JP2024501943A - 多価ｈｖｔベクターワクチン - Google Patents

Abstract

本発明は、家禽用多価ベクターワクチンとして有用である組換えＨＶＴ（ｒＨＶＴ）構築物に関する。本発明のｒＨＶＴは、家禽病原体由来の４つの異種遺伝子、すなわち、ＩＢＤＶ由来のＶＰ２遺伝子、ＮＤＶ由来のＦ遺伝子、ならびにＩＬＴＶ由来のｇＤ遺伝子およびｇｌ遺伝子を含む。ＶＰ２遺伝子およびＦ遺伝子がｒＨＶＴのＵｓゲノム領域に挿入される。ｇＤ遺伝子－ｇｌ遺伝子がＵＬ４４とＵＬ４５との間またはＵＬ４５とＵＬ４６との間のどちらかでＵＬゲノム領域に挿入される。本発明のｒＨＶＴは、インビトロおよびインビボで遺伝的に安定であることが判明し、すべての挿入遺伝子を、ＩＢＤＶ、ＮＤＶおよびＩＬＴＶに対する防御免疫をワクチン接種家禽において誘発するために十分に足りるほど発現した。【選択図】図１

Description

本発明は、動物用ワクチンの分野、すなわち、ウイルスベクターワクチンとしてのシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスに基づく家禽用ワクチンに関する。特に、本発明は、シチメンチョウの組換えヘルペスウイルス（ｒＨＶＴ）、前記ｒＨＶＴを含む宿主細胞、前記ｒＨＶＴおよび前記宿主細胞の医学的使用、前記ｒＨＶＴおよび／または前記宿主細胞を含むワクチン、ならびに前記ワクチンの製造方法に関する。

組換えベクターウイルスは、異種遺伝子を発現させ、そのコードされたタンパク質をヒト標的または非ヒト動物標的に送達するための広く知られた手段である。例として、ワクシニアベクター、麻疹ベクターまたはアデノウイルスベクターが挙げられる。異種遺伝子が病原体由来の免疫原性タンパク質をコードするときには、これは、その病原体によって引き起こされる疾患に対する標的の効果的なワクチン接種の手段であり得る。複製する微生物として、ベクターウイルスは、ワクチン接種された標的における増殖性感染を異種遺伝子をそれ自身の遺伝子と共に発現させながら確立することができ、このようにして標的における防御免疫応答を誘発することができる。

動物用ワクチン接種において、とりわけ家禽へのワクチン接種のために、様々なベクターワクチンが、それらは使用が比較的容易でありかつコストが比較的低いために関心を集めている。いくつかのトリ用ベクターワクチンが、例えば、トリアデノウイルス、鶏痘ウイルス、および特にシチメンチョウのヘルペスウイルス（ＨＶＴ）に基づくものがこれまで検討されてきている（国際公開第８７／０４４６３号および国際公開第９０／００２８０３号を参照のこと）。ＨＶＴをベクターとして使用することの利点は、ＨＶＴは鳥類に対して非病原性であり、挿入された遺伝子を運び、発現することができ、免疫をそのウイルスファミリーの病原性メンバーに対して、すなわち、マレック病ウイルス１型またはマレック病ウイルス２型（ＭＤＶ１またはＭＤＶ２）に対して誘発することができるということである。

長年にわたり、種々のトリ病原体に由来する様々な遺伝子がＨＶＴウイルスベクターによって発現されている：例えば、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）、および伝染性気管支炎ウイルスに由来する遺伝子（国際公開第９３／０２５６６５号を参照のこと）、トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）由来の遺伝子（国際公開第２０１２／０５２３８４号を参照のこと）、または寄生虫エイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）由来の遺伝子（Ｃｒｏｎｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｃｔａ Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．４３，ｐ．１９２－１９７）など。このことは、家禽用の様々な商用ＨＶＴベクターワクチンの開発につながっている：例えば、ＮＤに対してはＩｎｎｏｖａｘ（登録商標）－ＮＤ（ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）およびＶｅｃｔｏｒｍｕｎｅ（商標）ＨＶＴ－ＮＤＶ（Ｃｅｖａ Ｓａｎｔｅ Ａｎｉｍａｌｅ）、ＩＬＴに対してはＩｎｎｏｖａｘ（登録商標）－ＩＬＴ（ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）、ＩＢＤに対してはＶａｘｘｉｔｅｋ（商標）ＨＶＴ＋ＩＢＤ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ－Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）（以前の名称：Ｇａｌｌｉｖａｃ（商標）ＨＶＴ－ＩＢＤ）およびＶｅｃｔｏｒｍｕｎｅ（登録商標）ＮＤ（Ｃｅｖａ Ｓａｎｔｅ Ａｎｉｍａｌｅ）、ＡＩに対してはＶｅｃｔｏｒｍｕｎｅ（登録商標）ＡＩ（Ｃｅｖａ Ｓａｎｔｅ Ａｎｉｍａｌｅ）。

異種遺伝子がそのウイルスゲノムに挿入されることは、それにより、その複製、発現および／またはその遺伝的安定性がインビトロおよび／またはインビボにおいて影響を受けることがあるので、ベクターウイルスに対する負担である。これらの問題は、２つ以上の異種遺伝子が挿入されるときには特に顕著である。そのような多価組換えベクターワクチンは、潜在的に多数の疾患に対する保護を単回接種後に与えることができる。しかしながら、そのようなベクター構築物は、すべての意図された病原体に対するワクチン接種標的における防御免疫応答を誘発し、かつ維持するためには、依然としてベクターおよびその挿入物の良好な複製をインビトロおよびインビボの両方で、そして、その異種遺伝子のすべての効果的な発現を十分に高いレベルで、かつ有意な期間にわたって提供しなければならない。

遺伝的安定性はまた、大規模産生のために必要であるインビトロでの多数回の複製について可能にするであろう。加えて、そのような安定性は、販売のための許認可を、組換えウイルスが商用製造物として現場に導入され得る前に政府当局または規制当局から得るために、（遺伝子組換え生物である）インビボでの組換えウイルスによって満たされなければならない安全性および生物学的安定性の非常に高い基準を遵守していることをもたらすための要件である。

多くの多価ＨＶＴベクターワクチンが、例えば、国際公開第９３／０２５６６５号および国際公開第９６／００５２９１号に記載されるようにこれまで記載されている。しかしながら、そのような刊行物に記載される多遺伝子構築物のほとんどが示唆されるに過ぎず、多数の挿入物を有する組換えベクターの一部が実際に構築され、単離されたに過ぎなかった。ごく少数がこれまでに鳥で試験された。全体として、複製時のそれらの安定性、または外来遺伝子の発現レベルに関して、結果は何ら得られておらず、ましてや、標的動物における効果的な免疫防御の誘発に関するいかなるデータも得られていない。多価ＨＶＴベクター構築物のごく少数のみが実際に認可された市販のワクチン製造物になっているのは、挿入物の遺伝的安定性および継続した発現に関するそのような課題のためである。現在、これらは、Ｉｎｎｏｖａｘ（登録商標）ＮＤ－ＩＢＤ（ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ；国際公開第２０１６／１０２６４７号）、Ｉｎｎｏｖａｘ（登録商標）ＮＤ－ＩＬＴ（ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ；国際公開第２０１３／０５７２３６号）、ＵＬＴＩＦＥＮＤ（商標）ＩＢＤ ＮＤ（Ｃｅｖａ Ｓａｎｔｅ Ａｎｉｍａｌｅ；国際公開第２０１３／１４４３５５号）、およびＶａｘｘｉｔｅｋ（登録商標）ＨＶＴ＋ＩＢＤ＋ＮＤ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ－Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ；国際公開第２０１８／１１２．０５１号）である。

Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０２０，Ｖａｃｃｉｎｅｓ，ｖｏｌ．８，ｐ．９７）は、種々の異種遺伝子を含有するｒＨＶＴ、すなわち、ＨＶＴのＵＬ４５遺伝子とＵＬ４６遺伝子との間に挿入されるＩＢＤＶのＶＰ２遺伝子、ＵＬ６５遺伝子とＵＬ６６遺伝子との間に挿入されるＩＬＴＶのｇＤ遺伝子およびｇＩ遺伝子、ならびにＵｓ２におけるＡＩＶのＨＡ遺伝子を含有するｒＨＶＴを記載する。これらのｒＨＶＴはインビトロ細胞培養物で試験されただけであった。

国際公開第２０１６／１０２６４７号には、ｒＨＶＴがＩＢＤＶのＶＰ２遺伝子およびＮＤＶのＦ遺伝子を、ＨＶＴのＵｓゲノム領域のＵｓ２遺伝子に挿入されるただ１つの発現カセットから発現する、ＨＶＴベクターワクチンが記載される。

国際公開第２０１９／０７２９６４号には、ＭＤＶ、ＮＤＶ、ＩＢＤＶおよびＩＬＴＶに対する保護をもたらすことができる多価ｒＨＶＴベクターのワクチンが記載される。挿入物がＨＶＴゲノムのＵＬ５４．５遺伝子の中およびＵｓ２遺伝子の中に配置された。

しかしながら、いくつかの方法が、家禽疾患に対処するためにあるので、家禽の効果的なワクチン接種のためのより多くのさらなる選択肢が絶えず求められている。

国際公開第８７／０４４６３号 国際公開第９０／００２８０３号 国際公開第９３／０２５６６５号 国際公開第２０１２／０５２３８４号 国際公開第９６／００５２９１号 国際公開第２０１６／１０２６４７号 国際公開第２０１３／０５７２３６号 国際公開第２０１３／１４４３５５号 国際公開第２０１８／１１２．０５１号 国際公開第２０１９／０７２９６４号

Ｃｒｏｎｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｃｔａ Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．４３，ｐ．１９２－１９７ Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｖａｃｃｉｎｅｓ，ｖｏｌ．８，ｐ．９７

この分野における必要性に順応させ、そして、４つのトリ病原体（ＭＤＶ、ＮＤＶ、ＩＢＤＶおよびＩＬＴＶ）に対する家禽の免疫化を、ただ１つのワクチンを介して可能にするｒＨＶＴベクターワクチンを提供することが本発明の目的である。

驚くべきことに、ＩＢＤＶのＶＰ２遺伝子およびＮＤＶのＦ遺伝子をＵｓゲノム領域から発現し、かつ、ＩＬＴＶのｇＤ遺伝子およびｇＩ遺伝子をＵＬゲノム領域における２つの特異的な遺伝子座の一方から発現するｒＨＶＴを提供することによって、この目的が満たされ得ること、その結果として、先行技術の１以上の短所が克服され得ることが見出された。

本発明者らは、ＩＢＤＶ－ＶＰ２遺伝子およびＮＤＶ－Ｆ遺伝子を発現すると知られているｒＨＶＴ（「ｒＨＶＴ－ＶＰ２－Ｆ」）によって既に提供されている保護を、ＩＬＴＶに対する保護を伴って拡張することを試みた。選択された追加の異種遺伝子がＩＬＴＶのｇＤ遺伝子およびｇＩ遺伝子であった。いくつかの多挿入物ｒＨＶＴは、インビトロおよびインビボで試験されたとき、安定な多価組換えウイルスを生じさせることができず、すなわち、いくつかは多価組換えＨＶＴの複製ができず、また、いくつかは異種遺伝子の１以上の発現を喪失したことが見出された。

例えば、ＨＶＴのＵＬ３９遺伝子（リボヌクレオチドレダクターゼのラージサブユニット）の遺伝子座の中へのｇＤ遺伝子およびｇＩ遺伝子の追加挿入は、中央部分に挿入されるときまたはＵＬ３９遺伝子の３’領域に挿入されるときのどちらも成功しなかった。これらのｒＨＶＴ構築物はインビトロでＣＥＦ細胞において複製したが、ニワトリに接種されたときには複製することが完全にできなかった。

