KR20170063552A - 재조합 혈청형 9 조류 아데노바이러스 벡터 형태의 백신 - Google Patents

재조합 혈청형 9 조류 아데노바이러스 벡터 형태의 백신 Download PDF

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KR20170063552A
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베르나르도 로자노-듀베르나드
에르네스토 소토-프리안테
데이비드 사파리-미즈라히
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그루포 인더스트리얼 페쿠아리오 에스.에이. 데 씨.브이.
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Abstract

관심 질환의 적어도 1종의 항원을 암호화하고, 아데노바이러스의 게놈 비-필수 영역을 대체하는, 적어도 1개의 외인성 뉴클레오티드 서열이 삽입된, 혈청형 9 가금 아데노바이러스 벡터(FAdV-9), 및 약학적으로 허용가능한 비히클, 보강제 및/또는 부형제를 포함하는 재조합 백신으로, 관심 질환의 적어도 1종의 항원을 암호화하고 아데노바이러스의 게놈 비-필수 영역을 대체하는 적어도 1개의 외인성 뉴클레오티드 서열이 491-2782 뉴클레오티드에 위치한다.
본 백신의 벡터는 산업용 규모의 생산에 대해 안정적이다. 마찬가지로, 본 백신이 마렉 병에 대한 백신과 병용 투여되더라도, 두 백신 모두 서로 간의 간섭에 영향을 받지 않는 적절한 면역 반응을 생성한다. 동일한 방식으로, 재조합 백신의 유효성은 모체 항체에 의해 영향을 받지 않으며, 단 한 번의 적용만으로 초기 및 지속적인 보호 반응을 유도할 수 있다.

Description

재조합 혈청형 9 조류 아데노바이러스 벡터 형태의 백신{VACCINE IN THE FORM OF A RECOMBINANT SERO TYPE 9 AVIAN ADENOVIRUS VECTOR}
본 발명은 바이러스 벡터에 기초한 백신에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 혈청형-8 가금 아데노바이러스 재조합 벡터에 기초한 백신에 관한 것이다.
아데노바이러스는 선형, 이중 가닥의 DNA 바이러스로, 직경 70-90nm이며, 외피가 없으며, 이십면체형 캡시드를 가지며, 이는 각 20면체의 꼭지점에서 연장되는 240 헥손, 12 펜톤 및 섬유에 의해 형성된다. 이들 헥손, 펜톤 및 섬유는 주류 아데노바이러스 항원 및 이의 혈청형을 결정하는 것들을 나타낸다.
아데노바이러스 게놈은 크기가 약 30-45kb이며 4개의 초기 영역 (E1, E2, E3 및 E4) 및 5개의 후기 영역 (L1-L5)을 갖는다.
아데노바이러스는 서로 다른 종들로부터 단리되어 왔으며, 두 가지 주요 유형은 조류에서 단리된 아비아데노바이러스(Aviadenovirus)와 포유류에서 단리된 마스트아데노바이러스(Mastadenovirus)이다.
아데노바이러스는 매우 감염성이 높고 그들 중 다수는 병원성이 없기 때문에 백신 생산을 위한 재조합 벡터로서 좋은 후보로 여겨지고 있다. 또한, 아데노바이러스 벡터는 대형 유전자를 효율적으로 번역할 수 있으며, 동물에서 면역 반응을 연장시킬 수 있다. 그럼에도 불구하고, 아데노바이러스 특이적 구조는 각 종에 대한 이종 유전자의 특이적 삽입 부위의 연구를 필요로 하며, 재조합 바이러스 벡터로 전환될 때 다양한 공지된 아데노바이러스의 생물학적 거동에 대해 일반화하는 것은 사실상 불가능하다는 것이 또한 알려져 있다.
지금까지, 인간, 유인원, 조류, 돼지, 다른 것들 중에서도, 아데노바이러스는 재조합 백신으로서 잠재적 용도를 위한 벡터로 이용되어 왔다. 특히, 가금 아데노바이러스(fowl adenovirus, FadV)가 재조합 백신 개발을 위한 잠재적인 후보로 알려져 있다. 그럼에도 불구하고, 하기에 기술되는 바와 같이, 상업적 수준, 특히 수의학 산업에서 이들을 성공적으로 이용할 가능성은, 요구되는 안정성을 가지면서 그들의 대규모 생산에 도달할 수 없기 때문에 일반적으로 억제되어 왔는데, 아데노바이러스의 생산이 수율이 전형적으로 매우 낮은 세포주 또는 연속 계대배양에서 바이러스 벡터의 안정성 달성을 방해하는 성질을 갖는 세포주에서 수행되기 때문이며, 이에 따라, 최근에는 조류 아데노바이러스에 벡터화된 백신이 없다는 것을 쉽게 이해할 수 있다.
예를 들어, 국제 공개 공보 WO94/24268에서는 적어도 하나의 이종 뉴클레오티드 서열이 삽입되어 있고 질병에 걸리기 쉬운 조류에서 면역 반응을 일으키는 데 유용한 FAdV 재조합 벡터를 기재하고 있다. 이 문헌에 따르면, 대체되거나 삽입될 이종 유전자에 적합할 수도 있는 아데노바이러스 게놈의 비-필수 영역은, 게놈 우측 말단에 위치하는 것들이고, 바람직하게는 (97 및 99.9 m.u.)의 0.0038 내지 0.0039 사이에 위치하는 영역이다. 이 문서에 따르면, 재조합 백신은 이에 대한 증거가 없어도 마렉 병(Marek's disease)이나 뉴캐슬 병(Newcastle's disease)과 같은 다른 바이러스에 대한 백신과 함께 분명히 활용될 수 있을 것이다. 또한, 이 문서에서는 대규모 생산을 위한 세포주에서 연속 계대배양한 후에 얻어진 아데노바이러스의 거동도 설명하지 않고 있다.
또한, 미국 특허 제6,296,852호에서는 뉴클레오티드 이종 서열을 바이러스 게놈의 비-필수 영역에 삽입하는 혈청형-9 FAdV 벡터 (FAdV-9)가 기재되어 있다. 이 영역은 게놈 좌측 및/또는 우측 말단, 바람직하게는 우 말단(3')에 위치하는 영역, (60 및 100 m.u.)의 0.0023 내지 0.0039 사이에 위치하는 비-암호화 영역일 수 있다. WO94/24268 문서의 경우, 이 특허는 비록 외인성 유전자의 잠재적인 삽입을 위한 또 다른 넓은 영역을 확인하고 있지만, 세포주에서 연속 계대배양한 후에도 그 거동 및 특히 그 온전성을 설명하지는 않는다.
다른 문헌 (Corredor, J. C. 및 Nagy, E., 가금 아데노바이러스 9 게놈의 비-필수 좌측 말단 영역이 외래 유전자 삽입/대체에 적합함. Virus Research, Vol 149, 167-174, 2010)에서, FAdV-9 게놈의 5' 말단 비-필수 영역이, 재조합 벡터를 생산하기 위한 외인성 유전자에 의한 삽입 또는 대체를 위한 적당한 부위일 수도 있음을 개시하고 있다. 예를 들어, 그러한 벡터 중 하나는 491-2782 뉴클레오티드 사이에 위치하는 비-필수 영역을 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP)을 암호화하는 유전자로 대체하여 얻어졌다. 그러나, 이 문헌은 다른 것들과 마찬가지로, 질병의 항원을 암호화하는 외인성 유전자를 삽입할 때 구축물로서 바이러스 벡터가 안정한지 아닌지 여부와, 적합한 세포 시스템에서 복제하여 재조합 벡터를 얻는 지 여부를 나타내지 않는데, 이 문서는 리포터 유전자 발현만을 보여주고 생체 내 분석이 부족하기 때문이며; 그 외에는 관심있는 질병에 대한 조성물이나 보호 수준에 대해서도 언급하지 않고 있다.
알 수 있는 바와 같이, FAdV 게놈의 비-필수 영역이 외인성 뉴클레오티드 서열이 삽입되거나 대체될 수도 있는 잠재적 부위를 나타내는 것으로 알려져 있다. 그러나, 당업계의 기술 분야에 기재된 벡터는 세포 배양에서 다양한 계대 후에 삽입된 이종 유전자의 손실로 인해, 산업적 수준에서 재조합 백신을 생산할 때 불안정하다는 단점이 있다.
또한, 현재 기술 수준에서, 조류 처리, 주로 가금류에 대한 아데노바이러스 벡터의 사용은 조류 산업에 광범위하게 사용되는 백신인, 마렉 병 백신의 간섭으로 인해 회피되었다. 마렉 병(Marek's disease, EM)은 국내 조류에 영향을 미치는 헤르페스바이러스에 의해 유발되는 질환으로, 다리 또는 날개 마비를 유발하는 림프증식성 질환, 및 림프 종양 및 사망을 유발한다. 이 질환을 예방하기 위해서는, 1가 또는 다가 활성 백신이 주로 피하 또는 난 내(in-ovo)로 적용된다.
적용 시점에 비용을 줄이고 효율성을 더 높이기 위해 때로는 적어도 두 가지 백신을 동시에 투여하는 것이 바람직하다. 그러나, 상기 국제 공개 공보 WO94/24268와 같은 문헌이 마렉 백신과 조합하여 아데노바이러스를 이용할 가능성을 시사하고 있지만; 후속 연구에 따르면 아데노바이러스 백신과 마렉 바이러스 백신은 상업적 입장의 암탉과 마찬가지로 조류에 대해 두 질병에 의해 생성된 치사율 및 병변, 바람직하게는 긴 수명이 분석될 때, 심한 현장 간섭을 나타낸다.
현재 현재 아데노바이러스 벡터에서 재조합 백신을 사용하여 EM에 대한 전바이러스 백신을 동시에 적용함으로써, EM에 대한 백신은 다음과 같은 메커니즘으로 인해 재조합 백신을 방해할 지도 모른다: a) 상이한 복제 역학; b) 백신이 조류에서 복제를 위해 동일한 세포 유형에 대해 경쟁한다; 및 c) EM 바이러스가 조류에서 면역억제를 일으킨다. 명백하게, 이러한 간섭을 극복하고, 재조합 백신의 외인성 유전자와 관련된 질환에 대한 효과적인 백신 접종을 달성하기 위해서는, 보다 많은 양의 상기 재조합 백신을 투여하거나, EM에 대한 백신 투여량을 감소시킬 필요가 있다 (Breedlove 등, 조류 인플루엔자 아데노바이러스-벡터 난 내 백신 접종; 표적 배아 조직 및 마렉 병 백신 조합. Avian Disease, 55, 667-673, 2011). 그러나, 동일한 Breedlove’s 등의 참고문헌에 따르면 아데노바이러스 재조합 백신의 용량을 늘리면 효과가 없게 만드는 EM에 대한 백신에 의한 일시적 간섭을 일으켜서, 현장에서 심각한 문제가 발생할 수 있다. 이는 최근까지, 재조합 아데노바이러스 바이러스 벡터를 기반으로 한 백신이 마렉 병 백신이 제공하는 보호를 방해하지 않는 외인성 유전자로 제형화될 수 없었으며 그 반대의 경우도 마찬가지라는 것을 의미한다.
마찬가지로, 모체 항체는 잠재적으로 백신에 간섭을 일으킬 수 있는 또 다른 요소이다. 모체 항체가 신생 동물에 대한 보호를 제공하지만, 이들의 존재는 백신 효과를 저해하거나 감소시켜서 이로 인해 생성된 면역 반응을 비-최적 상태로 만들 수 있다.
일반적으로 백신 개발 과정에서 발견되는 또 다른 도전 과제는 백신에 사용된 수식의 함수로서, 보호 및 상기 보호의 지속이 달성되는 시간이다.
초기 보호를 부여하는 백신은, 즉, 적용하기 시작하는 아주 짧은 시간에, 보호 수준이 급격히 떨어지면서 주기적인 재접종을 필요로 하기 때문에 단기간에 효과가 있을 것이다. 대조적으로, 내구성이 있거나 오래 지속되는 보호를 부여하는 백신은 보호 효과를 달성하는 데 더 오래 시간이 걸리지만, 보호는 오래 지속되며 원하는 보호 효과를 달성하기 위해 일반적으로 재접종을 더 적게 필요로 할 것이다. 일반적으로, 한 그룹의 동물에서 지속적인 보호를 위해서는, 동물이 전체적으로 발병할 수 있는 가능성을 피하기 위해서 후기 보호 백신과 함께 초기 보호 백신을 적용할 필요가 있다.
