CN108368488B

CN108368488B - 鸭肠炎病毒及其用途

Info

Publication number: CN108368488B
Application number: CN201680050454.7A
Authority: CN
Inventors: S.于卡里; S.赛托
Original assignee: Ceva Sante Animale SA
Current assignee: Ceva Sante Animale SA
Priority date: 2015-06-30
Filing date: 2016-06-29
Publication date: 2022-04-05
Anticipated expiration: 2036-06-29
Also published as: CA2992158A1; UA122339C2; CN108368488A; RU2018103145A; PE20180463A1; WO2017001469A1; US20190144835A1; US20190144836A1; BR112017028420A2; US10202582B2; CA2992158C; US10704028B2; MX2018000091A; JP2018519826A; RU2721575C2; US10717967B2; US20190136208A1; US10711255B2; US10711254B2; JP6802813B2

Abstract

本发明涉及DEV及其用途。本发明特别适合于针对禽病原体接种家禽。

Description

鸭肠炎病毒及其用途

发明领域

本发明涉及新病毒及其用途。更具体地，本发明涉及新的鸭肠炎病毒构建体及其表达或递送目的多肽至动物、特别是家禽的用途。本发明特别适合于接种家禽以对抗禽病原体。

发明背景

家禽肉和蛋是重要的食物来源，其消耗由于人群增长和它们极大的品质-价格比率而持续增加。最近的禽流感流行病将舆论聚焦于家禽健康以及食品安全和保障，并且家禽疫苗技术已成为全球性的关注。

表达病原体蛋白的重组病毒通常用作针对靶向的病原体的家禽疫苗。包括这样的病毒的疫苗在感染的细胞内诱导外源病原体蛋白或其片段的表达，其可随后诱导特异性和保护性体液免疫以及细胞介导的免疫。

在此方面，已开发其中已整合了源自病原体的外源基因的许多病毒，用作病毒载体的疫苗。这些病毒载体(或重组病毒)通常基于禽痘病毒例如禽痘(EP-A-0,517,292)、疱疹病毒，特别是HVT(例如，WO-A-87/04463、5,980,906、5,853,733)、新城疫病毒(NDV)或禽腺病毒。这些重组禽病毒显示可变水平的保护作用，取决于疾病和/或动物。

例如，因为痘病毒、NDV和腺病毒在鸡中不持续存在，它们不被视为在鸡中持续时间长的免疫的最佳候选物。重组HVT表达的抗原已显示益处，并且目前被商业化用于在鸡中接种(例如，

IBD、

ND或

LT)。

然而，考虑到日益增加的病原体数量和多样性，和家禽消耗的持续增长，对可用于在家禽中引起有效的保护性免疫的备选接种策略和/或系统存在需要。特别地，对在非常幼小的动物(3天或更小)或在胚蛋中获得免疫的有效系统存在需要。

在此方面，已经探索了新的病毒血清型，目的是发现备选的相容性病毒载体以改进在动物中、特别是在家禽中的接种，允许稳定的蛋白表达和有效的保护作用。

WO2014/0036735论述了鸭肠炎病毒在鸡中的可能用途。DEV天然感染鸭或鹅，但对鸡没有已知的向性。该文献提示，DEV构建体可通过肌内注射给予1周龄的鸡。然而在此文献中，仅报道了晚期给予。

然而通过用DEV进行进一步的实验，发明人发现，当给予幼小的鸡(3天或更小)或在胚蛋中给予时，这样的病毒是致死的。令人惊讶地，尽管在孵化后1周向鸡给予野生型DEV(或含有所有天然基因的DEV构建体，如WO2014/0036735中所提议的)显示耐受良好，但在孵化后第1天或在胚蛋中给予这样的构建体导致极大量的动物死亡(即，80-100％)。甚至更令人惊讶地，发明人已能够修饰DEV的结构以产生DEV构建体，所述构建体可用于家禽，包括非常早期阶段(3天或更小)或在胚蛋中，和可导致在体内实质的和早期阶段的蛋白表达。这样的病毒因此代表了用于接种家禽的新的有效载体。

发明简述

本发明提供了适合于在动物、特别是家禽中，包括非常早期阶段(即，在孵化后第3天或更早，以及在胚蛋中)体内表达基因或蛋白的新的病毒构建体。特别地，本发明提供了通过UL4基因失活获得的新的DEV，和证实了这样的DEV(i)在体内、特别是在鸡中是减毒的，和(ii)是稳定的并能够以适合于诱导保护性免疫的方式表达外源基因。因为这样的DEV对例如鸡没有已知的自然向性，使用这样的DEV构建体以接种鸡对未接种的动物不涉及传播或污染的风险。此外，鸡没有抗DEV的母体抗体或免疫力，并且本发明的病毒可用于在接种的动物中诱导非常早期的免疫启动。令人惊讶地，如之前所示的，尽管野生型DEV在幼小的鸡中或在胚蛋中是致死的，但本发明的DEV是安全的，并可在体内有效地表达目的基因。这样的新的DEV因此代表了用于接种非人动物、特别是家禽和用于赋予早期保护性免疫的非常有效的载体。

本发明的目标更特别地涉及鸭肠炎病毒(DEV)，其中所述病毒具有失活的UL4基因。本发明事实上显示，通过使UL4基因失活，可获得有活力的、稳定的和可复制的DEV，并且这样的病毒可用于通过插入外源遗传物质来产生重组DEV。结果进一步显示，这样的外源遗传物质在细胞感染时从所述病毒高表达，并且这样的表达随时间保持稳定。此外和显著地，尽管已发现天然DEV以及由发明人产生的许多其它缺失的DEV构建体在幼小的鸡(孵化后第3天或更早)中和在胚蛋中是致病性的或致死的，但UL4的失活产生减毒的病毒，其可安全地用于在幼小的动物中包括在胚蛋中表达蛋白和抗原。这样的发现完全是令人惊讶的，并为本发明的病毒提供了高度的优势和功用。

本发明的另一个目标因此涉及鸭肠炎病毒(DEV)，其中所述病毒具有失活的UL4基因和包含外源核酸。

根据具体的实施方案，UL4基因是突变的，或缺失的，或间断的；和/或外源核酸位于UL4基因中，其置换了所有或部分的UL4基因序列，和/或外源核酸编码禽病原体。

本发明的另一个目标是核酸分子，其包含具有失活的UL4基因的DEV的基因组。

本发明进一步涉及宿主细胞，其包含如上文定义的DEV或核酸。

本发明还提供了用于生产或复制如上文定义的DEV的方法，包括用如上文定义的核酸分子或DEV感染感受态细胞，和收集DEV。

本发明还涉及用于制备重组DEV的方法，包括将外源核酸插入DEV的UL4基因序列，优选地置换了所有或至少20％的UL4基因序列。

本发明还提供了组合物，其包含如上文定义的DEV、核酸或宿主细胞，药学或兽医学可接受的赋形剂或载体，和任选地，佐剂。

本发明还提供了疫苗，其包含如上文定义的DEV、核酸或宿主细胞，药学或兽医学可接受的赋形剂或载体，和任选地，佐剂。

本发明的另一个目标涉及如上文定义的组合物、DEV、核酸或宿主细胞，用于接种或免疫禽、特别是家禽、更特别是鸡、更特别是幼小的家禽(孵化后第3天或更早或在胚蛋中)。

本发明的另一个目标涉及如上文定义的组合物、DEV、核酸或宿主细胞，用于在禽、特别是家禽、更特别是鸡、更特别是幼小的家禽中(孵化后第3天或更早或在胚蛋中)诱导保护性免疫。

本发明还涉及接种非人动物、特别是家禽、更特别是鸡、更特别是幼小的家禽(孵化后第3天或更早或在胚蛋中)的方法，包括向所述非人动物给予如上文定义的组合物或病毒。

本发明的特定目标是接种家禽的方法，包括在胚蛋中给予如上文定义的组合物或病毒。

本发明的另一个特定目标是接种家禽的方法，包括在孵化后第1天(即，在约24小时内)给予如上文定义的组合物或病毒。

在另一方面，本发明提供了用于在非人动物中针对一种或多种禽病原体诱导免疫原性或保护性反应的方法，包括向所述非人动物、特别是家禽、更特别是鸡、更特别是幼小的家禽(孵化后第3天或更早或在蛋中)给予如上文定义的组合物、疫苗或病毒。

本发明的病毒或组合物可通过任何途径给予。优选地，它们在胚蛋中给予或孵化后1或2天通过皮下(例如，s.c.)注射给予，以非常早期地提供免疫。

本发明还提供了用于免疫禽的接种试剂盒，其包含以下组分：

a.有效量的上述组合物，和

b.用于向所述禽给予所述组合物的工具。

本发明可用于在任何动物中表达多肽，优选地用于禽的接种，并且其适合于表达一种或数种多肽或肽、特别是禽病原体的免疫原性肽。

附图简述

图1说明了鸭肠炎病毒(DEV)基因组和重组DEV/rpsLneo-DsRed2的克隆区的位置(包括插入位点)的示意图。

图2显示了重组DEV/rpsLneo-DsRed2基因组的图示，指示在PCR反应中扩增的接点1、接点2和接点3的位置，以证实病毒的基因组结构。

图3说明了DEV基因组和pUC18-KAPEVAC-UL4del的UL4基因和克隆区的位置的示意图。

图4说明了DEV基因组和UL26/UL27插入区的位置的示意图，指示在PCR反应中扩增的接点1、接点2和接点3的位置，以证实病毒的基因组结构。

图5说明了DEV基因组和pUC18-KAPEVAC-UL23del-BacVP2和pUC18-KAPEVAC-UL23del-Coa5VP2的UL23基因和克隆区的位置的示意图。

图6说明了DEV基因组和UL45/UL46插入区的位置的示意图。

图7说明了DEV基因组和UL50/UL51插入区的位置的示意图。

图8说明了DEV基因组和pUC18-KAPEVAC-US7-BacVP2的US7区和克隆区的位置的示意图。

发明详述

本发明总体上涉及减毒的DEV，以及包含位于基因组内的特定插入位点的外源基因序列的DEV。本发明还涉及包含这样的DEV的组合物，以及其用于接种动物、特别是家禽、更特别是幼小的家禽(孵化后第3天或更早或在胚蛋中)的用途。

本公开内容通过参考以下定义将得到最好理解：

定义

术语“病毒”特别是指包含囊封在衣壳或被膜中的核酸分子(例如，基因组)的病毒颗粒。术语“病毒”还指病毒载体或分离的病毒基因组。

术语“重组”是指已使用遗传技术产生、设计或修饰的分子。关于病毒的术语“重组”更特别地是指其基因组(或其原种的基因组)通过插入或缺失至少一个核酸序列而被修饰的病毒。

关于病毒的术语“外源核酸”是指在病毒的基因组中天然不存在的核酸，或在所述基因组中天然存在，但以不同形式或在不同位置存在的核酸。

在本申请说明书中，术语“核酸”或“多种核酸”是指任何核酸分子或序列，例如脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)，其可以是例如，单链或双链的。核酸可包含或不包含ORF。核酸分子可通过本领域本身已知的技术，例如通过人工合成、重组技术、酶技术、在宿主细胞中复制，或其组合产生。