ＩＬＴＶのｇＤ遺伝子およびｇＩ遺伝子を、ＵＬ４０（リボヌクレオチドレダクターゼのスモールサブユニット）とＵＬ４１遺伝子（ビリオン宿主シャットオフタンパク質）との間に挿入されるか、またはＵＬ４７遺伝子（外皮リンタンパク質）とＵＬ４８遺伝子（前初期遺伝子転写活性化因子）との間に挿入されて、そのどちらかで含む構築物もまた、効果がなかった：ＵＬ４０－４１挿入物構築物は、（ｒＨＶＴ－ＶＰ２－Ｆ構築物と比較して）インビトロでは正常に複製し、しかし、ヒヨコでのインビボでは低下したレベルで複製した。加えて、この構築物は、Ｆ遺伝子およびＶＰ２遺伝子の発現を失ったので、インビボにおいて遺伝的に不安定であることが判明した。匹敵する状況がＵＬ４７－４８挿入物構築物について生じた：この構築物もまた、インビトロでは正常に、そしてインビボでは低下した速度で複製し、また、ｇＤ遺伝子およびｇＩ遺伝子の発現は非常に低いレベルであったに過ぎず、ＩＬＴＶに対する効果的なワクチン接種には不十分であったので、この構築物もまた、インビボでは遺伝的に安定でなかった。ＵＬ４７－４８挿入物構築物についてのこの知見は、ＵＬ４７遺伝子およびＵＬ４８遺伝子はＨＶＴゲノムのトランスポゾン遺伝子ノックアウト研究において非必須であることが報告されていたので（Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ，ｖｏｌ．１２，ｐ．１３０）、ことのほか期待外れであった。

本発明者らの所見は、挿入物が多くなると、ウイルスベクターの遺伝的安定性に対するより多くの問題が複製および外来遺伝子発現に関して生じるというこの分野における一般的な認識と一致していた。この場合、元となるベクターが既に２つの他の異種遺伝子を発現するという事実がＩＬＴＶのｇＤ遺伝子およびｇＩ遺伝子の追加発現のための事態を複雑化していることが明らかであった。このことは、成功した組換えＨＶＴ構築物がどんなものであるかの予測が、ＨＶＴゲノムにおける異種遺伝子のための許容可能な挿入部位が何であるかに関する先行技術における所見に基づくことができないようなほどでさえあった。同様に、ある種のｒＨＶＴ構築物（例えば、Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０２０（上掲）に記載されるようなｒＨＶＴ構築物）のインビトロでの効果的な複製の報告は、インビボ特性を予測するために依拠することができない。

そのため、ＩＬＴＶのｇＤ遺伝子およびｇＩ遺伝子を有する発現カセットの、ＨＶＴのＵＬゲノム領域における２つの他の挿入部位への追加組み込みにより、安定かつ効果的な多価ＨＶＴベクター構築物が生じること、具体的には、ＨＶＴのＵＬ４４遺伝子とＵＬ４５遺伝子との間、またはＨＶＴのＵＬ４５遺伝子とＵＬ４６遺伝子との間における挿入により、安定かつ効果的な多価ＨＶＴベクター構築物が生じることは予想外であった。これらの挿入遺伝子座は、本明細書中では「ＵＬ４４－４５」遺伝子座または「ＵＬ４５－４６」遺伝子座としてそれぞれ示されるであろう。

ＦおよびＶＰ２をＵｓに有し、ｇＤ遺伝子およびｇＩ遺伝子をＵＬ４４－４５遺伝子座またはＵＬ４５－４６遺伝子座に有する得られた多価ｒＨＶＴベクターは、インビトロ細胞培養における１５回の連続した継代の後でさえ、遺伝的に安定であることが見出された。ウイルスは続いて、インビボでの数回のさらなる複製サイクルを引き起こすニワトリへの接種のために使用された。その後、ウイルスが、ワクチン接種されたニワトリの脾臓からワクチン接種後１５日で再び単離され、すべての挿入遺伝子の発現を維持することについて分析された。両方のＵＬ挿入部位ｒＨＶＴについて、ワクチン接種後１５日での再単離ウイルスは、完全に遺伝的に安定であることが見出された：免疫蛍光プラークアッセイにおいて、試験されたすべての再単離ウイルスは、すべての異種遺伝子の発現、すなわち、Ｆ、ＶＰ２、ｇＤおよびｇＩの発現を明らかにした。

ワクチン接種されたニワトリはまた、発現した異種抗原（Ｆ、ＶＰ２、ｇＤおよびｇＩ）のそれぞれに対する優れたセロコンバージョンを示した。３つの病原体（ＮＤＶ、ＩＢＤＶおよびＩＬＴＶ）のそれぞれに対して到達した抗体レベルは、感染または疾患に対するインビボ保護のために要求されることが知られているそれらのレベルを十分に超えていた。詳細が実施例において示される。

したがって、これらの新しい多価ｒＨＶＴベクターウイルスは安定であり、ＭＤＶ、ＮＤＶ、ＩＢＤＶおよびＩＬＴＶの１以上またはすべてに対するワクチンとして有用である。

４つの主要な家禽疾患に対するワクチン接種をただ１つのワクチンから得る可能性があることは、このワクチン接種が標的動物についてはストレスのかなりの軽減を、並びに、養鶏業者については労力およびコストの削減を表すので、非常に有益である。

ＶＰ２遺伝子およびＦ遺伝子を発現するｒＨＶＴがＵＬ４４－４５挿入遺伝子座またはＵＬ４５－４６挿入遺伝子座におけるＩＬＴＶのｇＤ遺伝子およびｇＩ遺伝子の追加発現をどのように許容し得るかまたはなぜ許容し得るかは正確には知られておらず、これに対して、いくつかの他の部位における挿入は、これらの部位ならば好適であると最初には思われたが、安定かつ効果的なベクター構築物をもたらさなかった。

本発明者らは、どのような理論またはモデルであれこれらの知見を説明するかもしれないであろう理論またはモデルによって縛られることを望まないが、この効果が、インビトロおよびインビボでの複製および発現のために要求されるときには多価ｒＨＶＴにおける様々な発現パターンの複雑な相互作用から生じると仮定する。不明な理由のために、追加の遺伝子がＵＬにおけるこれらの特異的な遺伝子座で挿入されることにより、異種遺伝子の発現の強さと、これがＨＶＴそのものの複製能力および遺伝的安定性に与えるストレスとの間におけるちょうど適切なバランスを有する多価ｒＨＶＴがもたらされ、これに対して、他の構築物では、（予測不能であったが）そのような多価ｒＨＶＴがもたらされない。

したがって、１つの局面において、本発明は、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）のウイルスタンパク質２（ＶＰ２）遺伝子およびニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）の融合（Ｆ）タンパク質遺伝子を、ｒＨＶＴのゲノムのユニークショート（ｕｎｉｑｕｅ ｓｈｏｒｔ；Ｕｓ）領域に挿入される第１の発現カセットから発現するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルス（ｒＨＶＴ）であって、前記ｒＨＶＴがまた、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）の糖タンパク質Ｄ遺伝子および糖タンパク質Ｉ遺伝子（ｇＤ遺伝子およびｇＩ遺伝子）を、前記ｒＨＶＴのゲノムのユニークロング（ｕｎｉｑｕｅ ｌｏｎｇ：ＵＬ）領域においてＵＬ４４遺伝子とＵＬ４５遺伝子との間またはＵＬ４５遺伝子とＵＬ４６遺伝子との間のどちらかで挿入される第２の発現カセットから発現することを特徴する、シチメンチョウの組換えヘルペスウイルス（ｒＨＶＴ）に関する。

「組換え（の）」は、元々は保有していなかった遺伝子構成をもたらすように出発状態または天然状態に対してその遺伝物質が改変されている核酸分子または微生物である。典型的には、そのような構築物は人工的であり、人によって作られたものである。

「シチメンチョウのヘルペスウイルス（ＨＶＴ）」はまた、ＭＤＶ３、メレアグリッド（Ｍｅｌｅａｇｒｉｄ）ヘルペスウイルス１、またはシチメンチョウヘルペスウイルスとも呼ばれる。ＨＶＴは１９７０年に初めて記載された（Ｗｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７０，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．３１，ｐ．５２５）。ＨＶＴの広く知られた株、例えば、ＰＢ１またはＦＣ－１２６などが、長い間、ＭＤＶ１またはＭＤＶ２によって引き起こされるマレック病に対する家禽用の生ワクチンとして使用されている。

シチメンチョウのヘルペスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスおよび伝染性喉頭気管炎ウイルスはすべて、獣医学的関連性を有する広く知られたウイルスである。同じことが、マウスおよびヒトのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ならびにネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）について当てはまる。そのようなウイルスは、その分類学群の特徴づける特徴、例えば、形態学的特徴、ゲノム特徴および生化学的特徴など、並びに、生物学的特性、例えば、生理学的挙動、免疫学的挙動または病理学的挙動などを有する。

これらのウイルスに関する一般的な情報が、例えば、参考ハンドブックから、例えば、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（ＬＷＷ ｐｕｂｌ．，ＩＳＢＮ：９７８１４５１１０５６３６）などから入手可能である。これらのウイルスによって引き起こされる疾患に関する情報が、例えば、’Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｍａｎｕａｌ’（２０１０，１０ｔｈ ｅｄ．，２０１０，Ｃ．Ｍ．Ｋａｈｎ ｅｄｔ．，ＩＳＢＮ：０９１１９１０９３Ｘ）、および’Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｐｏｕｌｔｒｙ’（２００８，１２ｔｈ ｅｄ．，Ｙ．Ｓａｉｆ ｅｄ．，Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖ．ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ－１０：０８１３８０７１８２）のようなハンドブックから入手可能である。本発明における使用のためのこれらのウイルスのサンプルを、様々な供給源から、例えば、ヒトからの現場単離体として、または野生もしくは農場における非ヒト動物からの現場単離体として、あるいは様々な研究所、（寄託）機関または（獣医学）大学から得ることができる。これらのウイルスは、日常的な血清学的ツールまたは分子生物学的ツールを使用して容易に特定することができる。これらすべてのウイルスから、多くの遺伝情報が、公開されている配列データベースにおいて、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋ（商標）、ＵｎｉＰｒｏｔ、およびＥＭＢＬのＥＢＩなどにおいてデジタル情報として利用可能である。

この分野では知られているように、特定の分類学群における微生物の分類はその特徴の組み合わせに基づいている。そのため、本発明にはまた、例えば、亜種、株、単離体、遺伝子型、バリアント、サブタイプまたはサブグループなどとして、何らかの方法で細分類されるこれらのウイルス種のバリアントが含まれる。

さらに、本発明のための特定のウイルスが現在はこの種に帰属させられているかもしれないが、新たな識見により、新しい分類学群または異なる分類学群に再分類される可能性があるため、その分類は、やがては変わり得るかもしれない分類学的分類であることが、本発明の分野の当業者には明らかであろう。しかしながら、このことはウイルス自体またはその抗原レパートリーを変化さるのではなく、その科学的な名称または分類のみを変化させるため、そのような再分類されたウイルスは依然として本発明の範囲の範囲内にある。

「ＶＰ２タンパク質遺伝子」はこの技術分野では広く知られており、ＩＢＤＶのカプシドタンパク質をコードする。ＶＰ２タンパク質遺伝子は典型的タイプのＩＢＤＶまたはバリアントタイプのＩＢＤＶに由来する場合があり、あるいはキメラである場合がある。

同様に、「Ｆタンパク質遺伝子」は広く知られており、ＮＤＶの融合糖タンパク質をコードする。本発明については、Ｆタンパク質遺伝子は、長潜伏期性タイプ、亜病原性タイプまたは短潜伏期性タイプのＮＤＶから得ることができ、あるいはキメラである場合がある。

用語「遺伝子」は、タンパク質をコードすることができる核酸の区域を示すために使用される。本発明については、これは、「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）、すなわち、遺伝子のプロモーターを含まないＤＮＡのタンパク質コード区域に対応する。本発明についての遺伝子は完全なタンパク質をコードする場合があり、または、タンパク質のある区域、例えば、タンパク質の成熟形態のみをコードする、すなわち、「リーダー」、「アンカー」または「シグナル配列」を含まないタンパク質の区域をコードする場合がある。遺伝子は、タンパク質の特異的な区域、例えば、免疫防御エピトープを含む区域をコードする場合さえある。

この関連で、本発明についての「タンパク質」はアミノ酸の分子鎖である。タンパク質として、生来型タンパク質または成熟タンパク質、プレタンパク質またはプロタンパク質、あるいはタンパク質の機能的フラグメントが可能である。そのため、ペプチド、オリゴペプチドおよびポリペプチドは、これらが依然として、関連した免疫学的エピトープおよび／または機能的領域を含有する限り、タンパク質の定義の範囲内に含まれる。

