y 4 plásmidos se transfectan todos juntos en los CEF, usando un protocolo de transfección con CaCl² convencional y la reserva de virus resultante se purificó por placas dos veces.

Construcción del HVT/ILT/IBDV 1386-48.1.1.1: [véase, 1386-48 representado en la Figura 2]

La regeneración de cósmidos de HVT/ILT/IBDV 1386-48.1.1.1 se realizó esencialmente como se describe en el documento US 5.853.733 [por ejemplo, la Figura 8 del documento US 5.853.733; redibujado, al menos en parte, en la Figura 1, en el presente documento]. Para permitir la integración en la región US del genoma del HVT FC126, la región cubierta por el cósmido n.° 378-50 en el documento US 5.853.733, se proporcionó ahora a partir de tres plásmidos más pequeños: pSY640 y 556-60.6, y un plásmido de transferencia (1333-85.B6), que solapa con estos dos, y que contienen los casetes de expresión de IBDV/ILTV en el locus del gen US2.

El conjunto de siete construcciones linealizadas: 3 cósmidos y 4 plásmidos se transfectan todos juntos en los CEF, usando un protocolo de transfección con CaCh convencional y la reserva de virus resultante se purificó por placas dos veces.

Construcción del HVT/ILT/IBDV 1386-48.3.1.7: [véase, 1386-48 representado en la Figura 2]

La regeneración de cósmidos de HVT/ILT/IBDV 1386-48.3.1.7 se realizó esencialmente como se describe en la Pat. de EE. UU. 5.853.733 [por ejemplo, la Figura 8 del documento US 5.853.733; redibujado, al menos en parte, en la Figura 1, en el presente documento]. Para permitir la integración en la región US del genoma del HVT FC126, la región cubierta por el cósmido n.° 378-50 en el documento US 5.853.733, se proporcionó ahora a partir de tres plásmidos más pequeños: pSY640 y 556-60.6, y un plásmido de transferencia (1386-04.4 n.° 1), que solapa con estos dos, y que contienen los casetes de expresión de IBDV/ILTV en el locus del gen US2. El conjunto de siete construcciones linealizadas: 3 cósmidos y 4 plásmidos se transfectan todos juntos en los CEF, usando un protocolo de transfección con CaCl² convencional y la reserva de virus resultante se purificó por placas dos veces.

Construcción de HVT/ILT/IBDV484: [véase, 1386-484 representado en la Figura 2]

La regeneración de cósmidos de HVT/ILT/IBDV HVT/ILT/IBDV 484 se realizó esencialmente como se describe en el documento US 5.853.733 [por ejemplo, la Figura 8 del documento US 5.853.733; redibujado, al menos en parte, en la Figura 1, en el presente documento]. Para permitir la integración en la región UL54.5 del genoma del HVT FC126, la región cubierta por el cósmido n.° 407-32 1C1 en el documento US 5.853.733, se proporcionó ahora a partir de tres plásmidos más pequeños: 672-01.A40 y 672-07.C40, y un plásmido de transferencia (484-1050-2641-10859), que solapa con estos dos, y que contienen los casetes de expresión de IBDV/ILTV en el locus del gen UL54.5. El conjunto de siete construcciones linealizadas: 4 cósmidos y 3 plásmidos se transfectan todos juntos en los CEF, usando un protocolo de transfección con CaCh convencional y la reserva de virus resultante se purificó por placas dos veces.

Descripción de los fragmentos subgenómicos para la generación del HVT FC126:

Clon subgenómico 407-32.2C3

El cósmido 407-32.2C3 contiene una región de aproximadamente 40.170 pares de bases de ADN genómico del HVT [extremo izquierdo - pos. 39.754; Afonso et al., 2001, citado anteriormente; n.° de ref. AF291866]. Esta región incluye los fragmentos F', L, P, N1, E, D de BamHI de HVT y 2.092 pares de bases del fragmento B.

Clon subgenómico 172-07.BA2

El plásmido 172-07.BA2 contiene una región de 25.931 pares de bases de ADN genómico del HVT. Se construyó mediante la clonación del fragmento de B de BamHI de HVT [pos. 37.663 a 63.593; Afonso et al., 2001, citado anteriormente; n.° de ref. AF291866], en el plásmido pSP64 (Promega, Madison Wis.).

Clon subgenómico 407-32.5G6

El cósmido 407-32.5G6 contiene una región de 39.404 pares de bases de ADN genómico del HVT [pos. 61.852 -101.255; Afonso et al., 2001, citado anteriormente; n.° de ref. AF291866]. Esta región incluye los fragmentos H, C, Q, K1, M, K2 de BamHI de HVT, más 1.742 pares de bases del fragmento B y 3.880 pares de bases del fragmento J. Clon subgenómico 407-31.

El cósmido 1C1 407-31.1C1 contiene una región de 37.444 pares de bases de ADN genómico del HVT [pos. 96.095 -133.538; Afonso et al., 2001, citado anteriormente; n.° de ref. AF291866]. Esta región incluye los fragmentos J, G, I, F, O de BamHI de HVT, más 1.281 pares de bases del fragmento K2 y 6.691 pares de bases del fragmento A.

Clon subgenómico 378-50

El cósmido 378-50 contiene una región de 28.897 pares de bases de ADN genómico del HVT [véase, La FIG. 8 del documento U.S. 5.853.733; redibujado, al menos en parte, en la Figura 1, en el presente documento]. Esta región incluye el fragmento A de BamHI de HVT. Se construyó clonando el fragmento A de BamHI de HVT [pos. 126.848 -155.744; Afonso et al., 2001, citado anteriormente; n.° de ref. AF291866] en el cósmido pWE15.

Fragmentos de inserción adicionales para generar HVT/ILT/IBDV 1386-134.1-2:

Clon subgenómico 228059-ILT-435Vec6

El plásmido de inserción 228059-ILT-435Vec6 contiene un fragmento de EcoRI de 7311 pares de bases de las regiones cortas únicas de HVT [pos. 126880-144190; Afonso et al., 2001, citado anteriormente; n.° de ref. AF291866], clonado en el plásmido pSP64 (Promega, Madison, WI.). Insertados en un sitio StuI único dentro del gen US2 del HVT [pos. 140540/140541; Afonso et al., 2001, citado anteriormente; n.° de ref. AF291866, entre los restos de aminoácidos 124 y 125] hay 2 elementos: un casete de expresión que consiste en el promotor mCMV IE, el gen de la proteína vírica 2 (Vp2) del IBDV tipo clásico cepa F52/70, Faragher, y la señal de poliadenilación del SV40, seguido de un fragmento SaII-HindIII de 3563 pares de bases del ILTV, cepa de exposición NVSL, n.° de lote 83-2 [pos. 10532-14094; Wild et al., Virus Genes 12:104-116 (1996); n.° de ref. U28832], que codifica los genes de longitud completa de la glucoproteína D (gD) y la glucoproteína I (gI), más las regiones codificantes parciales de la glucoproteína E (aminoácidos 1-101) y Or F5 (aminoácidos 734-985). Los genes de VP2 del IBDV, gD del ILTV, gI del ILTV y F del ILTV se transcriben en la dirección opuesta con respecto al gen US2 del HVT.

Clon subgenómico pSY640

El plásmido pSY640 contiene una región de aproximadamente 13.600 pares de bases de ADN del HVT genómico (pos. 126848 -140540; Afonso et al., 2001, citado anteriormente; n.° de ref. AF291866] procedente del fragmento A de BamHI. Para generar este plásmido se clonó en el plásmido pSP64 (Promega, Madison WI.) la región de ADN situada cadena arriba del gen US2, comenzando en el sitio Stul situado en el gen US2 y continuando hasta el extremo del fragmento A de BamHI.

Clon subgenómico 556-60.6

El plásmido 556-60.6 contiene una región de aproximadamente 12.500 pares de bases de ADN genómico del HVT obtenida a partir del fragmento A de BamHI (pos. aproxim. 143300-155744; Afonso et al., 2001, citado anteriormente; n.° de ref. AF291866]. Para generar este plásmido, la región de ADN situada cadena abajo del gen US2 (comenzando en el sitio Stul situado en el gen US2 y continuando hasta el extremo del fragmento A de BamHI) se clonó en pSP64 (Promega, Madison WI.), y luego se trató con exonucleasa para "retroceder" desde el sitio Stul ~150 pb, y se volvió a clonar en el vector plásmido pBR322.

Fragmentos de inserción adicionales para generar HVT/ILT/IBDV 1386-48.1.1.1:

Clon subgenómico 1333-85.B6

El plásmido de inserción 1333-85.B6 contiene un fragmento de EcoRI de 7311 pares de bases de las regiones cortas únicas de HVT [pos. 126880-144190; Afonso et al., 2001, citado anteriormente; n.° de ref. AF291866], clonado en el plásmido pSP64 (Promega, Madison, WI.). Insertados en un sitio StuI único dentro del gen US2 del HVT [pos.

140540/140541; Afonso et al., 2001, citado anteriormente; n.° de ref. AF291866, entre los restos de aminoácidos 124 y 125] hay 2 elementos: un fragmento SaII-HindIII de 3563 pares de bases del ILTV, cepa de exposición NVSL, n.° de lote 83-2 [pos. 10532-14094; Wild et al., Virus Genes 12:104-116 (1996); n.° de ref. u 28832], que codifica los genes de longitud completa de la glucoproteína D (gD) y la glucoproteína I (gI), más regiones codificantes parciales de la glucoproteína E (aminoácidos 1-101) y ORF5 (aminoácidos 734-985) y un casete de expresión que consiste en el promotor de la p-actina de pollo, el gen de la proteína vírica 2 (VP2) del IBDV tipo clásico cepa F52/70, Faragher, y la señal de poliadenilación del gen de la glucoproteína B del herpesvirus felino (FHV). Los genes de gD de ILTV, gI de ILTV y Vp2 de IBDV se transcriben en dirección opuesta con respecto al gen US2 de HVT.

Clon subgenómico pSY640.

El plásmido pSY640 contiene una región de aproximadamente 13.600 pares de bases de ADN del HVT genómico (pos. 126848 -140540; Afonso et al., 2001, citado anteriormente; n.° de ref. AF291866] procedente del fragmento A de BamHI. Para generar este plásmido se clonó en el plásmido pSP64 (Promega, Madison WI.) la región de ADN situada cadena arriba del gen US2, comenzando en el sitio Stul situado en el gen US2 y continuando hasta el extremo del fragmento A de BamHI.

Clon subgenómico 556-60.6.

El plásmido 556-60.6 contiene una región de aproximadamente 12.500 pares de bases de ADN genómico del HVT obtenida a partir del fragmento A de BamHI (pos. aproxim. 143300-155744; Afonso et al., 2001, citado anteriormente; n.° de ref. AF291866]. Para generar este plásmido, la región de ADN situada cadena abajo del gen US2 (comenzando en el sitio Stul situado en el gen US2 y continuando hasta el extremo del fragmento A de BamHI) se clonó en pSP64 (Promega, Madison WI.), y luego se trató con exonucleasa para "retroceder" desde el sitio Stul ~150 pb, y se volvió a clonar en el vector plásmido pBR322.

Fragmentos de inserción adicionales para generar HVT/ILT/IBDV 1386-48.3.1.7:

Clon subgenómico 1386-04.4 n ° 1

El plásmido de inserción 1386-04.4 n.° 1 contiene un fragmento de EcoRI de 7311 pares de bases de las regiones cortas únicas de HVT [pos. 126880-144190; Afonso et al., 2001, citado anteriormente; n.° de ref. AF291866], clonado en el plásmido pSP64 (Promega, Madison, WI.). Insertados en un sitio StuI único dentro del gen US2 del HVT [pos.

140540/140541; Afonso et al., 2001, citado anteriormente; n.° de ref. AF291866, entre los restos de aminoácidos 124 y 125] hay 2 elementos: un fragmento SaII-HindIII de 3563 pares de bases del ILTV, cepa de exposición NVSL, n.° de lote 83-2 [pos. 10532-14094; Wild et al., Virus Genes 12:104-116 (1996); n.° de ref. u 28832], que codifica los genes de longitud completa de la glucoproteína D (gD) y la glucoproteína I (gI), más regiones codificantes parciales de la glucoproteína E (aminoácidos 1-101) y la ORF5 (aminoácidos 734-985) y un casete de expresión que consiste en el promotor hCMV IE, el gen de la proteína vírica 2 (VP2) del IBDV tipo clásico cepa F52/70, Faragher, y la señal de poliadenilación del gen de la timidina cinasa del virus del herpes simple (HSV). Los genes de gD de ILTV, gI de ILTV, y VP2 de IBDV se transcriben en dirección opuesta con respecto al gen US2 de HVT.

Clon subgenómico pSY640.

El plásmido pSY640 contiene una región de aproximadamente 13.600 pares de bases de ADN del HVT genómico (pos. 126848 -140540; Afonso et al., 2001, citado anteriormente; n.° de ref. AF291866] procedente del fragmento A de BamHI. Para generar este plásmido se clonó en el plásmido pSP64 (Promega, Madison WI.) la región de ADN situada cadena arriba del gen US2, comenzando en el sitio Stul situado en el gen US2 y continuando hasta el extremo del fragmento A de BamHI.

Clon subgenómico 556-60.6.

El plásmido 556-60.6 contiene una región de aproximadamente 12.500 pares de bases de ADN genómico del HVT obtenida a partir del fragmento A de BamHI (pos. aproxim. 143300-155744; Afonso et al., 2001, citado anteriormente; n.° de ref. AF291866]. Para generar este plásmido, la región de ADN situada cadena abajo del gen US2 (comenzando en el sitio Stul situado en el gen US2 y continuando hasta el extremo del fragmento A de BamHI) se clonó en pSP64 (Promega, Madison WI.), y luego se trató con exonucleasa para "retroceder" desde el sitio Stul ~150 pb, y se volvió a clonar en el vector plásmido pBR322.

Fragmentos de inserción adicionales para generar HVT/ILT/IBDV 484:

Clon subgenómico 484-1050-2641-10859

El plásmido de inserción 484-1050-2641-10859 contiene una región de 8636 pares de bases de la región genómica grande única del HVT [pos. 109489-118124; Afonso et al., 2001, citado anteriormente; n.° de ref. AF291866], clonado en un derivado del plásmido pNEB193 (Aatll-Pvull eliminado). Está flanqueado por sitios AscI e incluye fragmentos I, S de BamHI de HVT, más 1337 pares de bases del fragmento G y 1177 pares de bases del fragmento F. Se insertó en un sitio XhoI dentro del marco de lectura abierto de HVT UL54.5 [pos. 111240/111241; Afonso et al., 2001, citado anteriormente; n.° de ref. AF291866, entre los restos de aminoácidos 21 y 22] hay 2 elementos: un casete de expresión que consiste en el promotor mCMV IE, el gen de la proteína vírica 2 (VP2) del IBDv tipo clásico cepa F52/70, Faragher, y la señal de poliadenilación del SV40, seguido de un fragmento SaII-HindIII de 3563 pares de bases del ILTV, cepa de exposición NVSL, n.° de lote 83-2 [pos. 10532-14094; Wild et al., Virus Genes 12:104-116 (1996); n.° de ref. U28832], que codifica los genes de longitud completa de la glucoproteína D (gD) y la glucoproteína I (gI), más las regiones codificantes parciales de la glucoproteína E (aminoácidos 1-101) y ORF5 (aminoácidos 734-985). Los genes VP2 de IBDV, gD de ILTV y gI de ILTV se transcriben en dirección opuesta con respecto al gen UL54.5 de HVT.

Clon subgenómico 672-01.A40

El plásmido 672-01.A40 contiene una región de 14.731 pares de bases de ADN genómico de HVT procedente de la región larga única [pos. 96095-110825; Afonso et al., 2001, citado anteriormente; n.° de ref. AF291866], clonada en un derivado del plásmido pNEB193. Esta región incluye fragmentos H, J de BamHI del HVT, J y 1281 pares de bases de K2.

Clon subgenómico 672-07.C40

El plásmido 672-07.C40 contiene una región de 12.520 pares de bases de ADN genómico de HVT procedente de la región larga única [pos. 116948-129467; Afonso et al., 2001, citado anteriormente; n.° de ref. AF291866], clonada en un derivado del plásmido pNEB193. Esta región incluye los fragmentos F, O de BamHI del HVT, y 2620 pares de bases de A.

PROTOCOLO DE TRANSFECCIÓN CON CaCl2 CONVENCIONAL:

Los CEF secundarios se siembran en placas de cultivo de 6 pocillos y se incuban a 38 °C con CO² al 5 % durante 24 horas, y se forman monocapas confluentes. Para cada pocillo se mezcló una cantidad total de 0,5 |jg de ADN de cósmidos y plásmidos en tampón Hepes y se añadió CaCh 125 mM gota a gota hasta que la precipitación fue inminente. Esta mezcla se añadió a la monocapa de células CEF y se incubó durante 2 a 3 horas. Se eliminó el sobrenadante y se añadió una capa de glicerol al 15 %, y se mantuvo sobre las células durante 1 minuto. Luego, esto se eliminó, se lavó con PBS y se añadió medio de cultivo recién preparado, y las células se incubaron durante 5 días. A continuación, las células se recogieron mediante tratamiento con tripsina y las células de las placas individuales se sembraron cada una en monocapas recientes de células CEF en placas de 10 cm, y se incubaron hasta alcanzar el 50-90 % de CPE. A continuación, las células transfectadas amplificadas se recogieron mediante tratamiento con tripsina y se sembraron en placas diluciones de 10'2 a 10'4 en placas de 10 cm con monocapas de CEF, y se incubó. El día siguiente, las placas se cubrieron con agar y se aislaron varias placas individuales de HVT/ILTV/IBDV y se amplificaron en CEF. Cada reserva de virus se purificó por placas por segunda vez infectando monocapas confluentes de CEF en placas de 10 cm con reservas purificadas en primera ronda diluidas a 10'2 a 10'4 e incubando las células. El día siguiente, las placas se cubrieron con agar y se aislaron varias placas individuales de HVT/ILTV/IBDV y se amplificaron en CEF.