“基因”是指包含编码产物，例如多肽(例如，肽、蛋白等)或RNA的开放阅读框的核酸分子或序列。

本文使用的术语“减毒的”是指在动物模型中基本上不引起疾病的病毒。减毒病毒通常可在宿主中复制，而不导致其死亡。减毒病毒更特别地是指当以1x10³噬斑形成单位(pfu)/胚蛋的剂量注射时在胚胎中没有毒力的病毒。最优选的减毒病毒在1x10³pfu/胚蛋的剂量下在至少70％注射的胚蛋中，更优选在至少80％注射的胚蛋中，甚至更优选在至少90％、95％、97％、98％、99％或更多中是安全的。本发明的减毒病毒对于孵化后注射，包括孵化后第0天(即，孵化后0.1-48小时)注射也是安全的。

术语“禽”意图包括所有类型的禽类，例如鸟纲的鸟类，即，有羽毛、有翅、双足、温血和产卵的脊椎动物。在本发明的上下文中，禽类或禽物种更特别地是指具有经济学和/或农艺学益处的鸟类，例如家禽，更优选鸡和火鸡；或观赏鸟类，例如天鹅和鹦鹉。

本文使用的术语"疫苗"是指可用于在生物体中引起、刺激或增强免疫反应的试剂。

"免疫反应"是指在宿主中对目的组合物或疫苗发展细胞和/或抗体介导的免疫反应。通常，"免疫反应"包括特异性针对在目的组合物或疫苗中包括的一种或多种抗原，产生抗体、B细胞、辅助T细胞和/或细胞毒性T细胞。优选地，免疫反应是保护性的，使得对新感染的抗性得到增强，和/或降低疾病的临床严重性。

术语“在胚蛋中”给予或注射一般是指在胚蛋中包含的胚胎中接种或注射。在胚蛋中注射优选地在孵化前第5天和第1天之间的任何时间进行。

鸭肠炎病毒

鸭肠炎病毒(DEV)，亦称为鸭病毒性肠炎病毒(DVEV)，自然感染鸭和鹅。DEV的全长核苷酸序列已经测定，并可在线获得(参见例如JQ673560)。病毒基因组包含约162Kb，编码接近80种不同的蛋白。已经分离了DEV的数个血清型和毒株，例如Jansen株、CSC株、CHv株、VAC株和2085株。

DEV表征不足，并且其作为表达基因的载体的用途尚未深入探索。例如，Liu等(2013)和WO2014/0036735试图使用重组DEV以在鸡中表达基因。他们利用DEV构建体，其中核酸被克隆在病毒基因组的US7和US8基因之间，没有改变天然基因表达。尽管报道了这样的构建体可通过肌内注射转移至1周龄的鸡中，然而在该文献中或在任何其它现有技术文献中没有公开DEV在胚蛋中接种家禽或接种幼小的家禽(即，在孵化后第3天或之前，特别是在孵化后第1天或第2天)的任何可能的用途。

通过用DEV进行进一步的实验，发明人令人惊讶地发现，当给予幼小的鸡(3天或更小)或在胚蛋中给予时，该病毒是致死的。令人惊讶地，尽管孵化后1周向鸡给予野生型DEV(或包含所有天然基因的DEV构建体，如WO2014/0036735中提议的)显示耐受良好，但在孵化后第1天或在胚蛋中给予这样的构建体导致极大量的动物死亡(即，80-100％之间)，如实施例1所报告的。

甚至更令人惊讶地，发明人已经能够修饰DEV的结构以产生DEV构建体，其可用于家禽，包括非常早期阶段(3天或更小)或在胚蛋中，并可导致在体内实质的和早期阶段的蛋白表达。更特别地，本发明人用DEV进行进一步的研究和产生具有不同的基因缺失或改变的各种重组体。发明人令人惊讶地发现，这些构建体之一是稳定的、安全的和有效的DEV重组体，而其它的构建体在胚蛋中基本上是致死的。更特别地，通过使UL4基因失活，可获得重组DEV，其(i)在体内，特别是在鸡中是减毒的，和(ii)是稳定的和能够以适合于诱导保护性免疫的方式表达外源基因。本发明事实上显示，通过使UL4基因失活，可获得有活力的、稳定的和可复制的DEV，并且这样的病毒可用于插入外源遗传物质。结果还显示，这样的外源遗传物质在细胞感染时从这样的病毒高度表达，并且这样的表达随时间保持稳定。此外和显著地，尽管天然DEV或其它重组DEV在幼小的鸡中(低于3日龄或在胚蛋中)是致病性的或致死的，但UL4的失活产生减毒的DEV，其可安全地用于在幼小的家禽中和在胚蛋中表达蛋白或抗原。因为DEV对例如，鸡没有已知的自然向性，使用本发明的DEV构建体接种鸡对未接种的动物不涉及传播或污染的风险。此外，鸡没有抗DEV的母体抗体或免疫，和本发明的病毒可用于在接种的动物中诱导非常早期的免疫启动。

本发明的目标因此涉及鸭肠炎病毒(DEV)，其中所述病毒具有失活的UL4基因。

本发明的另一个目标涉及鸭肠炎病毒(DEV)，其中所述病毒具有失活的UL4基因和包含外源核酸。

本发明的另一个目标涉及鸭肠炎病毒(DEV)，其中所述病毒至少具有第一和第二失活的基因，其中第一失活的基因是UL4基因和第二失活的基因选自UL23和US7基因。

本发明的DEV可从任何DEV种类或毒株制备。已经报道了DEV的许多毒株，其可获自公开的收集，例如CSC株(Genbank#JQ673560)、Jansen株、CHv株(Genbank#JQ647509)、VAC株(Genbank#EU082088)和2085株(Genbank#JF999965)。

在优选的实施方案中，本发明的DEV源自亲本株或从亲本株制备，所述亲本株选自Jansen株或CSC株，或与Jansen株或CSC株具有至少90％序列同一性，更优选至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的任何DEV毒株。

本发明显示，通过使UL4基因失活(即，使其无功能性或缺失)，有可能产生减毒的DEV，甚至当在胚蛋中或在幼小的家禽中注射时，其是安全的，和其可在家禽中复制和表达蛋白。预测DEV的UL4基因编码核蛋白。然而，DEV的UL4基因的实际功能仍不清楚。在本发明之前，不知道产生UL4-缺陷的DEV病毒的能力，和完全不知道UL4-缺陷的DEV病毒复制和表达外源基因，而在禽类中没有致死性的能力。

UL4基因通常由DEV基因组的717bp构成。参照CSC株，UL4基因对应于基因组的nt112845至nt113561。DEV的Jansen型毒株的UL4基因的核苷酸序列以SEQ NO:13表示。应理解，使用本申请中包含的信息和公知常识，或通过序列比对，技术人员可容易地鉴定在任何DEV毒株中UL4基因的确切位置。

在本发明的上下文中，具有失活的UL4基因的DEV是指不能表达功能UL4蛋白的DEV。失活的UL4基因因此指不能编码野生型UL4蛋白的突变、缺失和/或间断的UL4基因。

特定的突变是在UL4编码序列中阻止全长UL4蛋白的表达的点突变。这样的突变可在序列中引入终止密码子或无义密码子，或导致在编码的蛋白中必需氨基酸残基的置换，产生失活的蛋白。

在本发明的特定DEV中，至少20％的UL4基因序列缺失，更优选至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少85％，直至100％。在优选的实例中，本发明的DEV具有至少400bp的UL4基因序列缺失，更优选至少500bp、至少600bp或更多。

在具体的实施方案中，本发明的DEV具有跨越UL4基因序列的至少nt 200-500的缺失，更优选至少nt100-600，甚至更优选至少nt80-650。在具体的实例中，本发明的DEV具有UL4基因序列(例如，DEV/UL4/rpsLneo-DsRed2)的nt51至nt667(即，约85％)的缺失。

如实施例中所示，具有失活的UL4基因的DEV构建体是稳定的，可在培养中复制，和可安全地给予家禽胚蛋或幼小的家禽。这样的病毒可因此用于产生包含外源核酸物质、特别是抗原编码基因的重组DEV，以在家禽中表达这样的基因。

在特定的实施方案中，本发明因此涉及鸭肠炎病毒(DEV)，其中所述病毒具有失活的UL4基因和包含外源核酸。

在优选的实施方案中，外源核酸位于DEV病毒基因组的UL4基因序列中，其添加至已有的UL4基因序列中(因此通过间断基因序列致使基因失活)或置换UL4基因的缺失的序列，或在突变的UL4基因序列中。

在优选的实施方案中，本发明的DEV具有UL4基因序列中的缺失，和包含位于缺失的核苷酸的位置的外源核酸。

在另一个特定的实施方案中，外源核酸位于DEV病毒基因组的不同于UL4基因序列的克隆位点，其添加至已有的基因序列，或置换缺失的序列，或在突变的基因序列中。这样的另外的插入位点可以选自UL44基因、UL27-UL26基因间区域、UL23基因、UL45-UL46基因间区域、UL50-UL51基因间区域、US4基因、US5基因、US7基因、US7-US8基因间区域或US10基因。

在本发明的DEV中，外源基因一般在转录启动子的控制下。优选地，启动子与外源基因一起克隆。启动子可以是衍生自细胞或病毒基因的任何天然或合成的启动子。合适的启动子的实例包括例如，鸡β-肌动蛋白(Bac)启动子或其衍生物，例如Coa5，Pec启动子，鼠巨细胞病毒(Mcmv)立即早期(ie)1启动子、人巨细胞病毒启动子(Hcmv)、猴病毒(SV)40启动子和劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子，或其保留启动子活性的任何片段。

此外，本发明的DEV可包含数种外源核酸。在此方面，数种外源核酸可在单个或数个不同的启动子的控制下插入到如上所述的UL4区中。或者，DEV可包含插入到UL4中的外源核酸和在一个或多个不同的插入位点中插入的一种或多种外源核酸。这样的另外的插入位点可以选自UL44基因、UL27-UL26基因间区域、UL23基因、UL45-UL46基因间区域、UL50-UL51基因间区域、US4基因、US5基因、US7基因、US7-US8基因间区域或US10基因。

在此方面，在具体的实施方案中，本发明涉及鸭肠炎病毒(DEV)，其中所述病毒具有失活的UL4基因和失活的UL44基因。更特别地，本发明涉及DEV，其中所述病毒包含克隆至UL4基因的第一外源核酸，其置换了至少20％的所述基因，和克隆至UL44基因的第二外源核酸，其置换了至少20％的所述基因。UL44基因通常由DEV基因组的1296bp构成。参考CSC株，UL44基因对应于基因组的nt27419至nt28714。应理解，使用本申请包含的信息和公知常识，或通过序列比对，技术人员可容易地鉴定在任何DEV毒株中UL44基因的确切位置。在本发明的特定DEV中，至少20％的UL44基因序列被缺失，更优选至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，直至100％。在优选的实例中，本发明的DEV具有至少500bp的UL44基因序列缺失，更优选至少600、700、800、900、1000或更多。在具体的实施方案中，本发明的DEV具有跨越UL44基因序列的至少nt 200-1000的缺失，更优选至少nt100-1100，甚至更优选至少nt100-1200。在具体的实例中，本发明的DEV具有UL44基因序列的nt51至nt1246(即，超过90％)的缺失。