本発明については、遺伝子がｒＨＶＴベクターを作製するために使用された元のＨＶＴに存在しなかったならば、その遺伝子は当該遺伝子を運ぶｒＨＶＴベクターに対して「異種」である。

本発明については、用語「発現」は、タンパク質が転写および翻訳を介して産生されるための規則が遺伝情報により提供される遺伝子発現の広く知られた原理を示す。

「発現カセット」は、少なくとも１つの異種遺伝子と、その遺伝子の転写を行わせるためのプロモーターとを含む核酸フラグメントである。転写の終結がベクターゲノムにおけるカセットのゲノム挿入部位によって提供される配列から生じる場合があり、または発現カセットは、それ自体が終結シグナル、例えば、転写ターミネーターなどを含むことができる。

そのようなカセットでは、プロモーターおよび（任意には）ターミネーターの両方が、それらが発現を調節する遺伝子の極近傍にあることが必要であり、このことは、「機能的に連結される」として知られており、それによって、それらの間には、転写の効果的な開始－終結にそれぞれ介入するであろう意味のある他の配列が存在しない。

発現カセットはＤＮＡ形態またはＲＮＡ形態で存在することが可能であるが、ＨＶＴベクターにおけるその意図された使用のために、本発明のための発現カセットはＤＮＡとして用いられる。当業者には明らかであろうように、発現カセットは自己完結型の発現モジュールであり、そのため、ベクターウイルスゲノムにおけるその配向は一般に重要でない。

任意に、発現カセットは、さらなるＤＮＡエレメントを、例えば、構築およびクローニングを支援するためのＤＮＡエレメント、例えば、制限酵素認識またはＰＣＲプライマーのための部位などを含有する場合がある。

発現カセットは、全体としてベクターのゲノムにおけるただ１つの遺伝子座の中に挿入される。種々の技術が遺伝子座およびその挿入の向きを制御するために利用可能である。例えば、ベクターのゲノムからの隣接区域を使用することによって、カセットを特異的な方法で、例えば、米国特許第５，９６１，９８２号に記載されるような重複するコスミドを使用することにより相同的組換えプロセスによって組み込むものである。代替において、組み込みが、Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１８（Ｖａｃｃｉｎｅ，ｖｏｌ．３６，ｐ．７１６－７２２）に記載されるようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用することによって行われる場合がある。

本発明については、ベクターのゲノムにおける「挿入された」発現カセットは、挿入されたエレメントがベクターの生来的遺伝子と一緒に転写され、かつ翻訳されるようにベクターのゲノム核酸の中に組み込まれていることを示す。ベクターのゲノムに対するその挿入の影響は、挿入が行われる方法に依存して異なる：ゲノムにおける正味の結果が、遺伝物質の付加、置換、または欠失であるかに依存して、ベクターゲノムはサイズがそれぞれ、大きくなる、同じである、または小さくなる場合がある。当業者は、ある特定のタイプの挿入を選択し、実施し、そして必要なときには様々な適合化を行うことが完全に可能である。

発現カセットの構築およびＨＶＴベクターへのその挿入を、クローニング、トランスフェクション、組換え、選択および増幅を伴う広く知られた分子生物学的技術によって行うことができる。これらの技術および他の技術が、Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”（２００１，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；ＩＳＢＮ：０８７９６９５７７３）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ，ＮＹ，２００３，ＩＳＢＮ：０４７１５０３３８Ｘ）、およびＣ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ＆Ｇ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ：“ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ”（ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ ０８７９６９６５４０）、ならびに“ＰＣＲ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ｊ．Ｂａｒｔｌｅｔｔ ａｎｄ Ｄ．Ｓｔｉｒｌｉｎｇ；Ｈｕｍａｎａ ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ：０８９６０３６４２１）のような標準的な教本に非常に詳しく説明されている。

本発明については、発現カセットに関しての用語「第１」および用語「第２」は、参照を容易にするために使用されるだけであり、順序または好みをどのような順序または好みであれ示すためには使用されない。

ＨＶＴゲノムの「ユニークショート（Ｕｓ）領域」は、「内部反復ショート」（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｐｅａｔ ｓｈｏｒｔ）と、「末端反復ショート」（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ ｓｈｏｒｔ）との間におけるゲノムの下流側区域であることが広く知られている。ＨＶＴのＵｓはサイズが約８．６ｋｂである（Ｋｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．ｏｆ Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．８２，ｐ．１１２３－１１３５を参照のこと）。

いくつかのＨＶＴ株の完全に注釈づけされたゲノム配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋを介して公開されている：ＨＶＴ株ＦＣ－１２６のゲノム配列がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２９１８６６として入手可能であり、ヌクレオチド１３６９９０～１４５６０６がＵｓ領域を形成する。

「ＩＬＴＶ」はまた、トリアルファヘルペスウイルス１型と呼ばれる。いくつかのＩＬＴＶ株の完全に注釈づけされたゲノム配列が、ＩＬＴＶ参照株ＳＡ－２について、例えば、ＧｅｎＢａｎｋを介して、例えば、アクセッション番号ＮＣ＿００６６２３のもとで公開されている。ＩＬＴＶのｇＤエンベロープ糖タンパク質およびｇＩエンベロープ糖タンパク質についての遺伝子が、Ｕｓ６遺伝子およびＵｓ７遺伝子として、それぞれＩＬＴＶゲノムのＵｓ領域に位置する。ＩＬＴＶのｇＤタンパク質およびｇＩタンパク質はＩＬＴＶ特異的かつ防御的な抗体を誘発することができ、それらは組み合わせで使用されることが多い。それらの自然界の状況において、これらの遺伝子は一部が重複しており、それによって、ｇＩ遺伝子プロモーターが上流側のｇＤのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に位置し、ｇＤ遺伝子ターミネーターが下流側のｇＩのＯＲＦに位置する。その結果として、組み合わせで使用されたときまたはＩＬＴウイルスゲノムにおけるそれらの自然界の状況から取り出されたとき、ｇＤ遺伝子およびｇＩ遺伝子は、１つの連続したフラグメントとして、例えば、ｇＤ遺伝子プロモーターから始まり、ｇＩ遺伝子の後で終わる１つの連続したフラグメントとして都合よくサブクローニングすることができる。

ＨＶＴゲノムの「ユニークロング（ＵＬ）」領域はゲノムの上流側部分であり、ＨＶＴではサイズが約１１０ｋｂである。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２９１８６６におけるＨＶＴ株ＦＣ－１２６のゲノム配列では、ＵＬ領域がヌクレオチド５９１０～１１７７７７によって形成される。

本明細書中で使用されるような表示「ＵＬ４４」および類似した用語は、ＵＬゲノム領域に位置する具体的な遺伝子を示すための本発明の分野における広く知られた方法である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２９１８６６を参照のこと）。この命名は、単純ヘルペスウイルス１型（ヘルペスウイルス基準種）における相同遺伝子の命名に由来する。同じことが（必要な変更を加えて）、表示「ＵＬ４５」および表示「ＵＬ４６」について当てはまる。ＵＬ４４は膜糖タンパク質Ｃであり、ＵＬ４５は細胞融合膜タンパク質であり、ＵＬ４６は外皮リンタンパク質である。

用語「の間」は、挿入された第２の発現カセットが、示された遺伝子の間で、かつその外側に、すなわち、いわゆる遺伝子間領域にあるＨＶＴゲノムでの挿入部位（すなわち、遺伝子座）に配置されることを示すために役立つ。よって、その結果として、そのような挿入は、ＵＬ４４、ＵＬ４５またはＵＬ４６のオープンリーディングフレームにおいてそれぞれなされない。

本発明による例示的なｒＨＶＴベクター構築物のグラフィック表示である：上部には、多くのＯＲＦがブロック矢印によって示されているＨＶＴゲノムが示される。細い線のボックスは反復領域を示している。 中央には、挿入物が導入されたＨＶＴゲノムの領域が拡大されている：ＵＬ４４－４５の間またはＵＬ４５－４６の間における挿入物、およびＵｓ２における挿入物。

下部には、挿入された２つの発現カセットの例が表示される；
・左下：ｇＤ遺伝子プロモーター－ｇＤ遺伝子（ｇＩ遺伝子プロモーターを含む）－ｇＩ遺伝子（ｇＤ遺伝子ターミネーターを含む）－ＦＨＶ１ Ｕｓ９遺伝子ターミネーター。
・右下：ｍＣＭＶ－ＩＥ１遺伝子プロモーター－ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子－ＳＶ４０後期遺伝子ターミネーター－ｈＣＭＶ ＩＥ１遺伝子プロモーター－ＮＤＶ Ｆ遺伝子－ｈＣＭＶ－ＩＥ１遺伝子ターミネーター。

本発明の様々な実施形態およびさらなる局面の詳細が下記において記載されるであろう。

１つの実施形態において、本発明によるｒＨＶＴは、第１の発現カセットが、５’から３’への方向で、かつ、次に述べる順に、
ａ．マウスサイトメガロウイルス前初期１遺伝子（ｍＣＭＶ－ＩＥ１）プロモーター、
ｂ．ＩＢＤＶのＶＰ２遺伝子、
ｃ．転写ターミネーター、
ｄ．ヒトサイトメガロウイルス前初期１遺伝子（ｈＣＭＶ－ＩＥ１）プロモーター、
ｅ．ＮＤＶのＦタンパク質遺伝子、および
ｆ．転写ターミネーター
を含み、
それによって、前記プロモーターおよびターミネーターが、前記ＶＰ２遺伝子に、前記Ｆ遺伝子にそれぞれ機能的に連結されることを特徴とする。すなわち、構成要素ａ．のプロモーターおよび構成要素ｃ．のターミネーターがＶＰ２遺伝子に機能的に連結され、そして、構成要素ｄ．のプロモーターおよび構成要素ｆ．のターミネーターがＦ遺伝子に機能的に連結される。

本明細書中で使用されるような用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」（含む）（同様にまた、様々な変化形、例えば、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」（含む）、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」（含む）、および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ」（含まれる）など）は、この用語が使用される本文の節、段落、請求項などによって包含されるか、あるいはこの用語が使用される本文の節、段落、請求項などにおいて包含されるすべての構成要素を、また、そのようなすべての構成要素を本発明のために想定され得るあらゆる可能な組み合わせで、たとえそのような構成要素または組み合わせが明示的に記載されていなくても示すことを意図しており、かつ、（１以上の）そのような構成要素または組み合わせのいずれかが除外されることを示すことは意図していない。

そのため、したがって、そのような本文の節、段落、請求項などはどれもまた、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」（またはその様々な異形）が、「ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ」（からなる）、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ」（からなる）、または「ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ」（から本質的にはなる）などの用語によって置き換えられる１以上の実施形態に関係し得る。

用語「５’から３’への方向で」は、「下流側方向で」としてもまた知られている用語であり、この分野では広く知られている。用語「次に述べる順に」と一緒になって、この用語は、本発明によるｒＨＶＴの複製および発現が行われ得る宿主細胞の遺伝子発現機構と一緒に機能するために、その後にまとめられる構成要素が互いに関して有する必要がある相対的な向きを示すために役立つ。当業者が認識するであろうように、この方向は、「コード鎖」であるＨＶＴの二本鎖ＤＮＡゲノムからのＤＮＡ鎖に関連し、また、「＋」配向または「センス」配向にあるコードされたｍＲＮＡ分子に関連する。

それにもかかわらず、そして、上記の節に不利益を与えることなく、ｒＨＶＴのｄｓ ＤＮＡゲノムの相補鎖、すなわち、「テンプレート」鎖では、列挙された構成要素の相対的な順序は同じであり、しかし、そのＤＮＡ鎖では、これらの構成要素の方向は３’から５’へであり、「上流側方向で」ある。

本発明のための「プロモーター」は、下流側のコード領域の転写を導く遺伝情報の機能的領域であることが広く知られている。したがって、プロモーターは、遺伝子の上流側に位置する。