EJEMPLO 3

LAS RESERVAS DE VIRUS HVT/ILTV/IBDV RECOMBINANTES SON FENOTÍPICAMENTE ESTABLES PARA LA EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS DE ILT Y IBDV DESPUÉS DEL PASE SERIADO EN CULTIVO DE TEJIDOS.

Tres construcciones, una comprendiendo HVT/IBDV/ILT 1386-134.1-2, la segundo, comprendiendo HVT/ILT/IBDV 1386-48.1.1.1, y la tercera comprendiendo HVT/ILT/IBDV 1386-48.3.1.7 se pasaron en serie más de 14 veces en células CEF secundarias y se evaluó la expresión de los genes ILTV e IBDV insertados en un ensayo de inmunofluorescencia. Una cuarta construcción, designada HVT/ILT/IBDV 484.1-1A3A3, se pasó en serie más de 15 veces en células CEF secundarias y se evaluó la expresión de los genes ILTV e IBDV insertados en un ensayo de inmunofluorescencia, [véase, Tablas 1 y 2 a continuación).

Generación de reservas de Pases en cultivo de tejidos:

Para cada pase en cultivo de tejidos, se inocularon 50-100 |jl de caldo de virus en monocapas confluentes de CEF secundarias, colocadas en una placa de 10 cm, luego se incubó a 38 °C, CO² al 5 % durante 2 - 5 días hasta que el ECP fuera evidente. A continuación, las células se recogieron mediante tratamiento con tripsina, pase 1 (P1). El procedimiento se repitió para preparar más reservas de pases (P2 - P15).

Análisis de estabilidad fenotípica:

Se sembraron en placas seis placas de pocillos con monocapas de CEF secundarias. Las células se inocularon con reservas de virus recogidos en diversos pases: P0 - P15, o solo con diluyente. Las placas se inocularon con múltiples diluciones para lograr un número contable de placas por pocillo y se incubaron a 38 °C, CO² al 5 %. Después de una incubación de cinco días, el sobrenadante se decantó y las monocapas de CEF se fijaron con metanol al 100 % durante 10-15 minutos a 15-30 °C. El metanol se decantó y las células se dejaron secar al aire antes de teñirlas con gD del ILTV (MAB n.° 6), anticuerpos primarios para gl del ILTV (policlonal de conejo anti-gl) y para VP2 del IBDV (MCA GDV-R63). Después de una etapa de bloqueo de 2 horas, (leche descremada en polvo al 5 % en PBS), se añadieron 2 ml por pocillo a las placas y se incubaron en una plataforma oscilante a 15-30°C, los anticuerpos primarios se diluyeron según procediera y se añadieron a 2 ml por pocillo, luego se incubaron a 15-30 °C durante 3 horas en una plataforma oscilante.

Después de la incubación del anticuerpo, las placas se lavaron tres veces con PBS. La solución de anticuerpo secundario marcado con FITC (anti-ratón de conejo o anti-conejo de cabra) se preparó a 1:100 y se añadieron 2 ml a cada pocillo. Las placas se incubaron durante 1 hora a 15-30 °C en una plataforma oscilante. Después de la incubación, las placas se lavaron tres veces con PBS, y se examinaron en un sistema fluorescente. Se observaron placas teñidas con los anticuerpos para ILT en cuanto a fluorescencia positiva (+) o negativa (-). Se recontaron las placas fluorescentes teñidas con anticuerpo primario para la proteína VP2 del IBDV. Luego se examinaron las placas al microscopio óptico y se recontaron las placas. El porcentaje de placas fluorescentes en cada nivel de pase se proporciona en las Tablas 1 y 2 a continuación, así como una determinación cualitativa de la expresión de la proteína VP2 del IBDV y la estabilidad del vector.

TABLA 1

TABLA 2

EJEMPLO 4

Las reservas de virus HVT/ILTV/IBDV recombinantes son fenotípicamente estables para la expresión de las proteínas de ILT y IBDV después de la vacunación y la recuperación a partir de aves

Tes vacunas, una comprendiendo HVT/ILT/IBDV 1386-134.1-2, otra comprendiendo HVT/ILT IBDV 1386-48.3.1.7, y una tercera comprendiendo HVT/ILT/IBDV 484.1-1A3A3 se utilizaron para inocular tres grupos de pollos de quince (15) días de edad por vía subcutánea. Un cuarto grupo de aves se vacunó con solo diluyente para servir como grupo de control negativo. Se recogieron muestras de bazo siete días posinoculación y se procesaron para el aislamiento del virus en fibroblastos de embrión de pollo. Las células inoculadas se pasaron dos veces para permitir la expansión de cualquier virus presente. Cuando el efecto citopático era claramente visible, las monocapas se recogieron y se congelaron reservas. Estas reservas se usaron para inocular CEF secundarios y las placas se analizaron en cuanto a la expresión de las proteínas gD del ILTV, gI del ILTV y VP2 del IBDV mediante ensayo de inmunofluorescencia (IFA), con anticuerpos específicos para cada proteína.

Análisis de estabilidad fenotípica:

Se sembraron en placas seis placas de pocillos con monocapas de CEF secundarias. Las células se inocularon con las reservas de aislamiento de virus recogidas o con diluyente solo. Las placas se inocularon con múltiples diluciones para lograr un número contable de placas por pocillo, y se incubaron a 38 °C, CO² al 5 %. Después de cinco días de incubación, el sobrenadante se decantó y las monocapas de CEF se fijaron con metanol al 100% durante 10-15 minutos a 15-30 °C. El metanol se decantó y las células se dejaron secar al aire antes de teñirlas con gD del ILTV (MAB n.° 6), anticuerpos primarios para gI del ILTV (policlonal de conejo anti-gI) y para VP2 del IBDV (MCA GDV-R63). Después de una etapa de bloqueo de 2 horas, (leche descremada en polvo al 5 % en PBS), se añadieron 2 ml por pocillo a las placas y se incubaron en una plataforma oscilante a 15-30°C, los anticuerpos primarios se diluyeron según procediera, y se añadieron a 2 ml por pocillo, luego se incubaron a 15-30 °C durante 3 horas en una plataforma oscilante. Después de la incubación del anticuerpo, las placas se lavaron tres veces con PBS. La solución de anticuerpo secundario marcado con FITC (anti-ratón de conejo o anti-conejo de cabra) se preparó a 1:100 y se añadieron 2 ml a cada pocillo. Las placas se incubaron durante 1 hora a 15-30 °C en una plataforma oscilante. Después de la incubación, las placas se lavaron tres veces con PBS y se examinaron en un sistema fluorescente. Se observaron placas teñidas con los anticuerpos para ILTV en cuanto a fluorescencia positiva (+) o negativa (-). Se recontaron las placas fluorescentes teñidas con anticuerpo primario para VP2 del IBDv . Luego se examinaron las placas al microscopio óptico y las placas se recontaron. El porcentaje de placas fluorescentes en cada nivel de pase se proporciona en la Tabla 3A a continuación. Este estudio fue prácticamente repetido, con la excepción de que el virus se recuperó dos semanas después de la inoculación, véase, la Tabla 3B a continuación.

TABLA A

TABLA B

EJEMPLO 5

CONSTRUCCIONES NO SATISFACTORIAS

Los virus vacunales de vectores recombinantes, por definición, están genomodificados para portar y expresar genes extraños. En caso de que la transcripción y la expresión de estos genes extraños proporcionen una desventaja de crecimiento para el virus recombinante con respecto al virus parental, es posible que estos genes se pierdan durante la producción de la vacuna. Por este motivo, las vacunas candidatas deben someterse a pruebas de estabilidad tanto genética como fenotípica.

Además, el criterio de protección utilizado es el establecido por la USDA y codificado en el Título 9 del Código de Regulaciones Federales, parte 113 (9CFR 113) "Requisitos normativos para los productos de origen animal". Las vacunas de virus vivos deben proporcionar al menos el 90 % de protección, en el caso del NDV, el IBDV y el ILTV, y al menos el 80 % en el caso del MDV, frente a los signos clínicos o lesiones asociadas a la enfermedad para obtener una autorización.

La estabilidad genética de las construcciones víricas se determinó mediante análisis de transferencia de Southern después de un número definido de pases en cultivo de tejidos, el nivel de producción de vacuna previsto más alto, y en comparación con el ADN del aislado original. El ADN extraído de las reservas vírica se digiere con enzimas de restricción, se transfiere a una membrana y se hibrida con sondas diseñadas para detectar la presencia de los genes extraños insertados. La estabilidad genética también puede determinarse mediante análisis de PCR. Para amplificar fragmentos de tamaño conocido de los moldes de ADN vírico, tanto antes como después de su paso por el cultivo de tejidos, podrían utilizarse cebadores de PCR diseñados para aparearse al ADN dentro del ADN extraño o flanqueándolo.

La estabilidad fenotípica de las construcciones víricas se determinó mediante tinción inmunológica de las placas víricas individuales con anticuerpos dirigidos contra los productos proteicos de estos genes extraños insertados. La protección proporcionada por estas vacunas recombinantes se basa en la expresión de estos productos proteicos para estimular el sistema inmunitario de los animales. En la mayoría de los casos, si el porcentaje de virus con tinción positiva para la expresión de proteína extraña caía por debajo del 90 %, probablemente era perjudicial para la capacidad de los virus de crecer en cultivo de tejidos y, por tanto, no era adecuado como candidato a vacuna.

Como se desprende fácilmente de las Tablas 4A y 4B a continuación, la mayoría de las construcciones de rMDVnp no cumplen estos dos criterios, a saber, estabilidad con una expresión y/o eficacia del antígeno relativamente fuerte. La Tabla 4A proporciona una serie de construcciones de HVT recombinantes con múltiples insertos heterólogos en los que uno de los insertos heterólogos codifica un antígeno del IBDV. Como muestran los resultados, todas las construcciones de la Tabla 4A no lograron cumplir los criterios de estabilidad con expresión de antígenos y/o eficacia relativamente fuertes.

TABLA 4A

continuación

La Tabla 4B a continuación, proporciona una serie de once construcciones de HVT recombinantes y una construcción de NAHV solitaria, cada una de las cuales comprende múltiples insertos heterólogos en los que al menos uno de los insertos heterólogos codifica un antígeno de NDV o ILTV.1 Como muestran los resultados, todas las construcciones de la Tabla 4B no lograron cumplir los criterios de estabilidad con expresión de antígenos y/o eficacia relativamente fuertes.

1 Los datos de la Tabla 4B se enviaron a la Oficina de Patentes de EE. UU. durante la tramitación del documento US 8.932.604 B2 en una Declaración firmada por uno de los coinventores de la presente solicitud.

TABLA 4B

continuación

EJEMPLO 6

SECUENCIAS

Las siguientes secuencias se han usado en las construcciones ilustrativas de rHVT. Las secuencias de codificación proporcionadas a continuación incluyen codones de terminación individuales, que pueden sustituirse fácilmente por codones de terminación alternativos sin modificar las propiedades de los antígenos proteicos que codifican las secuencias codificantes.

SEQ ID NO 1: Glucoproteína gD del ILTV (1134 pb)

atggaccgccatttatttttgaggaatgctttttggactatcgtactgctttcttccttcgctagcca gagcaccgccgccgtcacgtacgactacattttaggccgtcgcgcgctcgacgcgctaaccataccgg cggttggcccgtataacagatacctcactagggtatcaagaggctgcgacgttgtcgagctcaacccg atttctaacgtggacgacatgatatcggcggccaaagaaaaagagaaggggggccctttcgaggcctc cgtcgtctggttctacgtgattaagggcgacgacggcgaggacaagtactgtccaatctatagaaaag agtacagggaatgtggcgacgtacaactgctatctgaatgcgccgttcaatctgcacagatgtgggca gtggactatgttcctagcacccttgtatcgcgaaatggcgcgggactgactatattctcccccactgc tgcgctctctggccaatacttgctgaccctgaaaatcgggagatttgcgcaaacagctctcgtaactc tagaagttaacgatcgctgtttaaagatcgggtcgcagcttaactttttaccgtcgaaatgctggaca acagaacagtatcagactggatttcaaggcgaacacctttatccgatcgcagacaccaatacacgaca cgcggacgacgtatatcggggatacgaagatattctgcagcgctggaataatttgctgaggaaaaaga atcctagcgcgccagaccctcgtccagatagcgtcccgcaagaaattcccgctgtaaccaagaaagcg gaagggcgcaccccggacgcagaaagcagcgaaaagaaggcccctccagaagactcggaggacgacat gcaggcagaggcttctggagaaaatcctgccgccctccccgaagacgacgaagtccccgaggacaccg agcacgatgatccaaactcggatcctgactattacaatgacatgcccgccgtgatcccggtggaggag actactaaaagttctaatgccgtctccatgcccatattcgcggcgttcgtagcctgcgcggtcgcgct cgtggggctactggtttggagcatcgtaaaatgcgcgcgtagctaa

SEQ ID NO 2: Glucoproteína gD del ILTV (377 aminoácidos)

MDRHLFLRNAFWTIVLLSSFASQSTAAVTYDYILGRRALDALTIPAVGPYNRYLTRVSRGCDWELNP ISNVDDMISAAKEKEKGGPFEASVVWFYVIKGDDGEDKYCPIYRKEYRECGDVQLLSECAVQSAQMWA VDYVPSTLVSRNGAGLTIFSPTAALSGQYLLTLKIGRFAQTALVTLEVNDRCLKIGSQLNFLPSKCWT TEQYQTGFQGEHLYPIADTNTRHADDVYRGYEDILQRWNNLLRKKNPSAPDPRPDSVPQEIPAVTKKA EGRTPDAESSEKKAPPEDSEDDMQAEASGENPAALPEDDEVPEDTEHDDPNSDPDYYNDMPAVIPVEE TTKSSNAVSMPIFAAFVACAVALVGLLVWSIVKCARS

SEQ ID NO 3: Glucoproteína gI del ILTV (1089 pb)

Atggcatcgctacttggaactctggctctccttgccgcgacgctcgcacccttcggcgcgatgggaat cgtgatcactggaaatcacgtctccgccaggattgacgacgatcacatcgtgatcgtcgcgcctcgcc ccgaagctacaattcaactgcagctatttttcatgcctggccagagaccccacaaaccctactcagga accgtccgcgtcgcgtttcggtctgatataacaaaccagtgctaccaggaacttagcgaggagcgctt tgaaaattgcactcatcgatcgtcttctgtttttgtcggctgtaaagtgaccgagtacacgttctccg cctcgaacagactaaccggacctccacacccgtttaagctcactatacgaaatcctcgtccgaacgac agcgggatgttctacgtaattgttcggctagacgacaccaaagaacccattgacgtcttcgcgatcca actatcggtgtatcaattcgcgaacaccgccgcgactcgcggactctattccaaggcttcgtgtcgca ccttcggattacctaccgtccaacttgaggcctatctcaggaccgaggaaagttggcgcaactggcaa gcgtacgttgccacggaggccacgacgaccagcgccgaggcgacaaccccgacgcccgtcactgcaac cagcgcctccgaacttgaagcggaacactttacctttccctggctagaaaatggcgtggatcattacg aaccgacacccgcaaacgaaaattcaaacgttactgtccgtctcgggacaatgagccctacgctaatt ggggtaaccgtggctgccgtcgtgagcgcaacgatcggcctcgtcattgtaatttccatcgtcaccag aaacatgtgcaccccgcaccgaaaattagacacggtctcgcaagacgacgaagaacgttcccaaacta gaagggaatcgcgaaaatttggacccatggttgcgtgcgaaataaacaagggggctgaccaggatagt gaacttgtggaactggttgcgattgttaacccgtctgcgctaagctcgcccgactcaataaaaatgtg a

SEQ ID NO 4: Glucoproteína gl del ILTV (362 aminoácidos)

MASLLGTLALLAATLAPFGAMGIVITGNHVSARIDDDHIVIVAPRPEATIQLQLFFMPGQRPHKPYSG TVRVAFRSDITNQCYQELSEERFENCTHRSSSVFVGCKVTEYTFSASNRLTGPPHPFKLTIRNPRPND SGMFYVIVRLDDTKEPIDVFAIQLSVYQFANTAATRGLYSKASCRTFGLPTVQLEAYLRTEESWRNWQ AYVATEATTTSAEATTPTPVTATSASELEAEHFTFPWLENGVDHYEPTPANENSNVTVRLGTMSPTLI GVTVAAWSATIGLVIVISIVTRNMCTPHRKLDTVSQDDEERSQTRRESRKFGPMVACEINKGADQDS ELVELVAIVNPSALSSPDSIKM