현재 기술 수준에서, 활성 바이러스 백신은 일반적으로 적용 초기부터 단기간 내에 허용 가능하지만 지속적인 보호 수준을 달성하기 때문에, 신속하거나 초기 보호를 부여하는 것으로 알려져 있다. 반면, 비활성화된 바이러스 백신은 활성 바이러스보다 더 오래 지속되는 보호 기능을 제공하지만, 달성하는 데 오랜 시간이 필요하지 않는다는 사실도 알려져 있다, 즉, 보호가 늦고 많은 경우에 빈번하지는 않지만 재접종 또한 필요하다.
예를 들어, Stine 등 (Evaluation of inactivated newcastle disease, avian diseases, Vol. 24, No. 1 (Jan. - Mar., 1980), pp. 99-111)은 NDV에 대한 세 가지 백신을 평가했다: 에멀젼 내 비활성화 백신, Al(OH)3에 흡착된 비활성화 백신 및 상업용 생백신, 생백신은 비활성화 백신이 발생하기 일주일 전에 닭에서 HI 역가를 생산하는 반면, 에멀젼 내 비활성 백신은 지속적인 면역 반응을 생성한다는 것을 발견했다.
마찬가지로 Folitse 등 (Efficacy of combined killed-in-oil emulsion and alive newcastle disease vaccines in chickens, Avian Diseases, Vol. 42, No. 1 (Jan. - Mar., 1998), pp. 173-178)은 오일 속에 유화된 NDV 비활성화 백신은 활성 백신으로 이전에 백신 접종한 조류에서 높고 지속적인 수준의 순환 항체를 유도한다는 점을 언급하고 있다. 마찬가지로, 동일한 질환에 대한 활성 백신과 함께 NDV 비활성화 백신의 투여시 높은 항체 반응이 얻어지는 이유는 처음에 살아있는 바이러스가 빠르게 복제되어, 1차 면역 반응을 유발하고, 보강 용량과 같이 거동하는 비활성화 백신의 항원의 연속적이지만 느린 방출이 뒤따르기 때문일 수도 있다고 언급하고 있다.
또한, Toro 등(Avian influenza mucosal vaccination in chickens with replication-defective recombinant adenovirus vaccine, Avian Diseases 55:43-47, 2011)은 5일 된 산란계 조류에 적용된 코돈으로 최적화되었으며, 일부 경우에는 15일 되었을 때 재접종을 받은 조류 인플루엔자 H5 유전자를 발현하는 복제에 유망한 아데노바이러스가 없는 재조합 아데노바이러스 백신에 의해 부여된 보호를 평가했다. 그 결과, 다시 백신 접종된 새들 만 높은 항체 역가를 나타내었다. 이 역가는 9일령부터 시작하여 32일령에서 최대치에 도달할 수 있었다.
같은 방식으로, 마렉 바이러스와 마찬가지로, 특별하게도 초기 및 지속적인 보호를 둘 다 제공하는 몇몇 활성 바이러스가 있다. 그럼에도 불구하고 마렉 바이러스는 벡터로 활용될 수 있으며 현재 기술 수준에서 마렉 질환에 대해서는 단 한 번의 적용으로 초기 및 지속적인 보호를 달성하는 것으로 입증했으나, 삽입된 외인성 항원에 대해서는 초기 보호를 달성하지 못하고, 단지 후기 및 지속적인 보호를 달성하는 것을 나타낸다.
현재 기술 수준에서 알 수 있듯이, 아데노바이러스와, 특히 산업적 규모에서 임의의 외인성 유전자를 갖는 조류에 대해서는 조류에 대한 재조합 백신으로서 현재 기술 수준에서 혈청형 9 조류 아데노바이러스 FAdV-9를 성공적으로 이용할 수 없었는데, 비록 다양한 삽입 부위가 기술되었지만, 한편으로는 연속 계대배양 후에 세포주에서의 재생에서 충분한 안정성이 달성되지 못하고, 다른 한편으로는 마렉 병 백신이 아데노바이러스의 작용 메카니즘을 방해하거나 그 반대의 경우라는 사실로 인해, 마렉 병 백신과 함께 아데노바이러스를 사용하는 이유가 현재 기술 수준에서 명시적으로 회피되어 왔다. 또한, 단 한 번의 적용으로 사용되는 바이러스 벡터에 삽입된 외인성 항원에 대해 초기 및 지속적인 보호를 둘 다 달성하는 바이러스 재조합 백신을 수득하는 것이 가능하지 않았다.
선행 기술의 단점을 고려하여, 본 발명의 목적은 혈청형-9 가금 아데노바이러스에서 재조합 백신을 제공하는 것으로, 상기 벡터는 산업적 수준에서 제조될 때 안정적이다.
본 발명의 또 다른 목적은 마렉 병에 대한 백신과 병용 투여되더라도 두 백신이 서로 간의 간섭에 의해 영향을 받지 않는 적절한 면역 반응을 생성하는 재조합 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 효과가 모체 항체에 의해 영향을 받지 않으며 최적의 면역 반응을 유도하는 재조합 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 예방적, 즉 적용 시점부터 시작하여 처음 19일 이내, 그리고 지속적, 즉 적용 후 적어도 90일까지, 보호 반응을 유도하는 재조합 백신을 기대하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 단 한 번의 적용으로 상기 백신에 함유된 바이러스 벡터에 삽입된 외인성 항원과 관련된 질환에 대해 초기 및 지속적인 보호 둘 다 달성하는 재조합 백신을 기대하는 것이다.
본 발명을 개발하는 동안, 적어도 하나의 관심있는 질환 항원을 암호화하고, 특히 491-2782 뉴클레오티드 사이에 위치하는 아데노바이러스의 게놈 비-필수 영역을 대체하는 적어도 하나의 외인성 뉴클레오티드 서열이 삽입된, 혈청형-9 가금 아데노바이러스 벡터 (FAdV-9), 및 약학적으로 허용가능한 담체, 보강제 및/또는 부형제를 포함하는 재조합 백신이, 상기 관심 질환에 대해 적절한 보호를 제공하여, 산업적 규모로 생산될 때 안정적이기도 하다는 것이 밝혀졌는데, 아데노바이러스 벡터가 세포 배양 내에서 연속 계대를 수행할 때 삽입된 외인성 뉴클레오티드 서열을 잃지 않기 때문이다. 마찬가지로, 이 재조합 백신이 마렉 병 전바이러스 백신과 병용 투여되더라도 백신 접종된 조류에서 효능을 잃지 않으며, 이 재조합 백신과 함께 투여되었을 때 마렉 백신도 효능을 잃지 않는다는 것은 놀랍다. 동일한 방식으로, 본 발명의 재조합 백신은 그 효과가 신생 동물에서 모체 항체에 의해 영향을 받지 않으며 단 한 번의 적용으로, 초기 및 지속적인 보호를 제공한다는 장점을 제시한다.
이러한 의미에서, 본 발명의 목적 상 초기 보호는 백신 적용 후부터 시작하여 19일 이내에 달성된 것으로 간주되는 반면, 지속적인 보호는 백신 접종 후 적어도 90일까지 달성된 것으로 간주된다.
사용된 아데노바이러스 벡터는 살아있을 수도 있고(활성) 또는 비활성화된 것일 수도 있다. 생(alive) 또는 활성(active)이란 용어는 재조합 벡터가 그 복제 능력을 유지하는 것을 의미하고, 비활성화는 외인성 뉴클레오티드 서열을 갖는 아데노바이러스 재조합 벡터가 복제 능력을 상실한 것을 의미한다. 재조합 벡터의 비활성화는 포름알데히드 또는 베타-프로피오락톤을 이용한 화학적 비활성화와 같은 당업계의 기술 분야에서 주지된 물리적 또는 화학적 절차를 이용하여 수행된다 (Office International des Epizooties 2008). 뉴캐슬 병(Newcastle Disease). OIE 육상동물에 대한 진단 및 백신 매뉴얼(OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals). 국제 수역 기구(Office International des Epizooties). 프랑스, p. 576-589).
상기 언급한 바와 같이, 사용된 벡터는 임의의 균주를 포함하는 혈청형-9 가금 아데노바이러스 (FAdv-9)이다. 바람직하게는, FAdV-9는 유전자은행 등록번호 EU979376, AF083975, HQ697594, AF508958, AF339923, EU847634, EU847629, EU847628, DQ323986, AY683550, EU847635, NC_000899, 및 AC_000013을 갖는 균주로부터 선택된다.
이제, 외인성 뉴클레오티드 서열에 관해서, 그것은 관심있는 질환의 적어도 한 항원을 암호화하며, 바람직하게는 상기 항원은 조류 인플루엔자, 봉입체를 갖는 간염, 조류 감염성 후두기관염, 뉴캐슬 병, 닭 전염성 파브리시우스 낭병, 전염성 기관지염, 메타뉴모바이러스(metapneumovirus, MPNV) 원인 질환, 마렉 병(Marek 's disease), 조류 감염성 빈혈증 또는 크기가 아데노바이러스 벡터 내 삽입을 허용하는 다른 임의의 유전자로부터 선택된 적어도 하나의 질환의 항원이다. 보다 바람직하게는, 조류 인플루엔자 유전자가 이용된다.
본 발명의 특정 실시예에서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 인플루엔자 바이러스의 18개 혈구응집소 아형 또는 면역원성 변이체로부터 선택된, 조류 인플루엔자 바이러스의 혈구응집소(HA) (더욱 바람직하게는 상기 단백질의 아형 H1, H2, H3, H5, H6, H7 또는 H9 중 적어도 하나를 암호화한다); 봉입체 간염 바이러스의 섬유 및 헥손, 혈청형 4 및 8; 조류 유래 당단백질 B (gB) 및 당단백질 D (gD) 감염성 후두기관염 바이러스 (LTI); 뉴캐슬병 바이러스의 HN 및 F 단백질; 파브리시우스 낭병의 VP2 단백질 바이러스 감염; 감염성 기관지염 바이러스의 S1 및 S2 단백질; 메타뉴모바이러스(MPNV)의 F 단백질; 및 조류에서의 전염성 빈혈의 VP1, VP2 및 VP3 단백질.을 포함하는 군을 암호화하는 유전자로 이루어진다.
마찬가지로, 외인성 뉴클레오티드 서열은 바이러스 벡터로서 이용되는 FAdV-9와는 다른 가금 아데노바이러스의 적어도 하나의 항원을 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명의 관심있는 외인성 유전자를 포함하는 백신 아데노바이러스 벡터는 관심있는 뉴클레오티드 서열을 PCR 증폭시켜서, 나중에 491-2782 뉴클레오티드 사이에 위치한 비-필수 게놈 영역이 제거된 아데노바이러스 벡터 내부에서 이미 증폭시킨 후 삽입할 수 있도록 준비될 수도 있다. 외인성 유전자 삽입 및 아데노바이러스 비-필수 영역의 결실은 분자 생물학에서 표준 클로닝 기술을 사용하여 이루어진다. 이렇게 생산된 전염성 클론은 세포 배양에서 형질감염되어서 재조합 바이러스를 생성시킨다.
항원 반응을 달성하기 위해, 바람직하게는 투여량 당 적어도 105.0DICC 50 %, 보다 바람직하게는 투여량 당 적어도 106.0DICC 50 %를 달성하기 위해서, 적어도 필요한 바이러스 농도에 도달할 때까지, 바이러스는 조류 기원의 불멸화된 간세포 (immortalized liver cells of avian origin, CeLi), 상업적 세포주 또는 아데노바이러스 성장을 위해 특별히 설계된 것과 같이 성장에 적합한 모든 시스템에서 복제한다.
예를 들어, 면역 과산화효소 테스트에 대한 역가가 투여량 당 최소한 106.0DICC50 %에 도달 할 때까지, 재조합 바이러스는 고정식 성장 시스템을 이용하여, 특정 배양 배지로 성장한 CeLi 계통 세포에서, 세포 배양 병에서, 마이크로 담체에서, 대규모 세포 생산 시스템에서 또는 롤러 병 시스템에서 복제할 수 있다. 같은 종류의 세포에서 5번에서 10번까지 블라인드 계대배양을 수행한 후에 이 역가에 도달 할 수 있다. 또한, 수확물을 원심분리하고, 분획화하고, 동결 상태로 유지하여, 소위 마스터 시드(master seed, MS)를 수득할 수도 있다.
마스터 시드를 사용하여, 생산 시드 (production seed, SP)를 만들기 위해 동일한 세포에서 추가 계대배양을 수행하고, 백신 생산을 위해 이로부터 하나 더 사용한다.
본 발명은 관심 항원 질환을 암호화하고, 특히 491-2782 뉴클레오티드 사이에 위치하는 아데노바이러스의 게놈 비-필수 영역을 대체하는, 외인성 뉴클레오티드 서열이 삽입된, 혈청형-9 가금 아데노바이러스 벡터 (FAdV-9)의 마스터 시드를 포함하며; 상기 마스터 시드는 세포 배양에서 6 내지 11회 계대시킨 후에 수득된다.