プロモーターについての命名法は、一般にはプロモーターがその自然界の状況において発現を制御する遺伝子に基づいている。例えば、本明細書中で使用されるような用語「ｍＣＭＶ－ＩＥ１遺伝子プロモーター」は、自然界においてｍＣＭＶからのＩＥ１遺伝子の発現を行わせる、したがって、ｍＣＭＶゲノムにおけるその遺伝子のすぐ上流側に位置するプロモーターを示す。ＩＥ１遺伝子は文書による十分な裏付けがあり、明らかに認識可能な遺伝子であるので、また、いくつかのｍＣＭＶのゲノムが配列決定されているので、そのようなプロモーターは、日常的な技術によって容易に特定することができる。例えば、基本的プロトコルにおいて、プロモーターを、２つの連続する遺伝子の間の領域を、例えば、上流側遺伝子の停止コドンから下流側遺伝子の開始コドンまでを大まかにサブクローニングすることによって、簡単に得ることができる。その後、プロモーターは、標準的な試験によって、例えば、疑わしいプロモーターを含有するクローン化領域の次第に小さくなる区域を使用するマーカー遺伝子の発現によって、特定することができる。

一般に、プロモーターは、転写の時期、持続期間、条件およびレベルに影響を及ぼす調節因子に結合することに関与するいくつかの認識可能な調節領域、例えば、エンハンサー領域などを含有する。エンハンサー領域は、一般にはプロモーターの上流側部分に位置するが、プロモーターはまた、開始コドンに向かってより下流側の領域であって、転写因子の結合およびＲＮＡポリメラーゼ自体を向かわせることに関与する領域によって影響され得る。プロモーターの下流側領域は、一般にはいくつかの保存された配列エレメント、例えば、ＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴボックスおよびＧＣボックスなどを含有する。

エンハンサー領域と下流側領域との両方を含むプロモーターは、「完全な」プロモーターと称され、下流側領域のみを含むプロモーターは、「コア」プロモーターと称される。

ｍＣＭＶ－ＩＥ１遺伝子はこの技術分野では広く知られており、様々な商用供給源から、例えば、クローニングおよび発現のための商用プラスミドの供給業者などから容易に得ることができる。ＩＥ１遺伝子はまた、ＣＭＶの「主要ＩＥ遺伝子」とも呼ばれる。

ｍＣＭＶ－ＩＥ１タンパク質はまた、ｐｐ８９とも呼ばれる。ｍＣＭＶ ＩＥ１遺伝子プロモーターは１９８５年に記載された（Ｋ．Ｄｏｒｓｃｈ－Ｈａｓｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９８５，ＰＮＡＳ，ｖｏｌ．８２，ｐ．８３２５）。異種発現におけるこのプロモーターの使用は国際公開第８７／０３．９０５号および欧州特許第７２８．８４２号に記載される。完全なｍＣＭＶ ＩＥ遺伝子の遺伝子座のヌクレオチド配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋからアクセション番号Ｌ０６８１６．１のもとで入手可能である。ｍＣＭＶそのものが、例えば、ＡＴＣＣからアクセション番号ＶＲ－１３９９のもとで入手可能である。

本発明によるｒＨＶＴの１つの実施形態において、第１の発現カセットでは、ｍＣＭＶ－ＩＥ１遺伝子プロモーターは、コアプロモーター領域、並びに、ｍＣＭＶ－ＩＥ１遺伝子のためのエンハンサー領域の両方を含む完全なプロモーターである。この完全なｍＣＭＶ－ＩＥ１遺伝子プロモーターはサイズが約１．４ｋｂである。

本発明のための用語「約」は、示された値を中心に±２５％を意味し、好ましくは、「約」は、示された値を中心に±２０％、±１５％、±１２％、±１０％、±８％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％を意味し、または、「約」は、示された値を中心に±１％をも意味する（これらはその順で好ましい）。

１つの実施形態において、本発明のためのｍＣＭＶ－ＩＥ１遺伝子プロモーターは、配列番号１のヌクレオチド１～１３９１の領域の全長に対する少なくとも９５％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む約１．４ｋｂのＤＮＡ分子である。少なくとも９６％、９７％、９８％、または、９９％ものヌクレオチド配列同一性がより好ましい（これらはその順で好ましい）。

１つの実施形態において、ｍＣＭＶ－ＩＥ１遺伝子プロモーターは配列番号１のヌクレオチド１～１３９１の領域である。

本発明によるｒＨＶＴの１つの実施形態において、第１の発現カセットでは、本発明のためのＩＢＤＶのＶＰ２遺伝子は、典型的タイプであるＩＢＤＶに由来するＶＰ２タンパク質をコードする。そのような様々な遺伝子が広く知られており、それらの配列情報が先行技術において容易に入手可能である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｄ００８６９（Ｆ５２／７０株）、同Ｄ００４９９（ＳＴＣ株）または同ＡＦ４９９９２９（Ｄ７８株）を参照のこと）。代替において、この遺伝子は、ビルナウイルスを操作するための日常的な技術を使用して、自然界から単離される典型的ＩＢＤＶのゲノムから得ることができる。典型的タイプの様々なＩＢＤＶを、血清学または分子生物学を使用して容易に特定することができる。

ＩＢＤＶのＶＰ２遺伝子のホモログまたはバリアントは同等の効力および安定性を有するであろうので、そのため、１つの実施形態において、本発明のためのＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド１４２３～２７８１の領域の全長に対する少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有する。少なくとも９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％ものヌクレオチド配列同一性が好ましい（これらはその順で好ましい）。

１つの実施形態において、本発明のためのＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質遺伝子は、典型的ＩＢＤＶ株のＦａｒａｇｈｅｒ ５２／７０に由来する。

１つの実施形態において、本発明のためのＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド１４２３～２７８１の領域である。

「転写ターミネーター」またはターミネーターは、コード領域のＲＮＡへの転写の終結に関与する調節ＤＮＡエレメントである。一般に、そのようなエレメントは、ＲＮＡポリメラーゼ複合体に転写を停止させることができる二次構造（例えば、ヘアピン）を有する区域をコードする。そのため、転写ターミネーターは、常に翻訳されることになる領域の終止コドンの下流側に、したがって「３’非翻訳領域」に位置する。ターミネーターはまた、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを含むことができる。このシグナルは、ほとんどの真核生物ｍＲＮＡに起こり、かつ、そのようなｍＲＮＡの輸送および安定性において役割を果たすポリアデニル化を提供する。

本発明のための発現カセットのためには、ＲＮＡ転写の効果的な終結がもたらされる限り、具体的なタイプの転写ターミネーターの選択は重要でない。

本発明のための第１の発現カセットにおいて、ＶＰ２遺伝子とＦ遺伝子との間における転写ターミネーターである構成要素ｃ．は、ＶＰ２遺伝子の転写の終結を提供するだけでなく、これらの遺伝子の発現の効果的な分離もまた、ＲＮＡ転写の起こり得る読み過ごしを妨げることによって提供している。

第１の発現カセットのために示される２つのターミネーターは同じであってもよく、または異なっていてもよい。

本発明によるｒＨＶＴの１つの実施形態において、第１の発現カセットは、ターミネーター領域とポリＡ領域との両方を含む転写ターミネーターを含む。

本発明によるｒＨＶＴの１つの実施形態において、第１の発現カセットでは、ＶＰ２遺伝子のための転写ターミネーターはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来し、好ましくはＳＶ４０後期遺伝子に由来する。

このターミネーターは１９８０年代後半以降、商用の「ｐＣＭＶβ」クローニングプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を介して入手可能である。

本発明によるｒＨＶＴの１つの実施形態において、第１の発現カセットでは、ＶＰ２遺伝子のための転写ターミネーターはＳＶ４０後期遺伝子に由来し、サイズが約０．２ｋｂであり、配列番号１のヌクレオチド２８１２～３０２１の領域の全長に対する少なくとも９５％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％ものヌクレオチド配列同一性がより好ましい（これらはその順で好ましい）。

１つの実施形態において、ＳＶ４０後期遺伝子由来の転写ターミネーターは配列番号１のヌクレオチド２８１２～３０２１の領域である。

その完全版でのｈＣＭＶ－ＩＥ１遺伝子プロモーターはサイズが約１．５ｋｂであり、エンハンサー、コアプロモーターおよびイントロンからなり、それによって、プロモーター活性がイントロン領域内にまで進む（Ｋｏｅｄｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９９５，Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．６９，ｐ．２１９４－２２０７）を参照のこと）。

ｈＣＭＶ－ＩＥ１遺伝子プロモーターを、通常の分子生物学的ツールおよび分子生物学的方法を使用して、ＩＥ１遺伝子に先行するゲノム領域をサブクローニングすることによって、（広範囲に入手可能である）ｈＣＭＶウイルスのゲノムから得ることができる。代替において、プロモーターは、例えば、商用の発現プラスミドから、例えば、ｐＩ１７（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．（２００２，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．５５，ｐ．１４－２３）によって記載される）などから、あるいは市販の哺乳動物発現ベクターから、例えば、ｐＣＭＶ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）またはｐＣＭＶ－ＭＣＳシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３６９９６６）などから得ることができる。ｈＣＭＶのゲノム配列が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ１７４０３から入手可能である。

ｈＣＭＶ－ＩＥ１遺伝子プロモーターからは、多くの非常に類似した型、例えば、ＧｅｎＢａｎｋから知られている。そのようなホモログおよびバリアントは、本発明の範囲の範囲内である。

本発明によるｒＨＶＴの１つの実施形態において、第１の発現カセットでは、ｈＣＭＶ－ＩＥ１遺伝子プロモーターはコアプロモーターである。そのようなコアプロモーターは、典型的にはサイズが１ｋｂ未満であろうし、好ましくはサイズが約０．４ｋｂであろう。

１つの実施形態において、本発明のためのｈＣＭＶ－ＩＥ１遺伝子コアプロモーターは、配列番号１のヌクレオチド３１６０～３５２０の領域の全長に対する少なくとも９５％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む約０．４ｋｂのＤＮＡ分子である。少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％ものヌクレオチド配列同一性がより好ましい（これらはその順で好ましい）。

１つの実施形態において、ｈＣＭＶ－ＩＥ１遺伝子コアプロモーターは配列番号１のヌクレオチド３１６０～３５２０の領域である。

本発明によるｒＨＶＴの１つの実施形態において、第１の発現カセットでは、ＮＤＶのＦタンパク質遺伝子は、長潜伏期性タイプであるＮＤＶに由来する。

好ましくは、長潜伏期性のＮＤＶ株に由来するＮＤＶのＦタンパク質遺伝子はＮＤＶ株のクローン３０に由来する。

ＮＤＶクローン３０は、例えば、Ｎｏｂｉｌｉｓ（登録商標）ＮＤ Ｃｌｏｎｅ ３０（ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）でのように、生ワクチンとして長年にわたって使用されている広く知られた長潜伏期性タイプのＮＤＶである。

１つの実施形態において、本発明のためのＮＤＶのＦタンパク質遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド３５４５～５２０６の領域の全長に対する少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有する。好ましくは、少なくとも９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％ものヌクレオチド配列同一性（これらはその順で好ましい）。

１つの実施形態において、本発明のためのＮＤＶのＦタンパク質遺伝子は配列番号１のヌクレオチド３５４５～５２０６の領域である。

本発明によるｒＨＶＴの１つの実施形態において、第１の発現カセットでは、Ｆ遺伝子のための転写ターミネーターはｈＣＭＶ－ＩＥ１遺伝子に由来する。好ましくは、この転写ターミネーターはサイズが約０．３ｋｂである。

１つの実施形態において、転写ターミネーターはｈＣＭＶ－ＩＥ１遺伝子に由来し、サイズが約０．３ｋｂであり、配列番号１のヌクレオチド５２１８～５４９８の領域の全長に対する少なくとも９５％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％ものヌクレオチド配列同一性がより好ましい（これらはその順で好ましい）。