在另一个具体的实施方案中，本发明涉及鸭肠炎病毒(DEV)，其中所述病毒具有失活的UL4基因和失活的UL23基因。本发明的这样的重组DEV的实例包括JK015、JK022、JK023、JK024和JK025。本发明显示，这两个基因的失活产生高度减毒的DEV，在胚蛋中给予时具有约95％存活率。得到的结果还显示，这样的减毒病毒可在体外有效地复制，和可表达外源基因序列。更特别地，本发明涉及DEV，其中所述病毒包含克隆至UL4基因的第一外源核酸，其置换至少20％的所述基因，和克隆至UL23基因的第二外源核酸，其置换至少20％的所述基因。本发明还涉及DEV，其中所述病毒包含失活的UL4基因，和其中所述病毒包含克隆至UL23基因的外源核酸，其置换至少20％的所述基因。本发明还涉及DEV，其中所述病毒包含失活的UL4基因和失活的US7基因，和其中所述病毒包含克隆至UL23基因的外源核酸，其置换至少20％的所述基因。本发明还涉及DEV，其中所述病毒包含失活的UL4基因和失活的UL23基因，和其中所述病毒包含克隆至UL26-27基因间区域或克隆至UL45-46基因间区域或克隆至UL50-51基因间区域的外源核酸。DEV的UL23基因编码胸苷激酶，其被认为参与催化核苷酸合成。在本发明之前，不知道产生UL23-缺陷的DEV病毒的能力。UL23基因通常由DEV基因组的1077bp构成。参考CSC株，UL23基因对应于基因组的nt77997至nt79073。应理解，使用本申请包含的信息和公知常识，或通过序列比对，技术人员可容易地鉴定在任何DEV毒株中UL23基因的确切位置。在本发明的具体DEV中，至少20％的UL23基因序列被缺失，更优选至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，直至100％。在优选的实例中，本发明的DEV具有至少500bp的UL23基因序列缺失，更优选至少600、700、800、900、1000或更多。在具体的实施方案中，本发明的DEV具有跨越UL23基因序列的至少nt 200-900的缺失，更优选至少nt100-1000，甚至更优选至少nt80-1000。在具体的实例中，本发明的DEV具有UL23基因序列的nt51至nt1027(即，约90％)的缺失。

在另一个具体的实施方案中，本发明涉及鸭肠炎病毒(DEV)，其中所述病毒具有失活的UL4基因和失活的US4基因。更特别地，本发明涉及DEV，其中所述病毒包含克隆至UL4基因的第一外源核酸，其置换了至少20％的所述基因，和克隆至US4基因的第二外源核酸，其置换了至少20％的所述基因。DEV的US4基因编码糖蛋白D，其被认为位于病毒被膜和感染的细胞的质膜上。在本发明之前，不知道产生US4-缺陷的DEV病毒的能力。US4基因通常由DEV基因组的1380bp构成。参考CSC株，US4基因对应于基因组的nt141123至nt142502。应理解，使用本申请包含的信息和公知常识，或通过序列比对，技术人员可容易地鉴定在任何DEV毒株中US4基因的确切位置。在本发明的具体DEV中，至少20％的US4基因序列被缺失，更优选至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，直至100％。在优选的实例中，本发明的DEV具有至少500bp的US4基因序列缺失，更优选至少600、700、800、900、1000或更多。在具体的实施方案中，本发明的DEV具有跨越US4基因序列的至少nt 200-1000的缺失，更优选至少nt150-1150，甚至更优选至少nt100-1300。在具体的实例中，本发明的DEV具有US4基因序列的nt51至nt1330(即，大于90％)的缺失。

在此方面，在具体的实施方案中，本发明涉及鸭肠炎病毒(DEV)，其中所述病毒具有失活的UL4基因和失活的US5基因。更特别地，本发明涉及DEV，其中所述病毒包含克隆至UL4基因的第一外源核酸，其置换了至少20％的所述基因，和克隆至US5基因的第二外源核酸，其置换了至少20％的所述基因。DEV的US5基因编码糖蛋白J，其功能仍然未知。在本发明之前，不知道产生US5-缺陷的DEV病毒的能力。US5基因通常由DEV基因组的1620bp构成。在具体的DEV毒株中，例如2085株和Jansen株，因为基因中的突变导致US5基因更短(约1197bp)。参考CSC株，US5基因对应于基因组的nt142662至nt144281。应理解，使用本申请包含的信息和公知常识，或通过序列比对，技术人员可容易地鉴定在任何DEV毒株中US5基因的确切位置。在本发明的具体DEV中，至少20％的US5基因序列被缺失，更优选至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，直至100％。在优选的实例中，本发明的DEV具有至少500bp的US5基因序列缺失，更优选至少600、700、800、900、1000或更多。在具体的实施方案中，本发明的DEV具有跨越US5基因序列的至少nt 200-1000的缺失，更优选至少nt100-1100，甚至更优选至少nt80-1120。在具体的实例中，自Jansen株产生的本发明的DEV具有US5基因序列的nt51至nt1147(即，超过90％)的缺失，和自CSC株产生的DEV具有US5基因序列的nt51至nt1570的缺失。

在另一个具体的实施方案中，本发明涉及鸭肠炎病毒(DEV)，其中所述病毒具有失活的UL4基因和失活的US7基因。本发明的这样的重组DEV的实例包括JK016、JK025、JK026、JK027和JK028。本发明显示，这两个基因的失活产生高度减毒的DEV，在胚蛋中给予时导致0％死亡率。得到的结果还显示，这样的减毒病毒可在体外有效地复制，和可表达外源基因序列。更特别地，本发明涉及DEV，其中所述病毒包含克隆至UL4基因的第一外源核酸，其置换了至少20％的所述基因，和克隆至US7基因的第二外源核酸，其置换了至少20％的所述基因。本发明还涉及DEV，其中所述病毒包含失活的UL4基因，和其中所述病毒包含克隆至US7基因的外源核酸，其置换了至少20％的所述基因。本发明还涉及DEV，其中所述病毒包含失活的UL4基因和失活的US7基因，和其中所述病毒包含克隆至UL23基因的外源核酸，其置换了至少20％的所述基因。本发明还涉及DEV，其中所述病毒包含失活的UL4基因和失活的US7基因，和其中所述病毒包含克隆至UL26-27基因间区域或克隆至UL45-46基因间区域或克隆至UL50-51基因间区域的外源核酸。DEV的US7基因编码糖蛋白I，其被认为参与病毒的细胞至细胞传播。在本发明之前，不知道产生US7-缺陷的DEV病毒的能力。US7基因通常由DEV基因组的1116bp构成。参考CSC株，US7基因对应于基因组的nt145769至nt146884。应理解，使用本申请包含的信息和公知常识，或通过序列比对，技术人员可容易地鉴定在任何DEV毒株中US7基因的确切位置。在本发明的具体DEV中，至少20％的US7基因序列被缺失，更优选至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，直至100％。在优选的实例中，本发明的DEV具有至少500bp的US7基因序列缺失，更优选至少600、700、800、900、1000或更多。在具体的实施方案中，本发明的DEV具有跨越US7基因序列的至少nt 200-900的缺失，更优选至少nt100-1000，甚至更优选至少nt80-1120。在具体的实例中，本发明的DEV具有US7基因序列的nt51至nt1066(即，超过90％)的缺失。

在此方面，在具体的实施方案中，本发明涉及鸭肠炎病毒(DEV)，其中所述病毒具有失活的UL4基因和失活的US10。更特别地，本发明涉及DEV，其中所述病毒包含克隆至UL4基因的第一外源核酸，其置换了至少20％的所述基因，和克隆至US10基因的第二外源核酸，其置换了至少20％的所述基因。预测DEV的US10基因编码毒粒蛋白，其功能仍然未知。在本发明之前，不知道产生US10-缺陷的DEV病毒的能力。US10基因通常由DEV基因组的约900至970bp构成，取决于毒株。参考CSC株，US10基因对应于基因组的nt136391至nt137320。应理解，使用本申请包含的信息和公知常识，或通过序列比对，技术人员可容易地鉴定在任何DEV毒株中US10基因的确切位置。在本发明的具体DEV中，至少20％的US10基因序列被缺失，更优选至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，直至100％。在优选的实例中，本发明的DEV具有至少500bp的US10基因序列缺失，更优选至少600、700或800或更多。在具体的实施方案中，本发明的DEV具有跨越US10基因序列的至少nt200-700的缺失，更优选至少nt100-800，甚至更优选至少nt80-850。在具体的实例中，自CSC株产生的本发明的DEV具有US10基因序列的nt51至nt880(即，超过80％)的缺失，和自VAC株产生的DEV具有US10基因序列的nt51至nt847的缺失。

本发明还涉及DEV，其中所述病毒包含克隆至UL4基因的第一外源核酸，其置换了至少20％的所述基因，和克隆至位于UL27和UL26基因之间的基因间区域的第二外源核酸。本发明还涉及DEV，其中所述病毒包含失活的UL4基因，和其中所述病毒包含克隆至位于UL27和UL26基因之间的基因间区域的外源核酸。参考CSC株，位于UL27和UL26之间的基因间区域对应于基因组的nt72195至nt72646。克隆可在这样的结构域内的任何位置进行，更优选在nt72300和nt72500之间，还更优选在nt72350和nt72450之间。在具体的实施方案中，克隆在nt72431和nt72432之间进行。

本发明还涉及DEV，其中所述病毒包含克隆至UL4基因的第一外源核酸，其置换了至少20％的所述基因，和克隆至位于US7和US8基因之间的基因间区域的第二外源核酸。这样的基因间克隆位点已描述于WO2014/0036735。

本发明还涉及DEV，其中所述病毒包含失活的UL4基因，和其中所述病毒包含克隆至位于UL45和UL46基因之间或UL50和UL51基因之间的基因间区域的外源核酸。参考CSC株，位于UL45和UL46之间的基因间区域对应于基因组的nt25132至nt25352。克隆可在这样的结构域内的任何位置进行，更优选在nt25200和nt25300之间。在具体的实施方案中，克隆在nt25275和nt25276之间进行。参考CSC株，位于UL50和UL51之间的基因间区域对应于基因组的nt15914至nt16063。克隆可在这样的结构域内的任何位置进行，更优选在nt15970和nt16010之间。在具体的实施方案中，克隆在nt15979和nt15980之间进行。

病毒构建和克隆可通过本领域本身已知的技术完成。基因克隆和质粒构建是本领域普通技术人员众所周知的，并可通过标准分子生物学技术基本上实现(MolecularCloning:A Laboratory Manual.第四版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,New York,USA,2012)。通常，重组病毒可通过在病毒基因组和构建体(例如，同源质粒)之间同源重组来制备，所述构建体包含待插入的核酸，侧接来自插入位点的核苷酸以允许重组。克隆可在有或没有内源序列缺失的情况下进行。在具体的实施方案中，重组序列被克隆，置换了基因组的至少部分序列，例如至少50个核苷酸或更多。这样的缺失增加了病毒的克隆能力。