이제, 백신이 생백신 또는 활성 백신인 실시예에서, 그것은 활성 바이러스, 바람직하게는 자연적으로 비병원성인 조류 아데노바이러스, 또는 병원성이 낮거나, 또는 당 업계의 기술 분야에서 이미 공지된 절차로 약독화된 것으로부터 선택된다. 반면에 백신이 비활성화된 경우, 항원 반응을 얻기 위해 필요한 바이러스 농도에 도달하면, 바이러스의 비활성화가 진행된다. 바람직하게는, 비활성화는 당업계의 기술 분야에서 잘 알려진 물리적 또는 화학적 절차를 통해, 바람직하게는 포름알데히드 또는 베타-프로피오락톤에 의한 화학적 비활성화를 통해 수행된다.
본 발명의 백신이 생백신 또는 활성 백신인 경우, 약학적으로 허용가능한 비히클은 수용액이며, 바람직하게는 TPGA 안정화제(트레할로스, 포스페이트, 글루타메이트, 알부민)를 포함하는 수용액; 펩톤 안정화제를 포함하는 수용액; 및 탈지유를 포함하는 수용액으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 백신이 비활성화된 것인 경우, 약학적으로 허용가능한 비히클은 바람직하게는 수용액 또는 에멀젼이다. 보다 구체적으로, 사용되는 비히클은 바람직하게는 물-오일, 오일-물 또는 물-오일-물 (WOW) 에멀젼, 바람직하게는 물-오일-물 에멀젼이다.
생백신 또는 활성 백신의 투여와 관련하여, 이것은 각 경우에 적절한 수단과 방법을 사용하여 근육 내, 비강 내, 피하, 살포, 분무, 경구, 음용수를 통해 또는 난 내 수행될 수 있다. 그것이 비활성화 백신인 경우, 이는 근육 내 또는 피하, 바람직하게는 피하 투여된다.
마찬가지로, 본 발명의 재조합 백신은 마렉 병에 대한 백신과 같이, 단독으로 또는 생백신 (활성) 또는 비활성화된 다른 재조합 또는 비-재조합 백신과 함께 단일 용량으로, 2회 이상 용량으로 투여될 수 있다.
마찬가지로, 심지어 본 발명의 백신이 단일 용량 또는 어플리케이션으로 투여되는 경우에도, 상기 백신에 함유된 바이러스 벡터에 삽입된 외인성 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 항원과 관련된 관심 질환에 대한 초기 및 지속적인 보호를 달성한다.
추가적인 실시예에서, 본 발명에 따른 혈청형-9 가금 아데노바이러스 벡터(FAdV-9)를 포함하는 다가 재조합 백신은 동일한 관심 질환 또는 상이한 관심 질환으로부터의 적어도 2종의 항원을 암호화하고, 특히 491-2782 뉴클레오티드 사이에 위치하는 아데노바이러스의 게놈 비-필수 영역을 대체하는, 적어도 2개의 외인성 뉴클레오티드 서열이 삽입된 것으로 기재되어 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 관심 질환의 적어도 1종의 항원을 암호화하고, 특히 490-2782 뉴클레오티드 사이에 위치하는 아데노바이러스의 게놈 비-필수 영역을 대체하는, 적어도 1개의 외인성 뉴클레오티드 서열이 삽입된, 본 발명에 따른 혈청형-9 가금 아데노바이러스 벡터(FAdV-9)에 기초한 제1 백신; 및 동일한 관심 질환 또는 상이한 관심 질환으로부터의 적어도 1종의 항원을 암호화하고, 특히 491-2782 뉴클레오티드 사이에 위치하는 아데노바이러스의 게놈 비-필수 영역을 대체하는, 적어도 1개의 외인성 뉴클레오티드 서열을 가지는, 본 발명에 따른 혈청형-9 가금 아데노바이러스 벡터(FAdV-9)에 기초한 제2 백신을 포함하는 다가 백신이 기재된다. 다가 백신은 생백신 또는 활성 또는 비활성화된 형태로 발견될 수도 있다.
마찬가지로, 본 발명은 관심 질환의 항원을 암호화하고, 특히 491-2782 뉴클레오티드 사이에 위치하는 아데노바이러스의 게놈 비-필수 영역을 대체하는, 외인성 뉴클레오티드 서열이 삽입된, 본 발명에 따른 혈청형-9 가금 아데노바이러스 벡터(FAdV-9)에 기초한 적어도 하나의 백신과 조합한 마렉 병 전바이러스 백신을 포함하는 다가 백신을 의도한다. 다가 백신은 생백신 또는 활성 또는 비활성화된 형태로 발견될 수도 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면에서, 동물 질환에 대한 백신 접종 방법이 개시되며, 관심 질환의 항원을 암호화하고, 특히 491-2782 뉴클레오티드 사이에 위치하는 아데노바이러스의 게놈 비-필수 영역을 대체하는, 외인성 뉴클레오티드 서열이 삽입된, 혈청형-9 가금 아데노바이러스 벡터(FAdV-9); 및 약학적으로 허용가능한 비히클, 보강제 및/또는 부형제를 포함하는, 본 발명에 따른 재조합 백신을 동물에게 공급하는 단계를 포함하고; 여기서 상기 백신은 동물에서 면역 반응을 일으킬 수 있다.
상기 외인성 뉴클레오티드 서열은 관심있는 질환의 항원, 바람직하게는 조류 인플루엔자, 봉입체를 갖는 간염, 조류 감염성 후두기관염, 뉴캐슬 병, 닭 전염성 파브리시우스 낭병, 전염성 기관지염, 메타뉴모바이러스(metapneumovirus, MPNV) 원인 질환, 마렉 병(Marek 's disease), 조류 감염성 빈혈증 또는 크기가 아데노바이러스 벡터 내 삽입을 허용하는 다른 임의의 유전자로부터 선택된 적어도 하나의 질환의 항원을 암호화한다. 바람직하게는, 조류 인플루엔자 유전자가 이용된다.
바람직하게는, 외인성 뉴클레오티드 서열은 인플루엔자 바이러스의 18개 혈구응집소 아형 또는 면역원성 변이체로부터 선택된, 조류 인플루엔자 바이러스의 혈구응집소(HA) (더욱 바람직하게는 상기 단백질의 아형 H1, H2, H3, H5, H6, H7 또는 H9 중 적어도 하나를 암호화한다); 봉입체 간염 바이러스의 섬유 및 헥손, 혈청형 4 및 8; 조류 유래 감염성 후두기관염 바이러스의 당단백질 B (gB) 및 당단백질 D (gD); 뉴캐슬병 바이러스의 HN 및 F 단백질; 파브리시우스 낭병의 VP2 단백질 바이러스 감염; 감염성 기관지염 바이러스의 S1 및 S2 단백질; 메타뉴모바이러스(MPNV)의 F 단백질; 및 조류 전염성 빈혈의 VP1, VP2 및 VP3 단백질을 포함하는 군을 암호화하는 유전자로 이루어진다.
마찬가지로, 적절한 보호를 달성하기 위해 재조합 백신의 필요한 농도는 투여량 당 적어도 105.0 DICC50 %, 보다 바람직하게는 투여량 당 적어도 106.0 DICC50 %를 갖는다.
생백신 또는 활성 재조합 백신은 각 경우에 적절한 수단과 방법을 사용하여 근육 내, 비강 내, 피하, 살포, 분무, 음용수를 통한 경구, 또는 난 내 투여될 수 있다. 그것이 비활성화 백신인 경우, 이는 근육 내 또는 피하, 바람직하게는 피하 투여된다. 마찬가지로, 본 발명의 재조합 백신은 마렉 병에 대한 백신과 같이, 단독으로 또는 생백신 (활성) 또는 비활성화된 다른 재조합 또는 비-재조합 백신과 함께 단일 용량으로, 2회 이상 용량으로 투여될 수 있다.
마찬가지로, 심지어 본 발명의 백신이 단일 용량 또는 어플리케이션으로 투여되는 경우에도, 상기 백신에 함유된 바이러스 벡터에 삽입된 외인성 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 항원과 관련된 관심 질환에 대한 초기 및 지속적인 보호를 달성한다.
본 발명은, 본 발명의 바람직한 실시예들을 적절하게 이해할 수 있도록 단지 예시적인 목적으로 도시된 하기의 실시예들로부터 더 잘 이해될 것이며, 상기 개시된 상세한 설명에 기초하여 실시될 수 있는 예시되지 않는 다른 실시예들이 없다는 것으로 의미하지는 않는다.
본 발명의 특징으로 고려되는 신규한 측면들은 첨부된 청구범위에서 구체적으로 확립될 것이다. 그러나, 일부 실시예, 특징 및 그 일부 목적 및 이점은 첨부된 도면과 관련하여 읽을 때, 상세한 설명으로부터 더욱 잘 이해될 것이다:
도 1a는 본 발명에 따라 구축된, 조류 인플루엔자 HA 삽입물을 갖는 FAdV-9 재조합 바이러스의 DNA 제한 지도이다.
도 1b는 제한 효소 절단에 의해 수득되며, 본 발명에 따라 구축된, 조류 인플루엔자 HA 삽입물을 갖는 FAdV-9 재조합 바이러스의 DNA 단편이 보이는 아가로오스 겔이다.
도 1c는 비감염된 CeLi 세포 배양물, 및 본 발명에 따라 구축된, 조류 인플루엔자 HA 삽입물을 갖는 FAdV-9 재조합 바이러스에 감염된 것이다.
도 2a는 본 발명에 따라 구축된, 봉입체를 갖는 간염 Fiber-4 삽입물을 갖는 FAdV-9 재조합 바이러스의 DNA 제한 지도를 도시한다.
도 2b는 제한 효소 절단에 의해 수득되며, 본 발명에 따라 구축된, 봉입체를 갖는 간염 Fiber-4 삽입물을 갖는 FAdV-9 재조합 바이러스의 ADN 단편이 보이는 아가로오스 겔이다.
도 2c는 비감염된 CeLi 세포 배양물, 및 본 발명에 따라 구축된, 봉입체를 갖는 간염 Fiber-4 삽입물을 갖는 FAdV-9 재조합 바이러스에 감염된 것이다.
도 3a는 본 발명에 따라 구축된, 조류에서 감염성 후두기관염 바이러스의 당단백질-B 삽입물을 갖는 FAdV-9 재조합 바이러스의 DNA 제한 지도를 도시한다.
도 3b는 제한 효소 절단에 의해 수득되며, 본 발명에 따라 구축된, 조류에서 감염성 후두기관염 바이러스의 당단백질-B 삽입물을 갖는 FAdV-9 재조합 바이러스의 DNA 단편이 보이는 아가로오스 겔이다.
도 3c는 비감염된 CeLi 세포 배양물, 및 본 발명에 따라 구축된, 조류에서 감염성 후두기관염 바이러스의 당단백질-B 삽입물을 갖는 FAdV-9 재조합 바이러스에 감염된 것이다.
도 4a는 본 발명에 따라 구축된, 뉴캐슬 병 바이러스의 HN 단백질 삽입물을 갖는 FAdV-9 재조합 바이러스의 DNA 제한 지도이다.
도 4b는 제한 효소 절단에 의해 수득되며, 본 발명에 따라 구축된, 뉴캐슬 병 바이러스의 HN 단백질 삽입물을 갖는 FAdV-9 재조합 바이러스의 DNA 단편이 보이는 아가로오스 겔이다.
도 4c는 비감염된 CeLi 세포 배양물, 및 본 발명에 따라 구축된, 뉴캐슬 병 바이러스의 HN 단백질 삽입물을 갖는 FAdV-9 재조합 바이러스에 감염된 것이다.
도 5a는 게놈의 38,807 및 40,561 뉴클레오티드 사이에 삽입된, 뉴캐슬 병 바이러스의 HN 단백질 삽입물을 갖는 FAdV-9 재조합 바이러스의 DNA 제한 지도이다.
도 5b는 제한 효소 절단에 의해 수득되며, 게놈의 38,807 및 40,561 뉴클레오티드 사이에 삽입된, 뉴캐슬 병 바이러스의 HN 단백질 삽입물을 갖는 FAdV-9 재조합 바이러스의 DNA 단편이 보이는 아가로오스 겔이다.
도 5c는 제한 효소 절단에 의해 수득되며, CeLi 세포 배양물에서 2회 계대 후 게놈의 38,807 및 40,561 뉴클레오티드 사이에 삽입된, 뉴캐슬 병 바이러스의 HN 단백질 삽입물을 갖는 FAdV-9 재조합 바이러스의 DNA 단편이 보이는 아가로오스 겔이다.
도 6은 1일령(DE)에 취한 혈청으로 난 내 면역화시킨 품종 상업용 닭(CRL)의 혈구응집소 억제(IH) 결과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 10 DE에 취한 혈청으로 난 내 면역화시킨 CRL 닭의 IH 결과를 보여주는 그래프이다.
