JP6802813B2 - アヒル腸炎ウイルス及びその使用 - Google Patents
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Description
a.有効量の前記組成物、及び
b.前記組成物を当該鳥に投与するための手段
を含むワクチン接種キットを提供する。
本発明は一般的には、弱毒化DEVに、さらには、そのゲノム内の特定の挿入部位に位置する外来遺伝子配列(1または複数)を含むDEVに関する。本発明はまた、このようなDEVを含む組成物に、さらには動物、特に家禽、より詳細には若年の家禽(孵化後第3日もしくはそれ以前、又はインオボ)のワクチン接種のための、それらの使用にも関する。
「ウイルス」の用語は特に、カプシド又はカプセル剤内に封入された核酸分子(例えば、ゲノム)を含むウイルス粒子意味する。「ウイルス」の用語はまた、ウイルスベクター又は単離されたウイルスゲノム意味する。
アヒル腸炎ウイルス(DEV)は、アヒルウイルス性腸炎ウイルス(DVEV)としても公知であり、自然にアヒル及びガチョウに感染する。DEVの全長ヌクレオチド配列が決定されており、オンラインで利用可能である(例えば、JQ673560参照)。ウイルスゲノムは約162Kbを含み、約80の別異のタンパク質をコードしている。DEVの様々な血清型、並びにJansen株、CSC株、CHv株、VAC株、及び2085株などの株が単離されている。
本発明のDEVは、任意の外来核酸、好ましくは任意の外来遺伝子を含み得る。外来遺伝子は、RNA又は生物活性及び/又は免疫原性(例えば、抗原性)のあるタンパク質、ポリペプチド又はペプチドなどの、対象となる任意の産物をコードし得る。好ましい実施形態では、外来遺伝子は、抗原、さらにより好ましくは動物、特に鳥で感染を引き起こすことができる病原性物の抗原から由来するペプチド又はポリペプチドをコードする。鳥で感染を引き起こす病原体の例としては、ウイルス、細菌、真菌、原虫などが挙げられる。免疫原性の(ポリ)ペプチドは、好ましくは当該病原体の表面タンパク質、分泌タンパク質、若しくは構造タンパク質又はそのフラグメントであり得る(これらに由来し得る)。ポリペプチドは、例えば、ウイルス性、原核性、真核性又は合成によるなど、任意の供給源に由来することができる。
本発明の好ましいDEVは、全UL4遺伝子の欠失を含む。
・UL44遺伝子配列の少なくともヌクレオチド100〜ヌクレオチド1200の欠失、
・UL23遺伝子配列の少なくともヌクレオチド100〜ヌクレオチド1000の欠失、
・US4遺伝子配列の少なくともヌクレオチド100〜ヌクレオチド1300の欠失、
・US5遺伝子配列の少なくともヌクレオチド100〜ヌクレオチド1100の欠失、
・US7遺伝子配列の少なくともヌクレオチド100〜ヌクレオチド1000の欠失、及び/若しくは
・US10遺伝子配列の少なくともヌクレオチド100〜ヌクレオチド800の欠失、又はこれらの組み合わせ。
本発明はまた、不活性UL4遺伝子を有するDEVのゲノムを含む核酸分子にも関する。このような核酸は、一本鎖又は二本鎖の、DNA又はRNAであり得る。特定の実施形態では、核酸は先に定義したようなDEVのゲノムを含むDNA分子である。
本発明のリコンビナントウイルスは、任意のコンピテント細胞培養において増殖され得る。ウイルスの必要とされる成長が成し遂げられた後は、細胞をスクレーパーを使用して又はトリプシンでウェルから剥離させてもよく、そして感染細胞は遠心分離により上清から分離されてもよい。
本発明はまた、一以上の本発明のDEVを含む、ワクチンなどの組成物にも関する。
臨床研究を実施して、異なるタイムスケジュールでの注射に際した、ニワトリでのDEVの病原性又は病原力(virulence)を検討した。さらに詳細には、インオボ(孵化前第3日)、孵化後第1日、又は孵化後第4日に、注射を実施した。使用したDEVは、野生型DEV Jansen株であった。投与された用量は、100又は1000pfu/投与分のいずれかであった。コントロールとして、グループ1ではPBS溶液が投与された。病原性は、孵化後毎日、死亡率を測定することによって評価された。