SEQ ID NO 5: VP2 del IBDV (1362 pb)

atgacaaacctgcaagatcaaacccaacagattgttccgttcatacggagccttctgatgccaacaac cggaccggcgtccattccggacgacaccctggagaagcacactctcaggtcagagacctcgacctaca atttgactgtgggggacacagggtcagggctaattgtctttttccctggattccctggctcaattgtg ggtgctcactacacactgcagagcaatgggaactacaagttcgatcagatgctcctgactgcccagaa cctaccggccagctacaactactgcagactagtgagtcggagtctcacagtgaggtcaagcacactcc ctggtggcgtttatgcactaaacggcaccataaacgccgtgaccttccaaggaagcctgagtgaactg acagatgttagctacaatgggttgatgtctgcaacagccaacatcaacgacaaaattgggaatgtcct ggtaggggaaggggtcactgtcctcagcctacccacatcatatgatcttgggtatgtgaggcttggtg accccattcccgctatagggcttgacccaaaaatggtagctacatgcgacagcagtgacaggcccaga gtctacaccataactgcagccgatgattaccaattctcatcacagtaccaaccaggtggggtaacaat cacactgttctcagccaacattgatgctatcacaagcctcagcattgggggagagctcgtgtttcaaa caagcgtccaaggccttgtactgggcgccaccatctaccttataggctttgatgggactgcggtaatc accagagctgtggccgcagataatgggctgacggccggcaccgacaatcttatgccattcaatcttgt cattccaaccaatgagataacccagccaatcacatccatcaaactggagatagtgacctccaaaagtg gtggtcaggcaggggatcagatgtcatggtcggcaagtgggagcctagcagtgacgatccatggtggc aactatccaggggccctccgtcccgtcacactagtagcctacgaaagagtggcaacaggatccgtcgt tacggtcgctggggtgagtaacttcgagctgattccaaatcctgaactagcaaagaacctggttacag aatacggccgatttgacccaggagccatgaactacacaaaattgatactgagtgagagggaccgtctt ggcatcaagaccgtctggccaacaagggagtacactgattttcgtgagtacttcatggaggtggccga cctcaactctcccctgaagattgcaggagcatttggcttcaaagacataatccgggctataaggaggt aa

SEQ ID NO 6: VP2 del IBDV (453 aminoácidos)

MTNLQDQTQQIVPFIRSLLMPTTGPASIPDDTLEKHTLRSETSTYNLTVGDTGSGLIVFFPGFPGSIV GAHYTLQSNGNYKFDQMLLTAQNLPASYNYCRLVSRSLTVRSSTLPGGVYALNGTINAVTFQGSLSEL TDVSYNGLMSATANINDKIGNVLVGEGVTVLSLPTSYDLGYVRLGDPIPAIGLDPKMVATCDSSDRPR VYTITAADDYQFSSQYQPGGVTITLFSANIDAITSLSIGGELVFQTSVQGLVLGATIYLIGFDGTAVI TRAVAADNGLTAGTDNLMPFNLVIPTNEITQPITSIKLEIVTSKSGGQAGDQMSWSASGSLAVTIHGG NYPGALRPVTLVAYERVATGSVVTVAGVSNFELIPNPELAKNLVTEYGRFDPGAMNYTKLILSERDRL GIKTVWPTREYTDFREYFMEVADLNSPLKIAGAFGFKDIIRAIRR

SEQ ID NO 7: promotor de gD del ILTV (527 pb)

aaacagctgtactacagagtaaccgatggaagaacatcggtccagctaatgtgcctgtcgtgcacgag ccattctccggaaccttactgtcttttcgacacgtctcttatagcgagggaaaaagatatcgcgccag agttatactttacctctgatccgcaaacggcatactgcacaataactctgccgtccggcgttgttccg agattcgaatggagccttaataatgtttcactgccggaatatttgacggccacgaccgttgtttcgca taccgctggccaaagtacagtgtggaagagcagcgcgagagcaggcgaggcgtggatttctggccggg gaggcaatatatacgaatgcaccgtcctcatctcagacggcactcgcgttactacgcgaaaggagagg tgcttaacaaacacatggattgcggtggaaaacggtgctgctcaggcgcagctgtattcactcttttc tggacttgtgtcaggattatgcgggagcatatctgctttgtacgcaacgct

SEQ ID NO 8: promotor de gI del ILTV (264 pb)

tgactattacaatgacatgcccgccgtgatcccggtggaggagactactaaaagttctaatgccgtct ccatgcccatattcgcggcgttcgtagcctgcgcggtcgcgctcgtggggctactggtttggagcatc gtaaaatgcgcgcgtagctaatcgagcctagaataggtggtttcttcctacatgccacgcctcacgct cataatataaatcacatggaatagcataccaatgcctattcattgggacgttcgaaaagc

SEQ ID NO 9: Inserto de ILTV (3563 pb)

tcgacggcagagtcgcagacgcccctattggacgtcaaaattgtagaggtgaagttttcaaacgatgg cgaagtaacggcgacttgcgtttccaccgtcaaatctccctatagggtagaaactaattggaaagtag acctcgtagatgtaatggatgaaatttctgggaacagtcccgccggggtttttaacagtaatgagaaa tggcagaaacagctgtactacagagtaaccgatggaagaacatcggtccagctaatgtgcctgtcgtg cacgagccattctccggaaccttactgtcttttcgacacgtctcttatagcgagggaaaaagatatcg cgccagagttatactttacctctgatccgcaaacggcatactgcacaataactctgccgtccggcgtt gttccgagattcgaatggagccttaataatgtttcactgccggaatatttgacggccacgaccgttgt ttcgcataccgctggccaaagtacagtgtggaagagcagcgcgagagcaggcgaggcgtggatttctg gccggggaggcaatatatacgaatgcaccgtcctcatctcagacggcactcgcgttactacgcgaaag gagaggtgcttaacaaacacatggattgcggtggaaaacggtgctgctcaggcgcagctgtattcact cttttctggacttgtgtcaggattatgcgggagcatatctgctttgtacgcaacgctatggaccgcca tttatttttgaggaatgctttttggactatcgtactgctttcttccttcgctagccagagcaccgccg ccgtcacgtacgactacattttaggccgtcgcgcgctcgacgcgctaaccataccggcggttggcccg tataacagatacctcactagggtatcaagaggctgcgacgttgtcgagctcaacccgatttctaacgt ggacgacatgatatcggcggccaaagaaaaagagaaggggggccctttcgaggcctccgtcgtctggt tctacgtgattaagggcgacgacggcgaggacaagtactgtccaatctatagaaaagagtacagggaa tgtggcgacgtacaactgctatctgaatgcgccgttcaatctgcacagatgtgggcagtggactatgt tcctagcacccttgtatcgcgaaatggcgcgggactgactatattctcccccactgctgcgctctctg gccaatacttgctgaccctgaaaatcgggagatttgcgcaaacagctctcgtaactctagaagttaac gatcgctgtttaaagatcgggtcgcagcttaactttttaccgtcgaaatgctggacaacagaacagta tcagactggatttcaaggcgaacacctttatccgatcgcagacaccaatacacgacacgcggacgacg tatatcggggatacgaagatattctgcagcgctggaataatttgctgaggaaaaagaatcctagcgcg ccagaccctcgtccagatagcgtcccgcaagaaattcccgctgtaaccaagaaagcggaagggcgcac cccggacgcagaaagcagcgaaaagaaggcccctccagaagactcggaggacgacatgcaggcagagg cttctggagaaaatcctgccgccctccccgaagacgacgaagtccccgaggacaccgagcacgatgat ccaaactcggatcctgactattacaatgacatgcccgccgtgatcccggtggaggagactactaaaag ttctaatgccgtctccatgcccatattcgcggcgttcgtagcctgcgcggtcgcgctcgtggggctac tggtttggagcatcgtaaaatgcgcgcgtagctaatcgagcctagaataggtggtttcttcctacatg ccacgcctcacgctcataatataaatcacatggaatagcataccaatgcctattcattgggacgttcg aaaagcatggcatcgctacttggaactctggctctccttgccgcgacgctcgcacccttcggcgcgat gggaatcgtgatcactggaaatcacgtctccgccaggattgacgacgatcacatcgtgatcgtcgcgc ctcgccccgaagctacaattcaactgcagctatttttcatgcctggccagagaccccacaaaccctac tcaggaaccgtccgcgtcgcgtttcggtctgatataacaaaccagtgctaccaggaacttagcgagga gcgctttgaaaattgcactcatcgatcgtcttctgtttttgtcggctgtaaagtgaccgagtacacgt tctccgcctcgaacagactaaccggacctccacacccgtttaagctcactatacgaaatcctcgtccg aacgacagcgggatgttctacgtaattgttcggctagacgacaccaaagaacccattgacgtcttcgc gatccaactatcggtgtatcaattcgcgaacaccgccgcgactcgcggactctattccaaggcttcgt gtcgcaccttcggattacctaccgtccaacttgaggcctatctcaggaccgaggaaagttggcgcaac tggcaagcgtacgttgccacggaggccacgacgaccagcgccgaggcgacaaccccgacgcccgtcac tgcaaccagcgcctccgaacttgaagcggaacactttacctttccctggctagaaaatggcgtggatc attacgaaccgacacccgcaaacgaaaattcaaacgttactgtccgtctcgggacaatgagccctacg ctaattggggtaaccgtggctgccgtcgtgagcgcaacgatcggcctcgtcattgtaatttccatcgt caccagaaacatgtgcaccccgcaccgaaaattagacacggtctcgcaagacgacgaagaacgttccc aaactagaagggaatcgcgaaaatttggacccatggttgcgtgcgaaataaacaagggggctgaccag gatagtgaacttgtggaactggttgcgattgttaacccgtctgcgctaagctcgcccgactcaataaa aatgtgattaagtctgaatgtggctctccaatcatttcgattctctaatctcccaatcctctcaaaag gggcagtatcggacacggactgggaggggcgtacacgatagttatatggtacagcagaggcctctgaa cacttaggaggagaattcagccggggagagcccctgttgagtaggcttgggagcatattgcaggatga acatgttagtgatagttctcgcctcttgtcttgcgcgcctaacttttgcgacgcgacacgtcctcttt ttggaaggcactcaggctgtcctcggggaagatgatcccagaaacgttccggaagggactgtaatcaa atggacaaaagtcctgcggaacgcgtgcaagatgaaggcggccgatgtctgctcttcgcctaactatt gctttcatgatttaatttacgacggaggaaagaaagactgcccgcccgcgggacccctgtctgcaaac ctggtaattttactaaagcgcggcgaa

SEQ ID NO 10: promotor mCMV IE (1391 pb)

aactccgcccgttttatgactagaaccaatagtttttaatgccaaatgcactgaaatcccctaatttg caaagccaaacgccccctatgtgagtaatacggggactttttacccaatttcccacgcggaaagcccc ctaatacactcatatggcatatgaatcagcacggtcatgcactctaatggcggcccatagggactttc cacatagggggcgttcaccatttcccagcataggggtggtgactcaatggcctttacccaagtacatt gggtcaatgggaggtaagccaatgggtttttcccattactggcaagcacactgagtcaaatgggactt tccactgggttttgcccaagtacattgggtcaatgggaggtgagccaatgggaaaaacccattgctgc caagtacactgactcaatagggactttccaatgggtttttccattgttggcaagcatataaggtcaat gtgggtgagtcaatagggactttccattgtattctgcccagtacataaggtcaatagggggtgaatca acaggaaagtcccattggagccaagtacactgcgtcaatagggactttccattgggttttgcccagta cataaggtcaataggggatgagtcaatgggaaaaacccattggagccaagtacactgactcaataggg actttccattgggttttgcccagtacataaggtcaatagggggtgagtcaacaggaaagttccattgg agccaagtacattgagtcaatagggactttccaatgggttttgcccagtacataaggtcaatgggagg taagccaatgggtttttcccattactggcacgtatactgagtcattagggactttccaatgggttttg cccagtacataaggtcaataggggtgaatcaacaggaaagtcccattggagccaagtacactgagtca atagggactttccattgggttttgcccagtacaaaaggtcaatagggggtgagtcaatgggtttttcc cattattggcacgtacataaggtcaataggggtgagtcattgggtttttccagccaatttaattaaaa cgccatgtactttcccaccattgacgtcaatgggctattgaaactaatgcaacgtgacctttaaacgg tactttcccatagctgattaatgggaaagtaccgttctcgagccaatacacgtcaatgggaagtgaaa gggcagccaaaacgtaacaccgccccggttttcccctggaaattccatattggcacgcattctattgg ctgagctgcgttctacgtgggtataagaggcgcgaccagcgtcggtaccgtcgcagtcttcggtctga ccaccgtagaacgcagagctcctcgctgcag

SEQ ID NO 11: promotor de la p-actina de pollo (692 pb)

(Nota: "nnn" indica una secuencia ambigua en una región altamente rica en GC. Podría ser de 3-5 "g")

cgcgccggatcagatctccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccc cctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggg ggggnnncgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcgg cggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccc tataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgc cgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacg gcccttctcctccgggctgtaattagcggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgcc gcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtccgcggggggacggctgccttcgggggg gacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgtt catgccttcttctttttcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttgg caaagaattgca

SEQ ID NO 12: promotor hCMV IE, de la cepa AD169 (301 pb)

ggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatggg cgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgtt ttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcg gtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggaga cgccatccacgctgttttgacctccatag

SEQ ID NO 13: señal de poliadenilación de FHV US-9 (55 pb) caataaacatagcatacgttatgacatggtctaccgcgtcttatatggggacgac

SEQ ID NO 14: señal de poliadenilación de la TK del ILTV (370 pb)

gatccataattgattgacgggagatgggggaggctaactgaaacacggaaggagacaataccggaagg aacccgcgctatgacggcaataaaaagacagaataaaacgcacgggtgttgggtcgtttgttcataaa cgcggggttcggtcccagggctggcactctgtcgataccccaccgagaccccattggggccaatacgc ccgcgtttcttccttttccccaccccaccccccaagttcgggtgaaggcccagggctcgcagccaacg tcggggcggcaggccctgccatagccactggccccgtgggttagggacggggtcccccatggggaatg gtttatggttcgtgggggttattattttga

SEQ ID NO 15: 228509-ILT-435Vec6 (mCMV IEpro-VP2-SV40pA/ILT/HVT) (14113 pb) (casetes de genes de ILT IBDV en fragmento EcoRI n.° 7 de HVT. Virus n.° HVT/IBDV/ILT 1386-134)