도 8은 19 DE에 취한 혈청으로 18일 인큐베이션 (DI) 후 또는 1 DE에 난 내 면역화시킨 CRL 닭의 IH 결과를 보여주는 그래프이다.
도 9는 19 DE에 취한 혈청으로 18 DI 또는 1 DE에 난 내 면역화시키고, 10 DE에 재접종한 CRL 닭의 IH 결과를 보여주는 그래프이다.
도 10은 31 DE에 취한 혈청으로 18 DI 또는 1 DE에 난 내 면역화시킨 CRL 닭의 IH 결과를 보여주는 그래프이다.
도 11은 31 DE에 취한 혈청으로 18 DI 또는 1 DE에 난 내 면역화시키고, 10 DE에 재접종한 CRL 닭의 IH 결과를 보여주는 그래프이다.
도 12는 38 DE에 취한 혈청으로 18 DI 또는 1 DE에 난 내 면역화시킨 CRL 닭의 IH 결과를 보여주는 그래프이다.
도 13은 38 DE에 취한 혈청으로 18 DI 또는 1 DE에 난 내 면역화시키고, 10 DE에 재접종한 CRL 닭의 IH 결과를 보여주는 그래프이다.
도 14는 45 DE에 취한 혈청으로 18 DI 또는 1 DE에 난 내 면역화시킨 CRL 닭의 IH 결과를 보여주는 그래프이다.
도 15는 45 DE에 취한 혈청으로 18 DI 또는 1 DE에 난 내 면역화시키고, 10 DE에 재접종한 CRL 닭의 IH 결과를 보여주는 그래프이다.
도 16은 1 DE에 면역화시키고, 10 DE에 재접종하거나 없고, 19 DE에 시험감염시킨 CRL 닭의 효능 결과를 보여주는 그래프이다.
도 17은 1 DE에 면역화시키고, 10 DE에 재접종하거나 없고, 31 DE에 시험감염시킨 CRL 닭의 효능 결과를 보여주는 그래프이다.
도 18은 1 DE에 면역화시키고, 10 DE에 재접종하거나 없고, 93 DE에 시험감염시킨 CRL 닭의 효능 결과를 보여주는 그래프이다.
도 19는 19 DE에 취한 혈청으로 1 DE에 면역화시키고, 10 DE에 재접종하거나 없는, CRL 닭의 IH 결과를 보여주는 그래프이다.
도 20은 31 DE에 취한 혈청으로 1 DE에 면역화시키고, 10 DE에 재접종하거나 없는, CRL 닭의 IH 결과를 보여주는 그래프이다.
도 21은 93 DE에 취한 혈청으로 1 DE에 면역화시키고, 10 DE에 재접종하거나 없는, CRL 닭의 IH 결과를 보여주는 그래프이다.
도 22는 1 및 10 DE에 면역화시키고, 31 DE에 시험감염시킨 특정 병원균 부재 (Free of Specific Pathogen, LPE) 닭의 효능 결과를 보여주는 그래프이다.
도 23은 31 DE에 취한 혈청으로 1 및 10 DE에 면역화시킨, LPE 닭의 IH 결과를 보여주는 그래프이다.
실시예
실시예 1. FAdV-9 벡터의 생성
먼저, 역 유전학(reverse genetics)에 의해 생성되고 영역 FV1 (1-491 뉴클레오티드 사이에 포함됨) 및 FV2(2,782-7,453 뉴클레오티드 사이에 포함됨)를 함유하는 서열번호 1을 포함하는 FAdV-9 45kb 게놈에서, 2,291pb의 비-필수 영역을 제거하였으며, 491-2,782 뉴클레오티드 사이를, 즉 게놈의 5' 말단에서 포함하였으며; 또한 관심 유전자에 독특한 Swal 부위를 491 부위에서 삽입했다. 이 게놈을 pBg 플라스미드에서 서브 클로닝해서, 배양 내에 살아있는 바이러스를 생성할 수 있게 하는 독특한 제한 부위를 그 말단에서 확보했다.
또한, EcoRV 부위를 PCR 기술에 의해 올리고뉴클레오티드를 사용하여 FV-2에 도입하여 중간체 pΔL2.4를 얻었다. 이 중간체에서, 4,391에서 7,453 사이의 뉴클레오티드가 포함된 원래 게놈 단편이 결실되어, 2,100pb의 재조합 암부(arm)가 남았다. 또한, AdEASY로부터의 pShuttle에 션트된 PCR EcoRV-EcoRV의 단편을 클로닝하고, EcoRV-Pmel로 실행하였다. EcoRI 부위는 유지되었다.
491 뉴클레오티드의 SwaI 부위에서, pVAX로부터의 발현 카세트를 CMV, poliLinker 및 PoliA를 사용하여 클로닝하였으며, 이는 또한 관심있는 유전자를 클로닝하기 위해 독특한 PmeI 부위를 포함함으로써 감염성 관심 클론을 얻어냈다. 세포 배양에서 감염성 클론의 형질감염은 관심있는 재조합 바이러스를 생성한다.
실시예 2. 세포 배양에서 rFAdV9-435 재조합 바이러스 rFAdV9-435의 생성
실시예 1에 기술된 방법론에 따라, 저 병원성 조류 인플루엔자 바이러스 VIABP-H5N2, 균주 435 (rFAdV9-435)로부터의 H5 유전자가 삽입된 FAdV-9 감염성 클론을 유전자은행 등록번호 FJ864690로 수득하였으며, 이는 서열번호 2의 서열을 포함한다.
먼저, 마스터 시드(SM)를 수득하기 위해서, rFAdV9-435를 세포 배양기 (고정형 시스템)에서 DMEM F12 + Glutamax 배양 배지로 성장시킨 CeLi 계통 세포에서 복제시켰다. 동일한 세포 유형에서 7회 블라인드 계대배양을 수행한 후, 106.0 DICC50 %의 면역 과산화효소 검사에 대한 역가에 도달했다. 수확물을 500g에서 20분 동안 원심분리하고, 이를 -70℃ 내지 -80℃의 온도에서 급속 냉동 상태로 유지시킨 1.5mL 저온유리병(cryovial)에서 분획화하였다.
박테리아, 조류 미코플라스마, 진균류 및 효모의 존재를 배제하고, 상기 MS가 조류 바이러스가 없는 것임을 증명하기 위해 SM에 테스트를 수행하였다.
또한 무균성, 힘, 면역원성 및 적절한 보호 및 면역원성을 생성하는 데 필요한 최소한의 투여량을 결정하기 위해 특이적 병원성 부재 닭(pathogen-free chicken, SPF)에서 SM에 테스트를 수행하였다.
생산 시드를 만들기 위해 동일한 세포(CeLi)에서 마스터 시드를 사용하여 추가 계대배양을 수행했다.
실시예 3. 다른 재조합 바이러스의 생성
상기 설명한 동일한 방법론에 따라, 표 1에 제시된 바에 따라 추가적인 FAdV-9 재조합 바이러스가 얻어졌다:
서로 다른 삽입물로 생성된 FAdV-9 재조합 바이러스.
삽입물 재조합 바이러스 명칭
조류 인플루엔자 H7 H7N3 rFAdV9-H7IA
혈청형-4 봉입체를 갖는 간염 섬유 rFAdV9-Fib HCI
조류 후두기관염 당단백질 B (gB) rFAdV9-gBLT
뉴캐슬병 HN rFAdV9-HN
감염성 기관지염 S1 및 S2 rFAdV9-S1S2BI
조류 인플루엔자 H5 및 H7 rFAdV9-H5H7IA
돼지 써코바이러스 ORF2 rFAdV9-ORF2PCV2
조류 전염성 빈혈 VP1 및 VP2 rFAdV9-VP2VP1CAV
조류 후두기관염 당단백질 D (gD) rFAdV9-gDLT
살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 플라젤린 C rFAdV9-FliC
이러한 재조합 벡터를 XhoI 절단으로 특징화하였다. 도 1a에서는 rFAdV9-H7IA 재조합 벡터의 DNA 제한 지도가 도시되어 있으며; 4.7kb 밴드는 이종 유전자가 클로닝되는 제한 단편을 나타낸다. 도 1b에서는 조류 인플루엔자 HA 유전자에 상응하는 3629bp가 관찰될 수 있으며, 이는 rFAdV9-H7IA 재조합 벡터가 실제로 이 유전자를 삽입하고 또한 상기 벡터가 세포 배양에서 10회 계대한 후에 안정적임을 입증한다. 도 1c에서, 좌측에서는 감염되지 않은 CeLi 세포 배양이 관찰될 수 있지만, 우측에서는 1.1 x 106 UFP의 바이러스 역가를 갖는 CeLi 세포에서 rFAdV9-H7IA 재조합 벡터의 전파로 인한 세포변성 효과가 관찰될 수 있으며, 이는 상기 재조합 벡터가 CeLi 세포 배양에서 안정적으로 정상적으로 거동한다는 사실로 인해 양호한 세포변성 효과를 생성한다는 것을 나타낸다.
또한, 도 2a에서 rFAdV9-Fib HCI 재조합 벡터의 DNA 제한 지도가 도시되어 있으며; 1.4kb 밴드는 이종 유전자가 클로닝되는 제한 단편을 나타내며, 도 2b에서는 혈청형-4 봉입체를 갖는 간염의 Fib4 유전자에 상응하는 1652pb 밴드가, 보여지며, 이는 rFAdV9-Fib HCI 재조합 벡터가 실제로 이 유전자를 삽입하고 또한 상기 벡터가 세포 배양에서 10회 계대한 후에 안정적임을 입증한다. 마지막으로, 도 2c에서, 좌측에서는 감염되지 않은 CeLi 세포 배양이 관찰될 수 있지만, 우측에서는 1.4 x 105 UFP의 바이러스 역가를 갖는 CeLi 세포에서 rFAdV9-Fib HCl 재조합 벡터의 전파로 인한 세포변성 효과가 관찰될 수 있으며, 이는 상기 재조합 벡터가 CeLi 세포 배양에서 안정적으로 정상적으로 거동한다는 사실로 인해 양호한 세포변성 효과를 생성한다는 것을 나타낸다.
도 3a에서 rFAdV9-gBLT 재조합 벡터의 DNA 제한 지도가 도시되어 있으며; 5.6kb 밴드는 이종 유전자가 클로닝되는 제한 단편을 나타낸다. 도 3b에서는 조류 감염성 후두기관염의 gB 유전자에 상응하는 4,573pb 밴드가 보여지며, 이는 rFAdV9-gBLT 재조합 벡터가 실제로 이 유전자를 삽입하고 또한 상기 벡터가 세포 배양에서 10회 계대한 후에 안정적임을 입증한다. 도 3c에서, 좌측에서는 감염되지 않은 CeLi 세포 배양이 관찰될 수 있지만, 우측에서는 2.6 x 106UFP의 바이러스 역가를 갖는 CeLi 세포에서 rFAdV9-gBLT 재조합 벡터의 전파로 인한 세포변성 효과가 관찰될 수 있다. 상기에서는 이 재조합 벡터가 CeLi 세포 배양에서 안정적이라는 것을 나타낸다.
도 4a에서 rFAdV9-HN 재조합 벡터의 DNA 제한 지도가 도시되어 있으며; 4.8kb 밴드는 이종 유전자가 클로닝되는 제한 단편을 나타낸다. 도 4b에서는 뉴캐슬 병의 HN 유전자에 상응하는 996bp 밴드가 보여지며, 이는 rFAdV9-HN 재조합 벡터가 실제로 이 유전자를 삽입하고 또한 상기 벡터가 세포 배양에서 10회 계대한 후에 안정적임을 보여준다. 도 4c에서, 좌측에서는 감염되지 않은 CeLi 세포 배양이 관찰될 수 있지만, 우측에서는 1.3 x 106UFP의 바이러스 역가를 갖는 CeLi 세포에서 rFAdV9-HN 재조합 벡터의 전파로 인한 세포변성 효과가 관찰될 수 있다. 상기에서는 이 재조합 벡터가 CeLi 세포 배양에서 안정적이라는 것을 나타낸다.
실시예 4. 다른 공지된 아데노바이러스 벡터에 따른 FAdV-9 재조합 벡터의 생성
45kb 게놈의 FAdV-9를 플라스미드 pWE-15에 클로닝하였다; 이 게놈은 TR-1 (37,648과 37,812 뉴클레오티드 사이에 위치)과 TR-2 (38,707과 40,561 뉴클레오티드 사이에 위치)(즉 3’ 말단에서 (60과 100 mu)의 0.0023와 0.0039 사이)라고 부르는 나란한 2개의 반복 블록을 가지며, 바이러스 복제에는 필요하지 않다. 그 후, 세포 배양에서 바이러스가 생성되는 동안 DNA를 선형화하는 데 유용한 게놈 말단의 PacI 부위들을 추가하기 위해서 pWE-15 내의 이 게놈을 플라스미드 pBg에 서브클로닝하였다.