rpsLneo-DsRed2カセットの2.8kbのDNAフラグメントをPCR反応によって構築した。手短に説明すると、3種のPCR反応を行った。第一のPCR反応は、配列番号:1(5’-GGCCTGGTGATGATGGCGGGATCGTTGTAT-3’)及び配列番号:2(5’-CCATGGTGCTGCGCTCAGAAGAACTCGTCA-3’)のプライマー対を使用し、rpsLneoの合成フラグメントの鋳型(配列番号:3)を用いて行われた。第二のPCR反応は、配列番号:4(5’-ACGAGTTCTTCTGAGCGCAGCACCATGGCC-3’)及び配列番号:5(5’-TCGGAGGAGGCCATCCTTAAGAGCTGTAAT-3’)のプライマー対を使用し、pSI哺乳類の発現ベクターの鋳型プラスミド(Promega、カタログ番号E1721)を用いて行われた。第三のPCR反応は、配列番号:6(5’-TACAGCTCTTAAGGATGGCCTCCTCCGAGA-3’)及び配列番号:7(5’-GCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAAT-3’)のプライマー対を使用し、pIRES2-DsRed2の鋳型プラスミド(Clontech、カタログ番号632420)を用いて行われた。第一及び第二のPCR反応からのPCR産物の混合物を鋳型とし、配列番号:1及び配列番号:5をプライマーとして用いて別のPCR反応を行った。このPCR産物と第三のPCR反応からのPCR産物を混合して、配列番号:1及び配列番号:7のプライマー対を用いた最終PCR反応に用い、結果としてrpsLneo-DsRed2カセットを得た。
5’及び3’両端のアヒル腸炎ウイルス(DEV)UL4領域相同配列(各50bp)を両端に付加したrpsLneo-DsRed2カセットのDNAフラグメントをPCR反応によって構築した(図1)。PCR反応は、rpsLneo-DsRed2カセットを鋳型として使用して行われた。使用されたプライマー対は配列番号:8(5’-ATGCAATCGCATCCGGCAACGTTTATAACTTACACTCTGGGGGGTACCGGGGCCTGGTGATGATGGCGGG-3’)及び配列番号:9(5’-TTAAATGTCTATACCGTTCACTGCAATTGGCTCCTGAGACGTTCCATTGCGCAGTGAAAAAAATGCTTTA-3’)である。得られたPCRフラグメントは電気泳動にかけられ精製された。
DEVゲノムを担持しており、0.1μgの挿入カセットでトランスフェクションされたE. coli.株における相同組換えにより、UL4領域にrpsLneo-DsRed2遺伝子を担持しているリコンビナントDEVの構築を行った。トランスフェクションは、Gene Pulser Xcell(Bio-Rad Laboratories)を使用して1.75kV、25μF、及び200ohmでエレクトロポレーションにより行った。トランスフェクションの後、E. coli.をLuria-Bertani(LB)寒天板上に播種し、30℃で一晩インキュベーションした。rpsLneo-DsRed2遺伝子を含む適切なインサートを担持しているE. coli.クローンを、DEVゲノムの挿入部位領域とrpsLneo-DsRed2遺伝子との間の領域(ジャンクション1、図2)を増幅するプライマー対を使用したPCRによって同定した。プライマーは、配列番号:10(5’-TGTTTAGCGTTATCCGCCCACTGTGTAAAC-3’)及び配列番号:11(5’-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3’)である。修飾されたDEV DNAを、適切なインサートを担持しているE. coli.クローンから抽出し、Nucleofector II(Lonza, Basel, Switzerland)を使用してCEF細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞をLeibovitz’s L-15(Life Technologies Corp., カタログ番号41300-39)、McCoy’s 5A培地(Life Technologies Corp., カタログ番号21500-061)(1:1)及び4%子ウシ血清[LM(+)培地]に添加して、96ウェル組織培養プレートに播種し、次いで37℃で4〜5%CO2にて5〜7日間、DEV細胞変性効果(CPE)が視認できるようになるまでインキュベーションした。