gaattccagactaaatgccccggcccaatttgtcaagtgtgcagtcacggaggcgtcgaccgtgtccc cggcattaaacaggaaagcgttaaagtttttgaatgttaggtcacaggtacaaacataaatgtttgta caaacaggtaacaggtacaaacataaatgccccggcataaatgtcccttacggcggatcgaaacgaca ttaggcatactcgggtaccattttgcattccgatcagcacggatgaaattaggcaggaatgcggttta tattatgcggcattggacaaacgatatggcattgattggcagtttatgaatgtcttcatgttgggcgt aaacggattcctattggttcagaagacaacgacgatatatttagagagaaaaagctacccagcatagg ataaacacacattgagcattgagagacataggtatcggtatggatgggaaaactacacacgtgaacac caaacgacttatatactcgagcggtgatactactgagcaagaatgcactgcatctgagccactgaatg aagactgtgatgaaaatgtgaccatcgatggaattggagaagaatatgcgcagttcttcatgtccccg caatgggtcccaaatctacatcgcttgagcgaggataccaaaaaggtataccgatgtatggtttccaa cagactcaattattttccctattatgaggcgttcaggcggtctttgtttgatatgtatatgctaggtc ggttggggcgtcgacttaagcgatctgactgggagactattatgcatctgtcaccaacgcaaagtcgg cgtctacatagaactttaagatttgtggagcgtagaattatcccatctaacagttatatacgcacatc gggccacgttccgccttcgagggcacttccgacagatacgaatttaaagatggatgaataattaaatt ggaaagagtaactacattaatcgagcgtcatgacggcgtcccgtgaaaatgggaattttctactcgaa acaccgtgacatttgacagacctggaattgttattctgatatatagtgggtgtgtctggccggcaaca tacataatgtgcatgcgaaaccactttttcagtgtacgctgacattgtgcaacacggaggggtagcat ctacatacaatatatgttgattaatgattggagaaaaaactatgcagctcgccgatcatatggctaac tcgccttcgtctatatggcggaccccgcgggaaaaatcgacgtaccatctgatttacaacaccagtaa tgaacatgtcgcatccctgcccagatctgtgcgcccattggcgcggatcgttgtgaatgccgccgaaa cacttcaggtcggtatgagagccgggaggccgccatcagcaggagtttggcgagaggtgtttgataga atgatgacagccttccgtgaccacgagcctactgcgacatttaatgctgcaaatcccattagaaaaat ggtcgagacagttctacagaataatgaagagcccccgcggacgcatgctgaaatgggtaatcgcctta tgaacattatgtactggtgttgcttgggacacgcaggacaatgctcgatatggcagttgtacgagacg aatcaggccattttaagtttattagatgaagtggttatcggcacaacaaatcccttttgcaccctcga gcaatactggaagccattatgcaccgcaatcgccaacaaggggacctcatcgcttgttgaggatgcca aagtggccgagtacctggttagcatgcgcaaattgatataacataggcacgctctgatgttacagacc acaataccgcatacatttattgtaaggttgttaataaaggtttattctatgtaagactacaatacttt cgacattgcttgtatacatattaaatactttctcaagttcctattacataaaatgggatctatcatta cattcgttaagagtctggataattttactgtttgccagcttcgatcttggaacgtactgtggatagtg ccttacttggaatcgtgaaaatttgaaacgtccattatttggatatcttccggttgtcccatatcccg ccctggtaccgctcggataccttgcccgtatggattcgtattgacagtcgcgcaatcggggaccaaca acgcgtgggtccacactcattcggaaattttccgatgattctgaatatttattgccgctcgttacgag tcgttggacatatctgtaatacatttcttcttctgaaggatcgctgcacatttgatctatacattggc caggatgttcaagtctcagatgttgcattctggcacagcacaactttatggcatttccgatgtaatcg tccggcagccctgggggagttctatattcgcatattgggatggtaaggacaatagcagatctcgcaac ctccagggaggctataataacgtttttaaaggatggatttctcataaaaatctgtcgcaaattacact gagaatatcctttactagcgccgattgagagcatcgtcgtccaattttctaaatggaaagaaaacaag gcgggcaagagtgttccaaacattttcattttcggcgaatctctcaaatcccatggcgtgcaattgat tgcaaaattggcacttccgttcacgtttgtatctccaaactctaagacacttttaattgaaaaactac gttctagtgtggaaagaaacctataggcagaccatagaactatttgacaccacatatctttttgtatg tcaaactgaccatgatcgtatgttgctgaatgcactagggcaattcgctcgcgcgactccatacattg aataattccacacgtcagctcatcggttagcaaggtccagtagttgaagtcatttatttttccccgcg gctggccaaatctacctctgggaatatccaagttgtcgaatatgatcgcaccggctctggtcatggtg aaggaactgtagcataaagacgcaggtatcataggggtaatatttttttattcactcacatactaaaa gtaacgcatattagcaccatgtatgggctatcaattgacatttgcgtagcactacatcacgattatgt acaacataatgggacaacatatggcaagtagatgcaatttcctcacactagttgggtttatctactat tgaattttcccctatctgtgatacacttgggagcctctacaagcatattgccatcatgtacgttttta tctactgtcttaacgcccatgggaacggaggcgtcgtcgtcatgtattggacggcaacataggcagca acacaaattgcgtttaggtggggtgcatgtggactcgataccaagcccctgcagctggggaacgtctg gtggagagccgataatttgatatacgcacgccatattactgtcgttgaagtacgccttatcttctatg ttttcaaatttaggttcccaagtggacgtgagaagtgtttgtatctcacatggaatggcccaaggcat tccagcccaggtgcctggtactttaatggcaaacaaacgttttggtagaggtattgattctattgcag ttctgcagatatctgcagccccgagtatccacaggctatacgatacgttatcggaggcaagctgcggc cgctctagaactagtggatcccccgggctgcagcccaatgtggaattcgcccttgcacattgttactc ctgcatcttaaaaatatatcctgtagtaattttcacagcaatgtcataacatcatctcgctaaagaat gacctgggattggagaagtaatgaatatttgcaaccaatgcattgaataaactaacattaaacgaatt cactagtggatcccccaactccgcccgttttatgactagaaccaatagtttttaatgccaaatgcact gaaatcccctaatttgcaaagccaaacgccccctatgtgagtaatacggggactttttacccaatttc ccacgcggaaagccccctaatacactcatatggcatatgaatcagcacggtcatgcactctaatggcg gcccatagggactttccacatagggggcgttcaccatttcccagcataggggtggtgactcaatggcc tttacccaagtacattgggtcaatgggaggtaagccaatgggtttttcccattactggcaagcacact gagtcaaatgggactttccactgggttttgcccaagtacattgggtcaatgggaggtgagccaatggg aaaaacccattgctgccaagtacactgactcaatagggactttccaatgggtttttccattgttggca agcatataaggtcaatgtgggtgagtcaatagggactttccattgtattctgcccagtacataaggtc aatagggggtgaatcaacaggaaagtcccattggagccaagtacactgcgtcaatagggactttccat tgggttttgcccagtacataaggtcaataggggatgagtcaatgggaaaaacccattggagccaagta cactgactcaatagggactttccattgggttttgcccagtacataaggtcaatagggggtgagtcaac aggaaagttccattggagccaagtacattgagtcaatagggactttccaatgggttttgcccagtaca taaggtcaatgggaggtaagccaatgggtttttcccattactggcacgtatactgagtcattagggac tttccaatgggttttgcccagtacataaggtcaataggggtgaatcaacaggaaagtcccattggagc caagtacactgagtcaatagggactttccattgggttttgcccagtacaaaaggtcaatagggggtga gtcaatgggtttttcccattattggcacgtacataaggtcaataggggtgagtcattgggtttttcca gccaatttaattaaaacgccatgtactttcccaccattgacgtcaatgggctattgaaactaatgcaa cgtgacctttaaacggtactttcccatagctgattaatgggaaagtaccgttctcgagccaatacacg tcaatgggaagtgaaagggcagccaaaacgtaacaccgccccggttttcccctggaaattccatattg gcacgcattctattggctgagctgcgttctacgtgggtataagaggcgcgaccagcgtcggtaccgtc gcagtcttcggtctgaccaccgtagaacgcagagctcctcgctgcaggcggccgctctagaactcgtc gatcgcagcgatgacaaacctgcaagatcaaacccaacagattgttccgttcatacggagccttctga tgccaacaaccggaccggcgtccattccggacgacaccctggagaagcacactctcaggtcagagacc tcgacctacaatttgactgtgggggacacagggtcagggctaattgtctttttccctggattccctgg ctcaattgtgggtgctcactacacactgcagagcaatgggaactacaagttcgatcagatgctcctga ctgcccagaacctaccggccagctacaactactgcagactagtgagtcggagtctcacagtgaggtca agcacactccctggtggcgtttatgcactaaacggcaccataaacgccgtgaccttccaaggaagcct gagtgaactgacagatgttagctacaatgggttgatgtctgcaacagccaacatcaacgacaaaattg ggaatgtcctggtaggggaaggggtcactgtcctcagcctacccacatcatatgatcttgggtatgtg aggcttggtgaccccattcccgctatagggcttgacccaaaaatggtagctacatgcgacagcagtga caggcccagagtctacaccataactgcagccgatgattaccaattctcatcacagtaccaaccaggtg gggtaacaatcacactgttctcagccaacattgatgctatcacaagcctcagcattgggggagagctc gtgtttcaaacaagcgtccaaggccttgtactgggcgccaccatctaccttataggctttgatgggac tgcggtaatcaccagagctgtggccgcagataatgggctgacggccggcaccgacaatcttatgccat tcaatcttgtcattccaaccaatgagataacccagccaatcacatccatcaaactggagatagtgacc tccaaaagtggtggtcaggcaggggatcagatgtcatggtcggcaagtgggagcctagcagtgacgat ccatggtggcaactatccaggggccctccgtcccgtcacactagtagcctacgaaagagtggcaacag gatccgtcgttacggtcgctggggtgagtaacttcgagctgattccaaatcctgaactagcaaagaac ctggttacagaatacggccgatttgacccaggagccatgaactacacaaaattgatactgagtgagag ggaccgtcttggcatcaagaccgtctggccaacaagggagtacactgattttcgtgagtacttcatgg aggtggccgacctcaactctcccctgaagattgcaggagcatttggcttcaaagacataatccgggct ataaggaggtaagcttcagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgca gtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgca ataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggaggtgtgggaggtt ttttcggatcctctagagtcgacggcagagtcgcagacgcccctattggacgtcaaaattgtagaggt gaagttttcaaacgatggcgaagtaacggcgacttgcgtttccaccgtcaaatctccctatagggtag aaactaattggaaagtagacctcgtagatgtaatggatgaaatttctgggaacagtcccgccggggtt tttaacagtaatgagaaatggcagaaacagctgtactacagagtaaccgatggaagaacatcggtcca gctaatgtgcctgtcgtgcacgagccattctccggaaccttactgtcttttcgacacgtctcttatag cgagggaaaaagatatcgcgccagagttatactttacctctgatccgcaaacggcatactgcacaata actctgccgtccggcgttgttccgagattcgaatggagccttaataatgtttcactgccggaatattt gacggccacgaccgttgtttcgcataccgctggccaaagtacagtgtggaagagcagcgcgagagcag gcgaggcgtggatttctggccggggaggcaatatatacgaatgcaccgtcctcatctcagacggcact cgcgttactacgcgaaaggagaggtgcttaacaaacacatggattgcggtggaaaacggtgctgctca ggcgcagctgtattcactcttttctggacttgtgtcaggattatgcgggagcatatctgctttgtacg caacgctatggaccgccatttatttttgaggaatgctttttggactatcgtactgctttcttccttcg ctagccagagcaccgccgccgtcacgtacgactacattttaggccgtcgcgcgctcgacgcgctaacc ataccggcggttggcccgtataacagatacctcactagggtatcaagaggctgcgacgttgtcgagct caacccgatttctaacgtggacgacatgatatcggcggccaaagaaaaagagaaggggggccctttcg aggcctccgtcgtctggttctacgtgattaagggcgacgacggcgaggacaagtactgtccaatctat agaaaagagtacagggaatgtggcgacgtacaactgctatctgaatgcgccgttcaatctgcacagat gtgggcagtggactatgttcctagcacccttgtatcgcgaaatggcgcgggactgactatattctccc ccactgctgcgctctctggccaatacttgctgaccctgaaaatcgggagatttgcgcaaacagctctc gtaactctagaagttaacgatcgctgtttaaagatcgggtcgcagcttaactttttaccgtcgaaatg ctggacaacagaacagtatcagactggatttcaaggcgaacacctttatccgatcgcagacaccaata cacgacacgcggacgacgtatatcggggatacgaagatattctgcagcgctggaataatttgctgagg aaaaagaatcctagcgcgccagaccctcgtccagatagcgtcccgcaagaaattcccgctgtaaccaa gaaagcggaagggcgcaccccggacgcagaaagcagcgaaaagaaggcccctccagaagactcggagg acgacatgcaggcagaggcttctggagaaaatcctgccgccctccccgaagacgacgaagtccccgag gacaccgagcacgatgatccaaactcggatcctgactattacaatgacatgcccgccgtgatcccggt ggaggagactactaaaagttctaatgccgtctccatgcccatattcgcggcgttcgtagcctgcgcgg tcgcgctcgtggggctactggtttggagcatcgtaaaatgcgcgcgtagctaatcgagcctagaatag gtggtttcttcctacatgccacgcctcacgctcataatataaatcacatggaatagcataccaatgcc tattcattgggacgttcgaaaagcatggcatcgctacttggaactctggctctccttgccgcgacgct cgcacccttcggcgcgatgggaatcgtgatcactggaaatcacgtctccgccaggattgacgacgatc acatcgtgatcgtcgcgcctcgccccgaagctacaattcaactgcagctatttttcatgcctggccag agaccccacaaaccctactcaggaaccgtccgcgtcgcgtttcggtctgatataacaaaccagtgcta ccaggaacttagcgaggagcgctttgaaaattgcactcatcgatcgtcttctgtttttgtcggctgta aagtgaccgagtacacgttctccgcctcgaacagactaaccggacctccacacccgtttaagctcact atacgaaatcctcgtccgaacgacagcgggatgttctacgtaattgttcggctagacgacaccaaaga acccattgacgtcttcgcgatccaactatcggtgtatcaattcgcgaacaccgccgcgactcgcggac tctattccaaggcttcgtgtcgcaccttcggattacctaccgtccaacttgaggcctatctcaggacc gaggaaagttggcgcaactggcaagcgtacgttgccacggaggccacgacgaccagcgccgaggcgac aaccccgacgcccgtcactgcaaccagcgcctccgaacttgaagcggaacactttacctttccctggc tagaaaatggcgtggatcattacgaaccgacacccgcaaacgaaaattcaaacgttactgtccgtctc gggacaatgagccctacgctaattggggtaaccgtggctgccgtcgtgagcgcaacgatcggcctcgt cattgtaatttccatcgtcaccagaaacatgtgcaccccgcaccgaaaattagacacggtctcgcaag acgacgaagaacgttcccaaactagaagggaatcgcgaaaatttggacccatggttgcgtgcgaaata aacaagggggctgaccaggatagtgaacttgtggaactggttgcgattgttaacccgtctgcgctaag ctcgcccgactcaataaaaatgtgattaagtctgaatgtggctctccaatcatttcgattctctaatc tcccaatcctctcaaaaggggcagtatcggacacggactgggaggggcgtacacgatagttatatggt acagcagaggcctctgaacacttaggaggagaattcagccggggagagcccctgttgagtaggcttgg gagcatattgcaggatgaacatgttagtgatagttctcgcctcttgtcttgcgcgcctaacttttgcg acgcgacacgtcctctttttggaaggcactcaggctgtcctcggggaagatgatcccagaaacgttcc ggaagggactgtaatcaaatggacaaaagtcctgcggaacgcgtgcaagatgaaggcggccgatgtct gctcttcgcctaactattgctttcatgatttaatttacgacggaggaaagaaagactgcccgcccgcg ggacccctgtctgcaaacctggtaattttactaaagcgcggcgaagcttagcttgcctccgattctag cattacatagccggtcagtagatcctgccattcggtagcgcaaccggctacatcttcaaacagtctca cgataaatgcatctctcgttcctgccaatccggaaccgggcataccactcccgcctgccgatttaatt ctcacaattgggcgatgccggcggggcaaaacgaatgtggatttggcaaaccgacacaggtctgctgt acggactaatatgggcacacccacatcattcttcagatgctccatgcattgttctatgagaaagatcc atagggtggaggcagcgtcacgagatcgcccaggcaatcgatcgcattcgtctagtaaagtgacgaga gttatcatgcacacacccatgcccacgccttccgaataactggagctgtggaagatcggaaacgtctt tttgactgccggtctcgtactactttcgcacaggtgtatacccggacgcgtactatatattttatatc atccaacgtccgaaattacatacgtggcggcgatggaagtagatgttgagtcttcgaaagtaagtgcc tcgaatatgggtattgtctgtgaaaatatcgaaagcggtacgacggttgcagaaccgtcgatgtcgcc agatactagtaacaatagcttcgataacgaagacttccgtgggcctgaatacgatgtggagataaata ccagaaaatctgctaatcttgatcgtatggaatcttcgtgccgtgaacaacgagcggcgtgcgaactt cgaaagtgttcgtgtcctacgtctgccgtgcgcatgcaatacagtattctttcatctctcgctccggg ttcagagggtcatgtatatatatgtactagatacggggacgcggaccaaaaaaaatgcatagtgaagg cagtcgttggaggaaagaatcccgggagggaagtggatattttaaaaaccatctcacataaatcaatt ataaaattaatccatgcctataaatggaaaaatgttgtgtgtatggcaatgcgtgtatatcgttatga tcttttcacatatattgacggagtcggccctatgccccttcaacagatgatctatattcaacgtggac tactagaggcgctagcatacatacatgaaaggggcatcattcaccgagacgtaaagacggagaatata ttcttggataatcacgaaaatgcagttttgggtgacttcggtgctgcatgccaactaggagattgtat agatacgccccaatgttacggttggagcggaactgtggaaacaaattcgccggaattatctgcacttg atccgtattgcacaaaaacagatatttggagtgccggattggttctatatgagatggcaattaaaaat gtaccattgtttagtaagcaggtgaaaagttcgggatctcagctgagatccataatacggtgcatgca agtgcatgaactggagtttccccgcaacgattctaccaacctctgtaaacatttcaaacaatatgcgg ttcgtgtacgaccgccttataccattcctcgagttataagaaatggggggatgccaatggatgttgaa tatgtcatttctaaaatgcttacgtttgaccaggagttcagaccttctgctaaggaaatattgaatat gcccctatttactaaggcgccgattaacctgcttaatatcacaccctctgacagtgtctaacggtata caggcgggagcgggtcgtggcgtcatcatcaccacttgagaatttatattttgaattgttgattgata aattaacctgattcattgagaactgaaacgccatattggtttcttggatatgtctacaacaattagtt aaattgctatgttctactgcgagtaacatttgataagttgtaagagacgggcgactcatgtcgaagtt gacgaatataaagtacataacgtgtttagaatacccagaatccgaatagtccgcgggggcgtcttctc gcgtgagtaccaaatactgagttgaacttgaaaatgctaaatctgtgacactctttgtgtgatgatta ttgtcaccacttcgaagatggcttcgacattcatgatgttctggtgtttgtttggaatcgtaatagcg cttgtttcgtccaagtctgacaacaaagaaaatctgaagaattatatcacggataagtcaaccaatat tagaatacccacgccattatttgtatcaacggaaaactcttatcccacaaaacatgtaatctacgatg aaaactgtggcttcgctgtactcaatcctataagtgaccccaaatatgtccttttgagccagcttcta atgggaaggcgcaaatatgatgcgacggtcgcgtggtttgttctcggtaaaatgtgtgccagattaat atatttgcgcgaattttataactgctcgacaaatgagccttttggcacatgttctatgagctctcctg gatggtgggacaggcgctacgtctcaaccagtttcatttctcgcgacgaattacagctggtttttgca gcgccgtcccgagaattagatggtttatatacgcgcgtagtagttgtcaacggggactttactacggc cgatataatgtttaatgttaaagtggcatgtgccttttcaaagactggaatagaagatgatacattat gcaaaccctttcatttctttgccaatgcaacattgcacaatttaaccatgattagatcggtaactctt cgagcgcacgaaagccatttaaaggaatgggtggcacggagaggtggtaacgtccctgcagtgctact tgagtctaccatgtatcatgcatccaatctgcctagaaatttcagggatttctacataaagtctccag atgattataagtataatcacctagatgggccatctgtaatgctcatcactgacagacctagtgaagat ttggatgggaggctcgttcaccaaagtgacatttttactactacaagtcctataaaacaggtccggta tgaagagcatcagtcacatacaaagcagtatcctgtaaacaaaatacaagctataatttttttgatag ggttaggctcgttcattggaagcatattcgtagttttggtagtatggattatacgcagatattgcaat ggagcgcggagtgggggaacgccccccagtcctcgccggtatgtgtataccaggctatgatcacgtgt gaaacttgggcggacctgtatcatatgtacaccgtccctattcgtttatagccagtacgtgttatctg cacatagaggaacatgtgtcatactgggatcgcatgcatggtatgtgtgactctaatattattctgta tcataataaaaacacagtgcatggtatatagaggatcgctggtaagcactacggtagaccaatcggct cagattgcattctttggcatcgataccgttgttaatttatatggcaaagtcttgttcatgggagatca gtatttggaggaaatatactctggaacgatggaaatactcaaatggaatcaagctaaccgctgctatt ctattgcgcatgcaacatattacgccgactgtcctataatcagttctacggtattcagaggatgccgg gacgccgttgtttatactaggccccacagcagaattc