중간체를 생성하기 위해, TR-2 영역을 PCR 증폭한 후 양 말단의 독특한 I-CeuI 및 PI-SceI 부위를 갖는 박테리아 플라스미드 pTRE-2에 클로닝하였다. 그 후, 뉴캐슬 병 바이러스 HN 유전자 발현을 지시하기 위해 CMV 폴리링커를 함유하는 발현 카세트를 삽입하고, 감염성 클론 pFΔTR2-CMV HN을 수득하였다.
rFΔTR2-CMV HN 재조합 바이러스를 CeLi 세포 배양에서 감염성 클론의 형질감염을 통해 수득하였다.
도 5a에서 rFΔTR2-CMV HN 재조합 벡터의 DNA 제한 지도를 관찰할 수 있으며; 3,473kb 밴드는 이종 유전자가 클로닝되는 제한 단편을 보여준다. 도 5b는 XhoI를 갖는 DNA 절단 밴드를 보여주며, 뉴캐슬 병 바이러스의 HN 유전자에 상응하는 3,473bp를 나타내며, 이는 rFΔTR2-CMV HN 재조합 벡터가 실제로 이 유전자를 삽입한 것을 입증한다. 그럼에도 불구하고, 도 5c에서, HN 유전자에 상응하는 3,473bp 밴드는 1.1 x 104UFP의 바이러스 역가를 갖는 CeLi 세포 배양에서 2회 계대한 후에 사라졌으며, rFΔTR2-CMV HN 벡터는 세포 배양에서 계대로 외인성 유전자 삽입물을 잃어 버림에 따라, 재조합 백신의 산업적 생산에 불안정하고 부적합한 결과를 초래하였다.
실시예 5. 조류 인플루엔자의 H5 삽입물을 갖는 FAd V -9 재조합 바이러스로 활성인 백신 생산 방법: rFAdV9-435
CeLi 계통 세포를 Roller system에서 꾸준히 배양하였다. 이를 위해 제조용 세포 은행 (Working Cell Bank, BCT)에서 32 계대 바이알을 T25 바이알에서 해동시켰다. 성장 속도(TD=24 시간)로 회복하기 위해 3 연속 계대배양을 1:3 비율로 2-3일 마다 실시했다. 일단 성장 속도가 회복되었으면, 세포를 T75 및 T225 박스(1:3 비율)에서 전파시키고, 80% 합류율이 얻어지면, 그들은 실시예 2에 따라 수득된 생산 시드로 0.1DICC50%/mL의 감염 다중도(moi)로 감염되었다. 감염 후 5일 만에, 내용물을 담은 바이알을 24 시간 동안 -70℃에서 동결시켰다. 이어서, 이들을 해동하고, 내용물을 회수하고 20분 동안 500g에서 원심분리하였다. 그것을 생산된 양에 따라 포장했다.
수확물을 면역 과산화효소에 의해 적정시켰고, 105.3DICC50 %/용량에 도달하기 위해 수확한 유체와 TPGA cbp를 안정제로 첨가하여 제형화하였다. 사용할 때까지 실험 백신을 -20℃에서 -30℃ 사이의 온도에서 동결시켰다.
실시예 6. 마렉 병에 대한 백신 유무에 관계없이 적용된 rFAd V 9-435 재조합 활성 백신의 생체 내 평가
본 발명의 활성 백신의 유효성을 결정하기 위한 목적으로 연구를 수행하였으며, 마렉 병에 대한 백신과 병용하여 조류에 투여될 때 영향을 미치지 않으며 또한 영향을 받지도 않음을 입증한다. 백신은 난 내 및 피하 투여되었다.
그 결과, 표 2에 보여진 대로, 270 마리의 1일령 (DE) 레그혼(Leghorn) 품종 상업용 닭(CRL)을 사용하였으며, 각각 30 마리 닭의 9 그룹으로 나누었다.
rFAdV9-435 활성 백신을 그룹 2 및 6의 경우 단독으로 106.1DICC50 %/0.2 mL의 비율로 알란토이스 캐비티 (Ai)를 통해 18일 인큐베이션(DI) 후, 백신과 난 내 적용하고, 그룹 1과 그룹 5의 경우 마렉 균주 HVT에 대한 백신과 함께 혼합하고 적용하였다. 반면에, rFAdV9-435 백신을 106.1DICC50 %/0.2 mL 비율로 접종한 경우 목의 중앙과 상부에 생후 (DE) 1일에 백신을 피하 주사(SC)하여 실험을 수행하였다. 그룹 4 및 그룹 8의 경우 백신 단독으로 투여하였고; 그룹 3 및 그룹 7의 경우 마렉 균주 HVT에 대한 백신과 함께 혼합하고 적용하였다. 마지막으로, 10 DE에 그룹 5 내지 8을 SC에 106.5DICC50 %/0.5 mL의 rFAdV9-435 백신을 재접종하였다.
rFAdV9-435 백신에 의한 치료 그룹.
그룹 백신 적용 일 및 백신 투여 경로 생후 (DE) 일에 VIAAP-H5N2에 의한 접종
18-DI 1-DE 10-DE 19 DE 31 DE 45 DE
G1 rFAdV9-435 + HVT Ai 10 10 10
G2 rFAdV9-435 Ai 10 10 10
G3 rFAdV9-435 + HVT SC 10 10 10
G4 rFAdV9-435 SC 10 10 10
G5 rFAdV9-435 + HVT + rFAdV9-435 Ai SC 10 10 10
G6 rFAdV9-435 + rFAdV9-435 Ai SC 10 10 10
G7 rFAdV9-435 + HVT + rFAdV9-435 SC SC 10 10 10
G8 rFAdV9-435 + rFAdV9-435 SC SC 10 10 10
G9 대조군 (백신 접종 안함) ---- ----- ---- 10 10 10
동물들을 격리 유닛에 수용했으며, 여기서 19, 31, 45 DE에 시험감염하고 그룹을 각각의 시험감염에 대해 각각 10마리 닭의 세 개의 하위 그룹으로 세분했다.
시험감염 바이러스는 각 닭에 0.3mL 중 107.5DIEP50 %를 적용하기 위해 PBS로 pH 7.2로 조정한, VIAAP-H5N2, 균주 A/닭/케레타로인, 고 병원성 조류 인플루엔자 바이러스였으며, 각각의 닭은 각 눈에 0.06ml(2 방울)을, 각 비공에는 0.09ml (3 방울)을 받았다.
실시예 6A. 효능 평가
모든 그룹을 임상 데이터를 평가하기 위한 시험감염 후 10 일 동안 매일 관찰했으며; 각 닭을 개별적으로 검사하여 표 3의 데이터에 따라 수치로 점수를 매겼다.
VIAAP-H5N2로 시험감염 후 임상 데이터의 매일 평가.
임상 표시 경증 중증
결막염 1 2
결막염 + 깃털 세워짐 3 4
결막염 + 깃털 세워짐 + 기면 5 6
사망 7 -
각 실험 그룹의 임상 데이터 중증도의 최대 값(MCDS)은 개별 가치 부가의 평균에 해당한다. 치사율(M)은 임상 신호의 최대 값을 100%로 조정하여, 10 일의 관측 일 동안 누적 기준으로 산출되었다.
그룹의 최대 이환율(MM)은 10 관찰 일 중 1 일에서의 아픈 조류의 최대 비율과 같다. 이환율 지수(IMb)는 다음과 같이 계산되었다:
Figure pct00001
예를 들어:
Figure pct00002
IMb = 44.8%
19, 31 및 45 DE에서 VIAAP-H5N2로 시험감염한 닭에 대한 치사 예방 (PM) 및 IMb 결과를 표 4에 나타내었다.
rFAdV9-435로 백신 접종되고 VIAAP-H5N2로 시험감염한 CRL 닭에서의 효능 결과
그룹 PM (%)
IMb (%)
19 DE 31 DE 45 DE 19 DE 31 DE 45 DE
G1 90 100 100 16.8 12.7 8.2
G2 90 100 100 26.7 6.5 7.1
G3 100 100 100 3.9 1.5 1.0
G4 100 100 100 1.2 1.2 0.9
G5 100 100 100 9.1 9.7 7.6
G6 100 100 100 10.2 8.8 5.0
G7 100 100 100 0.1 1.2 0.6
G8 100 100 100 0.5 0.6 0.1
G9 0 0 0 100 100 100
알 수 있듯이, 효능 결과는 본 발명의 rFAdV9-435 백신의 H5N2 조류 인플루엔자 제어에 있어서의 용도에 대한 효능을 확인하고, 다른 조류 인플루엔자 서브 타입을 제어하는데 사용될 수도 있다고 제안한다.
마찬가지로, 이 결과는 마렉 병에 대한 백신의 혼합 및 적용은 rFAdV9-435 활성 백신과 병용 투여시 간섭을 일으키지 않는다고 확인한다.
실시예 6B. 면역원성 평가
혈구응집소 억제 시험 (IH) 결과는 VIA-435의, 백신 접종 군과 대조군 모두의 항원(Ag)에 대한 항체 수준이 1 DE(도 6)에 수득한 새 혈청에서는 29.3에서 29.0, 10 DO(도 7)에 수득된 혈청의 경우 28,6 내지 28.8인, 매우 높은 모체 항체 수준을 나타냈음을 보여주었다.
10 DE에 rFAdV9-435의 재접종을 통해 난 내 또는 DE에 면역화한 군을 포함하여, 모든 그룹 (대조군과 백신 접종 군)에서 19 DE에 수득된 혈청의 경우, 검출된 항체 수준은 23,6에서 24.6 (도 8 및 도 9) 범위였다.
상기 결과는 검출된 항체의 수준이 백신 투여 rFAdV9-435에 의해 유도되지 않은 모체 항체에 해당한다는 것을 보여준다. 그러나, 상기 언급한 바와 같이, 다른 그룹에 대한 19 DE 자의 초기 시험감염에 대해 부여된 PM은 90%에서 100%이었고, 이는 본 발명의 백신의 유효성이 VIA-435에 대한 모체 항체에 의해 영향을 받지 않았음을 나타낸다. 또한, 시험감염 이전에 보호를 생성하면서 세포 유형 특이적 면역 반응을 자극하는 것이 가능했음을 제시하는데, 이는 세포 면역이 바이러스 질환 통제에 중요하다는 것을 지적하는 과학 문헌과 일치한다.
또한, 도 10에서 볼 수 있듯이, 31 DE에 수득된 혈청에 대해 난 내에 면역화된 그룹은 IH 테스트에서 검출가능한 항체 반응을 나타내지 않은 반면, 평균 22.1의 결과를 얻은 백신 접종을 하지 않은 대조군과 대조적으로, rFAdV9-435 백신에 기인하는 DE 항체 수준에서 면역화된 그룹의 경우 그룹 5 및 6에 대해 26.3 및 25.8의 역가로 검출되었다.
도 11에 도시된 바와 같이, 10 DE에 재접종을 받은 난 내에서 면역화된 그룹의 경우, 중등도 수준의 백신 rFAdV9-435-유도 항체는 그룹 5 및 그룹 6에 대해 각각 24.4 및 24.0의 역가가 검출되었다. 대조적으로, 백신 접종을 하지 않은 대조군은 102.1의 IH 항체 역가 평균을 초래했으며, 이는 기술적으로 음성 역가로 간주된다. 10 DE에 재접종을 받은, DE에 면역화된 그룹들의 경우, 그룹 7과 그룹 8 각각에 대해 26.9 및 26.8 의 결과가 나타났으며, 이는 기왕 면역 반응(anamnestic immune response)이 존재함을 시사한다.
38 D에 수득된 혈청의 경우, 도 12의 결과는, 난 내에서 면역화된 그룹의 경우, rFAdV9-435 백신이 VIA-435 Ag에 대한 상기 항체 그룹; 더욱 구체적으로는 24.4의 그룹 1과 24.1의 그룹 2의 검출을 처음으로 허용했음을 나타낸다. 한편, DE에 면역화된 그룹의 경우, 평균 21.2의 결과를 얻은 백신 접종을 하지 않은 대조군과 대조적으로, 항체 수준이 그룹 3 및 4에 대해 각각 28.8 및 28.4의 역가를 나타냈다.
10 DE에 재접종을 받은 난 내에서 면역화된 그룹을 지칭하며(도 13), 평균 101.2의 결과를 얻은 백신 접종을 하지 않은 대조군과 대조적으로, rFAdV9-435 백신의 경우 유도된 항체 수준이 그룹 3 및 4에 대해 각각 25.5 및 26.1의 역가를 가지고 검출되었다. 10 DE에 재접종을 받은, DE에 면역화된 그룹의 경우, 그룹 7 및 8에 대해 각각 28.9 및 28.4 의 결과가 나왔으며, 이는 38 DE에서도 모든 그룹에서 항체 수준이 계속 상승했음을 나타낸다.