本発明によるｒＨＶＴの１つの実施形態において、ｈＣＭＶ－ＩＥ１遺伝子に由来する転写ターミネーターは配列番号１のヌクレオチド５２１８～５４９８の領域である。

本発明によるｒＨＶＴの１つの実施形態において、第１の発現カセットのためには、下記のことからなる群から選択される条件の１以上またはすべてが当てはまる：
・ｍＣＭＶ－ＩＥ１遺伝子プロモーターは完全なプロモーターである；
・ＩＢＤＶのＶＰ２遺伝子は典型的ＩＢＤＶ由来のＶＰ２タンパク質をコードする；
・ＶＰ２遺伝子のための転写ターミネーターはターミネーター領域とポリＡ領域との両方を含み、好ましくは転写ターミネーターはＳＶ４０に由来する；
・ｈＣＭＶ－ＩＥ１遺伝子プロモーターはコアプロモーターである；
・ＮＤＶのＦ遺伝子は長潜伏期性のＮＤＶ株に由来し、好ましくはＮＤＶ株のクローン３０に由来する；および
・Ｆ遺伝子のための転写ターミネーターは、ｈＣＭＶ－ＩＥ１遺伝子に由来する。

本発明のためのＶＰ２遺伝子および／またはＦ遺伝子の発現を最適化するために、それらのコードするヌクレオチド配列をコドン最適化に供することができる。これはこの技術分野では広く知られており、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列の発現レベルを、コードされたタンパク質の天然起源の状況とは異なる状況において改善するために一般に適用される。コドン最適化は、組換えベクター、宿主細胞、または配列が発現されるであろう標的生物のコドン選択（ｔＲＮＡレパートリー）を一致させるヌクレオチド配列を介してであることを除いて、意図されたアミノ酸をコードするためのヌクレオチド配列の適合化を伴う。その結果として、加えられるヌクレオチド変異は一般にサイレントである。そのような改変は、一般には多くのコンピューターソフトウェアプログラムのうちの１つを使用することによってインシリコで計画され、その後、所望のヌクレオチド配列を合成することができる。

そのため、本発明によるｒＨＶＴの１つの実施形態において、ＶＰ２タンパク質およびＦタンパク質をコードする遺伝子は、ＨＶＴウイルスのコドン選択に向けてコドン最適化される。

本発明によるｒＨＶＴの１つの実施形態において、第１の発現カセットは、国際公開第２０１６／１０２６４７号に開示されるような発現カセットである。

一層より好ましくは、第１の発現カセットは、商用ワクチンＩｎｎｏｖａｘ（登録商標）ＮＤ－ＩＢＤ（ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）において利用可能であるＨＶＰ３６０として国際公開第２０１６／１０２６４７号に記載されるｒＨＶＴ構築物において用いられるようなカセットである。

本発明のための第１の発現カセットの一例が配列番号１で示され、その構成要素が表１に記載される。

本発明によるｒＨＶＴの１つの実施形態において、本発明のための第１の発現カセットは、サイズが約５．５ｋｂである。

本発明によるｒＨＶＴの１つの実施形態において、本発明のための第１の発現カセットは、配列番号１の全長に対する少なくとも９５％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む約５．５ｋｂのＤＮＡ分子である。少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％ものヌクレオチド配列同一性がより好ましい（これらはその順で好ましい）。

本発明によるｒＨＶＴの１つの実施形態において、本発明のための第１の発現カセットは、配列番号１に示されるような核酸を含む。好ましくは、第１の発現カセットは配列番号１である。

２つの異種遺伝子を１つの大きいカセットに有する本発明における使用のための第１の発現カセットの組成から当業者に明白であるように、第１の発現カセットは、ベクターウイルスのゲノムにおけるただ１つの場所への挿入のために設計され、意図される。

また、発現カセットは、記載されるように自己完結型の発現モジュールであるので、そのため、本発明のための第１の発現カセットは、本発明によるｒＨＶＴのＵｓゲノム領域において、種々の遺伝子座にかつ種々の向きで挿入され得る。

ＨＶＴ Ｕｓゲノム領域のいくつかの遺伝子座が、１以上の異種遺伝子の挿入を可能にすることが明らかにされている（例えば、欧州特許第４３１．６６８号および国際公開第２０１６／１０２６４７号を参照のこと）。例えば、Ｕｓ２遺伝子またはＵｓ１０遺伝子において、あるいはＵｓ１０とＳＯＲＦ３との間、またはＵｓ２とＳＯＲＦ３との間の領域においてである。

遺伝子に挿入されると、その結果は、挿入物を受ける遺伝子の正常なコード機能が得られたｒＨＶＴにおいて妨害されるか、または完全にさえ失われるということである。Ｕｓ２およびＵｓ１０については、このことは、得られたｒＨＶＴの複製も挿入された異種遺伝子の発現も有意に妨害しないことが見出された。

したがって、好ましい実施形態において、本発明によるｒＨＶＴは、第１の発現カセットがＵｓ２遺伝子またはＵｓ１０遺伝子に挿入されることを特徴とする。

さらなる好ましい実施形態において、本発明によるｒＨＶＴは、第１の発現カセットがＵｓ２遺伝子に挿入されることを特徴とする。

本発明のための「Ｕｓ２遺伝子における」挿入では、Ｕｓ２遺伝子の機能が乱れる。１つの実施形態において、Ｕｓ２における挿入では、国際公開第２０１６／１０２６４７号においてＨＶＰ３６０について記載されるように、Ｕｓ２遺伝子の少なくとも２５％、５０％、または少なくとも７５％もが欠失する。

本発明のための発現カセットの簡便な構築、操作、およびＨＶＴへの挿入を容易にするために、発現カセットは、それ自体がクローニングまたはトランスフェクションを可能にするビヒクルなどのＤＮＡ分子に含まれること、例えば、プラスミド、コスミド、バクミドなどに含まれることが可能である（国際公開第９３／２５．６６５号および欧州特許第９９６．７３８号を参照のこと）。一般的なクローニングプラスミドの例が、例えば、ｐＢＲ３２２由来のプラスミド、またはｐＵＣシリーズ由来のプラスミドである。これらは広く市販されている。

発現カセットを含むプラスミドは、一般には「トランスファーベクター」、「シャトルベクター」または「ドナープラスミド」として示される。この状況において、プラスミドは、挿入を導くためのベクターのゲノムの標的挿入遺伝子座からの隣接配列領域を有する発現カセットを含む。

典型的には、トランスフェクションで使用されるトランスファーベクターは、それ自体はベクターのゲノムに組み込まれず、トランスファーベクターが運ぶ発現カセットの組み込みを、例えば、挿入が相同的組換えによって生じることを可能にすることによって容易にするだけである。その結果として、本発明における使用のための第１の発現カセットの場合、第１の発現カセットは、好ましくはその５’末端’およびその３’末端において、そのカセットをＵｓ２に挿入するプロセスを導くＨＶＴのＵｓ２遺伝子の様々な区域が隣接する。

そのため、本発明によるｒＨＶＴの１つの実施形態において、第１の発現カセットは、ＨＶＴのＵｓ２遺伝子に由来する配列が隣接する。

好ましくは、隣接するＵｓ２遺伝子配列は、上流側がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２９１８６６からのヌクレオチド１４０１４３～１４０５４１であり、下流側がＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ２９１８６６からのヌクレオチド１４０５４１～１４１０５９である。

上記で記載されたように、本発明のｒＨＶＴベクターは、好都合には第２の発現カセットとして、インビトロおよびインビボの両方で複製時および発現時にｒＨＶＴにおいて安定に維持されるさらなる一組の異種遺伝子を含む。

したがって、１つの実施形態において、本発明によるｒＨＶＴは、第２の発現カセットが、５’から３’への方向で、かつ、次に述べる順に、
ａ．上流側プロモーターおよび下流側ターミネーターを伴うＩＬＴＶのｇＤ遺伝子、及び
ｂ．上流側プロモーターおよび下流側ターミネーターを伴うＩＬＴＶのｇＩ遺伝子
を含み、
それによって、前記プロモーターおよびターミネーターが、前記ｇＤ遺伝子に、前記ｇＩ遺伝子に、それぞれ機能的に連結されることを特徴とする。

本発明における使用のための第２の発現カセットには、第１の発現カセットの場合と同じ一般的な考慮事項および好ましい選択が、必要な変更を加えて当てはまり、その結果として、本発明によるｒＨＶＴの１つの実施形態において、第２の発現カセットには、
・プロモーターはコアプロモーターであってもよく、または完全なプロモーターであってもよく、
・挿入された第２の発現カセットの向きは重要でなく、そして
・ｇＤ遺伝子および／またはｇＩ遺伝子をコードする遺伝子は、ＨＶＴウイルスのコドン選択に向けてコドン最適化される。

本発明によるｒＨＶＴの１つの実施形態において、第２の発現カセットでは、
・ｇＤ遺伝子のためのプロモーターは、ＩＬＴＶのｇＤ遺伝子プロモーターであり、
・ｇＩ遺伝子のためのプロモーターは、ＩＬＴＶのｇＩ遺伝子プロモーターであり、
・ｇＤ遺伝子のためのターミネーターは、ＩＬＴＶのｇＤ遺伝子ターミネーターであり、および／または
・ｇＩ遺伝子のためのターミネーターは、ＩＬＴＶのｇＩ遺伝子ターミネーターである。

本発明によるｒＨＶＴの１つの実施形態において、第２の発現カセットでは、プロモーターおよびターミネーターを伴うｇＤ遺伝子と、プロモーターを伴うｇＩ遺伝子とを含む第２のカセットの区域が、ＩＬＴＶゲノムから全体として取り出される。上記で記載されたように、ＩＬＴＶのｇＤ遺伝子およびｇＩ遺伝子はそれらの自然界の状況では重複しているため、ｇＤ遺伝子ターミネーターおよびｇＩ遺伝子プロモーターは、今度はｇＩ遺伝子に、ｇＤ遺伝子に、それぞれ含まれる。

配列番号２は、本発明のための第２の発現カセットのヌクレオチド配列を約３．２ｋｂのＨｉｎｄ３フラグメントとして示す。

好ましくは、プロモーターおよびターミネーターを伴うｇＤ遺伝子と、プロモーターを伴うｇＩ遺伝子とからなる区域が、配列番号２のヌクレオチド１３～３０８１の領域の全長に対する少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を伴うヌクレオチド配列を含む約３ｋｂのＤＮＡ分子によって形成される。少なくとも９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％ものヌクレオチド配列同一性が一層より好ましい（これらはその順で好ましい）。

本発明によるｒＨＶＴの１つの実施形態において、第２の発現カセットでは、プロモーターおよびターミネーターを伴うｇＤ遺伝子と、プロモーターを伴うｇＩ遺伝子とを含む第２の発現カセットの区域が、配列番号２のヌクレオチド１３～３０８１の領域によって形成される。

本発明によるｒＨＶＴの１つの実施形態において、第２の発現カセットでは、ｇＩ遺伝子の転写ターミネーターはＦＨＶ１に由来し、好ましくはＦＨＶ１のＵｓ９遺伝子に由来する。ＦＨＶ１のＵｓ９遺伝子が、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ４２１１３で開示される。

本発明によるｒＨＶＴの１つの実施形態において、第２の発現カセットでは、転写ターミネーターはＦＨＶ１のＵｓ９遺伝子に由来し、サイズが約０．０５ｋｂであり、配列番号２のヌクレオチド３０９７～３１５１の領域の全長に対する少なくとも９５％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％ものヌクレオチド配列同一性がより好ましい（これらはその順で好ましい）。

１つの実施形態において、ＦＨＶ１のＵｓ９遺伝子に由来する転写ターミネーターは配列番号２のヌクレオチド３０９７～３１５１の領域である。

本発明によるｒＨＶＴの１つの実施形態において、本発明のための第２の発現カセットは、サイズが約３．２ｋｂである。

本発明によるｒＨＶＴの１つの実施形態において、本発明のための第２の発現カセットは、配列番号２の全長に対する少なくとも９５％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む約３．２ｋｂのＤＮＡ分子である。少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％ものヌクレオチド配列同一性がより好ましい（これらはその順で好ましい）。

本発明によるｒＨＶＴの１つの実施形態において、本発明のための第２の発現カセットは、配列番号２に示されるような核酸を含む。好ましくは、第２の発現カセットは配列番号２である。

本発明によるｒＨＶＴは、好ましくは、十分に複製し、かつ、若い鳥類への接種または鳥類胚への卵内接種のために好適であることが知られている樹立されたＨＶＴワクチン株（例えば、ＨＶＴワクチン株ＰＢ１または同ＦＣ－１２６）である元となるＨＶＴに基づいている。これらは、一般に入手可能である：ＦＣ－１２６はＡＴＣＣから入手可能であり（ＶＲ ＃ ５８４－Ｃ）、ＰＢ１は凍結感染細胞における生ワクチンとして、例えば、ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈから市販されている。