SEQ ID NO 16: 1333-85.B6 (ILT/p-actina de pollo pro-VP2-FHV US9pA/HVT) (13064 pb) (casetes de genes de ILT IBDV en fragmento EcoRI n.° 7 del HVT) Virus n.° HVT/ILT/IBDV 1386-48.1.1.1

gaattccagactaaatgccccggcccaatttgtcaagtgtgcagtcacggaggcgtcgaccgtgtccc cggcattaaacaggaaagcgttaaagtttttgaatgttaggtcacaggtacaaacataaatgtttgta caaacaggtaacaggtacaaacataaatgccccggcataaatgtcccttacggcggatcgaaacgaca ttaggcatactcgggtaccattttgcattccgatcagcacggatgaaattaggcaggaatgcggttta tattatgcggcattggacaaacgatatggcattgattggcagtttatgaatgtcttcatgttgggcgt aaacggattcctattggttcagaagacaacgacgatatatttagagagaaaaagctacccagcatagg ataaacacacattgagcattgagagacataggtatcggtatggatgggaaaactacacacgtgaacac caaacgacttatatactcgagcggtgatactactgagcaagaatgcactgcatctgagccactgaatg aagactgtgatgaaaatgtgaccatcgatggaattggagaagaatatgcgcagttcttcatgtccccg caatgggtcccaaatctacatcgcttgagcgaggataccaaaaaggtataccgatgtatggtttccaa cagactcaattattttccctattatgaggcgttcaggcggtctttgtttgatatgtatatgctaggtc ggttggggcgtcgacttaagcgatctgactgggagactattatgcatctgtcaccaacgcaaagtcgg cgtctacatagaactttaagatttgtggagcgtagaattatcccatctaacagttatatacgcacatc gggccacgttccgccttcgagggcacttccgacagatacgaatttaaagatggatgaataattaaatt ggaaagagtaactacattaatcgagcgtcatgacggcgtcccgtgaaaatgggaattttctactcgaa acaccgtgacatttgacagacctggaattgttattctgatatatagtgggtgtgtctggccggcaaca tacataatgtgcatgcgaaaccactttttcagtgtacgctgacattgtgcaacacggaggggtagcat ctacatacaatatatgttgattaatgattggagaaaaaactatgcagctcgccgatcatatggctaac tcgccttcgtctatatggcggaccccgcgggaaaaatcgacgtaccatctgatttacaacaccagtaa tgaacatgtcgcatccctgcccagatctgtgcgcccattggcgcggatcgttgtgaatgccgccgaaa cacttcaggtcggtatgagagccgggaggccgccatcagcaggagtttggcgagaggtgtttgataga atgatgacagccttccgtgaccacgagcctactgcgacatttaatgctgcaaatcccattagaaaaat ggtcgagacagttctacagaataatgaagagcccccgcggacgcatgctgaaatgggtaatcgcctta tgaacattatgtactggtgttgcttgggacacgcaggacaatgctcgatatggcagttgtacgagacg aatcaggccattttaagtttattagatgaagtggttatcggcacaacaaatcccttttgcaccctcga gcaatactggaagccattatgcaccgcaatcgccaacaaggggacctcatcgcttgttgaggatgcca aagtggccgagtacctggttagcatgcgcaaattgatataacataggcacgctctgatgttacagacc acaataccgcatacatttattgtaaggttgttaataaaggtttattctatgtaagactacaatacttt cgacattgcttgtatacatattaaatactttctcaagttcctattacataaaatgggatctatcatta cattcgttaagagtctggataattttactgtttgccagcttcgatcttggaacgtactgtggatagtg ccttacttggaatcgtgaaaatttgaaacgtccattatttggatatcttccggttgtcccatatcccg ccctggtaccgctcggataccttgcccgtatggattcgtattgacagtcgcgcaatcggggaccaaca acgcgtgggtccacactcattcggaaattttccgatgattctgaatatttattgccgctcgttacgag tcgttggacatatctgtaatacatttcttcttctgaaggatcgctgcacatttgatctatacattggc caggatgttcaagtctcagatgttgcattctggcacagcacaactttatggcatttccgatgtaatcg tccggcagccctgggggagttctatattcgcatattgggatggtaaggacaatagcagatctcgcaac ctccagggaggctataataacgtttttaaaggatggatttctcataaaaatctgtcgcaaattacact gagaatatcctttactagcgccgattgagagcatcgtcgtccaattttctaaatggaaagaaaacaag gcgggcaagagtgttccaaacattttcattttcggcgaatctctcaaatcccatggcgtgcaattgat tgcaaaattggcacttccgttcacgtttgtatctccaaactctaagacacttttaattgaaaaactac gttctagtgtggaaagaaacctataggcagaccatagaactatttgacaccacatatctttttgtatg tcaaactgaccatgatcgtatgttgctgaatgcactagggcaattcgctcgcgcgactccatacattg aataattccacacgtcagctcatcggttagcaaggtccagtagttgaagtcatttatttttccccgcg gctggccaaatctacctctgggaatatccaagttgtcgaatatgatcgcaccggctctggtcatggtg aaggaactgtagcataaagacgcaggtatcataggggtaatatttttttattcactcacatactaaaa gtaacgcatattagcaccatgtatgggctatcaattgacatttgcgtagcactacatcacgattatgt acaacataatgggacaacatatggcaagtagatgcaatttcctcacactagttgggtttatctactat tgaattttcccctatctgtgatacacttgggagcctctacaagcatattgccatcatgtacgttttta tctactgtcttaacgcccatgggaacggaggcgtcgtcgtcatgtattggacggcaacataggcagca acacaaattgcgtttaggtggggtgcatgtggactcgataccaagcccctgcagctggggaacgtctg gtggagagccgataatttgatatacgcacgccatattactgtcgttgaagtacgccttatcttctatg ttttcaaatttaggttcccaagtggacgtgagaagtgtttgtatctcacatggaatggcccaaggcat tccagcccaggtgcctggtactttaatggcaaacaaacgttttggtagaggtattgattctattgcag ttctgcagatatctgcagccccgagtatccacaggctatacgatacgttatcggaggcaagcttaatt aagtaccgagctcgaattggcgcgcccgacggcagagtcgcagacgcccctattggacgtcaaaattg tagaggtgaagttttcaaacgatggcgaagtaacggcgacttgcgtttccaccgtcaaatctccctat agggtagaaactaattggaaagtagacctcgtagatgtaatggatgaaatttctgggaacagtcccgc cggggtttttaacagtaatgagaaatggcagaaacagctgtactacagagtaaccgatggaagaacat cggtccagctaatgtgcctgtcgtgcacgagccattctccggaaccttactgtcttttcgacacgtct cttatagcgagggaaaaagatatcgcgccagagttatactttacctctgatccgcaaacggcatactg cacaataactctgccgtccggcgttgttccgagattcgaatggagccttaataatgtttcactgccgg aatatttgacggccacgaccgttgtttcgcataccgctggccaaagtacagtgtggaagagcagcgcg agagcaggcgaggcgtggatttctggccggggaggcaatatatacgaatgcaccgtcctcatctcaga cggcactcgcgttactacgcgaaaggagaggtgcttaacaaacacatggattgcggtggaaaacggtg ctgctcaggcgcagctgtattcactcttttctggacttgtgtcaggattatgcgggagcatatctgct ttgtacgcaacgctatggaccgccatttatttttgaggaatgctttttggactatcgtactgctttct tccttcgctagccagagcaccgccgccgtcacgtacgactacattttaggccgtcgcgcgctcgacgc gctaaccataccggcggttggcccgtataacagatacctcactagggtatcaagaggctgcgacgttg tcgagctcaacccgatttctaacgtggacgacatgatatcggcggccaaagaaaaagagaaggggggc cctttcgaggcctccgtcgtctggttctacgtgattaagggcgacgacggcgaggacaagtactgtcc aatctatagaaaagagtacagggaatgtggcgacgtacaactgctatctgaatgcgccgttcaatctg cacagatgtgggcagtggactatgttcctagcacccttgtatcgcgaaatggcgcgggactgactata ttctcccccactgctgcgctctctggccaatacttgctgaccctgaaaatcgggagatttgcgcaaac agctctcgtaactctagaagttaacgatcgctgtttaaagatcgggtcgcagcttaactttttaccgt cgaaatgctggacaacagaacagtatcagactggatttcaaggcgaacacctttatccgatcgcagac accaatacacgacacgcggacgacgtatatcggggatacgaagatattctgcagcgctggaataattt gctgaggaaaaagaatcctagcgcgccagaccctcgtccagatagcgtcccgcaagaaattcccgctg taaccaagaaagcggaagggcgcaccccggacgcagaaagcagcgaaaagaaggcccctccagaagac tcggaggacgacatgcaggcagaggcttctggagaaaatcctgccgccctccccgaagacgacgaagt ccccgaggacaccgagcacgatgatccaaactcggatcctgactattacaatgacatgcccgccgtga tcccggtggaggagactactaaaagttctaatgccgtctccatgcccatattcgcggcgttcgtagcc tgcgcggtcgcgctcgtggggctactggtttggagcatcgtaaaatgcgcgcgtagctaatcgagcct agaataggtggtttcttcctacatgccacgcctcacgctcataatataaatcacatggaatagcatac caatgcctattcattgggacgttcgaaaagcatggcatcgctacttggaactctggctctccttgccg cgacgctcgcacccttcggcgcgatgggaatcgtgatcactggaaatcacgtctccgccaggattgac gacgatcacatcgtgatcgtcgcgcctcgccccgaagctacaattcaactgcagctatttttcatgcc tggccagagaccccacaaaccctactcaggaaccgtccgcgtcgcgtttcggtctgatataacaaacc agtgctaccaggaacttagcgaggagcgctttgaaaattgcactcatcgatcgtcttctgtttttgtc ggctgtaaagtgaccgagtacacgttctccgcctcgaacagactaaccggacctccacacccgtttaa gctcactatacgaaatcctcgtccgaacgacagcgggatgttctacgtaattgttcggctagacgaca ccaaagaacccattgacgtcttcgcgatccaactatcggtgtatcaattcgcgaacaccgccgcgact cgcggactctattccaaggcttcgtgtcgcaccttcggattacctaccgtccaacttgaggcctatct caggaccgaggaaagttggcgcaactggcaagcgtacgttgccacggaggccacgacgaccagcgccg aggcgacaaccccgacgcccgtcactgcaaccagcgcctccgaacttgaagcggaacactttaccttt ccctggctagaaaatggcgtggatcattacgaaccgacacccgcaaacgaaaattcaaacgttactgt ccgtctcgggacaatgagccctacgctaattggggtaaccgtggctgccgtcgtgagcgcaacgatcg gcctcgtcattgtaatttccatcgtcaccagaaacatgtgcaccccgcaccgaaaattagacacggtc tcgcaagacgacgaagaacgttcccaaactagaagggaatcgcgaaaatttggacccatggttgcgtg cgaaataaacaagggggctgaccaggatagtgaacttgtggaactggttgcgattgttaacccgtctg cgctaagctcgcccgactcaataaaaatgtgattaagtctgaatgtggctctccaatcatttcgattc tctaatctcccaatcctctcaaaaggggcagtatcggacacggactgggaggggcgtacacgatagtt atatggtacagcagaggcctctgaacacttaggaggagaattcagccggggagagcccctgttgagta ggcttgggagcatattgcaggatgaacatgttagtgatagttctcgcctcttgtcttgcgcgcctaac ttttgcgacgcgacacgtcctctttttggaaggcactcaggctgtcctcggggaagatgatcccagaa acgttccggaagggactgtaatcaaatggacaaaagtcctgcggaacgcgtgcaagatgaaggcggcc gatgtctgctcttcgcctaactattgctttcatgatttaatttacgacggaggaaagaaagactgccc gcccgcgggacccctgtctgcaaacctggtaattttactaaagcgcggcgggcgcgccggatcagatc tccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaat tttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcgggggggggggnnncgcgcgcca ggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagag cggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcg cgcggcgggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgc ccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccggg ctgtaattagcggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtcccctt ctccctctccagcctcggggctgtccgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggg gttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttt tcctacagctcctgggcaacgtgctggttattgtgctgtctcatcattttggcaaagaattgcagatc tggatctatgacaaacctgcaagatcaaacccaacagattgttccgttcatacggagccttctgatgc caacaaccggaccggcgtccattccggacgacaccctggagaagcacactctcaggtcagagacctcg acctacaatttgactgtgggggacacagggtcagggctaattgtctttttccctggattccctggctc aattgtgggtgctcactacacactgcagagcaatgggaactacaagttcgatcagatgctcctgactg cccagaacctaccggccagctacaactactgcagactagtgagtcggagtctcacagtgaggtcaagc acactccctggtggcgtttatgcactaaacggcaccataaacgccgtgaccttccaaggaagcctgag tgaactgacagatgttagctacaatgggttgatgtctgcaacagccaacatcaacgacaaagttggga atgtcctggtaggggaaggggtcactgtcctcagcctacccacatcatatgatcttgggtatgtgagg cttggtgaccccattcccgctatagggcttgacccaaaaatggtagctacatgcgacagcagtgacag gcccagagtctacaccataactgcagccgatgattaccaattctcatcacagtaccaaccaggtgggg taacaatcacactgttctcagccaacattgatgctatcacaagcctcagcattgggggagagctcgtg tttcaaacaagcgtccaaggccttgtactgggcgccaccatctaccttataggctttgatgggactgc ggtaatcaccagagctgtggccgcagataatgggctgacggccggcaccgacaatcttatgccattca atcttgtcattccaaccaatgagataacccagccgatcacatccatcaaactggagatagtgacctcc aaaagtggtggtcaggcaggggatcagatgtcatggtcggcaagtgggagcctagcagtgacgatcca tggtggcaactatccaggggccctccgtcccgtcacactagtagcctacgaaagagtggcaacaggat ccgtcgttacggtcgctggggtgagtaacttcgagctgatcccaaatcctgaactagcaaagaacctg gttacagaatacggccgatttgacccaggagccatgaactacacaaaattgatactgagtgagaggga ccgtcttggcatcaagaccgtctggccaacaagggagtacactgattttcgtgagtacttcatggagg tggccgacctcaactctcccctgaagattgcaggagcatttggcttcaaagacataatccgggctata aggaggtaagatccgatctctcgattaattaacaataaacatagcatacgttatgacatggtctaccg cgtcttatatggggacgacaagcttgcctccgattctagcattacatagccggtcagtagatcctgcc attcggtagcgcaaccggctacatcttcaaacagtctcacgataaatgcatctctcgttcctgccaat ccggaaccgggcataccactcccgcctgccgatttaattctcacaattgggcgatgccggcggggcaa aacgaatgtggatttggcaaaccgacacaggtctgctgtacggactaatatgggcacacccacatcat tcttcagatgctccatgcattgttctatgagaaagatccatagggtggaggcagcgtcacgagatcgc ccaggcaatcgatcgcattcgtctagtaaagtgacgagagttatcatgcacacacccatgcccacgcc ttccgaataactggagctgtggaagatcggaaacgtctttttgactgccggtctcgtactactttcgc acaggtgtatacccggacgcgtactatatattttatatcatccaacgtccgaaattacatacgtggcg gcgatggaagtagatgttgagtcttcgaaagtaagtgcctcgaatatgggtattgtctgtgaaaatat cgaaagcggtacgacggttgcagaaccgtcgatgtcgccagatactagtaacaatagcttcgataacg aagacttccgtgggcctgaatacgatgtggagataaataccagaaaatctgctaatcttgatcgtatg gaatcttcgtgccgtgaacaacgagcggcgtgcgaacttcgaaagtgttcgtgtcctacgtctgccgt gcgcatgcaatacagtattctttcatctctcgctccgggttcagagggtcatgtatatatatgtacta gatacggggacgcggaccaaaaaaaatgcatagtgaaggcagtcgttggaggaaagaatcccgggagg gaagtggatattttaaaaaccatctcacataaatcaattataaaattaatccatgcctataaatggaa aaatgttgtgtgtatggcaatgcgtgtatatcgttatgatcttttcacatatattgacggagtcggcc ctatgccccttcaacagatgatctatattcaacgtggactactagaggcgctagcatacatacatgaa aggggcatcattcaccgagacgtaaagacggagaatatattcttggataatcacgaaaatgcagtttt gggtgacttcggtgctgcatgccaactaggagattgtatagatacgccccaatgttacggttggagcg gaactgtggaaacaaattcgccggaattatctgcacttgatccgtattgcacaaaaacagatatttgg agtgccggattggttctatatgagatggcaattaaaaatgtaccattgtttagtaagcaggtgaaaag ttcgggatctcagctgagatccataatacggtgcatgcaagtgcatgaactggagtttccccgcaacg attctaccaacctctgtaaacatttcaaacaatatgcggttcgtgtacgaccgccttataccattcct cgagttataagaaatggggggatgccaatggatgttgaatatgtcatttctaaaatgcttacgtttga ccaggagttcagaccttctgctaaggaaatattgaatatgcccctatttactaaggcgccgattaacc tgcttaatatcacaccctctgacagtgtctaacggtatacaggcgggagcgggtcgtggcgtcatcat caccacttgagaatttatattttgaattgttgattgataaattaacctgattcattgagaactgaaac gccatattggtttcttggatatgtctacaacaattagttaaattgctatgttctactgcgagtaacat ttgataagttgtaagagacgggcgactcatgtcgaagttgacgaatataaagtacataacgtgtttag aatacccagaatccgaatagtccgcgggggcgtcttctcgcgtgagtaccaaatactgagttgaactt gaaaatgctaaatctgtgacactctttgtgtgatgattattgtcaccacttcgaagatggcttcgaca ttcatgatgttctggtgtttgtttggaatcgtaatagcgcttgtttcgtccaagtctgacaacaaaga aaatctgaagaattatatcacggataagtcaaccaatattagaatacccacgccattatttgtatcaa cggaaaactcttatcccacaaaacatgtaatctacgatgaaaactgtggcttcgctgtactcaatcct ataagtgaccccaaatatgtccttttgagccagcttctaatgggaaggcgcaaatatgatgcgacggt cgcgtggtttgttctcggtaaaatgtgtgccagattaatatatttgcgcgaattttataactgctcga caaatgagccttttggcacatgttctatgagctctcctggatggtgggacaggcgctacgtctcaacc agtttcatttctcgcgacgaattacagctggtttttgcagcgccgtcccgagaattagatggtttata tacgcgcgtagtagttgtcaacggggactttactacggccgatataatgtttaatgttaaagtggcat gtgccttttcaaagactggaatagaagatgatacattatgcaaaccctttcatttctttgccaatgca acattgcacaatttaaccatgattagatcggtaactcttcgagcgcacgaaagccatttaaaggaatg ggtggcacggagaggtggtaacgtccctgcagtgctacttgagtctaccatgtatcatgcatccaatc tgcctagaaatttcagggatttctacataaagtctccagatgattataagtataatcacctagatggg ccatctgtaatgctcatcactgacagacctagtgaagatttggatgggaggctcgttcaccaaagtga catttttactactacaagtcctataaaacaggtccggtatgaagagcatcagtcacatacaaagcagt atcctgtaaacaaaatacaagctataatttttttgatagggttaggctcgttcattggaagcatattc gtagttttggtagtatggattatacgcagatattgcaatggagcgcggagtgggggaacgccccccag tcctcgccggtatgtgtataccaggctatgatcacgtgtgaaacttgggcggacctgtatcatatgta caccgtccctattcgtttatagccagtacgtgttatctgcacatagaggaacatgtgtcatactggga tcgcatgcatggtatgtgtgactctaatattattctgtatcataataaaaacacagtgcatggtatat agaggatcgctggtaagcactacggtagaccaatcggctcagattgcattctttggcatcgataccgt tgttaatttatatggcaaagtcttgttcatgggagatcagtatttggaggaaatatactctggaacga tggaaatactcaaatggaatcaagctaaccgctgctattctattgcgcatgcaacatattacgccgac tgtcctataatcagttctacggtattcagaggatgccgggacgccgttgtttatactaggccccacag cagaattc