对于构建，包含靶向的插入区的序列通常首先被克隆至合适的载体，以产生同源载体。载体的实例包括质粒，例如pBR322、pBR325、pBR327、pBR328、pUC18、pUC19、pUC7、pUC8或pUC9；噬菌体，例如λ噬菌体和M13噬菌体；或粘粒，例如pHC79。靶标区域序列通过常规的克隆方法被整合至载体。使用的靶标区域序列优选地具有足够的长度，以允许随后与DEV病毒基因组在体内同源重组。优选地，克隆的靶标区域序列应具有至少大约100个核苷酸长，通常大于300个，例如500-2000个核苷酸。外源核酸(其通常包含基因和启动子)然后被插入克隆至载体的靶标区域中。插入应优选地以留下一部分的靶标区域序列在克隆的插入序列的各侧的方式进行，插入序列的长度足以允许同源重组(例如至少50个核苷酸，优选地至少100个核苷酸)。外源核酸可通过经典技术例如限制酶和连接程序被引入克隆的靶标区域。如果合适的话，突变可在靶标区域的特定位点引入，以产生新的限制酶切割位点。本领域技术人员众所周知的常规诱变技术可用于该目的，诸如，例如，体外诱变或PCR。其中外源核酸已插入靶标区域的同源载体然后可使用已知的技术例如电穿孔、磷酸钙、基于脂质转染的方法等，被引入DEV-感染的细胞或DEV基因组-转染的细胞。重组病毒由此通过在所述细胞中在病毒和载体之间重组而产生。得到的重组病毒可使用已知的技术，例如，通过杂交、测序、PCR或检测由外源核酸编码的任何产物的功能测定法，在基因型或表型上进行选择，如实施例所述。选择的重组病毒可在细胞培养中大规模培养，之后可收集重组病毒。

外源基因

本发明的DEV可包含任何外源核酸，优选地任何外源基因。外源基因可编码任何目的产物，例如RNA或生物学活性和/或免疫原性(例如，抗原性)蛋白、多肽或肽。在优选的实施方案中，外源基因编码抗原，甚至更优选源自能够在动物、特别是禽中导致感染的致病性生物体的抗原的肽或多肽。在禽中导致感染的病原体的实例包括病毒、细菌、真菌、原生动物等。免疫原性(多)肽可优选地是(源自)所述病原体的表面蛋白、分泌蛋白或结构蛋白，或其片段。多肽可源自任何来源，例如，病毒、原核、真核或合成的。

在优选的实施方案中，外源基因编码鸟类病原体的抗原性肽。

病原体的具体实例包括但不限于，禽流感病毒、禽副粘病毒1型(亦称为新城疫病毒(NDV))、禽变性肺病毒(avian metapneumovirus)、马莱克病病毒、甘布罗病病毒(亦称为传染性法氏囊病病毒(IBDV))、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、大肠杆菌、沙门氏菌种属、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer)、鼻气管鸟杆菌(Ornithobacterium rhinotracheale)、鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)、关节液支原体(Mycoplasma synoviae)、感染禽类或球虫的支原体微生物。

优先地，外源基因编码选自NDV的F蛋白、NDV的HN蛋白、IBDV的VP2蛋白、ILTV的gB蛋白、鸡败血支原体的40K蛋白或禽流感病毒的表面蛋白血凝素(HA)，或其免疫原性片段的抗原。在本发明的情况下，术语蛋白的“片段”优选地是指包含所述蛋白的至少5个连续的氨基酸残基的片段，甚至更优选5-100个。在优选的实施方案中，这样的片段包含至少一个表位和/或在体内具有免疫原性，即，可导致产生结合全长蛋白的抗体。

免疫原性肽的具体实例包括例如，包含VP2的氨基酸残基1-453、gB的1-469或F的1-540的肽。

优选的DEV

本发明的优选的DEV包含整个UL4基因的缺失。

本发明的特定DEV包含UL4基因序列的至少nt100-nt600的缺失，例如DEV UL4基因组的nt51至nt667的缺失。

本发明的另一个优选的DEV包含失活的UL4基因和失活的UL23基因。

本发明的另一个优选的DEV包含失活的UL4基因和失活的US7基因。

在本发明的优选的DEV中，外源核酸编码禽抗原，更优选VP2、HN或F蛋白或其免疫原性片段。

本发明的另一个优选的DEV包含UL4基因序列的至少nt100-nt600的缺失和至少一个另外的缺失，其选自：

.UL44基因序列的至少nt100-nt1200的缺失，

.UL23基因序列的至少nt100-nt1000的缺失，

.US4基因序列的至少nt100-nt1300的缺失，

.US5基因序列的至少nt100-nt1100的缺失，

.US7基因序列的至少nt100-nt1000的缺失，和/或

.US10基因序列的至少nt100-nt800的缺失，或其组合。

核酸

本发明还涉及核酸分子，其包含具有失活的UL4基因的DEV基因组。这样的核酸可以是单链或双链的DNA或RNA。在具体的实施方案中，核酸是包含上文定义的DEV基因组的DNA分子。

核酸可以为游离形式，或在载体例如质粒、BAC等中。核酸可以是分离的，或包含在宿主细胞中。

细胞培养

本发明的重组病毒可在任何感受态细胞培养中繁殖。在需要的病毒生长实现后，细胞可使用刮刀或用胰蛋白酶离壁，和感染的细胞可通过离心从上清液分离。

感受态细胞的实例包括CEF、含胚卵、鸡肾细胞等。细胞或病毒可在培养基例如Eagle's MEM、Leibowitz-L-15/McCoy 5A(1:1混合物)培养基中在约37℃下培养3-6天。感染的细胞通常悬浮于包含10％二甲基亚砜(DMSO)的培养基中并在液氮中冷冻贮存。

组合物和疫苗

本发明还涉及组合物，例如疫苗，其包含本发明的一种或多种DEV。

本发明的组合物和疫苗可包含在药学或兽医学可接受的载体或赋形剂中的DEV。另外或备选地，组合物和疫苗可包含合适的佐剂。

根据本发明的组合物和疫苗可包含合适的溶剂，诸如，例如水性缓冲液或磷酸盐缓冲液。优选地，组合物和疫苗还包含添加剂，例如稳定剂、防腐剂、着色剂、表面活性剂等。

例如，本发明的组合物或疫苗可与维持等渗性、生理pH和稳定性的一种或多种另外的添加剂一起配制，例如缓冲液，例如生理盐水(0.85％)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、柠檬酸盐缓冲液、三(羟基甲基氨基甲烷)(TRIS)、Tris-缓冲盐水等，或抗生素，例如新霉素或链霉素等。

在具体的实施方案中，本发明的组合物包含防腐剂。

在另一个具体的实施方案中，本发明的组合物包含增溶剂。

在另一个具体的实施方案中，本发明的组合物包含佐剂。佐剂可获自多种来源的任何一种，包括源自动物的各种蛋白和肽(例如，激素、细胞因子、共刺激因子)和源自病毒以及其它来源的新的核酸(例如，双链RNA、CpG)等，其单独或组合，足以增强免疫反应。

本发明的组合物可以是液体(溶液、混悬液、乳液)或固体(粉末、凝胶、糊剂、油)，并且它们可经配制用于任何给予途径。优选地，它们经配制用于注射，例如在胚蛋中注射或用于例如，静脉内、皮下、肌内、眶内、眼内、皮内和/或腹膜内注射。或者，它们可经配制用于口服、经眼(例如，通过滴眼剂)、鼻内或眼-鼻给予，例如，使用气雾剂或喷雾剂。

每个疫苗剂量可包含足以在禽类中引起保护性免疫反应的合适的剂量。这样的剂量的优化是本领域众所周知的。每剂量的抗原量可通过已知的方法，使用抗原/抗体反应，例如通过ELISA方法确定。

本发明的疫苗可作为单剂量或以重复剂量给予，这取决于接种方案。

在具体的实施方案中，本发明涉及包含上文定义的病毒、核酸或细胞和合适的赋形剂或佐剂的疫苗。

在另一个具体的实施方案中，本发明涉及包含上文定义的病毒、核酸或细胞和合适的赋形剂或佐剂的液体组合物的疫苗。

本发明进一步涉及上文描述的病毒、组合物、疫苗、核酸或细胞用于免疫禽类，例如家禽的用途，和涉及通过给予免疫有效量的上文描述的病毒、组合物、疫苗、核酸或细胞免疫禽类的方法。

本发明的另一个目标涉及上文定义的组合物、DEV、核酸或宿主细胞，用于接种或免疫禽类、特别是家禽、更特别是鸡、更特别是幼小的家禽(孵化后第3天或更早)或在胚蛋中。

本发明的另一个目标涉及上文定义的组合物、疫苗、DEV、核酸或宿主细胞，用于在禽类、特别是家禽、更特别是鸡、更特别是幼小的家禽(孵化后第3天或更早)或在胚蛋中诱导保护性免疫。

本发明还涉及接种非人动物、特别是家禽、更特别是鸡、更特别是幼小的家禽(孵化后第3天或更早或在胚蛋中)的方法，包括向所述非人动物给予上文定义的组合物、疫苗、DEV、核酸或宿主细胞。

本发明的特定目标是接种家禽的方法，包括在胚蛋中给予上文定义的组合物、疫苗、DEV、核酸或宿主细胞。

本发明的另一个特定目标是接种家禽的方法，包括在孵化后第1天或第2天给予上文定义的组合物、疫苗、DEV、核酸或宿主细胞。

在另一方面，本发明提供了用于在非人动物中针对一种或多种禽病原体诱导免疫原性或保护性反应的方法，包括向所述非人动物、特别是家禽、更特别是鸡、更特别是幼小的家禽(孵化后第3天或更早)或在胚蛋中给予上文定义的组合物、疫苗、DEV、核酸或宿主细胞。

如实验部分中所示的，本发明的病毒对于接种幼小的家禽(孵化后第1天、第2天或第3天)或对于在胚蛋中接种是特别有利的。事实上，本发明令人惊讶地显示，本发明的病毒在这样的早期给予时是安全的，而天然或野生型DEV是致死的。这样的早期给予，结合由这些病毒引起的免疫早期发生，对于在家禽可基本上暴露于病原体之前诱导早期保护性免疫，是特别有利的。

在此方面，在更一般性的方面，本发明还涉及接种或免疫禽类、特别是家禽、更特别是鸡的方法，所述方法包括向所述禽类在胚蛋中给予编码抗原的减毒DEV。本发明还涉及在禽类、特别是家禽、更特别是鸡中表达外源基因的方法，所述方法包括向所述禽类在胚蛋中给予包含所述外源基因的减毒DEV。本发明还涉及包含外源基因的减毒DEV通过在蛋中给予所述DEV在禽中表达所述基因的用途。本发明还涉及编码抗原的减毒DEV，用于通过在胚蛋中给予所述DEV诱导免疫反应或接种禽。DEV优选地包含失活的内源基因，致使所述DEV减毒和在胚蛋中注射时耐受良好。

本发明还涉及用于免疫禽类的接种试剂盒，其包含有效量的上文所述的多价疫苗和用于向所述禽类给予所述组分的工具。例如，这样的试剂盒包含装有根据本发明的疫苗的注射装置和用于皮内、皮下、肌内或在胚蛋中注射的说明书。或者，试剂盒包含装有根据本发明的疫苗的喷雾剂/气雾剂或滴眼剂装置和用于眼-鼻给予、口服或粘膜给予的说明书。

本发明的其它方面和益处将在以下实验部分中公开，其举例说明了本发明。

实施例

实施例1：野生型DEV在胚蛋或幼小的家禽中的毒力

进行临床研究以探索在以不同的时间表注射时DEV在鸡中的致病性或毒力。更具体地，在胚蛋中(孵化前第3天)、孵化后第1天或孵化后第4天进行注射。使用的DEV是野生型DEV Jansen株。给予的剂量是100或1000pfu/剂。作为对照，在组1中给予PBS溶液。致病性通过孵化后每天测量死亡率评价。