挿入された遺伝子の各端部でジャンクション領域(ジャンクション1、ジャンクション2、及びジャンクション3;図2)を増幅する3種のPCR反応によって、リコンビナントDEV/UL4/rpsLneo-DsRed2のゲノム構造を確認した。ジャンクション1に対するPCR反応で使用されるプライマー対を実施例2.3に記載する。ジャンクション2に対するPCR反応で使用されるプライマー対は、配列番号:6及び配列番号:12(5’-GGGAGTATTCACAAAATAATAAACAAAC-3’)である。ジャンクション3に対しては、配列番号:10及び配列番号:12が使用される。PCR産物の予測サイズが観察され、rDEV/UL4/rpsLneo-DsRed2は予測されたゲノム構造を有していたことを確認した。
リコンビナントDEV/UL4/rpsLneo-DsRed2によるDsRed2タンパク質の発現を、DsRed2に対する刺激(excitation)によって確認した。DsRed2に対する刺激は、リコンビナントDEV/UL4/rpsLneo-DsRed2で感染されたCEF細胞を使用して行われた。手短に説明すると、rDEV/UL4/rpsLneo-DsRed2又はその親DEV株で6ウェルプレート中のCEF細胞を約0.01の感染多重度にて感染させた。接種後3日目に、細胞を563nmで刺激した。赤色蛍光は、リコンビナントDEV/UL4/rpsLneo-DsRed2のプラーク中でのみ観察された。
リコンビナントDEV/UL4/rpsLneo-DsRed2をCEF細胞中で15回継代させ、rpsLneo-DsRed2の挿入された遺伝子の安定性を確認した。継代は3〜4日ごとに行った。5継代ごとに、rDEV/UL4/rpsLneo-DsRed2のプラークを蛍光顕微鏡により赤色蛍光につきチェックし、rDEV/UL4/rpsLneo-DsRed2のゲノム構造は実施例2.4に示すプライマーを用いてジャンクション領域(ジャンクション1、ジャンクション2、及びジャンクション3;図2)を増幅するPCR分析によって確認した。PCR産物の赤色蛍光及び予測サイズは、観察されたウイルスの全てに観察され、rDEV/UL4/rpsLneo-DsRed2は少なくとも15継代に亘りrpsLneo-DsRed2遺伝子を保持することが確認された。
リコンビナントDEV/UL4/rpsLneo-DsRed2又は親DEVを、特定病原体除去(SPF)のニワトリ又は市販層(白色レグホン種)のニワトリの18日齢胚へと、母系の抗体と共に接種した。胚の全グループが、20ゲージ及び1.5インチの針を介して約1000pfu/0.1mLのリコンビナントDEV/UL4/rpsLneo-DsRed2、親DEV又はPBSでインオボのワクチン接種を受けた。1週齡から3週齡の間の各週に、孵化されたニワトリは採血された。ニワトリは、機能低下及び死などのDEVに伴う臨床徴候につき、毎日観察される。孵化後3週間、ニワトリの、体重増加についての検査、及び剖検、及び肉眼で見て観察可能な病変についての観察が行なわれる。
不活性UL4遺伝子、及びUL27とUL26との間に挿入された外来遺伝子配列を有するDEVを構築した。
UL5遺伝子及びUL3.5遺伝子に隣接しているDEVゲノムの1.0kbのDNAフラグメントを、挿入部位にSfiI認識部位を付加してPCR反応によりクローニングした(図3)。手短に説明すると、DEVから抽出されたDNAを鋳型として使用して、2種のPCR反応を行った。使用されたプライマー対は、配列番号:14(5’-gcGCATGCACTATAGCGCGCTCACAG-3’)及び配列番号:15(5’-CAGACCTAAAGGTTAGGCCGTCTGTGAATG-3’)、及び配列番号:16(5’-CATTCACAGACGGCCTAACCTTTAGGTCTG-3’)及び配列番号:17(5’-gcGAATTCCGCAAACTACACAAGTCCG-3’)である。前記2種のPCR反応からのPCR産物の混合物を鋳型とし、配列番号:14及び配列番号:17をプライマーとして使用して別のPCR反応を行った。得られたPCRフラグメントはSphI及びEcoRIでの消化後にpUC18ベクターへとクローニングされ、結果としてpUC18-KAPEVAC-UL4delが得られた(図3)。