第１および第２の発現カセット（両方とも本発明のために本明細書中で定義される通りである）を取り込むことは、（これに反して）元となるＨＶＴの毒性または病原性を増大させず、また、毒性への復帰がないことは、ＨＶＴは自然界では非病原性であるので予想されることである。

したがって、１つの実施形態において、本発明によるｒＨＶＴの作製のために使用される元となるＨＶＴはＨＶＴワクチン株であり、好ましくは、ＰＢ１株またはＦＣ－１２６株のＨＶＴワクチン株である。

本発明によるｒＨＶＴは、家禽へのワクチン接種のために都合よく使用することができる、生きている組換えキャリア微生物、または「ベクター」ウイルスである。本発明によるｒＨＶＴは、マレック病（ＭＤ）と、伝染性ファブリキウス嚢病（ＩＢＤ）、ニューカッスル病（ＮＤ）および伝染性喉頭気管炎（ＩＬＴ）の１以上またはすべてとに対する安全かつ効果的なワクチンであるという特徴を組み合わせており、加えて遺伝的に安定である。

本発明のために「遺伝的に安定」であることは、本発明によるｒＨＶＴの遺伝的構成がその後の繰り返されるウイルス複製において変化しないことを意味する。代替において、不安定な構築物は、非効率的なウイルス複製、ならびに／あるいは挿入された異種遺伝子（１つまたは複数）の１以上の発現の喪失を引き起こし得る。この安定性は、日常的な技術により、例えば、本発明によるｒＨＶＴを細胞培養におけるその後の継代培養に供することによって都合よくモニターすることができる。これらの工程の期間中に再単離されるウイルスを細胞培養ディッシュに置床し、寒天により覆い、ＨＶＴ特異的なプラークが視認されるまでインキュベーションすることができる：これらはすべて、日常的な技術を使用して行われる。次に、プラークは、好適な抗体調製物を適切な陽性対照および陰性対照とともに免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）プロトコルで使用して、ＶＰ２タンパク質、Ｆタンパク質、またはｇＤタンパク質およびｇＩタンパク質の発現について染色することができる。その後、蛍光を特定の異種タンパク質についてもはや示さない任意のプラークも記録することができ、それによって、好ましくは、特定のｒＨＶＴサンプルの約１００個の個々のプラークがモニターされなければならない。

驚くべきことに、本発明によるｒＨＶＴは、試験されたプラークのすべてで、１５回の連続した細胞培養継代の後でさえ、また、インビボでの１５日間の複製の後で、ＶＰ２タンパク質遺伝子、Ｆタンパク質遺伝子、ｇＤタンパク質遺伝子およびｇＩタンパク質遺伝子のそれぞれの存在および発現を維持することが見出された。詳細が実施例において記載される。

このことは、先行技術において記載される主張された多価ＨＶＴベクター構築物を上回る強力かつ非常に重要な改善である。

また、ＶＰ２遺伝子、Ｆ遺伝子、ｇＤ遺伝子およびｇＩ遺伝子のすべてが、効果的なＨＶＴベクターワクチンにおける挿入物として既に使用されていることを考慮すると、それらが安定に維持され、かつ発現されるという事実はまた、本発明によるｒＨＶＴが家禽における防御免疫応答をこれらの抗原に対し、並びにＭＤＶに対して誘発するであろうし、したがって、効果的な多価ベクターワクチンであろうことの信頼できる証明である。

本発明によるｒＨＶＴは、一般的な技術によって、好ましくはインビトロでの複製、例えば、ニワトリ細胞、典型的には初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）の培養物におけるインビトロでの複製によって増幅されることが可能である。この細胞は、ニワトリ胚のトリプシン処理（この技術分野ではすべて広く知られていること）によって調製することができる。ＣＥＦは単層で置床され、ＨＶＴに感染させられる。このプロセスは工業規模での産生にまでスケールアップすることができる。

一般に、ｒＨＶＴは、ｒＨＶＴを細胞会合形態で含有する感染した宿主細胞を採取することによって回収される。これらの細胞は、凍結期間中および貯蔵期間中の安定化をもたらすための適切なキャリア組成物に加えられる。次に、感染細胞は一般にはガラスアンプルに充填され、その後、ガラスアンプルは密封され、液体窒素において凍結され、貯蔵される。ワクチン接種のために使用されるとき、アンプルは解凍され、感染細胞は、使用中の安定化のための好適な希釈緩衝液に加えられる。好ましい実施形態において、希釈緩衝液は、国際公開第２０１９／１２１８８８号に開示されるような緩衝液である。

ＨＶＴの細胞会合凍結貯蔵が好ましいにもかかわらず、液体窒素の使用が実行可能でない状況では、１つの代替が、凍結乾燥を使用することである：凍結乾燥では、全培養物を使用して、ＨＶＴがその宿主細胞から細胞破壊によって、例えば、フレンチプレスまたは超音波処理器によって単離され得るというＨＶＴの有利な特徴が用いられる。これは遠心分離によって清澄化することができ、その後、安定剤に加えられ、長期にわたる貯蔵のために凍結乾燥される。

したがって、さらなる局面において、本発明は、本発明によるｒＨＶＴを含む宿主細胞に関する。

本発明についての「宿主細胞」は、ＨＶＴによる感染および複製に対して感受性がある細胞である。そのような細胞の例として、トリの細胞、特にリンパ球または線維芽細胞がある。

好ましくは、本発明による宿主細胞は、インビトロ条件のもとで保たれる宿主細胞である。

１つの実施形態において、本発明による宿主細胞は、初代トリ細胞、すなわち、非ヒト動物の組織または臓器からインビトロで導かれ、不死化された細胞株に由来しない細胞である。典型的には、初代細胞は、少ない限られた回数の細胞分裂を行うことができるだけである。

１つの実施形態において、本発明についての初代トリ宿主細胞は初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）である。

１つの実施形態において、本発明による宿主細胞は、不死化されたトリ細胞である。いくつかの不死化トリ細胞株が、例えば、国際公開第９７／０４４４４３号および国際公開第９８／００６８２４号に記載されている。

好ましい実施形態において、本発明による不死化トリ宿主細胞は不死化ＣＥＦであり、好ましくは、国際公開第２０１６／０８７５６０号に開示されるような不死化ＣＥＦである。

クローニングおよびトランスフェクションの種々の方法によって、本発明のための第１および第２の発現カセットは、本明細書中に記載されるようにこれらの発現カセットをそのゲノムに安定に含み、かつ発現する本発明によるｒＨＶＴを得るために使用することができる。

したがって、本発明のさらなる局面は、本発明によるｒＨＶＴを構築するための方法であって、本発明のための第１および第２の発現カセットを本発明について記載されるようなＨＶＴのゲノムの領域に挿入することを含む方法に関する。

本発明による発現カセットを、本発明によるｒＨＶＴを作製するためにＨＶＴゲノムに挿入することは、すべてこの技術分野では知られている種々の方法で行うことができる。１つの簡便な方法が、トランスファーベクターおよび相同的組換えの技術を使用することである。

代替において、本発明によるｒＨＶＴは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して、例えば、Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１８（上掲）によって記載されるようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して作製することができる。

特に、ｒＨＶＴ－ＶＰ２－Ｆベクターウイルスを使用することができ、これは２０１７年以降、商用ワクチンＩｎｎｏｖａｘ ＮＤ－ＩＢＤにおいて利用可能である。これはさらに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して、本明細書中に記載されるような第２の発現カセットを、本明細書中に記載されるようなｒＨＶＴのゲノムのＵＬ４４－４５遺伝子座またはＵＬ４５－４６遺伝子座の中に挿入することによって操作することができる。これらの挿入をこれらの遺伝子座に向けるために使用することができる特異的なガイドＲＮＡ配列が、実施例において記載される。

記載されるように、本発明によるｒＨＶＴの主な好都合な使用は、ＭＤ、ＩＢＤ、ＮＤおよび／またはＩＬＴ、あるいは関連した疾患徴候に対する安全、安定かつ効果的なワクチン接種を提供する家禽用ワクチンにおいてであり、非常に若齢の家禽に施すことができる。

したがって、本発明のさらなる局面は、家禽用ワクチンにおける使用のための本発明によるｒＨＶＴ、および／または家禽用ワクチンにおける使用のための本発明による宿主細胞に関する。

両方とも本発明によるものであるｒＨＶＴまたは宿主細胞の「ワクチンにおける使用」の種々の方法が上記で概説されており、無細胞ウイルスとして、または宿主細胞における細胞会合ウイルスとして、家禽に接種するためのワクチン組成物において使用することを含む。

また、さらなる局面において、本発明は、本発明によるｒＨＶＴおよび／または本発明による宿主細胞と、医薬的に許容され得るキャリアとを含む家禽用ワクチンに関する。

「ワクチン」は、免疫学的に活性な化合物を医薬的に許容され得るキャリア中に含む組成物であることが広く知られている。「免疫学的に活性な化合物」または「抗原」は、接種された標的の免疫系によって認識され、防御的な免疫学的応答を標的の体液性免疫系および／または細胞性免疫系から誘発する分子である。

本発明によるワクチンは、ＭＤＶ、ＩＢＤＶ、ＮＤＶおよび／またはＩＬＴによって引き起こされる感染および／または疾患に対する家禽の保護を提供する。この効果は、これらのウイルスの１以上による増殖性感染の確立または増殖をそれらのそれぞれの標的器官において防止することによって、または低減することによって得られる。このことは、例えば、ウイルス量を減少させることによって、またはウイルス複製の持続期間を短くすることによって達成される。このことは、結果としてウイルス感染によって引き起こされる疾患の病変および関連した臨床徴候の数、強度、または重症度の標的動物における低減につながる。

しかしながら、ある特定の養鶏場においてまたはある特定の地域において流行しているＭＤＶ野外ウイルス、ＩＢＤＶ野外ウイルス、ＮＤＶ野外ウイルスまたはＩＬＴＶ野外ウイルスの毒性に依存して、これらのウイルスの１以上のさらなるワクチン成分を加えることが、これらのウイルスの病原性バリアントまたは血清学的バリアントのための効果的なワクチン接種を保証するために必要となる場合がある。このことはこの技術分野ではすべて広く知られている。

両方とも本発明によるものである家禽用ワクチンとしての使用の有効性または家禽用ワクチンの有効性の判定は、十分に日常実施者の技能の範囲内であり、例えば、ワクチン接種後の免疫学的応答をモニターすることによって、または抗原暴露感染後の臨床症状もしくは死亡の出現を試験することによって、例えば、標的の疾患徴候、臨床スコア、血清学的パラメーターをモニターすることによって、または抗原暴露病原体を再単離することによって、そして、これらの結果を、擬似ワクチン接種動物において認められるワクチン接種－抗原暴露応答と比較することによって行うことができる。これら４つのウイルス感染のそれぞれを評価するための種々の方法がこの技術分野では広く知られている。

本発明による使用、本発明によるワクチンによってまたは本発明によるワクチン接種によって誘発される、ＭＤ、ＩＢＤ、ＮＤおよびＩＬＴに対する保護は、ワクチン接種された標的において、健康および経済的収益率における改善をもたらす。このことは、例えば、様々なパラメーターから、例えば、生存、成長速度、飼料転換、卵生産、ならびに子孫の数および健康のうちの１以上の増大などから評価することができる。さらなる効果が、健康管理のための低下したコスト、および運営の増大した経済性である。

本発明によるワクチンの様々な実施形態、好ましいものおよび実例が、下記において概説されるであろう。

本発明のための用語「家禽」は、獣医学実務との関係があり、かつ、ＨＶＴによる接種に対して感受性がある鳥類種に関連し、好ましい家禽種として、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒルおよびウズラが挙げられる。ニワトリが最も好ましい種である。

本発明については、家禽は、任意のタイプ、品種または変種のものであってよく、例えば、産卵鶏、繁殖用鶏、ブロイラー、組み合わせ品種、またはそのような品種のいずれかの親系統などである場合がある。好ましいタイプは、ブロイラー、繁殖用鶏および産卵鶏である。最も好ましいものは、ブロイラータイプおよび産卵鶏タイプの家禽である。