结果在下表中提供。

(1)接种时的日龄

(2)在9日龄至19日龄之间死亡的鸟的数量

上述结果显示，在孵化后第4天注射wtDEV是安全的，具有100％存活率(见组5)。鲜明对比的是，在胚蛋中注射DEV后，100％的鸟到4日龄时死亡，而在胚蛋中注射PBS是安全的。这些结果因此表明，尽管wtDEV可适合于给予成年动物，但令人惊讶地，在幼小动物(孵化后第3天或更小)中或当在胚蛋中给予时，它是致死的。

实施例2：包含失活的UL4基因的DEV的构建

2.1 rpsLneo-DsRed2盒的构建

2.8-kb DNA片段的rpsLneo-DsRed2盒通过PCR反应构建。简言之，进行三个PCR反应。使用引物对SEQ ID NO:1(5’-GGCCTGGTGATGATGGCGGGATCGTTGTAT-3’)和SEQ ID NO:2(5’-CCATGGTGCTGCGCTCAGAAGAACTCGTCA-3’)进行第一个PCR反应，模板为合成的rpsLneo片段(SEQ ID NO:3)。使用引物对SEQ ID NO:4(5’-ACGAGTTCTTCTGAGCGCAGCACCATGGCC-3’)和SEQ ID NO:5(5’-TCGGAGGAGGCCATCCTTAAGAGCTGTAAT-3’)进行第二个PCR反应，模板质粒是pSI哺乳动物表达载体(Promega,Cat#E1721)。使用引物对SEQ ID NO:6(5’-TACAGCTCTTAAGGATGGCCTCCTCCGAGA-3’)和SEQ ID NO:7(5’-GCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAAT-3’)进行第三个PCR反应，模板质粒为pIRES2-DsRed2(Clontech,Cat#632420)。使用来自第一和第二PCR反应的PCR产物的混合物作为模板以及SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5作为引物，进行另一个PCR反应。该PCR产物和来自第三个PCR反应的PCR产物混合，并用引物对SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:7进行最后的PCR反应，产生rpsLneo-DsRed2盒。

2.2.插入盒的构建

通过PCR反应构建rpsLneo-DsRed2盒的DNA片段，其添加了5’和3’末端的鸭肠炎病毒(DEV)UL4区同源序列(各自50bp)至其两个末端(图1)。使用rpsLneo-DsRed2盒作为模板进行PCR反应。使用的引物对是SEQ ID NO:8(5’-ATGCAATCGCATCCGGCAACGTTTATAACTTACACTCTGGGGGGTACCGGGGCCTGGTGATGATGGCGGG-3’)和SEQ ID NO:9(5’-TTAAATGTCTATACCGTTCACTGCAATTGGCTCCTGAGACGTTCCATTGCGCAGTGAAAAAAATGCTTTA-3’)。得到的PCR片段进行电泳和纯化。

2.3.带有rpsLneo-DsRed2基因的重组DEV的构建

在UL4区中带有rpsLneo-DsRed2基因的重组DEV的构建通过同源重组在带有DEV基因组并用0.1μg的插入盒转染的大肠杆菌菌株中进行。使用Gene Pulser Xcell(Bio-RadLaboratories)以1.75kV、25μF和200ohm通过电穿孔进行转染。转染后，将大肠杆菌接种到Luria-Bertani(LB)琼脂板上，和在30℃下孵育过夜。带有包含rpsLneo-DsRed2基因的合适插入片段的大肠杆菌克隆使用扩增rpsLneo-DsRed2基因和DEV基因组的插入位点区之间的区域(接点1，图2)的引物对通过PCR鉴定。引物是SEQ ID NO:10(5’-TGTTTAGCGTTATCCGCCCACTGTGTAAAC-3’)和SEQ ID NO:11(5’-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3’)。修饰的DEV DNA从带有合适的插入片段的大肠杆菌克隆中提取，并使用NucleofectorII(Lonza,Basel,Switzerland)转染至CEF细胞。转染的细胞加入至Leibovitz’s L-15(Life Technologies Corp.,Cat.#41300-39),McCoy’s 5A Medium(Life TechnologiesCorp.,Cat.#21500-061)(1:1)和4％小牛血清[LM(+)培养基]，接种到96-孔组织培养板，然后在37℃下在4-5％CO₂中孵育5-7天，直到DEV细胞病变作用(CPE)变得可见。

2.4.基因组结构的验证

重组DEV/UL4/rpsLneo-DsRed2的基因组结构通过扩增在插入的基因的各端的接点区域(接点1、接点2和接点3；图2)的三个PCR反应验证。用于接点1的PCR反应的引物对描述于实施例2.3。用于接点2的PCR反应的引物对是SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:12(5’-GGGAGTATTCACAAAATAATAAACAAAC-3’)。对于接点3，使用SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12。观察到预期的PCR产物大小，证实了rDEV/UL4/rpsLneo-DsRed2具有预期的基因组结构。

实施例3：由具有失活的UL4基因的重组DEV的外源基因的表达

由重组DEV/UL4/rpsLneo-DsRed2的DsRed2蛋白的表达通过激发DsRed2来证实。使用用重组DEV/UL4/rpsLneo-DsRed2感染的CEF细胞进行DsRed2的激发。简言之，在6-孔板中的CEF细胞用rDEV/UL4/rpsLneo-DsRed2或亲本DEV毒株以大约0.01的多重性感染进行感染。接种后三天，细胞在563nm进行激发。在重组DEV/UL4/rpsLneo-DsRed2的噬斑中仅观察到红色荧光。

实施例4：具有失活的UL4基因的重组DEV的存活力和稳定性

重组DEV/UL4/rpsLneo-DsRed2在CEF细胞中传代15次，并证实了插入的rpsLneo-DsRed2基因的稳定性。每3-4天进行传代。每5次传代，通过荧光显微镜检查rDEV/UL4/rpsLneo-DsRed2的噬斑的红色荧光，并且通过扩增接点区域(接点1、接点2和接点3；图2)的PCR分析，用实施例2.4中所示的引物证实rDEV/UL4/rpsLneo-DsRed2的基因组结构。在所有观察的病毒中都观察到红色荧光和预期的PCR产物大小，证实了rDEV/UL4/rpsLneo-DsRed2保留rpsLneo-DsRed2基因达至少15次传代。

实施例5：在胚蛋中给予

将重组DEV/UL4/rpsLneo-DsRed2或亲本DEV接种至无特定病原体(SPF)鸡或具有母体抗体的市售蛋鸡(白色来亨鸡)的18日龄的胚胎。所有组的胚胎用大约1000pfu/0.1ml的重组DEV/UL4/rpsLneo-DsRed2、亲本DEV或PBS通过20号和1.5英寸针头在胚蛋中接种。孵化的鸡在1和3周龄之间每周抽血。每日观察鸡的与DEV有关的临床迹象，例如抑郁和死亡。孵化后三周，检查鸡的体重增加，和尸体检查，并观察粗略可见的损伤。

(1)在6日龄至8日龄之间死亡的鸟的数量

(2)在10日龄至11日龄之间死亡的鸟的数量

结果显示在上文。尽管几乎所有用亲本DEV接种的鸟死亡，但超过60％的用DEV/UL4/rpsLneo-DsRed2接种的鸟存活。

实施例6：具有失活的UL4基因和在UL27和UL26之间插入的外源基因序列的DEV的构建和在胚蛋中给予

构建具有失活的UL4基因和在UL27和UL26之间插入的外源基因序列的DEV。

6.1.pUC18-KAPEVAC-UL4del的构建

侧接UL5和UL3.5基因的1.0-kb DNA片段的DEV基因组通过PCR反应克隆，在插入位点处添加了SfiI识别位点(图3)。简言之，使用从DEV提取的DNA作为模板，进行两个PCR反应。使用的引物对是SEQ ID NO:14(5’-gcGCATGCACTATAGCGCGCTCACAG-3’)和SEQ ID NO:15(5’-CAGACCTAAAGGTTAGGCCGTCTGTGAATG-3’)，以及SEQ ID NO:16(5’-CATTCACAGACGGCCTAACCTTTAGGTCTG-3’)和SEQ ID NO:17(5’-gcGAATTCCGCAAACTACACAAGTCCG-3’)。使用来自两个之前PCR反应的PCR产物的混合物作为模板以及SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:17作为引物进行另一个PCR反应。在用SphI和EcoRI消化后，将得到的PCR片段克隆至pUC18载体，产生pUC18-KAPEVAC-UL4del(图3)。

6.2.pUC18-KAPEVAC-UL26-BacVP2的构建

侧接UL26和UL27基因的1.0-kb DNA片段的DEV基因组通过PCR反应克隆，在插入位点处添加了SfiI识别位点(图4)。简言之，使用从DEV提取的DNA作为模板，进行两个PCR反应。使用的引物对是SEQ ID NO:18(5’-CGGTCGACACTCCCAGGGGTGAAGC-3’)和SEQ ID NO:19(5’-CGGCCAATAAGGCCAAGAATGCATTCGGCC-3’)，以及SEQ ID NO:20(5’-TGGCCTTATTGGCCGCCGTATGAATTGCGC-3’)和SEQ ID NO:21(5’-GCGAGCTCCTGCAACCACAGACCGC-3’)。使用来自两个之前PCR反应的PCR产物的混合物作为模板以及SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:21作为引物进行另一个PCR反应。在用SalI和SacI消化后将得到的PCR片段克隆至pUC18载体，产生pUC18-KAPEVAC-UL26-SfiI。接着，通过利用质粒pUC18-KAPEVAC-UL26-SfiI构建包含来自标准攻击株的启动子和IBDV VP2基因的同源载体。首先，pUC18-KAPEVAC-UL26-SfiI用SfiI切割，和用PAP去磷酸化。Bac启动子-VP2-STC盒通过BglI消化p45/46bacVP2-STC#11(美国专利号6,764,684)获得，并插入至SfiI-消化的pUC18-KAPEVAC-UL26-SfiI，产生pUC18-KAPEVAC-UL26-BacVP2(图4)。该质粒用于构建DEV/UL4del/UL26/BacVP2。

6.3.具有失活的UL4基因和在UL27和UL26之间插入的外源基因序列的DEV的构建

在带有DEV基因组和转染有0.1μg的pUC18-KAPEVAC-UL4del和pUC18-KAPEVAC-UL26-BacVP2的大肠杆菌菌株中通过同源重组，进行具有失活的UL4基因和在UL27和UL26区之间插入的外源基因序列的重组DEV的构建。使用Gene Pulser Xcell(Bio-RadLaboratories)以1.75kV、25μF和200ohm通过电穿孔进行转染。转染后，将大肠杆菌接种到Luria-Bertani(LB)琼脂板上，和在30℃下孵育过夜。带有包含rpsLneo-DsRed2基因的合适的插入序列的大肠杆菌克隆通过PCR鉴定，使用扩增UL3.5和UL5基因之间的区域(接点4；图4)或Bac-VP2基因和DEV基因组的插入位点区之间的区域(接点1,图4)的引物对。对于接点4的引物是SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:17，以及对于接点1的引物是SEQ ID NO:22(5’-GACGCTATACCCAATGACGATGAAAAC-3’)和SEQ ID NO:23(5’-GAGCAACTTCGAGCTGATCC-3’)。修饰的DEV DNA从带有合适的插入序列的大肠杆菌克隆提取，并使用Nucleofector II转染至CEF细胞。转染的细胞加入至LM(+)培养基，接种到96-孔组织培养板，然后在37℃在4-5％CO₂中孵育5-7天，直到DEV CPE变得可见。