마지막으로, 45 DO에 수득된 혈청의 경우, 결과는 도 14에서 알 수 있듯이, 난 내에서 면역화된 그룹의 경우, rFAdV9-435 백신이 VIA-435 Ag에 대한 항체 검출을 허용했으며, 24.3의 그룹 1과 24.6의 그룹 2의 검출을 허용한 반면, 그룹 3 및 그룹 4의 경우에는 평균 20.8의 결과를 얻은 백신 접종을 하지 않은 대조군과 대조적으로, 각각 28.4 및 28.1의 역가를 나타냈다.
10 DE에 재접종을 받은 난 내에서 면역화된 그룹에서(도 15), 평균 100.8의 결과를 얻은 백신 접종을 하지 않은 대조군과 대조적으로, rFAdV9-435 백신의 경우 유도된 항체 수준이 그룹 5 및 6에 대해 각각 26.6 및 26.8의 역가를 가지고 검출되었다. 10 DE에 재접종을 받은, DE에 면역화된 그룹의 경우, 그룹 7 및 8에 대해 각각 29.6 및 210.0 의 결과가 나왔으며; 이는 45 DE에서도 항체 수준이 그룹 5와 6에 대해 동일한 수준으로 유지되는 반면, 그룹 7과 8에 대해서는 항체 수준이 계속 상승했음을 나타낸다.
상기 결과로부터 알 수 있듯이, 이러한 결과들은 본 발명에 따라 제조된 rFAdV9-435 백신이, 10 DE에 재접종을 받은 난 내에 면역화된 그룹에 대해 31 DE부터 시작하여 난 내에 백신 접종된 그룹에 대해, IH 테스트에 대해 검출가능한 항체 수준을 유도할 수 있는 능력을 가졌다. 재접종 없이, DE에 백신 접종을 한 그룹의 경우, 31 DE에 시작하여 검출이 또한 주어졌지만, 난 내에 백신 접종하고 10 DE에 재접종한 그룹보다 높은 역가를 가졌고; DE에 백신 접종하고 10 DE에 재접종한 그룹의 경우, 검출된 항체 수준은 이번에는 중요한 기왕 반응을 나타내지 않았다.
그룹 1에 대한 항체 수준은 38 DE에 처음으로 검출되었으며 (난 내에 백신 접종), 그룹 3의 경우 (DE에 백신 접종) 항체 수준의 증가가 검출되었는데, 이는 rFAdV9-435 백신이 38 DE에서도 체액 반응을 계속 증가시킨다는 것을 나타낸다. 마찬가지로, 38 DE에, 난 내에 백신 접종하고 10 DE에서 재접종한 그룹의 경우, 난 내 투여만 받은 그룹보다 높은 항체 수준 증가가 주목되며; 반면에 DE에 백신 접종하고 10 DE에 재접종한 그룹의 경우, 38 DE에 항체 증가는 DE에 단 한번 투여를 받은 그룹에 비해서 중요하지 않았다.
45 DE에, 난 내에 한번 백신 투여한 그룹과 DE에 한번 백신 투여한 그룹 양쪽 모두의 경우, 항체 수준은 38 DE와 실질적으로 동일하게 유지되었는데, 이는 이들 그룹에 대해 IH 테스트에 의한 검출가능한 순환 항체의 최대 수준이 38 DE에 달성되었음을 나타낸다. 한편 난 내에 생후 1일 후에 백신 접종하고 10 DE에 재접종한 그룹의 경우, 항체 수준의 중요한 증가가 여전히 검출되었다.
실시예 7. 93 DE에 시험감염하고, 단독으로 또는 마렉 병 백신과 병용 투여한 rFAd V 9-435 재조합 활성 백신의 생체 내 평가
두 번째 연구는 본 발명의 활성 백신의 유효성을 결정하기 위해 수행되었다.
백신은 표 5에 제시된 바에 따라 각각 30마리의 닭의 6 그룹으로 나누어진 180마리의 CRL 닭에 SC를 통해 투여되었으며; 본 발명의 백신과 병용하여 사용되는 마렉 병에 대한 HVT 백신은 4200 UFP/mL의 역가를 갖는 시판용 백신이었으며 상업용 실험실 지시에 따라 사용되었다.
하기 실시예들의 목적 상, 1 마리 닭 투여량(DP)은 DICC50%로 표시되는, 각 조류에 투여된 대수 규모의 투여량 지수에 상응하는데; 예를 들어, 107.1 DICC50%의 한 용량을 투여하는 경우, 이것은 7.1 DP와 동등한다.
동물들을 격리 유닛에 수용시키고, 19, 31 및 93 DE에 안구와 비공을 통해서 0.3mL의 VIAAP-H5N2 (균주 A/닭/케레타로/14588-19/95)를 시험감염하였으며, 각 닭에 0.3mL에 108.0DIEP50 %를 적용했다.
rFAdV9-435 백신에 의한 치료 그룹.
그룹 백신 적용 일수, 용량 및 백신 투여 경로 상이한 DE에 VIAAP-H5N2 접종
1 DE 10 DE 19 DE 31 DE 93 DE
G1 rFAdV9-435 +HVT SC (7.1 DP/0.2 mL) 10 10 10
G2 rFAdV9-435 SC (7.1 DP/0.2 mL) 10 10 10
G3 rFAD9-435 SC (7.1 DP/0.2 mL) SC (7.5 DP/0.5 mL) 10 10 10
G4 rFAdV9-435 SC (6.1 DP/0.2 mL) 10 10 10
G5 rFAdV9-435 SC (6.1 DP/0.2 mL) IM (6.5 DP/0.5 mL) 10 10 10
G6 백신 접종하지 않은 대조군 - - 10 10 10
실시예 7A. 효능 평가
전체 그룹을 각 시험감염 후 10일 동안 매일 관찰했다. 임상적 평가를 수행하기 위해, 각각의 닭을 개별적으로 검사하였고, 표 3에 따라 관찰된 임상적 변화에 따라 수치를 부여하였다.
실시예 6A에 표시된 것에 따라 M 및 IMb를 계산하였다. 그 결과를 도 16 내지 도 18에 나타내었다.
19 DE에 초기 시험감염 전의 효능 결과는, 마렉 백신 희석제 그 자체 또는 단독으로 HVT 백신과 함께 7.1 DP으로 0.2mL의 속도로 SC를 통해 투여된 rFAdV9-435 벡터화 백신이, 각각 18.4% 및 19.3%의 낮은 IMb로 70%의 치사 예방(PM)을 생성한다는 것을 나타내었다. 이 결과는 rFAdV9-435 백신의 면역원성이 마렉 병에 대한 HVT 백신에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 확인시켜 준다.
19 DE에 초기 시험감염 전의 효능 결과는, 마렉 HVT 백신과 함께 또는 단독으로 HVT 백신과 함께 투여된 rFAdV9-435 벡터화 백신이, 70% 내지 90%의 PM과 낮은 IMb을 생성한다는 것을 보여준다 (도 16). 이 결과는 rFAdV9-435 백신의 면역원성이 마렉 병에 대한 HVT 백신에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 확인시켜 준다.
마찬가지로, 이 결과는 rFAdV9-435 백신을 생후 하루에 6.1 DP 단 한번 투여하면, 7.1 DP의 단일 용량을 투여하거나 또는 10 DE에 제2 용량을 투여하는 경우와 유사한 보호를 조류에 부여한다는 것을 나타낸다.
31 DE에서의 시험감염의 경우, 도 17에서 관찰된 결과는 SC를 통해 단독으로 또는 마렉 병에 대한 HVT 백신과 함께 적용된 rFAdV9-435 벡터화 백신이, 면역화된 모든 그룹에서 실질적으로 IMb이 없는 100% PM을 생성하며, rFAdV9-435 백신의 면역원성이 마렉 병에 대한 HVT 백신에 의해 영향을 받지 않는 것으로 나타낸다.
마찬가지로, rFAdV9-435 백신의 6.1 DP의 단일 적용은 31 DE에서의 시험감염에 대한 탁월한 보호를 부여하기에 충분하다는 것이 관찰되었다.
동일한 방식으로, 도 18에서, 93 DE에서의 후기 시험감염 전의 효능 결과는 단독으로 또는 마렉 병에 대한 HVT 백신과 조합하여 적용된 본 발명의 구획화된 백신이, 100%의 PM 및 실질적으로 없는 IMb를 생성한다는 것을 나타낸다. 그 결과, rFAdV9-435 백신은 생후 1일에 투여된 6.1 DP의 단일 용량을 이용하더라도, 적어도 93 DE까지 동일한 면역원성을 유지하는 것으로 나타났다.
실시예 7B. 면역원성 평가
19, 31, 03 DE의 모든 그룹에서 혈청 샘플을 수득하였으며, 사용할 때까지 -20℃에서 보관하였다. 혈청의 연속 이중 희석물은 IH 검사에서 VIABP-435의 4가지 혈구응집소 단위체(UHA)에 직면했다.
결과는 도 19 내지 21에 요약되어 있으며, 19, 31 및 93 DE에 수행된 시험감염에 대해 면역화된 그룹에서 측정된 항체 수준이 테스트된 모든 백신에 대해 유사하기 때문에, PM 및 IMb의 결과로 유추할 수 있다.
실시예 8. SC를 통한 적용 대비 IM을 통해 투여된 rFAdV9-435 재조합 활성 백신의 효능 및 깃털 모낭에서 마렉 병 HVT 바이러스 검출
330 LPE 닭을 사용하여 표 6에 나와있는 바에 따라서 각각 15 마리의 22 그룹으로 나누었다. 백신을 1 DE에 뿐만 아니라 생후 다양한 시간 후에 (HE) 및 DE (비-백신접종 대조군 제외)에 단독으로 또는 마렉에 대한 HVT 상업용 백신과 병용하여 투여했으며, 4200 UFP/mL의 역가를 가졌으며 상업용 실험실 지시에 따라 사용되었다.
새들을 격리 유닛에 수용시키고, 31 DE에 안구와 비공을 통해서 0.3mL의 VIAAP-H5N2 (균주 A/닭/케레타로/14588-19/95)를 시험감염하였으며, 각 닭에 108.0DIEP50 %의 투여량을 적용했다.
rFAdV9-435 백신 및/또는 HVT을 사용한 치료 그룹.
그룹 다양한 HE 및 DE에 적용된 백신, 투여 경로 및 용량 31 DE에 시험감염
1 DE 2 HE 4 DE 10 DE 14 DE
G1 SC
rFAdV9-435 (7.1 DP) +HVT (혼합)		 10
G2 SC
rFAdV9-435 (7.1 DP) + SC HVT		 10
G3 SC
rFAdV9-435 (6.1 DP)+HVT (혼합)		 10
G4 SC rFAdV9-435 (6.1 DP) + SC HVT 10
G5 SC HVT SC rFAdV9-435 (7.1 DP) 10
G6 SC HVT SC rFAdV9-435 (7.1 DP) 10
G7 SC HVT SC rFAdV9-435 (7.1 DP) 10
G8 SC HVT SC rFAdV9-435 (6.1 DP) 10
G9 SC HVT SC rFAdV9-435 (7.1 DP) 10
G10 SC HVT 10
G11 SC rFAdV9-435 (7.1 DP) 10
G12 SC rFAdV9-435 (6.1) 10
G13 IM rFAdV9-435 (7.1 DP) + SC HVT 10
G14 IM rFAdV9-435 (6.1) + SC HVT 10
G15 SC HVT IM rFAdV9-435 (7.1 DP) 10
G16 SC HVT IM rFAdV9-435 (7.1 DP) 10
G17 SC HVT IM rFAdV9-435 (7.1 DP) 10
G18 SC HVT IM rFAdV9-435 (6.1 DP) 10
G19 SC HVT IM rFAdV9-435 (7.1 DP) 10
G20 IM rFAdV9-435 (7.1) 10
G21 IM rFAdV9-435 (6.1) 10
G22 백신 접종하지 않은 대조군 10
실시예 8A. 마렉 바이러스 HVT 균주 검출
백신 접종 (PV) 후 15 일째에, 면역화된 각 그룹 및 백신 접종되지 않은 대조군에서 5 마리의 닭으로부터의 3개의 깃털 모낭을 수득하고 pH 7.2에서 PBS로 1:5의 비율로 침전된 덩어리를 제조하는데 사용하였고 및 샘플들에 대해 PCR 및 PCRtr 테스트를 수행하였다. 시험 결과를 표 7에 나타내었다.
rFAdV9-435 및/또는 HVT 백신을 사용한 치료 그룹으로부터 얻어진 결과
그룹 PCR/HVT a
15 일 PV 		PCRtr/HVT a
15 일 PV 		VIAAP 시험감염 보호
31 DE 		IMb
G1 양성 1.6 x 106 100% 1.2
G2 양성 6.4 x 106 100 % 2.3
G3 양성 3.1 x 106 100 % 0.8
G4 양성 5.5 x 106 100 % 1.2
G5 양성 7.1 x 106 100 % 0.7
G6 양성 7.8 x 106 100 % 2.1
G7 양성 5.9 x 106 100 % 0.0
G8 양성 5.0 x 106 100 % 0.1
G9 양성 8.3 x 106 100 % 2.3
G10 양성 9.7 x 106 0 % 100 %
G11 음성 음성 100 % 1.0
G12 음성 음성 100 % 2.3
G13 양성 2.4 x 106 100 % 1.2
G14 양성 3.4 x 106 100 % 2.6
G15 양성 3.2 x 106 100 % 1.3
G16 양성 5.7 x 106 100 % 2.4.