「医薬的に許容され得るキャリア」は、無害であり、かつ標的によって十分に許容されると同時に、ワクチンの安定化および投与を助けるために意図される。そのようなキャリアとして、例えば、滅菌水または滅菌生理的塩溶液を挙げることができる。より複雑な形態において、キャリアは、例えば、さらなる添加物（例えば、安定剤または保存剤など）を含み得る緩衝液であることが可能である。詳細および実例が、例えば、広く知られたハンドブックに記載されており、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｙ”（２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，ＵＳＡ，ＩＳＢＮ：６８３３０６４７２）、および“Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ”（Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｅｔ ｅｔ ａｌ．ｅｄ．，１９９７，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＩＳＢＮ ０４４４８１９６８１）などに記載される。

本発明については、また、ワクチンが細胞会合ＨＶＴの形態であるとき、その場合、医薬的に許容され得るキャリアは、好ましくは、培養培地と、約１０％の血清と、約６％のＤＭＳＯとの混合物である。このキャリアはまた、凍結期間中および凍結保存期間中におけるｒＨＶＴ感染宿主細胞の安定化を提供する。血清は、細胞培養のために日常的に使用される血清がいずれも可能であり、例えば、ウシ胎児血清または新生仔ウシ血清などが可能である。

本発明によるワクチンは、当業者によって容易に適用可能である本明細書中に記載されるような方法によって本発明によるｒＨＶＴから調製される。例えば、本発明によるｒＨＶＴは、本発明のために記載される発現カセットがトランスフェクションおよび組換えによって挿入されることにより構築される。次に、所望のｒＨＶＴが選択され、より小さい体積またはより大きい体積で、好ましくはインビトロ細胞培養において、例えば、ＣＥＦにおけるインビトロ細胞培養において工業的に増幅される。そのような培養物から、ｒＨＶＴに感染した宿主細胞の懸濁物が、全感染細胞としてまたは細胞破壊によって得られる無細胞調製物として、採取される。この懸濁物は、好適な医薬用キャリアと共にワクチンに配合され、最終製造物が包装される。細胞会合ワクチンはその後、液体窒素において貯蔵され、凍結乾燥ワクチンが－２０℃または＋４℃で貯蔵される。

医薬品製造のための広く知られた基準のもとでのワクチンの製造に適用される一般的な技術および考慮事項が、例えば、政府指令および政府規制（薬局方、連邦規則集第９章（９ＣＦＲ））、ならびに広く知られたハンドブック（「Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ」および「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ」、ともに上掲）に記載される。一般に、そのようなワクチンは無菌で調製され、医薬用品質規格の賦形剤を使用して調製される。

そのような調製物は、無菌性、および外来性作用因の非存在についての微生物学的試験を組み込むであろうし、また、効力および安全性を確認するためのインビボまたはインビトロでの様々な検討を含む場合がある。品質、量、無菌性、安全性および効力についての試験が完了した後、ワクチンは販売のために許可され得る。これらはすべてが当業者には広く知られている。

１つの実施形態において、本発明による家禽用ワクチンは細胞会合ワクチンである。

「細胞会合（した）」は、本発明によるｒＨＶＴが本発明に従ってインビトロでは宿主細胞に含まれることを意味する。その結果として、このタイプのワクチンは、両方とも本発明によるものであるが、宿主細胞並びにｒＨＶＴの両方を含む。

本発明によるワクチンのための標的動物は原則的には健康な動物または病気の動物であることが可能であり、また、ＭＤＶ、ＩＢＤＶ、ＮＤＶまたはＩＬＴＶの存在について、あるいはＭＤＶ、ＩＢＤＶ、ＮＤＶまたはＩＬＴＶに対する抗体について陽性または陰性である場合がある。また、標的は、任意の体重の標的、任意の性別の標的、またはワクチン接種に対して感受性がある任意の年齢の標的に可能である。しかしながら、健康な非感染の標的にワクチン接種すること、および任意の野外感染も、またその結果を防止するために可能な限り早期にワクチン接種することが明らかに有利である。

したがって、本発明によるワクチンは、ＭＤＶ、ＩＢＤＶ、ＮＤＶまたはＩＬＴＶによる感染の確立および進行の両方を妨げるので、予防的処置としてまたは治療的処置としていずれかで、あるいは両方として使用することができる。

その点において、本発明によるワクチンによるウイルス量の減少のさらなる好都合な効果は、ウイルス排出およびそれにより野外ウイルスの拡散、すなわち、子孫への垂直拡散、ならびに群れ内または集団内および地理学的地域内における水平拡散の両方を防止すること、または軽減することである。その結果として、本発明によるワクチンの使用は、ＭＤＶ、ＩＢＤＶ、ＮＤＶまたはＩＬＴＶの有病率の低下を引き起こす。

したがって、本発明のさらなる局面は、
・ＭＤＶ、ＩＢＤＶ、ＮＤＶまたはＩＬＴＶの有病率を集団において、または地理学的地域において低下させるための本発明による家禽用ワクチンの使用、および
・ＭＤＶ、ＩＢＤＶ、ＮＤＶまたはＩＬＴＶの有病率を集団において、または地理学的地域において低下させるための本発明による家禽用ワクチン
である。

本発明によるワクチンは：ＩＢＤ、ＮＤおよびＩＬＴに対しては異種挿入物の発現によって、加えて、ＭＤに対してはＨＶＴベクター自体によって多価免疫を既に提供している。それにもかかわらず、追加の免疫活性成分とのさらなる組み合わせを行うことが好都合であり得る。このことは、既に提供されている免疫防御を増強するために、または既に提供されている免疫防御を他の病原体に拡張するために役立ち得る。

したがって、１つの実施形態において、本発明によるワクチンは、少なくとも１つの追加の免疫活性成分を含むものである。

そのような「追加の免疫活性成分」は、抗原、免疫増強物質、サイトカイン、さらなるワクチン、または任意のそれらの組み合わせである場合がある。これにより、様々な利点が、コスト、効率および動物福祉の点でもたらされる。代替において、本発明によるワクチンは、それ自体がワクチンに加えられる場合がある。

１つの実施形態において、少なくとも１つの追加の免疫活性成分は免疫賦活性化合物であり、好ましくはサイトカインまたは免疫賦活性オリゴデオキシヌクレオチドである。

免疫賦活性オリゴデオキシヌクレオチドは、好ましくは免疫賦活性の非メチル化ＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチド（ＩＮＯ）である。好ましいＩＮＯは、トリＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）２１アゴニストであり、例えば、国際公開第２０１２／０８９．８００号に記載されるもの（Ｘ４ファミリー）、国際公開第２０１２／１６０．１８３号に記載されるもの（Ｘ４３ファミリー）、または国際公開第２０１２／１６０．１８４号に記載されるもの（Ｘ２３ファミリー）などである。

１つの実施形態において、少なくとも１つの追加の免疫活性成分は、家禽に対して病原性である微生物に由来する抗原である。この抗原は、任意の好適な方法、例えば、家禽に対して病原性である微生物から、「生の」弱毒化抗原、不活化抗原、またはサブユニット抗原として「得る」ことができる。

家禽に対して病原性である微生物に由来する追加の抗原は好ましくは、下記のものからなる群から選択される１以上の微生物に由来する：
・ウイルス：伝染性気管支炎ウイルス、ＮＤＶ、アデノウイルス、トリインフルエンザウイルス、産卵低下症候群ウイルス、ＩＢＤＶ、ニワトリ貧血ウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、鶏痘ウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス、アヒルペストウイルス（アヒルウイルス性腸炎）、鳩痘ウイルス、ＭＤＶ、トリ白血病ウイルス（ａｖｉａｎ ｌｅｕｃｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）、ＩＬＴＶ、トリニューモウイルスおよびレオウイルス；
細菌：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、オルニトバクテリウム・リノトラケアレ（Ｏｒｎｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ）、ヘモフィルス・パラガリナルム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、エリシペラス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌａｓ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）およびクリストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）；
寄生虫：エイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）；ならびに
真菌：アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）。

追加の抗原はまた、さらなるベクターワクチンである場合があり、例えば、ＨＶＴに基づくもの、ＭＤＶ２に基づくもの、ＮＤＶに基づくものなどである場合がある。

本発明によるワクチンの１つの実施形態において、家禽に対して病原性である微生物に由来する追加の抗原は、ＭＤＶ、ＩＢＤＶ、ＮＤＶまたはＩＬＴＶの弱毒化「生」ワクチン株である。これは、本発明によるワクチンの免疫原性を改善し、かつ拡張するために役立ち、また、このことは、ＭＤＶ、ＩＢＤＶ、ＮＤＶまたはＩＬＴＶの非常に毒性の野外株が流行しているそのような場合または地理学的地域において好都合である。

これに関して、ＨＶＴと、ＭＤＶ１、ＭＤＶ２またはＨＶＴとの組み合わせが知られており、本発明については、ＭＤＶのＲｉｓｐｅｎｓ株（ＭＤＶ１）、ＳＢ１株（ＭＤＶ２）、またはＦＣ－１２６株もしくはＰＢ１株（ＨＶＴ）が、追加の免疫活性成分として好ましい。

ＮＤに対する応答を改善するために、本発明によるｒＨＶＴは、ＮＤＶワクチン株（例えば、温和な生ＮＤＶワクチン株Ｃ２など）と組み合わされる場合がある。

同様に、ＩＢＤに対する応答を改善するために、本発明によるｒＨＶＴは、生ＩＢＤＶワクチン株（例えば、Ｄ７８、ＰＢＧ９８、Ｃｕ－１、ＳＴ－１２または８９－０３など）と組み合わされる場合がある。

当業者は理解するであろうように、これらの「組み合わせ」にはまた、本発明によるｒＨＶＴと、追加の免疫活性成分とが、組み合わされてまたは同時に適用されるのではなく、並行または逐次的でのワクチン接種スケジュールで適用されるワクチン接種スケジュールが含まれ：例えば、ｒＨＶＴが卵内に、ＮＤＶ Ｃ２が１日目に、ＩＢＤＶ ８９－０３が約１７日齢目に適用されよう。

したがって、少なくとも１つの追加の免疫活性成分を含む本発明によるワクチンの１つの実施形態において、少なくとも１つの追加の免疫活性成分は、ＭＤＶ、ＩＢＤＶ、ＮＤＶもしくはＩＬＴＶからのワクチン株、または任意のそれらの組み合わせからなる群から選択される微生物である。

より好ましくは、追加の免疫活性成分は、ＭＤＶ Ｒｉｓｐｅｎｓ、ＭＤＶ ＳＢ１、ＮＤＶ Ｃ２、ＩＢＤＶ Ｄ７８、およびＩＢＤＶ ８９－０３からなる群から選択される１以上である。

本発明によるワクチンは、本明細書中に記載されるような方法および例示されるような方法によって調製することができる。

したがって、本発明のさらなる局面は、本発明による家禽用ワクチンを調製するための方法であって、
下記の工程；
ａ．宿主細胞にインビトロで本発明によるｒＨＶＴを感染させる工程、
ｂ．感染した宿主細胞を採取する工程、および
ｃ．採取された感染宿主細胞を医薬的に許容され得るキャリアと混合する工程
を含む方法に関する。

本発明についての好適な宿主細胞および医薬的に許容され得るキャリアが上記で記載されている。また、感染、培養および採取のための好適なインビトロ方法がこの技術分野では広く知られており、本明細書中に記載され、例示される。

したがって、本発明の様々な異なる局面および実施形態を、安全な、安定かつ効果的な本発明による家禽用のワクチンを製造するために都合よく使用することができる。

したがって、さらなる局面において、本発明は、家禽用ワクチンを製造するための、本発明によるｒＨＶＴの使用、本発明による宿主細胞の使用、または任意のそれらの組み合わせの使用に関する。

他の化合物（例えば、安定剤、キャリア、アジュバント、希釈剤、乳化物および同様なものなど）を、本発明によるワクチンに混合することもまた本発明の範囲の範囲内であることは言うまでもない。そのような添加物は、広く知られたハンドブック、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ」および「Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ」（ともに上掲）に記載されている。