UL26遺伝子及びUL27遺伝子に隣接しているDEVゲノムの1.0kbのDNAフラグメントを、挿入部位にSfiI認識部位を付加してPCR反応によりクローニングした(図4)。手短に説明すると、DEVから抽出されたDNAを鋳型として使用して、2種のPCR反応を行った。使用されたプライマー対は、配列番号:18(5’-CGGTCGACACTCCCAGGGGTGAAGC-3’)及び配列番号:19(5’-CGGCCAATAAGGCCAAGAATGCATTCGGCC-3’)、及び配列番号:20(5’-TGGCCTTATTGGCCGCCGTATGAATTGCGC-3’)及び配列番号:21(5’-GCGAGCTCCTGCAACCACAGACCGC-3’)である。前記2種のPCR反応からのPCR産物の混合物を鋳型とし、配列番号:18及び配列番号:21をプライマーとして使用して別のPCR反応を行った。得られたPCRフラグメントはSalI及びSacIでの消化後にpUC18ベクターへとクローニングされ、結果としてpUC18-KAPEVAC-UL26-SfiIが得られた。次に、標準的なチャレンジ株からのIBDV VP2遺伝子及びプロモーターを含む相同性ベクターを、プラスミドpUC18-KAPEVAC-UL26-SfiIを利用することによって構築した。先ず、SfiIを用いてpUC18-KAPEVAC-UL26-SfiIを切断し、PAPを用いて脱リン酸化させた。p45/46bacVP2-STC#11のBglI消化によりBacプロモーター-VP2-STCカセットを得て(U.S. Pat. No. 6,764,684)、SfiIで消化されたpUC18-KAPEVAC-UL26-SfiIへと挿入し、結果としてpUC18-KAPEVAC-UL26-BacVP2を得た(図4)。このプラスミドを使用してDEV/UL4del/UL26/BacVP2を構築した。
DEVゲノムを担持しており、0.1μgのpUC18-KAPEVAC-UL4del及びpUC18-KAPEVAC-UL26-BacVP2でトランスフェクションされたE. coli.株における相同組換えにより、不活性UL4遺伝子、及びUL27とUL26との間の領域に挿入された外来遺伝子配列を有するリコンビナントDEVの構築を行った。トランスフェクションは、Gene Pulser Xcell(Bio-Rad Laboratories)を使用して1.75kV、25μF、及び200ohmでエレクトロポレーションにより行った。トランスフェクションの後、E. coli.をLuria-Bertani(LB)寒天板上に播種し、30℃で一晩インキュベーションした。rpsLneo-DsRed2遺伝子を含む適切なインサートを担持しているE. coli.クローンを、DEVゲノムのUL3.5遺伝子とUL5遺伝子との間の領域(ジャンクション4;図4)又はBac-VP2遺伝子と挿入部位領域との間の領域(ジャンクション1、図4)を増幅するプライマー対を使用したPCRによって同定した。プライマーは、ジャンクション4に対しては配列番号:14及び配列番号:17、並びにジャンクション1に対しては配列番号:22(5’-GACGCTATACCCAATGACGATGAAAAC-3’)及び配列番号:23(5’-GAGCAACTTCGAGCTGATCC-3’)である。修飾されたDEV DNAを、適切なインサートを担持しているE. coli.クローンから抽出し、Nucleofector IIを使用してCEF細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞をLM(+)培地に添加して、96ウェル組織培養プレートに播種し、次いで37℃で4〜5%CO2にて5〜7日間、DEV CPEが視認できるようになるまでインキュベーションした。
挿入された遺伝子の各端部でジャンクション領域(ジャンクション1、ジャンクション2、及びジャンクション3;図4)を増幅する4種のPCR反応によって、リコンビナントDEV/UL4del/UL26/BacVP2のゲノム構造を確認した。ジャンクション1及びジャンクション4に対するPCR反応で使用されるプライマー対を実施例6.3に記載する。ジャンクション2に対するPCR反応で使用されるプライマー対は、配列番号:24(5’-GTACTGCCCGGCCGGTCTAATG-3’)及び配列番号:25(5’-GCCAGGGAATCCAGGGAAAAAGAC-3’)である。ジャンクション3に対しては、配列番号:22及び配列番号:24が使用される。PCR産物の予測サイズが観察され、rDEV/UL4del/BacVP2は予測されたゲノム構造を有していたことを確認した。
rDEV/UL4del/UL26/BacVP2又は親KAPEVACウイルスの1000プラーク形成単位を、18日齢ニワトリ胚へインオボでDOA3に投与した。トリの臨床徴候を、孵化後35日間観察した。17羽のトリの結果は、80%を超える生存率を示している。
不活性UL4及びUL23遺伝子並びに外来遺伝子を有するDEVを構築した。