SEQ ID NO 17: 1386-04.4 n.° 1 (ILT/hCMV IEpro-VP2-HSV TKpA/HVT) (13017 pb) (casetes de genes de ILT IBDV en fragmento EcoRI n.° 7 de HVT. Virus n.° HVT/ILT/IBDV 1386-48.3.1.7)

gaattccagactaaatgccccggcccaatttgtcaagtgtgcagtcacggaggcgtcgaccgtgtccc cggcattaaacaggaaagcgttaaagtttttgaatgttaggtcacaggtacaaacataaatgtttgta caaacaggtaacaggtacaaacataaatgccccggcataaatgtcccttacggcggatcgaaacgaca ttaggcatactcgggtaccattttgcattccgatcagcacggatgaaattaggcaggaatgcggttta tattatgcggcattggacaaacgatatggcattgattggcagtttatgaatgtcttcatgttgggcgt aaacggattcctattggttcagaagacaacgacgatatatttagagagaaaaagctacccagcatagg ataaacacacattgagcattgagagacataggtatcggtatggatgggaaaactacacacgtgaacac caaacgacttatatactcgagcggtgatactactgagcaagaatgcactgcatctgagccactgaatg aagactgtgatgaaaatgtgaccatcgatggaattggagaagaatatgcgcagttcttcatgtccccg caatgggtcccaaatctacatcgcttgagcgaggataccaaaaaggtataccgatgtatggtttccaa cagactcaattattttccctattatgaggcgttcaggcggtctttgtttgatatgtatatgctaggtc ggttggggcgtcgacttaagcgatctgactgggagactattatgcatctgtcaccaacgcaaagtcgg cgtctacatagaactttaagatttgtggagcgtagaattatcccatctaacagttatatacgcacatc gggccacgttccgccttcgagggcacttccgacagatacgaatttaaagatggatgaataattaaatt ggaaagagtaactacattaatcgagcgtcatgacggcgtcccgtgaaaatgggaattttctactcgaa acaccgtgacatttgacagacctggaattgttattctgatatatagtgggtgtgtctggccggcaaca tacataatgtgcatgcgaaaccactttttcagtgtacgctgacattgtgcaacacggaggggtagcat ctacatacaatatatgttgattaatgattggagaaaaaactatgcagctcgccgatcatatggctaac tcgccttcgtctatatggcggaccccgcgggaaaaatcgacgtaccatctgatttacaacaccagtaa tgaacatgtcgcatccctgcccagatctgtgcgcccattggcgcggatcgttgtgaatgccgccgaaa cacttcaggtcggtatgagagccgggaggccgccatcagcaggagtttggcgagaggtgtttgataga atgatgacagccttccgtgaccacgagcctactgcgacatttaatgctgcaaatcccattagaaaaat ggtcgagacagttctacagaataatgaagagcccccgcggacgcatgctgaaatgggtaatcgcctta tgaacattatgtactggtgttgcttgggacacgcaggacaatgctcgatatggcagttgtacgagacg aatcaggccattttaagtttattagatgaagtggttatcggcacaacaaatcccttttgcaccctcga gcaatactggaagccattatgcaccgcaatcgccaacaaggggacctcatcgcttgttgaggatgcca aagtggccgagtacctggttagcatgcgcaaattgatataacataggcacgctctgatgttacagacc acaataccgcatacatttattgtaaggttgttaataaaggtttattctatgtaagactacaatacttt cgacattgcttgtatacatattaaatactttctcaagttcctattacataaaatgggatctatcatta cattcgttaagagtctggataattttactgtttgccagcttcgatcttggaacgtactgtggatagtg ccttacttggaatcgtgaaaatttgaaacgtccattatttggatatcttccggttgtcccatatcccg ccctggtaccgctcggataccttgcccgtatggattcgtattgacagtcgcgcaatcggggaccaaca acgcgtgggtccacactcattcggaaattttccgatgattctgaatatttattgccgctcgttacgag tcgttggacatatctgtaatacatttcttcttctgaaggatcgctgcacatttgatctatacattggc caggatgttcaagtctcagatgttgcattctggcacagcacaactttatggcatttccgatgtaatcg tccggcagccctgggggagttctatattcgcatattgggatggtaaggacaatagcagatctcgcaac ctccagggaggctataataacgtttttaaaggatggatttctcataaaaatctgtcgcaaattacact gagaatatcctttactagcgccgattgagagcatcgtcgtccaattttctaaatggaaagaaaacaag gcgggcaagagtgttccaaacattttcattttcggcgaatctctcaaatcccatggcgtgcaattgat tgcaaaattggcacttccgttcacgtttgtatctccaaactctaagacacttttaattgaaaaactac gttctagtgtggaaagaaacctataggcagaccatagaactatttgacaccacatatctttttgtatg tcaaactgaccatgatcgtatgttgctgaatgcactagggcaattcgctcgcgcgactccatacattg aataattccacacgtcagctcatcggttagcaaggtccagtagttgaagtcatttatttttccccgcg gctggccaaatctacctctgggaatatccaagttgtcgaatatgatcgcaccggctctggtcatggtg aaggaactgtagcataaagacgcaggtatcataggggtaatatttttttattcactcacatactaaaa gtaacgcatattagcaccatgtatgggctatcaattgacatttgcgtagcactacatcacgattatgt acaacataatgggacaacatatggcaagtagatgcaatttcctcacactagttgggtttatctactat tgaattttcccctatctgtgatacacttgggagcctctacaagcatattgccatcatgtacgttttta tctactgtcttaacgcccatgggaacggaggcgtcgtcgtcatgtattggacggcaacataggcagca acacaaattgcgtttaggtggggtgcatgtggactcgataccaagcccctgcagctggggaacgtctg gtggagagccgataatttgatatacgcacgccatattactgtcgttgaagtacgccttatcttctatg ttttcaaatttaggttcccaagtggacgtgagaagtgtttgtatctcacatggaatggcccaaggcat tccagcccaggtgcctggtactttaatggcaaacaaacgttttggtagaggtattgattctattgcag ttctgcagatatctgcagccccgagtatccacaggctatacgatacgttatcggaggcaagcttgtta attaagtcgacggcagagtcgcagacgcccctattggacgtcaaaattgtagaggtgaagttttcaaa cgatggcgaagtaacggcgacttgcgtttccaccgtcaaatctccctatagggtagaaactaattgga aagtagacctcgtagatgtaatggatgaaatttctgggaacagtcccgccggggtttttaacagtaat gagaaatggcagaaacagctgtactacagagtaaccgatggaagaacatcggtccagctaatgtgcct gtcgtgcacgagccattctccggaaccttactgtcttttcgacacgtctcttatagcgagggaaaaag atatcgcgccagagttatactttacctctgatccgcaaacggcatactgcacaataactctgccgtcc ggcgttgttccgagattcgaatggagccttaataatgtttcactgccggaatatttgacggccacgac cgttgtttcgcataccgctggccaaagtacagtgtggaagagcagcgcgagagcaggcgaggcgtgga tttctggccggggaggcaatatatacgaatgcaccgtcctcatctcagacggcactcgcgttactacg cgaaaggagaggtgcttaacaaacacatggattgcggtggaaaacggtgctgctcaggcgcagctgta ttcactcttttctggacttgtgtcaggattatgcgggagcatatctgctttgtacgcaacgctatgga ccgccatttatttttgaggaatgctttttggactatcgtactgctttcttccttcgctagccagagca ccgccgccgtcacgtacgactacattttaggccgtcgcgcgctcgacgcgctaaccataccggcggtt ggcccgtataacagatacctcactagggtatcaagaggctgcgacgttgtcgagctcaacccgatttc taacgtggacgacatgatatcggcggccaaagaaaaagagaaggggggccctttcgaggcctccgtcg tctggttctacgtgattaagggcgacgacggcgaggacaagtactgtccaatctatagaaaagagtac agggaatgtggcgacgtacaactgctatctgaatgcgccgttcaatctgcacagatgtgggcagtgga ctatgttcctagcacccttgtatcgcgaaatggcgcgggactgactatattctcccccactgctgcgc tctctggccaatacttgctgaccctgaaaatcgggagatttgcgcaaacagctctcgtaactctagaa gttaacgatcgctgtttaaagatcgggtcgcagcttaactttttaccgtcgaaatgctggacaacaga acagtatcagactggatttcaaggcgaacacctttatccgatcgcagacaccaatacacgacacgcgg acgacgtatatcggggatacgaagatattctgcagcgctggaataatttgctgaggaaaaagaatcct agcgcgccagaccctcgtccagatagcgtcccgcaagaaattcccgctgtaaccaagaaagcggaagg gcgcaccccggacgcagaaagcagcgaaaagaaggcccctccagaagactcggaggacgacatgcagg cagaggcttctggagaaaatcctgccgccctccccgaagacgacgaagtccccgaggacaccgagcac gatgatccaaactcggatcctgactattacaatgacatgcccgccgtgatcccggtggaggagactac taaaagttctaatgccgtctccatgcccatattcgcggcgttcgtagcctgcgcggtcgcgctcgtgg ggctactggtttggagcatcgtaaaatgcgcgcgtagctaatcgagcctagaataggtggtttcttcc tacatgccacgcctcacgctcataatataaatcacatggaatagcataccaatgcctattcattggga cgttcgaaaagcatggcatcgctacttggaactctggctctccttgccgcgacgctcgcacccttcgg cgcgatgggaatcgtgatcactggaaatcacgtctccgccaggattgacgacgatcacatcgtgatcg tcgcgcctcgccccgaagctacaattcaactgcagctatttttcatgcctggccagagaccccacaaa ccctactcaggaaccgtccgcgtcgcgtttcggtctgatataacaaaccagtgctaccaggaacttag cgaggagcgctttgaaaattgcactcatcgatcgtcttctgtttttgtcggctgtaaagtgaccgagt acacgttctccgcctcgaacagactaaccggacctccacacccgtttaagctcactatacgaaatcct cgtccgaacgacagcgggatgttctacgtaattgttcggctagacgacaccaaagaacccattgacgt cttcgcgatccaactatcggtgtatcaattcgcgaacaccgccgcgactcgcggactctattccaagg cttcgtgtcgcaccttcggattacctaccgtccaacttgaggcctatctcaggaccgaggaaagttgg cgcaactggcaagcgtacgttgccacggaggccacgacgaccagcgccgaggcgacaaccccgacgcc cgtcactgcaaccagcgcctccgaacttgaagcggaacactttacctttccctggctagaaaatggcg tggatcattacgaaccgacacccgcaaacgaaaattcaaacgttactgtccgtctcgggacaatgagc cctacgctaattggggtaaccgtggctgccgtcgtgagcgcaacgatcggcctcgtcattgtaatttc catcgtcaccagaaacatgtgcaccccgcaccgaaaattagacacggtctcgcaagacgacgaagaac gttcccaaactagaagggaatcgcgaaaatttggacccatggttgcgtgcgaaataaacaagggggct gaccaggatagtgaacttgtggaactggttgcgattgttaacccgtctgcgctaagctcgcccgactc aataaaaatgtgattaagtctgaatgtggctctccaatcatttcgattctctaatctcccaatcctct caaaaggggcagtatcggacacggactgggaggggcgtacacgatagttatatggtacagcagaggcc tctgaacacttaggaggagaattcagccggggagagcccctgttgagtaggcttgggagcatattgca ggatgaacatgttagtgatagttctcgcctcttgtcttgcgcgcctaacttttgcgacgcgacacgtc ctctttttggaaggcactcaggctgtcctcggggaagatgatcccagaaacgttccggaagggactgt aatcaaatggacaaaagtcctgcggaacgcgtgcaagatgaaggcggccgatgtctgctcttcgccta actattgctttcatgatttaatttacgacggaggaaagaaagactgcccgcccgcgggacccctgtct gcaaacctggtaattttactaaagcgcggcgaaagcttaggtcaattccctggcattatgcccagtac atgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgat gcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccacc ccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaac tccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgttt agtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggcgc gccggatctatgacaaacctgcaagatcaaacccaacagattgttccgttcatacggagccttctgat gccaacaaccggaccggcgtccattccggacgacaccctggagaagcacactctcaggtcagagacct cgacctacaatttgactgtgggggacacagggtcagggctaattgtctttttccctggattccctggc tcaattgtgggtgctcactacacactgcagagcaatgggaactacaagttcgatcagatgctcctgac tgcccagaacctaccggccagctacaactactgcagactagtgagtcggagtctcacagtgaggtcaa gcacactccctggtggcgtttatgcactaaacggcaccataaacgccgtgaccttccaaggaagcctg agtgaactgacagatgttagctacaatgggttgatgtctgcaacagccaacatcaacgacaaagttgg gaatgtcctggtaggggaaggggtcactgtcctcagcctacccacatcatatgatcttgggtatgtga ggcttggtgaccccattcccgctatagggcttgacccaaaaatggtagctacatgcgacagcagtgac aggcccagagtctacaccataactgcagccgatgattaccaattctcatcacagtaccaaccaggtgg ggtaacaatcacactgttctcagccaacattgatgctatcacaagcctcagcattgggggagagctcg tgtttcaaacaagcgtccaaggccttgtactgggcgccaccatctaccttataggctttgatgggact gcggtaatcaccagagctgtggccgcagataatgggctgacggccggcaccgacaatcttatgccatt caatcttgtcattccaaccaatgagataacccagccgatcacatccatcaaactggagatagtgacct ccaaaagtggtggtcaggcaggggatcagatgtcatggtcggcaagtgggagcctagcagtgacgatc catggtggcaactatccaggggccctccgtcccgtcacactagtagcctacgaaagagtggcaacagg atccgtcgttacggtcgctggggtgagtaacttcgagctgatcccaaatcctgaactagcaaagaacc tggttacagaatacggccgatttgacccaggagccatgaactacacaaaattgatactgagtgagagg gaccgtcttggcatcaagaccgtctggccaacaagggagtacactgattttcgtgagtacttcatgga ggtggccgacctcaactctcccctgaagattgcaggagcatttggcttcaaagacataatccgggcta taaggaggtaagatccataattgattgacgggagatgggggaggctaactgaaacacggaaggagaca ataccggaaggaacccgcgctatgacggcaataaaaagacagaataaaacgcacgggtgttgggtcgt ttgttcataaacgcggggttcggtcccagggctggcactctgtcgataccccaccgagaccccattgg ggccaatacgcccgcgtttcttccttttccccaccccaccccccaagttcgggtgaaggcccagggct cgcagccaacgtcggggcggcaggccctgccatagccactggccccgtgggttagggacggggtcccc catggggaatggtttatggttcgtgggggttattattttgaagcttgcctccgattctagcattacat agccggtcagtagatcctgccattcggtagcgcaaccggctacatcttcaaacagtctcacaataaat gcatctctcgttcctgccaatccggaaccgggcataccactcccgcctgccgatttaattctcacaat tgggcgatgccggcggggcaaaacgaatgtggatttggcaaaccgacacaggtctgctgtacggacta atatgggcacacccacatcattcttcagatgctccatgcattgttctatgagaaagatccatagggtg gaggcagcgtcacgagatcgcccaggcaatcgatcgcattcgtctagtaaagtgacgagagttatcat gcacacacccatgcccacgccttccgaataactggagctgtggaagatcggaaacgtctttttgactg ccggtctcgtactactttcgcacaggtgtatacccggacgcgtactatatattttatatcatccaacg tccgaaattacatacgtggcggcgatggaagtagatgttgagtcttcgaaagtaagtgcctcgaatat gggtattgtctgtgaaaatatcgaaagcggtacgacggttgcagaaccgtcgatgtcgccagatacta gtaacaatagcttcgataacgaagacttccgtgggcctgaatacgatgtggagataaataccagaaaa tctgctaatcttgatcgtatggaatcttcgtgccgtgaacaacgagcggcgtgcgaacttcgaaagtg ttcgtgtcctacgtctgccgtgcgcatgcaatacagtattctttcatctctcgctccgggttcagagg gtcatgtatatatatgtactagatacggggacgcggaccaaaaaaaatgcatagtgaaggcagtcgtt ggaggaaagaatcccgggagggaagtggatattttaaaaaccatctcacataaatcaattataaaatt aatccatgcctataaatggaaaaatgttgtgtgtatggcaatgcgtgtatatcgttatgatcttttca catatattgacggagtcggccctatgccccttcaacagatgatctatattcaacgtggactactagag gcgctagcatacatacatgaaaggggcatcattcaccgagacgtaaagacggagaatatattcttgga taatcacgaaaatgcagttttgggtgacttcggtgctgcatgccaactaggagattgtatagatacgc cccaatgttacggttggagcggaactgtggaaacaaattcgccggaattatctgcacttgatccgtat tgcacaaaaacagatatttggagtgccggattggttctatatgagatggcaattaaaaatgtaccatt gtttagtaagcaggtgaaaagttcgggatctcagctgagatccataatacggtgcatgcaagtgcatg aactggagtttccccgcaacgattctaccaacctctgtaaacatttcaaacaatatgcggttcgtgta cgaccgccttataccattcctcgagttataagaaatggggggatgccaatggatgttgaatatgtcat ttctaaaatgcttacgtttgaccaggagttcagaccttctgctaaggaaatattgaatatgcccctat ttactaaggcgccgattaacctgcttaatatcacaccctctgacagtgtctaacggtatacaggcggg agcgggtcgtggcgtcatcatcaccacttgagaatttatattttgaattgttgattgataaattaacc tgattcattgagaactgaaacgccatattggtttcttggatatgtctacaacaattagttaaattgct atgttctactgcgagtaacatttgataagttgtaagagacgggcgactcatgtcgaagttgacgaata taaagtacataacgtgtttagaatacccagaatccgaatagtccgcgggggcgtcttctcgcgtgagt accaaatactgagttgaacttgaaaatgctaaatctgtgacactctttgtgtgatgattattgtcacc acttcgaagatggcttcgacattcatgatgttctggtgtttgtttggaatcgtaatagcgcttgtttc gtccaagtctgacaacaaagaaaatctgaagaattatatcacggataagtcaaccaatattagaatac ccacgccattatttgtatcaacggaaaactcttatcccacaaaacatgtaatctacgatgaaaactgt ggcttcgctgtactcaatcctataagtgaccccaaatatgtccttttgagccagcttctaatgggaag gcgcaaatatgatgcgacggtcgcgtggtttgttctcggtaaaatgtgtgccagattaatatatttgc gcgaattttataactgctcgacaaatgagccttttggcacatgttctatgagctctcctggatggtgg gacaggcgctacgtctcaaccagtttcatttctcgcgacgaattacagctggtttttgcagcgccgtc ccgagaattagatggtttatatacgcgcgtagtagttgtcaacggggactttactacggccgatataa tgtttaatgttaaagtggcatgtgccttttcaaagactggaatagaagatgatacattatgcaaaccc tttcatttctttgccaatgcaacattgcacaatttaaccatgattagatcggtaactcttcgagcgca cgaaagccatttaaaggaatgggtggcacggagaggtggtaacgtccctgcagtgctacttgagtcta ccatgtatcatgcatccaatctgcctagaaatttcagggatttctacataaagtctccagatgattat aagtataatcacctagatgggccatctgtaatgctcatcactgacagacctagtgaagatttggatgg gaggctcgttcaccaaagtgacatttttactactacaagtcctataaaacaggtccggtatgaagagc atcagtcacatacaaagcagtatcctgtaaacaaaatacaagctataatttttttgatagggttaggc tcgttcattggaagcatattcgtagttttggtagtatggattatacgcagatattgcaatggagcgcg gagtgggggaacgccccccagtcctcgccggtatgtgtataccaggctatgatcacgtgtgaaacttg ggcggacctgtatcatatgtacaccgtccctattcgtttatagccagtacgtgttatctgcacataga ggaacatgtgtcatactgggatcgcatgcatggtatgtgtgactctaatattattctgtatcataata aaaacacagtgcatggtatatagaggatcgctggtaagcactacggtagaccaatcggctcagattgc attctttggcatcgataccgttgttaatttatatggcaaagtcttgttcatgggagatcagtatttgg aggaaatatactctggaacgatggaaatactcaaatggaatcaagctaaccgctgctattctattgcg catgcaacatattacgccgactgtcctataatcagttctacggtattcagaggatgccgggacgccgt tgtttatactaggccccacagcagaattc