G17 양성 1.3 x 106 100 % 2.0
G18 양성 2.6 x 106 100 % 1.7
G19 양성 4.9 x 106 100 % 2.0
G20 음성 음성 100 % 1.8
G21 음성 음성 100 % 2.6
G22 음성 음성 0 % 100 %
관찰할 수 있는 바와 같이, 상이한 백신 접종 달력을 가지고, 마렉에 대한 HVT 균주 백신으로 단독으로나 rFAdV9-435와 함께 백신 접종된 모든 군은, 깃털 모낭에서의 HVT 바이러스 검출에 특이적인 PCR 검사에서 양성 결과를 보였다. 대조적으로, rFAdV9-435으로만 면역화된 군 및 백신 접종하지 않은 대조군은 동일한 PCR/HVT 검사에서 음성 결과를 보였다.
PCRtr 결과에 대하여, HVT 백신만 접종한 군에 대한 결과는 9.7 x 106.0이었지만, HVT와 rFAdV9-435의 적용으로 다른 달력을 가진 모든 백신 접종된 그룹의 경우, 결과는 1.6 x 106.0에서 8.3 x 106.0까지 다양했다. rFAdV9-435 단독 백신 접종한 군과 백신 접종하지 않은 대조군의 경우, 결과는 음성이었다.
rFAdV9-435 백신 (SC 또는 IM) 및 마렉 병의 HVT 바이러스 병원성 (SC)의 투여 경로에 따르면, PCR 및 PCRtr 모두에 대한 결과는 HVT 백신 바이러스가 여러 기관에서 적절하게 복제할 수 있으며 궁극적으로 깃털 모낭에 수용됨에 따라, PCRtr 시험에서 검출된 염기 10 대수의 차이(유의하지 않음)는 적절한 HVT 백신 면역 반응을 피할 수 있을 정도로 HVT 바이러스 복제, 또는 유기체 내에서의 바이러스 부하 또는 순환을 방해하는 rFAdV9-435 백신을 표시하지 않는다는 점을 나타낸다.
실시예 8B. 효능 평가
모든 그룹을 시험감염 후 (PD) 10일 동안 매일 관찰했다. 임상적 평가를 수행하기 위해, 각각의 닭을 개별적으로 검사하였고, 표 3에 따라 관찰된 임상적 변화에 따라 수치를 부여하였다.
PM 및 IMb를 실시예 6A에 표시된 것에 따라 계산하였다. 그 결과 또한 표 7에 나타내었다.
효능 결과는 HVT 백신 유무에 따라, 그리고 상이한 백신 접종 달력을 가지고, SC 또는 IM을 통해 적용된 rFAdV9-435 백신이, PM이 0%이고 최대 IMb가 100%인 백신 접종을 하지 않은 대조군과 대조적으로, 모든 경우에 대해 탁월한 100% PM 및 실질적으로 PM이 0이었음을 나타낸다.
실시예 8A 및 8B로부터의 결과에 기초해서, 마렉 병에 대한 HVT 균주 백신과 IAAP-H5N2에 대한 rFAdV9-435 백신이, 두 백신 중 어느 한 쪽의 면역 반응에도 영향을 주지 않고 함께 사용될 수 있음을 알 수 있다.
실시예 9. SC를 통한 적용 대비 IM을 통해 투여된 rFAdV9-435 재조합 활성 백신의 효능
10 LPE 닭의 5 그룹을 각각 형성하였으며, 표 8에 따라서 그 중 4에 백신을 접종하고 1은 백신 접종을 하지 않은 대조군으로 남겨두었다.
닭들을 격리 유닛에 수용시키고, 31 DE에 안구와 비공을 통해서 0.3mL의 VIAAP-H5N2 (균주 A/닭/케레타로/14588-19/95)를 시험감염하였으며, 각 닭에 7.5 DP을 적용했다.
rFAdV9-435을 사용한 치료 그룹
그룹 백신 적용 일수, 용량 및 백신 투여 경로 VIAAP-H5N2에 의한 접종
1 DE 10 DE 31 DE
G1 rFAdV9-435 IM (6.1 DP/0.2 mL) 10
G2 rFAdV9-435 IM (6.5 DP/0.5 mL) 10
G3 rFAdV9-435 SC (6.1 DP/0.2 mL) 10
G4 rFAdV9-435 SC (6.5 DP/0.5 mL) 10
G5 백신 접종을 하지 않은 대조군 ---- ----- 10
실시예 9A. 효능 평가
모든 그룹을 PD 10 일 동안 매일 관찰했다. 임상적 평가를 수행하기 위해, 각각의 닭을 개별적으로 검사하였고, 표 3에 따라 관찰된 임상적 변화에 따라 수치를 부여하였다.
PM 및 IMb를 실시예 6A에 표시된 것에 따라 계산하였다. 결과들이 도 22에 보여진다.
VIAAP-H5N2로 31 DE에 시험감염하기 전 효능 결과는, G1 및 G2에서 생후 1일에 IM을 통해 적용된 rFAdV9-435 벡터화 백신이, 100% PM와 각각 1.2와 2.3인 IMb를 부여했음을 나타낸다. SC를 통해 면역화된, G3 및 G4의 결과는 rFAdV9-435 백신의 투여에 대해, 100% PM와 1.3와 2.6인 IMb이었는데, SC 경로 및 IM 경로의 사용 가능성을 확인하는 것이다.
실시예 9B. 면역원성 평가
31 DE에 모든 그룹에서 혈청 샘플을 얻었으며, 사용할 때까지 -20℃에서 보관하였다. 혈청의 연속 이중 희석물은 IH 검사에서 VIABP-435의 4가지 혈구응집소 단위체(UHA)에 직면했다.
IH 검사 결과는 도 23에 나와 있다. 31 DE에서 취한 혈청은 각각 G1, G2, G3 및 G4에 대해 24.6, 25.1, 24.5 및 24.8의 평균을 나타내며, 시험감염 전에 새의 보호와 높은 상관관계를 나타낸다.
본 발명의 백신이 IM을 통해 투여될 때와 SC를 통해 투여될 때 순환 항체를 유도하는데 동등하게 효과적임을 확인한다.
실시예 10. 조류 감염성 후두기관염에 대한 rFAd V 9-gB 재조합 활성 백신의 생체 내 평가
실시예 5에 설명된 것과 유사한 방식으로, 조류 감염성 후두기관염(LTI)의 당단백질 B 삽입물과 조류 아데노바이러스 벡터의 재조합 백신, 소위 rFAdV9-gB 백신을 제조하여 그 효과를 시험하였다.
90 마리의 LPE 닭을, 각각 10 마리씩 9 그룹으로 나누고, 백신 접종을 하지 않은 대조군 1 군, 백신 접종을 하지 않은 대조예 및 시험감염하지 않은 1 군, 및 하기 백신으로 면역화한 7 군을 사용하였다: a) rFAdV9-gB 백신; 및 b) 닭 배아 변형 활성 바이러스 (CEP-LTI)를 함유한 상업용 백신. 그룹들을 표 9에 제시된 바에 따라 면역화시켰다.
동물들을 격리 유닛에 수용시키고, 31 DE에 높은 바이러스 부하 LTI 바이러스 (vvLTI), USA 63,140 균주로 시험감염하였고, 이를 각 눈에 2 방울, 각 비공에 3 방울 가하면서, 각각의 닭에 0.3 mL 속의 3.9 DP의 투여량으로 투여하였다.
FAdV9-gB 백신을 사용한 치료 그룹
그룹 1, 4, 10 DE에 SC와 안구(O)를 통한 LTI에 대한 백신 투여량 및 적용 vvLTI에 의한 시험감염
1 DE 4 DE 10 DE 31 DE
G1 SC
rFAdV9-gB (7.1 DP/0.2 mL)		 10
G2 SC
rFAdV9-gB (7.5 DP/0.5 mL)		 10
G3 SC
rFAdV9-gB (7.1 DP/0.2 mL)		 SC
rFAdV9-gB (7.5 DP/0.5 mL)		 10
G4 SC
rFAdV9-gB (6.1 DP/0.2 mL)		 10
G5 SC
rFAdV9-gB (6.5 DP/0.5 mL)		 10
G6 SC
rFAdV9-gB (6.1 DP/0.2 mL)		 SC
rFAdV9-gB (6.5 DP/0.5 mL)		 10
G7 O
CEP-LTI (3.1 DP/0.03 Ml)		 10
G8 백신 접종하지 않은 대조군 10
G9 백신 접종을 하지 않고 시험감염하지 않음 10
실시예 10A. 효능 평가
모든 그룹을 PD 9 일 동안 매일 관찰했다. 임상적 평가를 수행하기 위해, 각각의 닭을 개별적으로 검사하였고, 표 3에 따라 관찰된 임상적 변화에 따라 수치를 부여하였다.
실시예 6A에 표시된 것에 따라 M 및 IMb를 계산하였다. 결과들이 표 10에 보여진다.
서로 다른 그룹의 백신 접종된 LPI 닭들에서 관찰된 IMb 결과는 9 일 PD에 vvLTI로, 임상 증상은 일반적으로 저 강도 내지 중등도 강도이며, G8에서 관찰된 것들, 백신 접종하지 않은 대조군보다 낮았다.
SC를 통해 rFAd9-gB 백신의 7.1 및/또는 7.5 DP로 면역화된 G1, G2 및 G3의 경우, IMb는 각각 6.2, 6.1 및 3.5이었고, 반면에 10 배 낮은 용량의 rFAdV9-gB 백신 (6.1 및/또는 6.5 DP)로 면역화된 G4, G5 및 G6 그룹의 경우, 각각 6.5, 6.3 및 5.2인 유사한 IMb를 얻었다 (표 10). 이러한 결과는 10 배 낮은 용량의 rFAdV9-gB 벡터화 백신을 사용한 경우 백신 접종된 조류가 면역화된 조류에서의 LT의 임상 증상을 보이는 것을 막기 위해 유의한 차이가 나타내지 않았음을 의미한다. 한편, 본 발명의 재조합 백신은 LTI 바이러스, rFAdV9-gB의 gen gB 삽입물을 가지고, CEP-LTI 상업용 백신보다 약간 열악한 후두 및 기관 병변을 예방하는 결과를 나타냈다.
M에 관해서는 어느 그룹에서도 관찰되지 않았다.
rFAdV-gB 백신 효능
그룹 IMb 그룹의 육안 병변 정도
G1 6.2 ++
G2 6.1 ++
G3 3.5 ++
G4 6.5 ++
G5 6.3 ++
G6 5.2 ++
G7 2.4 +
G8 37.0 +++++
G9 0 -
실시예 10B. 육안 병변 예방에 대한 효능 평가
시험감염 후 9 일째 모든 그룹의 새를 희생시키고, 각 그룹의 새의 후두와 기관을 검사하여 육안 병변이 있는지 여부(후두와 기관 점막하 위의 장액 삼출물 및 점상 출혈 존재)를 결정하고, 숫자 5(+++++)를 부여한 백신 접종을 하지 않았지만 시험감염한 G8과, 숫자 0(-)를 부여한 백신 접종을 하지 않았고 시험감염도 하지 않은 대조군 (G9라고 지칭)과 육안적 변화의 정도를 비교하였다.
표 10에 제시된 백신 접종된 서로 다른 그룹의 LPE 닭에서 관찰된 육안 병변 예방 결과에 의하면, rFAdV9-gB 백신으로 면역화된 모든 그룹은 (심지어 이 백신의 10배 낮은 용량이 투여된 G4, G5 및 G6 경우에도) CEP-LTI 상업용 백신에 의해 생성된 보호와 매우 유사한 육안 병변 보호 지수를 보였음을 나타낸다.