UL24遺伝子及びUL22遺伝子に隣接しているDEVゲノムの1.0kbのDNAフラグメントを、挿入部位にSfiI認識部位を付加してPCR反応によりクローニングした(図5)。手短に説明すると、DEVから抽出されたDNAを鋳型として使用して、2種のPCR反応を行った。使用されたプライマー対は、配列番号:26(5’-GCGCATGCCAATTGTCTAATTCCAG-3’)及び配列番号:27(5’-CCCGGCCAATAAGGCCACAGAAAAAGCGCG-3’)、及び配列番号:28(5’-CTGTGGCCTTATTGGCCGGGATCTGGAAC-3’)及び配列番号:29(5’-GCGAATTCATGTGCTACGCCCAG-3’)である。前記2種のPCR反応からのPCR産物の混合物を鋳型とし、配列番号:26及び配列番号:29をプライマーとして使用して別のPCR反応を行った。得られたPCRフラグメントはEcoRI及びSphIでの消化後にpUC18ベクターへとクローニングされ、結果としてpUC18-KAPEVAC-UL23del-SfiIが得られた。次に、プロモーター及びVP2-STCを含む相同性ベクターを、プラスミドpUC18-KAPEVAC-UL23del-SfiIを利用することによって構築した。先ず、SfiIを用いてpUC18-KAPEVAC-UL23del-SfiIを切断し、PAPを用いて脱リン酸化させた。Bac-VP2カセットはプラスミドpUC18-KAPEVAC-UL26-BacVP2からSfiI消化により得られ、SfiIで消化されライゲーションされたpUC18-KAPEVAC-UL23del-SfiIへと挿入され、結果としてpUC18-KAPEVAC-UL23-BacVP2が得られた(図5)。加えて、pUC18-KAPEVAC-UL23-Coa5VP2を、pUC18-KAPEVAC-UL23-SfiIを利用することによって構築した。Coa5プロモーターは、BglI及びXbaI消化によりプラスミドpGICOAから得られ(U.S. Pat. No. 6,866,852)、p45/46bacVP2-STC#11(U.S. Pat. No. 6,764,684)のXbaI-EcoRIフラグメント(6.3kb)及びEcoRI-BglIフラグメント(0.1kb)とライゲーションされ、結果としてp45/46COA5VP2-STC#11が得られた。次いでp45/46COA5VP2-STC#11からBglI消化によりCoa5プロモーター-VP2-STCカセットを切り出し、SfiIで消化されたpUC18-KAPEVAC-UL23del-SfiIとライゲーションされ、結果としてpUC18-KAPEVAC-UL23del-Coa5VP2(図5)が得られた。
SfiIで消化されたpUC18-KAPEVAC-UL26-SfiIを利用することによってpUC18-KAPEVAC-UL26-Coa5VP2を構築した。Coa5-VP2カセットは、pUC18-KAPEVAC-UL23-Coa5VP2からSfiI消化により得られ、SfiIで消化されたpUC18-KAPEVAC-UL26-SfiIへと挿入され、結果としてpUC18-KAPEVAC-UL26-Coa5VP2が得られた(図4)。
UL45遺伝子及びUL46遺伝子に隣接しているDEVゲノムの1.0kbのDNAフラグメントを、挿入部位にSfiI認識部位を付加してPCR反応によりクローニングした(図6)。手短に説明すると、DEVから抽出されたDNAを鋳型として使用して、2種のPCR反応を行った。使用されたプライマー対は、配列番号:30(5’-CGGTCGACATAGAACGCGCTTCATCTAA-3’)及び配列番号:31(5’-TGGCCAATAAGGCCGTTTATTGTTTATTAT-3’)、及び配列番号:32(5’-CGGCCTTATTGGCCAATCTGATTCATCCAA-3’)及び配列番号:33(5’-GCGAGCTCCGCCTAATCACAATCGGTATTG-3’)である。前記2種のPCR反応からのPCR産物の混合物を鋳型とし、配列番号:30及び配列番号:33をプライマーとして使用して別のPCR反応を行った。得られたPCRフラグメントはSalI及びSacIでの消化後にpUC18ベクターへとクローニングされ、結果としてpUC18-KAPEVAC-UL45-SfiIが得られた。次に、標準的なチャレンジ株からのIBDV VP2遺伝子及びプロモーターを含む相同性ベクターを、プラスミドpUC18-KAPEVAC-UL45-SfiIを利用することによって構築した。先ず、SfiIを用いてpUC18-KAPEVAC-UL45-SfiIを切断し、PAPを用いて脱リン酸化させた。pUC18-KAPEVAC-UL23del-Coa5VP2からSfiI消化によりCoa5プロモーター-VP2-STCカセットを切り出し、SfiIで消化されたpUC18-KAPEVAC-UL45-SfiIとライゲーションし、結果としてpUC18-KAPEVAC-UL45-Coa5VP2が得られた(図6)。