6.4.基因组结构的验证

重组DEV/UL4del/UL26/BacVP2的基因组结构通过扩增在插入的基因的各末端处的接点区(接点1、接点2、和接点3；图4)的四个PCR反应进行验证。在对于接点1和接点4的PCR反应中使用的引物对描述于实施例6.3。在对于接点2的PCR反应中使用的引物对是SEQID NO:24(5’-GTACTGCCCGGCCGGTCTAATG-3’)和SEQ ID NO:25(5’-GCCAGGGAATCCAGGGAAAAAGAC-3’)。对于接点3，使用SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:24。观察到预期的PCR产物大小，证实了rDEV/UL4del/BacVP2具有预期的基因组结构。

6.5.在胚蛋中给予

在DOA 3向18日龄的鸡胚胎在胚蛋中给予1000噬斑形成单位的rDEV/UL4del/UL26/BacVP2或亲本KAPEVAC病毒。孵化后观察鸟类的临床迹象35天。17只鸟的结果显示了大于80％的存活率。

实施例7：具有失活的UL4基因和失活的UL23基因的DEV的构建和在胚蛋中给予构建具有失活的UL4和UL23基因和外源基因的DEV。

7.1.pUC18-KAPEVAC-UL23-BacVP2和pUC18-KAPEVAC-UL23-Coa5VP2的构建侧接UL24和UL22基因的1.0-kb DNA片段的DEV基因组通过PCR反应克隆，在插入位点处添加了SfiI识别位点(图5)。简言之，使用从DEV提取的DNA作为模板，进行两个PCR反应。使用的引物对是SEQ ID NO:26(5’-GCGCATGCCAATTGTCTAATTCCAG-3’)和SEQ NO:27(5’-CCCGGCCAATAAGGCCACAGAAAAAGCGCG-3’)，以及SEQ ID NO:28(5’-CTGTGGCCTTATTGGCCGGGATCTGGAAC-3’)和SEQ ID NO:29(5’-GCGAATTCATGTGCTACGCCCAG-3’)。使用来自两个之前PCR反应的PCR产物的混合物作为模板以及SEQ ID NO:26和SEQ IDNO:29作为引物进行另一个PCR反应。在用EcoRI和SphI消化后将得到的PCR片段克隆至pUC18载体，产生pUC18-KAPEVAC-UL23del-SfiI。接着，包含启动子和VP2-STC的同源载体通过使用质粒pUC18-KAPEVAC-UL23del-SfiI构建。首先，pUC18-KAPEVAC-UL23del-SfiI用SfiI切割和用PAP去磷酸化。Bac-VP2盒从质粒pUC18-KAPEVAC-UL26-BacVP2通过SfiI消化获得，并且插入至SfiI-消化连接的pUC18-KAPEVAC-UL23del-SfiI，产生pUC18-KAPEVAC-UL23-BacVP2(图5)。此外，pUC18-KAPEVAC-UL23-Coa5VP2通过使用pUC18-KAPEVAC-UL23-SfiI构建。Coa5启动子通过BglI和XbaI消化获自质粒pGICOA(美国专利号6,866,852)，并与p45/46bacVP2-STC#11(美国专利号6,764,684)的XbaI-EcoRI片段(6.3-kb)和EcoRI-BglI片段(0.1-kb)连接，产生p45/46COA5VP2-STC#11。Coa5启动子-VP2-STC盒然后从p45/46COA5VP2-STC#11通过BglI消化切下，并与SfiI-消化的pUC18-KAPEVAC-UL23del-SfiI连接，产生pUC18-KAPEVAC-UL23del-Coa5VP2(图5)。

7.2.pUC18-KAPEVAC-UL26-Coa5VP2的构建

pUC18-KAPEVAC-UL26-Coa5VP2通过使用SfiI-消化的pUC18-KAPEVAC-UL26-SfiI构建。Coa5-VP2盒通过SfiI消化获自pUC18-KAPEVAC-UL23-Coa5VP2并插入至SfiI-消化的pUC18-KAPEVAC-UL26-SfiI，产生pUC18-KAPEVAC-UL26-Coa5VP2(图4)。

7.3.pUC18-KAPEVAC-UL45-Coa5VP2的构建

侧接UL45和UL46基因的1.0-kb DNA片段的DEV基因组通过PCR反应克隆，在插入位点处添加了SfiI识别位点(图6)。简言之，使用从DEV提取的DNA作为模板，进行两个PCR反应。使用的引物对是SEQ ID NO:30(5’-CGGTCGACATAGAACGCGCTTCATCTAA-3’)和SEQ ID NO:31(5’-TGGCCAATAAGGCCGTTTATTGTTTATTAT-3’)，以及SEQ ID NO:32(5’-CGGCCTTATTGGCCAATCTGATTCATCCAA-3’)和SEQ ID NO:33(5’-GCGAGCTCCGCCTAATCACAATCGGTATTG-3’)。使用来自两个之前PCR反应的PCR产物的混合物作为模板以及SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:33作为引物，进行另一个PCR反应。在用SalI和SacI消化后将得到的PCR片段克隆至pUC18载体，产生pUC18-KAPEVAC-UL45-SfiI。接着，包含来自标准攻击株的启动子和IBDV VP2基因的同源载体通过使用质粒pUC18-KAPEVAC-UL45-SfiI构建。首先，pUC18-KAPEVAC-UL45-SfiI用SfiI切割，和用PAP去磷酸化。Coa5启动子-VP2-STC盒从pUC18-KAPEVAC-UL23del-Coa5VP2通过SfiI消化切下，并与SfiI-消化的pUC18-KAPEVAC-UL45-SfiI连接，产生pUC18-KAPEVAC-UL45-Coa5VP2(图6)。

7.4.pUC18-KAPEVAC-UL50-Coa5VP2的构建

侧接UL50和UL51基因的1.0-kb DNA片段的DEV基因组通过PCR反应克隆，在插入位点处添加了SfiI识别位点(图7)。简言之，使用从DEV提取的DNA作为模板，进行两个PCR反应。使用的引物对是SEQ ID NO:34(5’-CCGCATGCGCAACTATATATGTCGGTC-3’)和SEQ ID NO:35(5’-GGGCCAATAAGGCCCAAAAGTACATTTTGT-3’)，以及SEQ ID NO:36(5’-GGGCCTTATTGGCCCAATTTATTTACTATT-3’)和SEQ ID NO:37(5’-GCGAATTCTGGATATGATATACCGTTGC-3’)。使用来自两个之前PCR反应的PCR产物的混合物作为模板以及SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:37作为引物进行另一个PCR反应。在用EcoRI和SphI消化后将得到的PCR片段克隆至pUC18载体，产生pUC18-KAPEVAC-UL50-SfiI。接着，包含来自标准攻击株的启动子和IBDV VP2基因的同源载体通过使用质粒pUC18-KAPEVAC-UL50-SfiI构建。首先，pUC18-KAPEVAC-UL50-SfiI用SfiI切割，和用PAP去磷酸化。Coa5启动子-VP2-STC盒从pUC18-KAPEVAC-UL23del-Coa5VP2通过SfiI消化切下，并与SfiI-消化的pUC18-KAPEVAC-UL50-SfiI连接，产生pUC18-KAPEVAC-UL50-Coa5VP2。该质粒用于构建DEV/US4US5del/UL50/Coa5VP2(图7)。

7.5.pUC18-KAPEVAC-UL23del的构建

侧接UL24和UL22基因的1.0-kb DNA片段的DEV基因组通过PCR反应克隆，在插入位点处添加了SfiI识别位点(图5)。简言之，使用从DEV提取的DNA作为模板，进行两个PCR反应。使用的引物对是SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:38(5’-CTTGTTCCAGATCCCACAGAAAAAGCGCG-3’)，以及SEQ ID NO:39(5’-CGCGCTTTTTCTGTGGGATCTGGAACAAG-3’)和SEQ ID NO:29。使用来自两个之前PCR反应的PCR产物的混合物作为模板以及SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:29作为引物进行另一个PCR反应。在用EcoRI和SphI消化后将得到的PCR片段克隆至pUC18载体，产生pUC18-KAPEVAC-UL23del(图5)。

7.6.具有失活的UL4和UL23基因和外源基因序列的DEV的构建

在带有DEV基因组和转染有0.1μg的pUC18-KAPEVAC-UL4del和pUC18-KAPEVAC-UL23-BacVP2(对于JK015)；pUC18-KAPEVAC-UL4del、pUC18-KAPEVAC-UL23del和pUC18-KAPEVAC-UL26-Coa5VP2(对于JK022)；pUC18-KAPEVAC-UL4del、pUC18-KAPEVAC-UL23del和pUC18-KAPEVAC-UL45-Coa5VP2(对于JK023)；或pUC18-KAPEVAC-UL4del、pUC18-KAPEVAC-UL23del和pUC18-KAPEVAC-UL50-Coa5VP2(对于JK024)的大肠杆菌菌株中，通过同源重组进行具有失活的UL4和UL23基因和外源基因序列的重组DEV的构建。按上所述进行转染，和具有失活的UL4和UL23基因和外源基因序列的DEV得到拯救(JK022-JK024)。

JK015、JK022、JK023和JK024得到成功拯救。

7.7.生长速率

评估这些DEV的生长速率，并且结果提供如下：

DEV	缺失位点	插入位点	贮液效价
				JK022	UL4,UL23	UL26/27	9.6x10E4
JK023	UL4,UL23	UL45/46	8.5x10E4
				JK024	UL4,UL23	UL50/51	6.1x10E4
JK025	UL4,UL23,US7	UL23	1.57x10E4

7.8.在胚蛋中给予

在DOA 3向18日龄的鸡胚胎在胚蛋中给予1000噬斑形成单位的以下DEV或亲本KAPEVAC病毒。孵化后观察鸟的临床迹象35天。结果在下表中显示：

在该试验中，用rDEV/UL4del/UL23/BacVP2接种的大多数鸡在观察期间存活，而用亲本DEV毒株接种的所有鸡死亡。

实施例8：具有失活的UL4基因和失活的US7基因的DEV的构建和在胚蛋中给予构建具有失活的UL4和US7基因和外源基因的DEV。

8.1.pUC18-KAPEVAC-US7-BacVP2的构建

侧接US6和US8基因的0.6-kb DNA片段的DEV基因组通过PCR反应克隆，在插入位点处添加了SfiI识别位点(图8)。简言之，使用从DEV提取的DNA作为模板，进行两个PCR反应。使用的引物对是SEQ ID NO:40(5’-gcGCATGCCCACCCATAGCCTATTAC-3’)和SEQ NO:41(5’-TATGATTGACTGTTTGCCTTTCATTAACATCCAAATATATTTGTACATGAGGTAATAGGCTATGGGTGCCTTATTGGCCA-3’)，以及SEQ ID NO:42(5’-AACAGTCAATCATAACAAAAACATTTACTTTTAGTCATACTGATGTGAATTAggccttattggccTTCTATTTTTGAAAC-3’)和SEQ ID NO:43(5’-gcGAATTCATGACCATGGACATGC-3’)。使用来自两个之前PCR反应的PCR产物的混合物作为模板以及SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:43作为引物进行另一个PCR反应。在用EcoRI和SphI消化后将得到的PCR片段克隆至pUC18载体，产生pUC18-KAPEVAC-US7del-SfiI。接着，包含启动子和VP2-STC的同源载体通过使用质粒pUC18-KAPEVAC-US7del-SfiI构建。首先，pUC18-KAPEVAC-US7del-SfiI用SfiI切割，和用PAP去磷酸化。Bac-VP2盒通过SfiI消化获自质粒pUC18-KAPEVAC-UL26-BacVP2并插入至SfiI-消化连接的pUC18-KAPEVAC-US7del-SfiI，产生pUC18-KAPEVAC-US7-BacVP2(图8)。