이 결과는 10배 낮은 용량의 rFAdV9-gB를 사용하는 것이 면역화된 조류에서 육안 병변의 출현을 줄이는 데 있어서 유의미한 차이를 대표하지 않았으며, 이로 인해 위험을 감수하지 않으면서 완전 바이러스로 제조되고 닭 배아에서 증식된 상업용 백신으로 얻은 결과에 가까운 결과를 얻을 수 있음을 확인시켜 준다.
상기한 바에 따르면, 혈청형-9 가금 아데노바이러스 벡터의 재조합 백신은, 안정적인 재조합 백신을 갖도록 고안되어 결과적으로 마렉 병 백신과 병용 투여시에도 효과적이며 그 효능이 모체 항체의 존재에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 알 수도 있으며, 당업자라면, 상기에서 기술되고 첨부된 도면에 도시된 바에 따라, 혈청형-9 가금 아데노바이러스 벡터의 재조합 백신의 실시예들이 단지 본 발명을 예시하고 비-제한하는 것임을 명백하게 알 것이며, 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 세부사항에 대한 여러 가지의 고려사항의 변경이 가능하기 때문이다. 예를 들어, 다양한 외인성 유전자로 세포 배양의 연속 계대에서 안정성을 달성할 수 있으며, 백신 제형을 위해 여러 유형의 수용가능한 비히클을 이용할 수 있다는 것이 실험적으로 밝혀졌다.
따라서, 본 발명은 선행기술의 수요 및 첨부된 청구항의 범위를 제외하고는 제한적으로 간주되어서는 안된다.
SEQUENCE LISTING <110> LABORATORIO AVI-MEX, S.A. DE C.V. <120> VACCINE IN THE FORM OF A RECOMBINANT SERO TYPE 9 AVIAN ADENOVIRUS VECTOR <130> PCT15-1044 <150> PCT/IB2014/063809 <151> 2014-08-08 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 593 <212> DNA <213> Fowl adenovirus 9 <400> 1 atgggagcca cctacttcga catcaagggc gttctagaca gaggaccttc ttttaaacca 60 tacggaggaa ccgcatacaa tcccctcgcg ccccgcgaag cctttttcaa caattggctt 120 gagtcagagc cgaacaagac cgtcattacg gggttaatga ccacccccta ccgaaacgac 180 caggggaaca agaccaatac tgctgacgta gttaatagcg tgtcgggagt ttatccgaac 240 cccaatctcg gaccctgcat cagcgagatg ggagcactgg atgatgcaac tgctgacctt 300 gtcggctttg cgggacggtt tgcgaaagtt acaaacgaga atacgcgttt ggcatacgga 360 gcgtatgtga aaccgttgaa aaacgatggt tcgcagtcat taaaccccac tccttactgg 420 gtaatggaca agactgacgc caagtatctg ggcgtgatgg ccgtggaaga tttcagcacc 480 agtctcacct atccggacag cttgttaatc cctccgccct cggactactc aaccgttaac 540 acgggcgcaa tgaaagcaaa ccgtcctaac tacatcggtt tcagagataa ctt 593 <210> 2 <211> 1695 <212> DNA <213> Influenza A virus <400> 2 atggaaagaa tagtgattgc ctttgcaata atcagcattg ttacaggtga ccaaatctgc 60 attggttatc atgcaaacaa ttcaacaaaa caagttgata caatcatgga aaagaatgtg 120 acggtcacac atgctcagga catactagaa aaagaacaca atggaagact ctgcagtctt 180 aaaggagtaa agcccctcat cctgaaggat tgcagcgtag ctgggtggat tctgggaaat 240 cctatgtgtg gtgaattcct gaatgtgccg gaatggtcat acattgtgga gaaagacaac 300 ccatccaatg gcctgtgtta ccctggaaac ttcgacaatt atgaagaatt gaagcattta 360 atgagcagca caaatcacat cgagagaatt cagatatttc ctaggagctc ttggtccaac 420 cataatgcct catcaggagt gagctcggca tgcccgtcca atggtatatc ttcctttttc 480 cggaatgtag tgtggttgat caagaaggat aatgtgtacc gaacactaaa gaagaactac 540 accaacacca atgtagaaga ccttttaata atgtggggag ttcatcaccc tactgatgca 600 actgagcaga caaaactcta ccagaacctg aacacttatg tatcggtggg aacatcaaca 660 ctaaatcaga ggtcaatccc gaaaatagcc accagacccc aggtgaacgg acagagagga 720 aggatggaat ttttttggac aatattaaag ccgaacgatt caatcttttt tgagagtact 780 gggaacttta tagctcccga atatgcatac aagatcacta aaaaagggaa atcagcagtc 840 atgaaaagtg aactggatta tggcgactgt aataccaaat gccagacccc agtgggtgct 900 gtaaattcca gtctgccttt ccacaatgtc catcccttta ccattgggga atgccccagg 960 tatgtaaaat cgaagaaact ggtccttgca acaggattaa gaaatgtacc ccaaaaagaa 1020 acaagaggct tatttggagc aatagctgga ttcatagaag gggggtggca aggaatggtg 1080 gatggatggt atggatacca tcatagcaat gagcagggta gtgggtatgc tgcagacaaa 1140 gaatctacac agaaagcaat taatggaatc actaataaag tcaactcaat cattggcaaa 1200 atgaacactc agttcgaagc cattgggaaa gaattcaaca acctagaaag gagaatagaa 1260 aatttgaata agaaaatgga agatgacttt ttggatgtat ggacttacaa tgcagaactt 1320 ctagtgctca tggaaaacga gagaactctg gatctccatg attcaaatgt caagaattta 1380 tacgataagg tccgactcca actgagagat aatgcaaaag aactaggcaa cggatgcttt 1440 gaattctacc acaagtgtga caatgaatgc atggaaagtg tgagaaatgg aacgtatgat 1500 tacccacaat actcaaaaga gtcaaaactg aatagagagg aaatagaagg ggtcaaatta 1560 gaatcaacag ggacttatca gatactttca atctattcaa cagtggcgag ttccctagca 1620 ctggcaatca tggtagctgg tctatctttt tggatgtgct ccaatggatc attgcagtgc 1680 agaatttgca tctaa 1695

Claims (23)

  1. 관심 질환의 적어도 1종의 항원을 암호화하고, 아데노바이러스의 게놈 비-필수 영역을 대체하는, 적어도 1개의 외인성 뉴클레오티드 서열이 삽입된, 혈청형 9 가금 아데노바이러스 벡터(FAdV-9), 및 약학적으로 허용가능한 비히클, 보강제 및/또는 부형제를 포함하는 재조합 백신으로, 상기 외인성 뉴클레오티드 서열이 491-2782 뉴클레오티드에 위치하는 것을 특징으로 하는, 재조합 백신.
  2. 제1항에 있어서, 상기 FAdV-9 벡터는 생백신 (활성) 또는 비활성화된 재조합 백신.
  3. 제1항에 있어서, 상기 FAdV-9 벡터는 서열번호 1의 서열을 포함하는 재조합 백신.
  4. 제1항에 있어서, 상기 외인성 뉴클레오티드 서열은 조류 인플루엔자, 봉입체를 갖는 간염, 조류 감염성 후두기관염, 뉴캐슬 병, 닭 전염성 파브리시우스 낭병, 전염성 기관지염, 메타뉴모바이러스(MPNV) 원인 질환, 마렉 병, 조류 감염성 빈혈증 또는 크기가 상기 FAdV-9 벡터 내 삽입을 허용하는 다른 임의의 유전자로부터 선택된, 관심 질환의 적어도 1종의 항원을 암호화하는 재조합 백신.
  5. 제4항에 있어서, 상기 외인성 뉴클레오티드 서열은 조류 인플루엔자 바이러스의 혈구응집소(HA); 봉입체 간염 바이러스의 섬유 및 헥손, 혈청형 4 및 8; 조류 유래 감염성 후두기관염(LTI) 바이러스의 당단백질 B (gB) 및 당단백질 D (gD); 뉴캐슬병 바이러스의 HN 및 F 단백질; 파브리시우스 낭병의 VP2 단백질 바이러스 감염; 감염성 기관지염 바이러스의 S1 및 S2 단백질; 메타뉴모바이러스(MPNV)의 F 단백질; 및 조류 전염성 빈혈의 VP1, VP2 및 VP3 단백질을 포함하는 군의 항원을 암호화하는 재조합 백신.
  6. 제5항에 있어서, 상기 조류 인플루엔자 바이러스의 HA는 상기 단백질의 아형 H1, H2, H3, H5, H6, H7 또는 H9 중 적어도 하나로부터 선택되는 재조합 백신.
  7. 제1항에 있어서, 상기 외인성 뉴클레오티드 서열은 바이러스 벡터로서 이용되는 상기 FAdV-9와 다른 가금 아데노바이러스의 적어도 1종의 항원을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 백신.
  8. 제1항에 있어서, 상기 항원 반응을 달성하기 위해 요구되는 바이러스 농도는 투여량 당 적어도 105.0 DICC50 %인 재조합 백신.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항원 반응을 달성하기 위해 요구되는 바이러스 농도는 투여량 당 적어도 106.0 DICC50 %인 재조합 백신.
  10. 제2항에 있어서, 상기 백신이 생백신(활성)인 경우, 상기 약학적으로 허용가능한 비히클은 바람직하게는 TPGA 안정화제(트레할로스, 포스페이트, 글루타메이트, 알부민)를 포함하는 수용액; 펩톤 안정화제를 포함하는 수용액; 및 탈지유를 포함하는 수용액으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 수용액인 재조합 백신.
  11. 제2항에 있어서, 상기 백신이 비활성화된 것인 경우, 상기 약학적으로 허용가능한 비히클은 수용액 또는 에멀젼인 재조합 백신.
  12. 제11항에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 비히클은 물-오일 에멀젼; 오일-물 에멀젼; 또는 물-오일-물 에멀젼인 재조합 백신.
  13. 제2항에 있어서, 상기 생백신 또는 활성 백신은 근육 내, 비강 내, 피하, 살포, 분무, 경구 또는 음용수를 통해, 또는 난 내 투여되도록 조제된 재조합 백신.
  14. 제2항에 있어서, 상기 비활성화 백신은 근육 내 또는 피하, 바람직하게는 피하로 투여되도록 조제된 재조합 백신.
  15. 제1항에 있어서, 마렉 병 전바이러스 백신을 포함하는 재조합 백신.
  16. 제1항에 있어서, 동일한 관심 질환 또는 상이한 관심 질환으로부터의 적어도 2종의 항원을 암호화하고, 491-2782 뉴클레오티드 사이에 위치하는 아데노바이러스의 게놈 비-필수 영역을 대체하는, 적어도 2개의 외인성 뉴클레오티드 서열이 삽입된, FAdV-9 벡터를 포함하는 재조합 백신.
  17. 제1항에 있어서, 동일한 관심 질환 또는 상이한 관심 질환으로부터의 제1 백신과 다른 적어도 1종의 항원을 암호화하고, 491-2782 뉴클레오티드 사이에 위치하는 아데노바이러스의 게놈 비-필수 영역을 대체하는, 적어도 1개의 외인성 뉴클레오티드 서열이 삽입된, FAdV-9 벡터에 기초한 적어도 제2 백신을 포함하는 재조합 백신.
  18. 관심 항원 질환을 암호화하고, 491-2782 뉴클레오티드 사이에 위치하는 아데노바이러스의 게놈 비-필수 영역을 대체하는, 외인성 뉴클레오티드 서열이 삽입된, 혈청형-9 가금 아데노바이러스 재조합 바이러스(FAdV-9)의 마스터 시드로, 여기서 상기 마스터 시드는 세포 배양에서 6 내지 11회 계대시킨 후에 수득되는, 마스터 시드.
  19. 동물에서 면역 반응을 생성할 수 있는 재조합 백신을 제조하기 위한, 관심 항원 질환을 암호화하고, 491-2782 뉴클레오티드 사이에 위치하는 아데노바이러스의 게놈 비-필수 영역을 대체하는, 외인성 뉴클레오티드 서열이 삽입된, 혈청형-9 가금 아데노바이러스 벡터 (FAdV-9)의 용도.
  20. 제19항에 있어서, 상기 재조합 백신은 단일 투여량 또는 2회 이상의 투여량으로 투여되는 것인 용도.
  21. 제20항에 있어서, 상기 재조합 백신은 단일 투여량으로 투여되는 것인 용도.
  22. 제21항에 있어서, 상기 재조합 백신은 단독 또는 다른 재조합 또는 비-재조합, 생(활성) 백신 또는 비활성화 백신과 함께 투여되는 것인 용도.
  23. 제22항에 있어서, 상기 재조합 백신은 마렉 병에 대한 백신과 함께 투여되는 것인 용도.
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