UL50遺伝子及びUL51遺伝子に隣接しているDEVゲノムの1.0kbのDNAフラグメントを、挿入部位にSfiI認識部位を付加してPCR反応によりクローニングした(図7)。手短に説明すると、DEVから抽出されたDNAを鋳型として使用して、2種のPCR反応を行った。使用されたプライマー対は、配列番号:34(5’-CCGCATGCGCAACTATATATGTCGGTC-3’)及び配列番号:35(5’-GGGCCAATAAGGCCCAAAAGTACATTTTGT-3’)、及び配列番号:36(5’-GGGCCTTATTGGCCCAATTTATTTACTATT-3’)及び配列番号:37(5’-GCGAATTCTGGATATGATATACCGTTGC-3’)である。前記2種のPCR反応からのPCR産物の混合物を鋳型とし、配列番号:34及び配列番号:37をプライマーとして使用して別のPCR反応を行った。得られたPCRフラグメントはEcoRI及びSphIでの消化後にpUC18ベクターへとクローニングされ、結果としてpUC18-KAPEVAC-UL50-SfiIが得られた。次に、標準的なチャレンジ株からのIBDV VP2遺伝子及びプロモーターを含む相同性ベクターを、プラスミドpUC18-KAPEVAC-UL50-SfiIを利用することによって構築した。先ず、SfiIを用いてpUC18-KAPEVAC-UL50-SfiIを切断し、PAPを用いて脱リン酸化させた。pUC18-KAPEVAC-UL23del-Coa5VP2からSfiI消化によりCoa5プロモーター-VP2-STCカセットを切り出し、SfiIで消化されたpUC18-KAPEVAC-UL50-SfiIとライゲーションし、結果としてpUC18-KAPEVAC-UL50-Coa5VP2が得られた。このプラスミドを使用してDEV/US4US5del/UL50/Coa5VP2を構築した(図7)。
UL24遺伝子及びUL22遺伝子に隣接しているDEVゲノムの1.0kbのDNAフラグメントを、挿入部位にSfiI認識部位を付加してPCR反応によりクローニングした(図5)。手短に説明すると、DEVから抽出されたDNAを鋳型として使用して、2種のPCR反応を行った。使用されたプライマー対は、配列番号:26及び配列番号:38(5’-CTTGTTCCAGATCCCACAGAAAAAGCGCG-3’)、及び配列番号:39(5’-CGCGCTTTTTCTGTGGGATCTGGAACAAG-3’)及び配列番号:29である。前記2種のPCR反応からのPCR産物の混合物を鋳型とし、配列番号:26及び配列番号:29をプライマーとして使用して別のPCR反応を行った。得られたPCRフラグメントはEcoRI及びSphIでの消化後にpUC18ベクターへとクローニングされ、結果としてpUC18-KAPEVAC-UL23delが得られた(図5)。
DEVゲノムを担持しており、0.1μgのpUC18-KAPEVAC-UL4del及びpUC18-KAPEVAC-UL23-BacVP2(JK015用)、0.1μgのpUC18-KAPEVAC-UL4del、pUC18-KAPEVAC-UL23del、及びpUC18-KAPEVAC-UL26-Coa5VP2(JK022用)、0.1μgのpUC18-KAPEVAC-UL4del、pUC18-KAPEVAC-UL23del、及びpUC18-KAPEVAC-UL45-Coa5VP2(JK023用)、又は0.1μgのpUC18-KAPEVAC-UL4del、pUC18-KAPEVAC-UL23del、及びpUC18-KAPEVAC-UL50-Coa5VP2(JK024用)でトランスフェクションされたE. coli.株における相同組換えにより、不活性UL4及びUL23遺伝子並びに外来遺伝子配列を有するリコンビナントDEVの構築を行った。トランスフェクションは先に記載したように行い、不活性UL4及びUL23遺伝子並びに外来遺伝子配列を有するDEVを獲得した(JK022〜JK024)。
これらのDEVの成長速度を評価し、結果を以下に示す。