8.2.pUC18-KAPEVAC-US7del的构建

侧接US6和US8基因的0.6-kb DNA片段的DEV基因组通过PCR反应克隆(图8)。简言之，使用从DEV提取的DNA作为模板，进行两个PCR反应。使用的引物对是SEQ ID NO:40和SEQNO:44(5’-GTGCGCCATATAGACGTAATTCACATCAG-3’)，以及SEQ ID NO:45(5’-CTGATGTGAATTACGTCTATATGGCGCAC-3’)和SEQ ID NO:43。使用来自两个之前PCR反应的PCR产物的混合物作为模板以及SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:43作为引物，进行另一个PCR反应。在用EcoRI和SphI消化后将得到的PCR片段克隆至pUC18载体，产生pUC18-KAPEVAC-US7del(图8)。

8.3.具有失活的UL4和US7基因和外源基因序列的DEV的构建

在带有DEV基因组和转染有0.1μg的pUC18-KAPEVAC-UL4del和pUC18-KAPEVAC-US7-BacVP2(对于JK016)；pUC18-KAPEVAC-UL4del、pUC18-KAPEVAC-US7del和pUC18-KAPEVAC-UL23del-Coa5VP2(对于JK025)；pUC18-KAPEVAC-UL4del、pUC18-KAPEVAC-US7del和pUC18-KAPEVAC-UL26-Coa5VP2(对于JK026)；pUC18-KAPEVAC-UL4del、pUC18-KAPEVAC-US7del和pUC18-KAPEVAC-UL45-Coa5VP2(对于JK027)；或pUC18-KAPEVAC-UL4del、pUC18-KAPEVAC-US7del和pUC18-KAPEVAC-UL50-Coa5VP2(对于JK028)的大肠杆菌菌株中，通过同源重组进行具有失活的UL4和US7基因和外源基因序列的重组DEV的构建。按上所述进行转染，并且具有失活的UL4和US7基因和外源基因序列的DEV得到拯救(JK016和JK025-JK028)。

JK016、JK025-JK028被成功构建。

8.4.生长速率

评价这些DEV的生长速率，并且结果提供如下：

DEV	缺失位点	插入位点	贮液效价
				JK025	UL4,UL23,US7	UL23	1.57x10E4
JK026	UL4,US7	UL26/27	5.2x10E4
				JK027	UL4,US7	UL45/46	1.18x10E5
JK028	UL4,US7	UL50/51	2.2x10E5

8.5.在胚蛋中给予

在DOA 3向18日龄鸡胚胎在胚蛋中给予1000噬斑形成单位的以下DEV或亲本KAPEVAC病毒。孵化后观察鸟类的临床迹象35天。结果在下表中显示：

在该试验中，用rDEV/UL4del/US7/BacVP2接种的所有鸡存活35天。

序列表

SEQ ID NO：1 F-rpsL：(5’-GGCCTGGTGATGATGGCGGGATCGTTGTAT-3’)

SEQ ID NO：2 R-SV40启动子-neoR-rpsL：(5’-CCATGGTGCTGCGCTCAGAAGAACTCGTCA-3’)

SEQ ID NO：3 rpsLneo：(5’-

GGCCTGGTGATGATGGCGGGATCGTTGTATATTTCTTGACACCTTTTCGGCATCGCCCTAAAATTCGGCGTCCTCATATTGTGTVAGGACGTTTTATTACGTGTTTACGAAGCAAAAGCTAAAACCAGGAGCTATTTAATGGCAACAGTTAACCAGCTGGTACGCAAACCACGTGCTCGCAAAGTTGCGAAAAGCAACGTGCCTGCGCTGGAAGCATGCCCGCAAAAACGTGGCGTATGTACTCGTGTATATACTACCACTCCTAAAAAACCGAACTCCGCGCTGCGTAAAGTATGCCGTGTTCGTGTGACTAACGGGTTTCGAAGTGACTTCCTACATCGGTGGTGAAGGTCACAACCTGCAGGAGCACTCCGTGATCCTGATCCGTGGCGGTCGTGTTAAAGACCTCCCGGGTGTTCGTTACCACACCGTACGTGGTGCGCTTGACTGCTCCGGCGTTAAAGACCGTAAGCAGGCTCGTTCCAAGTATGGCGTGAAGCGTCCTAAGGCTTAAGGAGGACAATCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGGGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTGTCAAGAVCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGA-3’)

SEQ ID No：4 F-neoR-SV40启动子：(5’-ACGAGTTCTTCTGAGCGCAGCACCATGGCC-3’)

SEQ ID NO：5 R-dsRed-SV40启动子-内含子：(5’-TCGGAGGAGGCCATCCTTAAGAGCTGTAAT3’)

SEQ ID NO：6 F-SV40启动子-内含子1-dsRed：(5’-TACAGCTCTTAAGGATGGCCTCCTCCGAGA-3’)

SEQ ID NO：7 R-SV40polyA-dsRed：(5’-GCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTTGTGAAAT-3’)

SEQ ID NO：8 F-DEV-UL4-rpsLneo：(5’-

ATGCAATCGCATCCGGCAACGTTTATAACTTACACTCTGGGGGGTACCGGGGCCTGGTGATGATGGCGGG-3’)

SEQ ID NO：9 R-DEV-UL4-rpsLncoSV40DsRed：(5’-

TTAAATGTCTATACCGTTCACTGCAATTGGCTCCTGAGACGTTCCATTGCGCAGTGAAAAAAATGCTTTA-3’)

SEQ ID No：10 F-VAC-109228：(5’-TGTTTAGGCTTATCCGCCCACTGTGTAAAC-3’)

SEQ ID NO：11 R-nco：(5’-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3’)

SEQ ID NO：12 R-VAC-110144：(5’-GGGAGTATTCACAAAATAATAAACAAAC-3’)

SEQ ID No：13 DEV Jansen株的UL4基因序列：(5’-ATGCAATCGCATCCGGCAACGTTTATAACTTACACTCTGGGGGGTACCGGTGCTTCGCATACGTGGACTGTTCCAGAATATGAACAAGTGATCTGTTCGTGCGATGGAGGATCGAGATCTGTTCTGGTCGGGAACAAGACACGCTGTGACAAACTCCCTCCGTGTAATGTTATTATTCAACGCGGCCCTCTTGGGACTCTATTCGTCGTAGATATTGGGTATGCAATATATTCCTATATGCTACGTTGTGATCTAAAAAAACAACAGGTCGGTACATTATCAGCTTCACCTGGTTCATTATATGTAGTTCCGTTTACATCATGTACCGTAGTCGGAGTAGATAGCTACATCCGCAGTGACTCTAGTGGTGTATTAACGATTGCATGGTCTCATAATACAGTGCATATAACAATAACTGTATATGGTCTGTCGGAAGAGTCTCAGCGCATGGCAAGCGTTTCGGCCATATCTACTGTCGGGCAAGACTATGAAAATCTTCAGGATATAGCCAACCAAGAGCAAAGTGAAGATTTACTATCTGCTGCAATAAAAGAAGCTAATATTGGTGTCGACTACATATCAGATAGTGAGTCGTCATCTAGAACGGTTATGGACGACTTACTAACTTCTATTCAAGATGAATGCCTAGAGACGGCCGACTGCTTCTGCAATGGAACGTCTCAGGAGCCAATTGCAGTGAACGGTATAGACATTTAA-3’)

SEQ ID NO：14 F-Sphl-KAPEVAC-111150：(5’-gcGCATGCACTATAGCGCGCTCACAG-3’)

SEQ ID NO：15 R-KAPEUL4del：(5’-CAGACCTAAAGGTTAGGCCGTCTGTGAATG-3’)

SEQ ID NO：16 F-KAPEUL4del：(5’-CATTCACAGACGGCCTAACCTTTAGGTCTG-3’)

SEQ ID NO：17 R-EcoRI-KAPEVAC-112880：(5’-gcGAATTCCGCAAACTACACAAGTCCG-3)

SEQ ID NO：18 F-Sall-VAC68400：(5’-CGGTCGACACTCCCAGGGGTGAAGC-3’)

SEQ ID NO：19 R-Sfil-UL26-27-插入序列：(5’-CGGCCAATAAGGCCAAGAATGCATTCGGCC-3’)

SEQ ID No：20 F-Sfil-UL26-27-插入序列：(5’-TGGCCTTATTGGCCGCCGTATGAATTGCGC-3’)

SEQ ID NO：21 R-Sacl-VAC69400：(5’-GCGAGCTCCTGCAACCACAGACCGC-3’)

SEQ ID NO：22 F-VAC-68351：(5′-GACGGCTATACCCAATGACGATGAAAAC-3’)

SEQ ID NO：23 STC1109S：(5’-GAGCAACTTCGAGCTGATCC-3’)

SEQ ID NO：24 R-VAC68971：(5’-GTACTGCCCGGCCGGTCTAATG-3’)

SEQ ID NO：25 STC201AS：(5’-GCCAGGGAATCCAGGGAAAAAGAC-3’)

SEQ ID NO：26 F-Sph1-KAPEVAC-76350：(5’-GCGCATGCCAATTGTCTAATTCCAG-3’)

SEQ ID NO：27 R-KAPE-UL23dcl-Sfil插入序列：(5’-CCCGGCCAATAAGGCCACAGAAAAAGCGCG-3’)

SEQ ID NO：28 F-KAPE-UL23del-Sfil插入序列：(5′-CTGTGGCCTTATTGGCCGGGATCTGGAAC-3’)

SEQ ID NO：29 R-EcoRI-KAPEVAC-78350：(5’-GCGAATTCATGTGCTACGCCCAG-3’)

SEQ ID NO：30 F-SalI-VAC21300：(5’-CGGTCGACATAGAACGCGCTTCATCTAA-3’)

SEQ ID NO：31 R-Sfil-UL45-46-插入序列：(5’-TGGCCAATAAGGCCGTTTATTGTTTATTAT-3’)

SEQ ID NO：32 F-Stil-UL45-46-插入序列：(5’-CGGCCTTATTGGCCAATCTGATTCATCCAA-3’)

SEQ ID NO：33 R-Sacl-VAC22300：(5’-GCGAGCTCCGCCTAATCACAATCGGTATTG-3’)

SEQ ID NO：34 F-Sphl-VAC12000：(5’-CCGCATGCGCAACTATATATGTCGGTC-3’)

SEQ ID NO：35 R-Sfil-UL50-51-插入序列：(5’-GGGCCAATAAGGCCCAAAAGTACATTTTGT-3’)

SEQ ID NO：36 F-Sfil-UL50-51-插入序列：(5’-GGGCCTTATTGGCCCAATTTATTTACTATT-3’)