SEQ ID NO 18: 484-1050-2641-10859 (mCMV IEpro-VP2-SV40pA/ILT/HVT) (15252 pb) (casetes de genes de IBDV+ ILT en fragmento Ascl de HVT.) Virus n.° HVT/IBDV/ILT 484

ggcgcgccactggagaacggcatgaccgcaaaaggcgttgtagagatcgatcccacgaactctcaggc gatcgtgtcagtcgccataaacagcgacgatcgtctccaggatctgaacggttttcttctcaacgatc atcagtatatgaggaactgaacctgatatttagccgagggaaacgcaggttaaaaaccctatcaagcg attgcgattttcgcgtatctagtaaaaatagatgggcttcggtactagccttcgccgccaactctgaa tatgcccttcgtggacctcatataacatggcattgtttgttggatgcggggccggaattaagaagaac attcgaaatacgagcaaaaatttcggccctggcatgtgctgcgcgagaatcggtacttcggggagaaa gttttatcggagctttgggtagtgcagaggaaactctatcttggttgaaaatgcatgcgaccctgcac ttgattctggttaaccacgatccaatttttaagacggctggcgcggtcctagataacctccgcttaaa actagccccaatattgatgtgcagatataacacagaaaaacgatcaatggaagacatgctacggcggt catctcccgaagacatcaccgattccctaacaatgtgcctgattatgttatcgcgcattcgtcgtacc atgcgcaccgcaggaaataaatatagctatatgatagatccaatgaatcgtatgtctaattacactcc aggcgaatgtatgacaggtatattgcgatatattgacgaacatgctagaaggtgtcctgatcacatat gtaatttgtatatcacatgtacacttatgccgatgtatgtgcacgggcgatatttctattgtaattca tttttttgttagtaaactaccacaggctgtccggaaatctaagttaatgaataaagtagatggttaat actcattgcttagaattggactacttttaattctctttaatgttcgtattaaataaaaacatctttaa taaacttcagcctcttcgcttattgtagaaattgagtattcaaaatcatgttcaaagccgtcttcgga gagtgtactcgccacggtggttggaacatcactatgtctacacgtcaaatttaagcacgtcaggtctg tcgaggacaagaaatggttaactagtgtttcaattattcttataaacgttaagcattgtaagcccccc ggccgtccgcagcaacaatttactagtatgccgtgggctccgggactatcacggatgtccaattcgca catgcatataatttttctagggtctctcatttcgagaaatcttcggggatccatcagcaatgcgggct gtagtcccgattcccgtttcaaatgaaggtgctccaacacggtcttcaaagcaaccggcataccagca aacacagactgcaactccccgctgcaatgattggttataaacagtaatctgtcttctggaagtatatt tcgcccgacaatccacggcgcccccaaagttaaaaaccatccatgtgtatttgcgtcttctctgttaa aagaatattgactggcattttcccgttgaccgccagatatccaaagtacagcacgatgttgcacggac gactttgcagtcaccagccttcctttccacccccccaccaacaaaatgtttatcgtaggacccatatc cgtaataaggatgggtctggcagcaaccccataggcgcctcggcgtggtagttctcgaggccttaagc ttaaggatcccccaactccgcccgttttatgactagaaccaatagtttttaatgccaaatgcactgaa atcccctaatttgcaaagccaaacgccccctatgtgagtaatacggggactttttacccaatttccca cgcggaaagccccctaatacactcatatggcatatgaatcagcacggtcatgcactctaatggcggcc catagggactttccacatagggggcgttcaccatttcccagcataggggtggtgactcaatggccttt acccaagtacattgggtcaatgggaggtaagccaatgggtttttcccattactggcaagcacactgag tcaaatgggactttccactgggttttgcccaagtacattgggtcaatgggaggtgagccaatgggaaa aacccattgctgccaagtacactgactcaatagggactttccaatgggtttttccattgttggcaagc atataaggtcaatgtgggtgagtcaatagggactttccattgtattctgcccagtacataaggtcaat agggggtgaatcaacaggaaagtcccattggagccaagtacactgcgtcaatagggactttccattgg gttttgcccagtacataaggtcaataggggatgagtcaatgggaaaaacccattggagccaagtacac tgactcaatagggactttccattgggttttgcccagtacataaggtcaatagggggtgagtcaacagg aaagttccattggagccaagtacattgagtcaatagggactttccaatgggttttgcccagtacataa ggtcaatgggaggtaagccaatgggtttttcccattactggcacgtatactgagtcattagggacttt ccaatgggttttgcccagtacataaggtcaataggggtgaatcaacaggaaagtcccattggagccaa gtacactgagtcaatagggactttccattgggttttgcccagtacaaaaggtcaatagggggtgagtc aatgggtttttcccattattggcacgtacataaggtcaataggggtgagtcattgggtttttccagcc aatttaattaaaacgccatgtactttcccaccattgacgtcaatgggctattgaaactaatgcaacgt gacctttaaacggtactttcccatagctgattaatgggaaagtaccgttctcgagccaatacacgtca atgggaagtgaaagggcagccaaaacgtaacaccgccccggttttcccctggaaattccatattggca cgcattctattggctgagctgcgttctacgtgggtataagaggcgcgaccagcgtcggtaccgtcgca gtcttcggtctgaccaccgtagaacgcagagctcctcgctgcaggcggccgctctagaactcgtcgat cgcagcgatgacaaacctgcaagatcaaacccaacagattgttccgttcatacggagccttctgatgc caacaaccggaccggcgtccattccggacgacaccctggagaagcacactctcaggtcagagacctcg acctacaatttgactgtgggggacacagggtcagggctaattgtctttttccctggattccctggctc aattgtgggtgctcactacacactgcagagcaatgggaactacaagttcgatcagatgctcctgactg cccagaacctaccggccagctacaactactgcagactagtgagtcggagtctcacagtgaggtcaagc acactccctggtggcgtttatgcactaaacggcaccataaacgccgtgaccttccaaggaagcctgag tgaactgacagatgttagctacaatgggttgatgtctgcaacagccaacatcaacgacaaaattggga atgtcctggtaggggaaggggtcactgtcctcagcctacccacatcatatgatcttgggtatgtgagg cttggtgaccccattcccgctatagggcttgacccaaaaatggtagctacatgcgacagcagtgacag gcccagagtctacaccataactgcagccgatgattaccaattctcatcacagtaccaaccaggtgggg taacaatcacactgttctcagccaacattgatgctatcacaagcctcagcattgggggagagctcgtg tttcaaacaagcgtccaaggccttgtactgggcgccaccatctaccttataggctttgatgggactgc ggtaatcaccagagctgtggccgcagataatgggctgacggccggcaccgacaatcttatgccattca atcttgtcattccaaccaatgagataacccagccaatcacatccatcaaactggagatagtgacctcc aaaagtggtggtcaggcaggggatcagatgtcatggtcggcaagtgggagcctagcagtgacgatcca tggtggcaactatccaggggccctccgtcccgtcacactagtagcctacgaaagagtggcaacaggat ccgtcgttacggtcgctggggtgagtaacttcgagctgattccaaatcctgaactagcaaagaacctg gttacagaatacggccgatttgacccaggagccatgaactacacaaaattgatactgagtgagaggga ccgtcttggcatcaagaccgtctggccaacaagggagtacactgattttcgtgagtacttcatggagg tggccgacctcaactctcccctgaagattgcaggagcatttggcttcaaagacataatccgggctata aggaggtagatccagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtga aaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataa acaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggaggtgtgggaggtttttt cggatcctctagagtcgacggcagagtcgcagacgcccctattggacgtcaaaattgtagaggtgaag ttttcaaacgatggcgaagtaacggcgacttgcgtttccaccgtcaaatctccctatagggtagaaac taattggaaagtagacctcgtagatgtaatggatgaaatttctgggaacagtcccgccggggttttta acagtaatgagaaatggcagaaacagctgtactacagagtaaccgatggaagaacatcggtccagcta atgtgcctgtcgtgcacgagccattctccggaaccttactgtcttttcgacacgtctcttatagcgag ggaaaaagatatcgcgccagagttatactttacctctgatccgcaaacggcatactgcacaataactc tgccgtccggcgttgttccgagattcgaatggagccttaataatgtttcactgccggaatatttgacg gccacgaccgttgtttcgcataccgctggccaaagtacagtgtggaagagcagcgcgagagcaggcga ggcgtggatttctggccggggaggcaatatatacgaatgcaccgtcctcatctcagacggcactcgcg ttactacgcgaaaggagaggtgcttaacaaacacatggattgcggtggaaaacggtgctgctcaggcg cagctgtattcactcttttctggacttgtgtcaggattatgcgggagcatatctgctttgtacgcaac gctatggaccgccatttatttttgaggaatgctttttggactatcgtactgctttcttccttcgctag ccagagcaccgccgccgtcacgtacgactacattttaggccgtcgcgcgctcgacgcgctaaccatac cggcggttggcccgtataacagatacctcactagggtatcaagaggctgcgacgttgtcgagctcaac ccgatttctaacgtggacgacatgatatcggcggccaaagaaaaagagaaggggggccctttcgaggc ctccgtcgtctggttctacgtgattaagggcgacgacggcgaggacaagtactgtccaatctatagaa aagagtacagggaatgtggcgacgtacaactgctatctgaatgcgccgttcaatctgcacagatgtgg gcagtggactatgttcctagcacccttgtatcgcgaaatggcgcgggactgactatattctcccccac tgctgcgctctctggccaatacttgctgaccctgaaaatcgggagatttgcgcaaacagctctcgtaa ctctagaagttaacgatcgctgtttaaagatcgggtcgcagcttaactttttaccgtcgaaatgctgg acaacagaacagtatcagactggatttcaaggcgaacacctttatccgatcgcagacaccaatacacg acacgcggacgacgtatatcggggatacgaagatattctgcagcgctggaataatttgctgaggaaaa agaatcctagcgcgccagaccctcgtccagatagcgtcccgcaagaaattcccgctgtaaccaagaaa gcggaagggcgcaccccggacgcagaaagcagcgaaaagaaggcccctccagaagactcggaggacga catgcaggcagaggcttctggagaaaatcctgccgccctccccgaagacgacgaagtccccgaggaca ccgagcacgatgatccaaactcggatcctgactattacaatgacatgcccgccgtgatcccggtggag gagactactaaaagttctaatgccgtctccatgcccatattcgcggcgttcgtagcctgcgcggtcgc gctcgtggggctactggtttggagcatcgtaaaatgcgcgcgtagctaatcgagcctagaataggtgg tttcttcctacatgccacgcctcacgctcataatataaatcacatggaatagcataccaatgcctatt cattgggacgttcgaaaagcatggcatcgctacttggaactctggctctccttgccgcgacgctcgca cccttcggcgcgatgggaatcgtgatcactggaaatcacgtctccgccaggattgacgacgatcacat cgtgatcgtcgcgcctcgccccgaagctacaattcaactgcagctatttttcatgcctggccagagac cccacaaaccctactcaggaaccgtccgcgtcgcgtttcggtctgatataacaaaccagtgctaccag gaacttagcgaggagcgctttgaaaattgcactcatcgatcgtcttctgtttttgtcggctgtaaagt gaccgagtacacgttctccgcctcgaacagactaaccggacctccacacccgtttaagctcactatac gaaatcctcgtccgaacgacagcgggatgttctacgtaattgttcggctagacgacaccaaagaaccc attgacgtcttcgcgatccaactatcggtgtatcaattcgcgaacaccgccgcgactcgcggactcta ttccaaggcttcgtgtcgcaccttcggattacctaccgtccaacttgaggcctatctcaggaccgagg aaagttggcgcaactggcaagcgtacgttgccacggaggccacgacgaccagcgccgaggcgacaacc ccgacgcccgtcactgcaaccagcgcctccgaacttgaagcggaacactttacctttccctggctaga aaatggcgtggatcattacgaaccgacacccgcaaacgaaaattcaaacgttactgtccgtctcggga caatgagccctacgctaattggggtaaccgtggctgccgtcgtgagcgcaacgatcggcctcgtcatt gtaatttccatcgtcaccagaaacatgtgcaccccgcaccgaaaattagacacggtctcgcaagacga cgaagaacgttcccaaactagaagggaatcgcgaaaatttggacccatggttgcgtgcgaaataaaca agggggctgaccaggatagtgaacttgtggaactggttgcgattgttaacccgtctgcgctaagctcg cccgactcaataaaaatgtgattaagtctgaatgtggctctccaatcatttcgattctctaatctccc aatcctctcaaaaggggcagtatcggacacggactgggaggggcgtacacgatagttatatggtacag cagaggcctctgaacacttaggaggagaattcagccggggagagcccctgttgagtaggcttgggagc atattgcaggatgaacatgttagtgatagttctcgcctcttgtcttgcgcgcctaacttttgcgacgc gacacgtcctctttttggaaggcactcaggctgtcctcggggaagatgatcccagaaacgttccggaa gggactgtaatcaaatggacaaaagtcctgcggaacgcgtgcaagatgaaggcggccgatgtctgctc ttcgcctaactattgctttcatgatttaatttacgacggaggaaagaaagactgcccgcccgcgggac ccctgtctgcaaacctggtaattttactaaagcgcggcgaaagcttcccgggttaattaaggccctcg aggatacatccaaagaggttgagtattctctctacacttcttgttaaatggaaagtgcatttgcttgt tcttacaatcggcccgagtctcgttcacagcgcctcgttcacacttaaaccacaaatagtctacaggc tatatgggagccagactgaaactcacatatgactaatattcgggggtgttagtcacgtgtagcccatt gtgtgcatataacgatgttggacgcgtccttattcgcggtgtacttgatactatggcagcgagcatgg gatattcatcctcgtcatcgttaacatctctacgggttcagaatgtttggcatgtcgtcgatcctttg cccatcgttgcaaattacaagtccgatcgccatgaccgcgataagcctgtaccatgtggcattagggt gacatctcgatcatacattataagaccaacgtgcgagtcttccaaagacctgcacgccttcttcttcg gattgtcaacgggttcttcagaatctatgcccatatctggcgttgagaccattgtgcgtttaatgaac aataaagcggcatgccatggaaaggagggctgcagatctccattttctcacgccactatcctggacgc tgtagacgataattataccatgaatatagagggggtatgtttccactgccactgtgatgataagtttt ctccagattgttggatatctgcattttctgctgccgaacaaacttcatcgctatgcaaagagatgcgt gtgtacacgcgccggtggagtatacgggaaactaaatgttcatagaggtctttgggctatatgttatt aaataaaataattgaccagtgaacaatttgtttaatgttagtttattcaatgcattggttgcaaatat tcattacttctccaatcccaggtcattctttagcgagatgatgttatgacattgctgtgaaaattact acaggatatatttttaagatgcaggagtaacaatgtgcatagtaggcgtagttatcgcagacgtgcaa