下記のDEV又は親KAPEVACウイルスの1000プラーク形成単位を、18日齢ニワトリ胚へインオボでDOA3に投与した。トリの臨床徴候を、孵化後35日間観察した。結果を以下の表に示す。
不活性UL4及びUS7遺伝子並びに外来遺伝子を有するDEVを構築した。
US6遺伝子及びUS8遺伝子に隣接しているDEVゲノムの0.6kbのDNAフラグメントを、挿入部位にSfiI認識部位を付加してPCR反応によりクローニングした(図8)。手短に説明すると、DEVから抽出されたDNAを鋳型として使用して、2種のPCR反応を行った。使用されたプライマー対は、配列番号:40(5’-gcGCATGCCCACCCATAGCCTATTAC-3’)及び配列番号:41(5’-TATGATTGACTGTTTGCCTTTCATTAACATCCAAATATATTTGTACATGAGGTAATAGGCTATGGGTGCCTTATTGGCCA-3’)、及び配列番号:42(5’-AACAGTCAATCATAACAAAAACATTTACTTTTAGTCATACTGATGTGAATTAggccttattggccTTCTATTTTTGAAAC-3’)及び配列番号:43(5’-gcGAATTCATGACCATGGACATGC-3’)である。前記2種のPCR反応からのPCR産物の混合物を鋳型とし、配列番号:40及び配列番号:43をプライマーとして使用して別のPCR反応を行った。得られたPCRフラグメントはEcoRI及びSphIでの消化後にpUC18ベクターへとクローニングされ、結果としてpUC18-KAPEVAC-US7del-SfiIが得られた。次に、プロモーター及びVP2-STCを含む相同性ベクターを、プラスミドpUC18-KAPEVAC-US7del-SfiIを利用することによって構築した。先ず、SfiIを用いてpUC18-KAPEVAC-US7del-SfiIを切断し、PAPを用いて脱リン酸化させた。Bac-VP2カセットはプラスミドpUC18-KAPEVAC-UL26-BacVP2からSfiI消化により得られ、SfiIで消化されライゲーションされたpUC18-KAPEVAC-US7del-SfiIへと挿入され、結果としてpUC18-KAPEVAC-US7-BacVP2が得られた(図8)。
US6遺伝子及びUS8遺伝子に隣接している、DEVゲノムの0.6kbのDNAフラグメントをPCR反応によりクローニングした(図8)。手短に説明すると、DEVから抽出されたDNAを鋳型として使用して、2種のPCR反応を行った。使用されたプライマー対は、配列番号:40及び配列番号:44(5’-GTGCGCCATATAGACGTAATTCACATCAG-3’)、及び配列番号:45(5’-CTGATGTGAATTACGTCTATATGGCGCAC-3’)及び配列番号:43である。前記2種のPCR反応からのPCR産物の混合物を鋳型とし、配列番号:40及び配列番号:43をプライマーとして使用して別のPCR反応を行った。得られたPCRフラグメントはEcoRI及びSphIでの消化後にpUC18ベクターへとクローニングされ、結果としてpUC18-KAPEVAC-US7delが得られた(図8)。
DEVゲノムを担持しており、0.1μgのpUC18-KAPEVAC-UL4del及びpUC18-KAPEVAC-US7-BacVP2(JK016用)、0.1μgのpUC18-KAPEVAC-UL4del、pUC18-KAPEVAC-US7del、及びpUC18-KAPEVAC-UL23del-Coa5VP2(JK025用)、0.1μgのpUC18-KAPEVAC-UL4del、pUC18-KAPEVAC-US7del、及びpUC18-KAPEVAC-UL26-Coa5VP2(JK026用)、0.1μgのpUC18-KAPEVAC-UL4del、pUC18-KAPEVAC-US7del、及びpUC18-KAPEVAC-UL45-Coa5VP2(JK027用)、又は0.1μgのpUC18-KAPEVAC-UL4del、pUC18-KAPEVAC-US7del、及びpUC18-KAPEVAC-UL50-Coa5VP2(JK028用)でトランスフェクションされたE. coli.株における相同組換えにより、不活性UL4及びUS7遺伝子並びに外来遺伝子配列を有するリコンビナントDEVの構築を行った。トランスフェクションは先に記載したように行い、不活性UL4及びUS7遺伝子並びに外来遺伝子配列を有するDEVを(JK022〜JK024)を獲得した(JK016、及びJK025-JK028)。
これらのDEVの成長速度を評価し、結果を以下に示す。