SEQ ID NO：37 R-EcoRI-VAC13000：(5’-GCGAATTCTGGATATGATATACCGTTGC-3’)

SEQ ID NO：38 R-KAPE-UL23del：(5’-CTTGTTCCAGATCCCACAGAAAAAGCGCG-3’)

SEQ ID NO：39 F-KAPE-UL23del：(5’-CGCGCTTTTCTGTGGGATCTGGAACAAG-3’)

SEQ ID NO：40 F-Sph1-KAPEVAC-US7del-new：(5’-gcGCATGCCCACCCATAGCCTATTAC-3’)

SEQ ID NO：41 R-KAPEUS7del-Stil插入序列：(5’-

TATGATTGACTGTTTGCCTTTCATTAACATCCAAATATATTTGTACATGAGGTAATAGGCTATGGGTGCCTTATTGGCCA-3’)

SEQ ID NO：42 F-KAPEUS7del-Sfil插入序列：(5’-

AACAGTCAATCATAACAAAAACATTTACTTTAGTCATACTGATGTGAATTAggccttattggccTTCTATTTTTGAAAC-3’)

SEQ ID NO：43 R-EcoRI-KAPEVAC-138100：(5’-gcGAATTCATGACCATGGACATGC-3’)

SEQ ID NO：44 R-KAPE-US7del：(5’-GTGCGCCATATAGACGTAATTCACATCAG-3’)

SEQ ID NO：45 F-KAPE-US7del：(5’-CTGATGTGAATTACGTCTATATGGGGCAC-3’)

序列表

<110> 法国诗华动物保健公司

<120> 鸭肠炎病毒及其用途

<130> B2056

<160> 45

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> F-rpsL

<400> 1

ggcctggtga tgatggcggg atcgttgtat 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> R-SV40启动子-neoR-rpsL

<400> 2

ccatggtgct gcgctcagaa gaactcgtca 30

<210> 3

<211> 1319

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> rpsLneo

<400> 3

ggcctggtga tgatggcggg atcgttgtat atttcttgac accttttcgg catcgcccta 60

aaattcggcg tcctcatatt gtgtgaggac gttttattac gtgtttacga agcaaaagct 120

aaaaccagga gctatttaat ggcaacagtt aaccagctgg tacgcaaacc acgtgctcgc 180

aaagttgcga aaagcaacgt gcctgcgctg gaagcatgcc cgcaaaaacg tggcgtatgt 240

actcgtgtat atactaccac tcctaaaaaa ccgaactccg cgctgcgtaa agtatgccgt 300

gttcgtctga ctaacggttt cgaagtgact tcctacatcg gtggtgaagg tcacaacctg 360

caggagcact ccgtgatcct gatccgtggc ggtcgtgtta aagacctccc gggtgttcgt 420

taccacaccg tacgtggtgc gcttgactgc tccggcgtta aagaccgtaa gcaggctcgt 480

tccaagtatg gcgtgaagcg tcctaaggct taaggaggac aatcatgatt gaacaagatg 540

gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac 600

aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg 660

ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaggac gaggcagcgc 720

ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg 780

aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc 840

accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc 900

ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta 960

ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg 1020

cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg cgcgcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg 1080

tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat 1140

tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc 1200

gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta 1260

tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctga 1319

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> F-neoR-SV40启动子

<400> 4

acgagttctt ctgagcgcag caccatggcc 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> R-dsRed-SV40启动子-内含子

<400> 5

tcggaggagg ccatccttaa gagctgtaat 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> F-SV40启动子-内含子-dsRed

<400> 6

tacagctctt aaggatggcc tcctccgaga 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> R-SV40polyA-dsRed

<400> 7

gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat 30

<210> 8

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> F-DEV-UL4-rpsLneo

<400> 8

atgcaatcgc atccggcaac gtttataact tacactctgg ggggtaccgg ggcctggtga 60

tgatggcggg 70

<210> 9

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> R-DEV-UL4-rpsLneoSV40DsRed

<400> 9

ttaaatgtct ataccgttca ctgcaattgg ctcctgagac gttccattgc gcagtgaaaa 60

aaatgcttta 70

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> F-VAC-109228

<400> 10

tgtttagcgt tatccgccca ctgtgtaaac 30

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> R-neo

<400> 11

tcagaagaac tcgtcaagaa ggc 23

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> R-VAC-110144

<400> 12

gggagtattc acaaaataat aaacaaac 28

<210> 13

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> UL4基因序列

<400> 13

atgcaatcgc atccggcaac gtttataact tacactctgg ggggtaccgg tgcttcgcat 60

acgtggactg ttccagaata tgaacaagtg atctgttcgt gcgatggagg atcgagatct 120

gttctggtcg ggaacaagac acgctgtgac aaactccctc cgtgtaatgt tattattcaa 180

cgcggccctc ttgggactct attcgtcgta gatattgggt atgcaatata ttcctatatg 240

ctacgttgtg atctaaaaaa acaacaggtc ggtacattat cagcctcacc tggttcatta 300

tatgtagttc cgtttacatc atgtaccgta gtcggagtag atagctacat ccgcagtgac 360

tctagtggtg tattaacgat tgcatggtct cataatacag tgcatataac aataactgta 420

tatggtctgt cggaagagtc tcagcgcatg gcaagcgttt cggccatatc tactgtcggg 480

caagactatg aaaatcttca ggatatagcc aaccaagagc aaagtgaaga tttactatct 540

gctgcaataa aagaagctaa tattggtgtc gactacatat cagatagtga gtcgtcatct 600

agaacggtta tggacgactt actaacttct attcaagatg aatgcctaga gacggccgac 660

tgcttctgca atggaacgtc tcaggagcca attgcagtga acggtataga catttaa 717

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 14

gcgcatgcac tatagcgcgc tcacag 26

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 15

cagacctaaa ggttaggccg tctgtgaatg 30

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 16

cattcacaga cggcctaacc tttaggtctg 30

<210> 17

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 17

gcgaattccg caaactacac aagtccg 27

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 18

cggtcgacac tcccaggggt gaagc 25

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 19

cggccaataa ggccaagaat gcattcggcc 30

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 20

tggccttatt ggccgccgta tgaattgcgc 30

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 21

gcgagctcct gcaaccacag accgc 25

<210> 22

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 22

gacgctatac ccaatgacga tgaaaac 27

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 23

gagcaacttc gagctgatcc 20

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 24

gtactgcccg gccggtctaa tg 22

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 25

gccagggaat ccagggaaaa agac 24

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 26

gcgcatgcca attgtctaat tccag 25

<210> 27

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 27

cccggccaat aaggccacag aaaaagcgcg 30

<210> 28

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 28

ctgtggcctt attggccggg atctggaac 29

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 29

gcgaattcat gtgctacgcc cag 23

<210> 30

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 30

cggtcgacat agaacgcgct tcatctaa 28

<210> 31

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 31

tggccaataa ggccgtttat tgtttattat 30

<210> 32

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 32

cggccttatt ggccaatctg attcatccaa 30

<210> 33

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 33

gcgagctccg cctaatcaca atcggtattg 30

<210> 34

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 34

ccgcatgcgc aactatatat gtcggtc 27

<210> 35

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 35

gggccaataa ggcccaaaag tacattttgt 30

<210> 36

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 36

gggccttatt ggcccaattt atttactatt 30

<210> 37

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 37

gcgaattctg gatatgatat accgttgc 28

<210> 38

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 38

cttgttccag atcccacaga aaaagcgcg 29

<210> 39

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 39

cgcgcttttt ctgtgggatc tggaacaag 29

<210> 40

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 40

gcgcatgccc acccatagcc tattac 26

<210> 41

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 41

tatgattgac tgtttgcctt tcattaacat ccaaatatat ttgtacatga ggtaataggc 60

tatgggtgcc ttattggcca 80

<210> 42

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 42

aacagtcaat cataacaaaa acatttactt ttagtcatac tgatgtgaat taggccttat 60

tggccttcta tttttgaaac 80

<210> 43

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 43

gcgaattcat gaccatggac atgc 24

<210> 44

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 44

gtgcgccata tagacgtaat tcacatcag 29

<210> 45

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 引物

<400> 45

ctgatgtgaa ttacgtctat atggcgcac 29

Claims

1.鸭肠炎病毒(DEV)，其中所述病毒具有失活的UL4 基因，其中至少20%的所述UL4 基因序列缺失，或其中所述UL4 基因是间断的。

2.权利要求1的DEV，其中至少50%的所述UL4 基因序列缺失。

3.权利要求1的DEV，其中至少60%的所述UL4 基因序列缺失。

4.权利要求1-3中任一项的DEV，其进一步包含外源核酸。

5.权利要求4的DEV，其中所述外源核酸位于失活的UL4 基因中。

6.前述权利要求1-3和5中任一项的DEV，其中所述病毒包含位于UL4 基因中的外源核酸，所述外源核酸置换了所有或部分的UL4 基因序列。

7.权利要求4的DEV，其中所述外源核酸位于选自以下的插入位点中：UL44 基因、UL27-UL26 基因间区域、UL23 基因、UL45-UL46 基因间区域、UL50-UL51 基因间区域、US4 基因、US5 基因、US7 基因、US7-US8 基因间区域或US10 基因。

8.权利要求4的DEV，其中所述外源核酸编码抗原。

9.权利要求8的DEV，其中所述外源核酸编码来自禽病原体的抗原。

10.权利要求8的DEV，其中所述抗原是禽副粘病毒1 型的抗原性蛋白或肽，甘布罗病病毒的抗原性肽，传染性喉气管炎病毒(ILTV)的抗原性肽，鸡毒支原体的抗原性肽，和禽流感病毒的抗原性肽。

11.权利要求8的DEV，其中所述抗原选自新城疫病毒(NDV)的F蛋白，传染性法氏囊病病毒(IBDV)的VP2 蛋白，ILTV的gB蛋白，鸡毒支原体的40K 蛋白，和禽流感病毒的表面蛋白血凝素(HA)。

12.权利要求8的DEV，其中所述抗原是IBDV 的VP2 蛋白或禽流感病毒的血凝素(HA)蛋白。

13.前述权利要求1-3、5和7-12中任一项的DEV，其中所述DEV 在鸡中是减毒的。

14.核酸分子，其包含前述权利要求1-12中任一项的DEV 的基因组。

15.宿主细胞，其包含权利要求1-13中任一项的DEV 或权利要求14的核酸分子。

16.生产或复制权利要求1-13中任一项的DEV 的方法，包括用权利要求14的核酸分子或用权利要求1 的DEV 感染感受态细胞，和收集DEV。

17.权利要求1-13中任一项的DEV在制备用于接种家禽的疫苗中的用途。

18.权利要求17的用途，用于在家禽中诱导保护性免疫。

19.权利要求17或18的用途，其中所述家禽是鸡。

20.权利要求17或18的用途，其中DEV 通过注射给予。

21.权利要求17或18的用途，其中DEV 在胚蛋中或在孵化后第1 天或第2 天给予。

22.组合物，其包含权利要求1-13中任一项的DEV、权利要求14的核酸或权利要求15的宿主细胞，和药学或兽医学可接受的赋形剂或载体。

23.权利要求22的组合物，其进一步包含佐剂。

24.用于免疫禽的接种试剂盒，其包含以下组分：

a. 有效量的权利要求22或23的组合物，和

b. 用于给予所述组合物至所述禽的工具。