cgcttcgcatttgagttaccgaagtgcccaacagtgctgcggttatggtttatgcgcacagaatccat gcatgtcctaattgaaccatccgatttttcttttaatcgcgatcgatgtttgggcaactgcgttattt cagatctaaaaaatttaccctttatgaccatcacatctctctggctcataccccgcttggataagata tcatgtagattccgccctaagaaatgcaaactaacattattgtcggttccatatacacttccatcttg tccttcgaaaataacaaactcgcgcaatagaccgtccgtacatgcatggccgatgtgtgtcaacatca ttggtctgctagatcccgatgggacgaatcgtacagtcgtcgctccagcattggcaaaaatccccaga taccctccatgcggcaaatctaaattgcgaccccgaagagactgcaccaaagtcttatcgacgcacgc tgatttttttgaacagcgggagcccattatcttcagtggagcgtagacgggcgaggctaattatgtga catagcaacactgcatgtatgtttttataaatcaataagagtacataatttattacgtatcatttccg tttgtaatatactgtatacatcatccacactattagtcagcactagcgcgcgggcgcacgttacaata gcagcgtgcccgttatctatattgtccgatatttacacataacatttcatcgacatgattaaatacct aagtactgcacacagatgtttaatgtatatcgtcatataaattatatcgctaggacagacccaaacga cctttatcccaaacagtcagatcctcttctcaagtgtcgatttctgttatggaatatgcataccctgg cccagaaattgcacgcacgagcgtagtgaatgcgtcattggttttacatttaaaggctaaatgcacaa attctttagacgacagcacatcgttaaatagcatctctagcgttcttatgaatgctaagcattggagt cctcctggtcggccacaataacagctgagtatcataccctgagctccggggttgtcgcacatagcgga ttcgtataaacataggattttccgcgaatccatcagttgcaaaaatctgttaggctccatcaacaacg ctggatttacttcagatccacgcgtaaagtaatggtgctcgaataccgtttttagagttgtcggcatt tcaaggaacaaagaattcatttcttcattgcaacgacgcgccagaaatcccaagacctctttgggtag tatgttcttgcctataaaacacggcgttccaagtgccaggaaccacgcatgtgttactgttggggcgt attcagaaataaagcggggtttatgcggcttttgaagctcggatatccaaagtatcgcttgctgatga acgagcgatgtagctgttacaaaacctcctttccatcctccagtcaacataatatttatcggcctacc tatgtccgtaataagtattggtcgggcaattattccgtatgaggtcttgcaggaataagctcttaggg acagccagcttggatatggtgcgaaacagaccttctcggcttcagaatgtcgctccgcagtctcttcg tgtcggtgcatcttagatccaccatcaatgtgtgcagcattgactcccgcccgtcgaatattcctttt gttacgatgcagtaatgagcacgatcatgggcggggcgatgacgttctatttgcatgtctgcgaacaa tttgcgtcagtcatacagctatggagtgggccatttctggccgtcaacttaaaaacgcgaaccgcaga catatgtatttgcatgcaaagacgtatcttcgtatttctgggcatcttcaaatgctctggccaatatg gcaatgaatttggattcgtttgacgccgatggtatgcagtgcaaatgtgccaatagcccacatccgaa aaagttatttgtcatacaagcaggtgttaagtagcaatcacataaaggcaccagacgcctcatggcat cataatgaatagctccttctccccactggaaccactgacaaaatctgcgagtatattccgcaaaccac attttatttctcatagaaactaccctaaatccttttaacgggaagaagaatcctagatagtgcttgaa gtcatgactgttactgctgcaataacactgtatattatttataaattccgtttgtctaggtatctgat gtaggcattccgatccctttactattgcgtcttcacgaccaaatgggaatgcgccaaaatccccacac ctcatcaccctggaggcagattgtgtattattaatatccgccgattgaagcacaaaacggtacggtac tgttcctaattctggtatagattctatggtcaaaagtctgcatatccccgacattgccatgagatcac acagtccaagtagcatgtttattgagtcactcagactgtcaacgtccctcgccgcaccaccaatcgaa aataaagtatctacgcaagttatagctccgcattttctatcgctagcagcaatcgcgacgcaaaacat aaaggccatgttgggatttgaactctctggggggcttgttatcttctgcaccgtcgcagtcgcagttt tccgaaatttatgtctaatatattttccggccgtgctccaatcggccgaaaagaatctgcgtattacc agactcattgacgggccgataaagaccataaaacaaaattcctgtgcactccctcctccagttttgcc atcgtccaagtcccgtaactttttttgcgtttcgaggagcaagcgttcgttatccctacccacacttg ttttccaccgttttcttattataagcggttgtatcgccaacgcgtcaccgcaggttgtcacatacagt gatggcatacttgaacgtgcaacaacgcgctcgctttgcaaatctaagtcattgaccatcaaatcgcg ttgagaggatagccaggcatcttttttcctagtatggtgacggtgcagccaccccaactcagttcttg taaaaaaagctattggcgggaatttatgttctgaggtgcattctatatttatgagtccatcaaatgcc attaaccagattcgtattttttcgctcgacccggcatcactatggatacaatacctttctatggccca tttcagctctcgaaccaaccacacggacaattgactaacataagtatgatctttatcacagtcgcacc catctgagttatatttatggcatccgagcgctcttactgtacggtcggatacacccatggtttttcct ttatatagtcgggttatagtctgtcgggtttggcggtagcacggagtagtttgatttttaagaatcga aaaccggcttggagagaccactgtcgaatatttgtccgtatactctacacgtgagtgttgtccattcc taggtatattcatctgttcggataccttcaattgctgttcaggcataaccttaaagcatatgttatgt tgtacatcaaaacttggtgagttatgttcgattgccgcgcataaagaatcgtacatgagcgtttctgc taacatactatctatattctcacacgcccctgcatatactgttcctattccaaattcacgttttgccc catcggctatctgctcccaaaaagttgtaatataggtgccgctgggtgcgaaattttcatcagttgta ttcctgataaactgaatcactttacataatttttgccacatatctgcgtgcagccatagtatcgaacc cgtgggctcggagacgacagtgcgtacaatgggtattttacctttccccaacaaaataatggtataca agttaggtccgtacctagaccttaatgtttccaattcttctgaatcactgcactctcgtaggggagta acggtaataatttcgtctctgagccccgttttgcgttgaaaactaatcacattagataatgtgcaatc ggtttcttttatccggatacatctaagtattatgacatcggtggtcattgtttccatcaacgaccatc ttttacgatcgcccatactactcatggacgttgtcggtgttgaaaaatcaccagaattgcaacggatc tctgggtaccatgctgctgatggaattggcggttttaattgttgtttcagtctattattgctatcttt ggcggggttgaataatgtggggggagagtgattgcaggaatccgaatgggtcaataaaacgaccgtgc tccgttctgccggcgccgatccgattgaagctatatacttcgcttctctccccacttttccaatttga tccggaaataaaacggccccggacaacagtatcgtacgatccggatccggatcctgcttgcctacaga agaatcaacatctcgccccaatattctggtcaaaactggctcgctcatggcaacgcggacgtttcccc cggtggccagtcttaatggttaatgttcttttcggcaatcttatacatcagcgggttgcgtgaatact ggtcacagttcagtcatttactacacaccagcaatacgacgacggacagtaccgtcccgacgaacgcg acgcccaaaattgctatcgcgaccgcgtccgaggcgatgtcgtacgggcggtgcggggttggatcctc ggcaaagagatcctcgtaattcggcggtgggagcggagggtaaagacgcgggtggggatctccctccg gaccgcgcgccgggcgcggttcgaaaatgctttccgcctcgctcagtgtcaacgccaagtattcgggc gggctgggggccggaatatctcccgcgacttcttctatcggcgcggaattggagtcgcggtcgtggcg cgcttctagcgtcgtcaacggaagtccattttcggggtctcccggtgggcgttcagcgtccatcgtcg tatatgctctaacacacgtctcgctatattaaaaaaaagaagagtatcggtcagtgtcgagtgtcgcc gacaatgtcgcgagttctcggcgatttaatttttggaactgctccctatgaatcccgtaactgtagcg cccgcgcagaaagccgccatcagaccaactacgtgtctgttcgatgtttgcccgccgatcgctttacc gattaaggttccggcgagaaatgacatgctcgatccaagaacaaagtttttcgcggtaaacaacaaca tagttaccgtgcgagatggagaaaccacatctcccgaattagtagaggaaagcccgcgctgtcggttt ggggacatatcgatcttttttgtgtttttcctaggacccttttgccagatcgtacaaagtcgcgtctt atgagcggacgttcttactgcagctcggtaggagtggggcagggttagatttcgtcggcgtttcggcc cccgtatgcgccgcgccaccctcttcgccgagctctttatgcgcggtgggggtgagcgcttccggagt tgcgatctccgatctcgagccgcagcccggcggtgtctctttcagtggagcgttagcgccatcatgtg gttcgtggcggtggaaaggctattatgtgttaggggagagaccacgtgatcggcatgcaaatgagcaa ggcgaacgcgtcagcgttcgcactgcgaaccaataatatatatattatactattggctttaggtgcga acgtccggctagtccaatagcggggtcgcgtttcgtaccacgtgttatagaccgccctaaactcgcac tcgggggtccggccgcgcccagacagggcggagacgtgccacaggggctttaaaacaccgcttcgggc accgttcatctcggcgcgcc

SEQ ID NO 19: señal de poliadenilación del SV40 (199 pb)

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un virus de la enfermedad de Marek no patógeno recombinante (rMDVnp) que comprende un primer ácido nucleico heterólogo situado en un primer sitio no esencial en el genoma del rMDVnp y un segundo ácido nucleico heterólogo situado en un segundo sitio no esencial en el genoma del rMDVnp;

en donde el primer ácido nucleico heterólogo comprende tanto una secuencia de nucleótidos que codifica una glucoproteína D del virus de la laringotraqueítis infecciosa (gD del ILTV) como una secuencia de nucleótidos que codifica una glucoproteína I del virus de la laringotraqueítis infecciosa (gI del ILTV);

en donde el segundo ácido nucleico heterólogo comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína vírica 2 del virus de la bursitis infecciosa (VP2 del IBDV);

en donde el primer sitio no esencial y el segundo sitio no esencial son el mismo; y ambos son el sitio US2 o ambos son el sitio UL54.5, y en donde el rMDVnp es un herpesvirus de pavos recombinante (rHVT).

2. El rHVT de la reivindicación 1, en donde el primer sitio no esencial y el segundo sitio no esencial son ambos el sitio US2.

3. El rHVT de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína gD del ILTV está operativamente bajo el control de un primer promotor, la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína gI del ILTV está operativamente bajo el control de un segundo promotor y la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína VP2 del IBDV está operativamente bajo el control de un tercer promotor, en donde el primer promotor, el segundo promotor y el tercer promotor son todos distintos, y en donde el primer promotor es el promotor de gD del ILTV endógeno, el segundo promotor es el promotor de gl del ILTV endógeno, y el tercer promotor se selecciona del grupo que consiste en el promotor del gen temprano inmediato del citomegalovirus murino 1 (mCMV IE1), el promotor del gen temprano inmediato del citomegalovirus humano 1 (hCMV IE1) y el promotor de la p-actina de pollo.

4. El rHVT de la reivindicación 3, en donde el rHVT comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 16 y el SEQ ID NO: 17, y en donde el primer sitio no esencial y el segundo sitio no esencial son ambos el sitio US2.

5. Un ácido nucleico recombinante que comprende en dirección 5' a 3' en el siguiente orden:

(i) un promotor mCMV IE1;

(ii) una secuencia codificante de la VP2 del IBDV;

(iii) una secuencia terminadora de la transcripción;

(iv) un promotor de gD del ILTV;

(v) una secuencia codificante de la proteína gD del ILTV;

(vi) un promotor de gl del ILTV; y

(vii) una secuencia codificante de la proteína gl del ILTV.

6. El ácido nucleico recombinante de la reivindicación 5, que comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 15.

7. Un rHVT que comprende el ácido nucleico recombinante de las reivindicaciones 5 o 6 insertado en un sitio no esencial, en donde el sitio de inserción no esencial es US2.

8. El ácido nucleico recombinante de la reivindicación 5, que comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 18.

9. Un rHVT que comprende el ácido nucleico recombinante de las reivindicaciones 5 u 8 insertado en un sitio no esencial, en donde el sitio de inserción no esencial es UL54.5.

10. Una composición inmunogénica que comprende el rHVT de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, 7 y 9.

11. Una vacuna que comprende la composición inmunogénica de la reivindicación 10.

12. La composición inmunogénica de la reivindicación 10 para su uso en un método para ayudar en la protección de un pollo frente al ILTV y el IBDV.