下記のDEV又は親KAPEVACウイルスの1000プラーク形成単位を、18日齢ニワトリ胚へインオボでDOA3に投与した。トリの臨床徴候を、孵化後35日間観察した。結果を以下の表に示す。
Claims (26)
- アヒル腸炎ウイルス(DEV)であって、該ウイルスは不活性UL4遺伝子を有するDEV。
- 前記UL4遺伝子が、突然変異、又は欠失、又は割り込みを受けている、請求項1記載のDEV。
- 前記UL4遺伝子配列の少なくとも20%が、欠失されている、請求項2記載のDEV。
- 前記UL4遺伝子配列の少なくとも50%が、欠失されている、請求項2記載のDEV。
- 前記UL4遺伝子配列の少なくとも60%が、欠失されている、請求項2記載のDEV。
- 外来核酸をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項記載のDEV。
- 外来核酸が、不活性UL4遺伝子内に局在する、請求項6記載のDEV。
- 前記ウイルスが、UL4遺伝子配列の全て又は一部に代えて、UL4遺伝子に局在する外来核酸を含む、請求項6又は7記載のDEV。
- 外来核酸が、UL44遺伝子、UL27−UL26遺伝子間領域、UL23遺伝子、UL45−UL46遺伝子間領域、UL50−UL51遺伝子間領域、US4遺伝子、US5遺伝子、US7遺伝子、US7−US8遺伝子間領域、又はUS10遺伝子から選択される挿入部位に局在する請求項6記載のDEV。
- 外来核酸が、抗原又は免疫促進性分子をコードする、請求項6〜9のいずれか一項記載のDEV。
- 外来核酸が、鳥病原体由来の抗原をコードする、請求項10記載のDEV。
- 抗原が、鳥パラミクソウイルス1型抗原性タンパク質又はペプチド、ガンボロ病ウイルスの抗原性タンパク質又はペプチド、伝染性喉頭気管炎ウイルス(ILTV)の抗原性タンパク質又はペプチド、マイコプラズマ・ガリセプチカムの抗原性タンパク質又はペプチド、又は鳥インフルエンザウイルスの抗原性タンパク質又はペプチドから選択される、請求項11記載のDEV。
- 抗原が、ニューカッスル病ウイルス(NDV)又はそのフラグメント、伝染性嚢病ウイルスVP2(IBDV)又はそのフラグメント、伝染性咽頭気管炎ウイルス(ILTV)のgBタンパク質又はそのフラングメント、Mycoplasma galisepticumの40Kタンパク質又はそのフラグメント、及び鳥インフルエンザウイルスの表面タンパク質ヘマグルチニン(HA)又はそのフラグメントから選択される、請求項12記載のDEV。
- 抗原性ペプチドが、IBDVのVP2タンパク質若しくはその免疫原性フラグメント、又はインフルエンザウイルスのヘマグルチニン(HA)タンパク質若しくはそのフラグメントである、請求項13記載のDEV。
- 前記DEVが、ニワトリにおいて弱毒化されている、請求項1〜14のいずれか一項記載のDEV。
- 請求項1〜15のいずれか一項記載のDEVのゲノムを含む、核酸分子。
- 請求項1〜15のいずれか一項記載のDEV又は請求項16記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
- コンピテント細胞に、請求項16記載の核酸分子又は請求項1記載のDEVを感染させ、DEVを回収することを含む、請求項1〜15のいずれか一項記載のDEVを製造又は複製するための方法。
- 家禽へのワクチン接種又は免疫付与に使用するための、請求項1〜15のいずれか一項記載のDEV。
- 家禽において防御免疫を誘導するために使用するための、請求項1〜15のいずれか一項記載のDEV。
- 家禽が、ニワトリである、請求項19又は20記載の使用のためのDEV。
- DEVが、注射により投与される、請求項19〜21のいずれか一項記載の使用のためのDEV。
- DEVが、インオボ又は孵化後第1日若しくは第2日に投与される、請求項19〜22のいずれか一項記載の使用のためのDEV。
- 請求項1〜15のいずれか一項記載のDEV、請求項16記載の核酸分子、又は請求項17記載の宿主細胞、及び薬学的又は獣医学に許容し得る賦形剤又は担体を含む、組成物。
- 佐剤をさらに含む、請求項24記載の組成物。
- 鳥に免疫付与するためのワクチン接種キットであって、以下の成分、
a.有効量の請求項24又は25記載の組成物、及び
b.該組成物を該鳥に投与するための手段
を含むワクチン接種キット。
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