このようにして、家禽を非常に若齢での単回接種により、ＭＤ、ＩＢＤ、ＮＤおよびＩＬＴから保護することの本発明によるワクチンの効力が、必要なときにはさらに最適化され得る。

本発明によるワクチンは、家禽標的への投与のために好適である形態で、かつ、所望の適用経路および所望の効果と一致する形態で調製することができる。

本発明によるワクチンの適用経路に依存して、ワクチンの組成を適合化することが必要である場合がある。これは十分に当業者の能力の範囲内であり、これには、ワクチンの効力または安全性を微調整することが一般に伴う。このことは、ワクチン用量、量、頻度、経路を適合化することによって、あるいはワクチンを別の形態または製剤で使用することによって、あるいはワクチンの他の構成成分（例えば、安定剤またはアジュバント）を適合化することによって行うことができる。

本発明によるワクチンは、原則的には接種されたｒＨＶＴが防御感染を確立することができるならば、標的家禽に、種々の適用経路によって、及び、その一生の種々の時点で与えることができる。

しかしながら、ＭＤＶ、ＩＢＤＶ、ＮＤＶまたはＩＬＴＶによる感染は、非常に若齢で確立され得るので、本発明によるワクチンを可能な限り早期に適用することは好都合である。したがって、本発明によるワクチンは、例えば、ふ化日（「１日目」）に、または卵内に、例えば、胚発達の約１８日に適用することができる（すべてがこの技術分野では広く知られている）。

したがって、１つの実施形態において、本発明によるワクチンは家禽に卵内投与される。

ワクチンの受精卵への産業的規模での自動化された注射のための装置が市販されている。これは、労働コストを最小限に抑えながら、可能な限り早期の保護をもたらす。種々の卵内接種経路が知られており、例えば、卵黄嚢内、胚内、または尿膜液腔（ａｌｌａｎｔｏｉｃ ｆｌｕｉｄ ｃａｖｉｔｙ）内であり、これらは必要に応じて最適化され得る。好ましくは、ＨＶＴによる卵内接種が、ニードルが胚に接触するように行われる。

好ましくは、本発明によるワクチンは、卵内注射または非経口注射のどちらかでの注射のために好適である注射可能な液状物として、例えば、懸濁物、溶液、分散物または乳化物として配合される。

１つの実施形態において、本発明によるワクチンは非経口経路によって投与される。好ましくは、筋肉内経路または皮下経路によってである。

本発明によるワクチンの動物服用あたりの本発明によるｒＨＶＴの正確な量は、不活性化型ワクチンまたはサブユニット型ワクチンほどに重要でない。これは、ｒＨＶＴが、生物学的に持続可能であるウイルス血症のレベルにまで標的動物において複製するであろうからである。原則的には、ワクチン用量は、そのような増殖性感染を開始させるために十分である必要があるだけである。接種量が大きくなっても、最適なウイルス血症感染に宿主において達するために要する時間はほとんど短くならない。そのため、非常に大きい用量は効果的でなく、加えて、経済的理由のために魅力的でない。

したがって、好ましい接種量は、本発明によるｒＨＶＴが動物服用あたり１×１０＾１～１×１０＾５プラーク形成単位（ｐｆｕ）の間であり、より好ましくは１×１０＾２～１×１０＾４ｐｆｕ／服用の間であり、一層より好ましくは５００～５０００ｐｆｕ／服用の間であり、最も好ましくは約１０００～約３０００ｐｆｕ／服用の間である。

本発明によるワクチンが細胞会合しているときには、これらの量のｒＨＶＴが感染宿主細胞に含まれる。本発明によるｒＨＶＴのウイルス粒子を計数するための様々な方法が広く知られている。

本発明によるｒＨＶＴの動物服用あたりの容量は、その意図された適用経路に従って最適化され得る。卵内接種は、一般には約０．０１ｍｌ／卵～約０．５ｍｌ／卵の間の用量を用いて適用され、非経口注射は、一般には約０．１ｍｌ／鳥～約１ｍｌ／鳥の間の用量を用いて行われる。

本発明によるワクチンの免疫学的に効果的な量がどのくらいであるかの決定、または動物服用あたりのワクチン容量の最適化は、ともに十分に当業者の能力の範囲内である。

本発明によるワクチンを標的生物に適用するための服用レジメンは、ワクチンの製剤と適合する様式での、かつ、免疫学的に効果的であろうような量での単回服用または多回服用であることが可能である。

好ましくは、本発明によるワクチンの投与のためのレジメンは、動物へのストレスを軽減するために、また、労働コストを削減するために、標的家禽によって要求されるかもしれない他のワクチンの既存のワクチン接種スケジュールに統合される。これらの他のワクチンは、それらの認可された使用に適合する様式で、同時に、並行して、または逐次的に投与することができる。

上記で記載されたように、また、本明細書中下記において例示されるように、本発明によるワクチンは、好都合にはＭＤＶ、ＩＢＤＶ、ＮＤＶおよびＩＬＴＶの１以上またはすべてによる感染を非常に若齢での単回接種によって防止するために、または軽減するために、そして、非常に若齢での単回接種による、そのような感染に関連する疾患（の徴候）の防止または軽減のために使用することができる。

したがって、本発明のさらなる局面として、下記が挙げられる：
・ＭＤＶ、ＩＢＤＶ、ＮＤＶおよび／またはＩＬＴＶによる感染、あるいはそれらの関連する疾患徴候を防止するための、または軽減するための、本発明による家禽用ワクチンの使用。
・ＭＤＶ、ＩＢＤＶ、ＮＤＶおよび／またはＩＬＴＶによる感染、あるいはそれらの関連する疾患徴候を防止するための、または軽減するための方法であって、本発明によるワクチンを家禽に投与することを含む方法。
・ＭＤＶ、ＩＢＤＶ、ＮＤＶおよび／またはＩＬＴＶによる感染、あるいはそれらの関連する疾患徴候を防止するために、または軽減するために家禽にワクチン接種する方法であって、前記家禽に本発明によるワクチンを接種する工程を含む方法。
家禽への接種による本発明によるワクチンの使用に関する詳細が上記で記載されている：具体的には、１日齢のヒヨコへの筋肉内接種または皮下接種による接種、および１８日齢の胚への卵内接種。

次に、本発明が、下記の限定されない実施例を参照してさらに説明されるであろう。

［実施例］
［実施例１］
多価ｒＨＶＴベクターの構築およびインビトロ試験
１．１．作製され、試験された構築物
ＨＶＴベクター構築物ｒＨＶＴ－ＶＰ２－Ｆ（ＨＶＰ３６０；国際公開第２０１６／１０２６４７号）に基づいて、ＩＬＴＶのｇＤ遺伝子およびｇＩ遺伝子をさらに発現する一連のＨＶＴ組換え体を作製した。ＨＶＰ３６０は、ＩＢＤＶ－ＶＰ２遺伝子およびＮＤＶ－Ｆ遺伝子を、ＨＶＴのＵｓ２遺伝子に挿入される１つの発現カセットから発現する。Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１８（上掲）によって記載されるようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して、ＩＬＴＶ ｇＤ－ｇＩを発現するさらなるカセットをＨＶＰ３６０ゲノムのＵＬ領域に種々の部位で導入した。いくつかの構築物を第２の発現カセットの挿入により作製し、２つの構築物が、インビトロおよびインビボで試験されたとき要求されたレベルの安定した複製および発現を有することが見出された。挿入部位は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２９１８６６で公開されるようにＨＶＴ株ＦＣ－１２６のゲノムに対して示される：
・ｒＨＶＴ構築物ＨＶＰ４１２：ＵＬ４４とＵＬ４５との間に、具体的にはｎｔ．９４４８２～９４４８３の間に挿入されるｇＤ－ｇＩカセット、および
・ｒＨＶＴ構築物ＨＶＰ４１３：ＵＬ４５とＵＬ４６との間に、具体的にはｎｔ．９５３３５～９５３３６の間に挿入されるｇＤ－ｇＩカセット。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９誘導された挿入のために使用されるガイドＲＮＡ配列は、
・ＵＬ４４とＵＬ４５との間での挿入：５’－ＡＣＡＴＣＧＧＧＡＣＧＴＡＣＡＴＣＡＴＧ－３’（配列番号３）
・ＵＬ４５とＵＬ４６との間での挿入：５’－ＣＴＡＡＣＧＧＴＴＡＣＴＧＴＧＴＴＴＴＡ－３’（配列番号４）
である。

配列番号３および配列番号４は、ＤＮＡプラスミドに挿入され、その後、ガイドＲＮＡを産生させるために転写されたので、ここではＤＮＡコードで示されている。配列番号３のガイドＲＮＡは、順方向向きでＨＶＴの二本鎖ＤＮＡに結合し、切断がそのヌクレオチド１７とヌクレオチド１８との間で行われる。配列番号４のガイドＲＮＡは、逆方向向きでＨＶＴのｄｓ ＤＮＡに結合し、切断がそのヌクレオチド３とヌクレオチド４との間で行われる。

これらのガイドＲＮＡは、インターネットウェブサイト（ｚｌａｂ．ｂｉｏ／ｇｕｉｄｅ－ｄｅｓｉｇｎ－ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）を使用して設計された。

使用された発現カセットおよびＨＶＴゲノムへのそれらの挿入のグラフ表示が図１に示される。

ベクター構築物ＨＶＰ３６０のＵＬ領域への第２の発現カセットの他の挿入を、
・ＵＬ３９の内側－中央部
・ＵＬ３９の内側－３’末端付近
・ＵＬ４０－４１の間
・ＵＬ４７－４８の間
において行った。

１．２．インビトロでの遺伝的安定性
様々なｒＨＶＴベクター構築物を、インビトロで１５回、ＣＥＦ細胞で継代した。Ｐ１５プラークを下記のようにＩＦＡによって挿入遺伝子の発現についてモニターした：一晩にわたって確立されたＣＥＦ単層に、１５回目の継代レベルでのｒＨＶＴベクターの１つを感染させた。プレートを、ＣＰＥが明瞭に視認されるまで２日間～３日間にわたってインキュベーションし、その後、９６％のエタノールにより固定した。ＶＰ２およびＦの発現を特異的モノクローナル抗体により検出し、ｇＤおよびｇＩを、ニワトリポリクローナル抗ＩＬＴＶ抗体を使用して検出した。第１の抗体の後、Ａｌｅｘａ（商標）標識されたコンジュゲートを二次抗体として使用した。次に、プレートをＵＶ顕微鏡法によって読み取った。約１００個のプラークを、発現を評価するために組換え体のそれぞれについて計数した。

ＨＶＰ４１２およびＨＶＰ４１３について試験されたすべてのプラークが、ＶＰ２遺伝子、Ｆ遺伝子およびｇＤ－ｇＩ遺伝子の完全な発現を示した。このことから、インビトロでの細胞継代レベルが（少なくとも）１５まででのこれら３つの異種遺伝子の機能的かつ安定な発現が確認された。

［実施例２］
インビボでの多価ｒＨＶＴベクターの特徴づけ
２．１．序論
いくつかの実験において、インビボにおけるウイルス複製および遺伝子挿入物の発現、ならびに血清学的免疫応答の誘発を、実施例１に記載されるように構築された様々な多価ｒＨＶＴベクターについて試験した。実験動物は１日齢のＳＰＦ産卵鶏のヒヨコであった。ｒＨＶＴベクターワクチンのインビボでの複製を明らかにするために、ワクチン接種後１５日目での脾臓におけるＨＶＴウイルス血症レベルを判定した。異種遺伝子挿入物の発現および特異的抗体の誘発について調べるために、血液サンプルを治験期間中の種々の時点で採取した。

２．２．実験
群サイズが、５匹のふ化仲間を加えた１２匹の動物であった。ワクチン接種日にふ化仲間から採取された血液サンプルを、この一群の動物がワクチン接種日にＮＤＶ、ＩＢＤＶおよびＩＬＴＶに対する抗体について陰性であることを確認するために、血清学的に試験した。

ｒＨＶＴワクチンウイルスを１５回目の細胞継代で使用し、液体窒素において感染ＣＥＦとして貯蔵した。ウイルス力価（感染細胞における）は、１～１．２×１０＾６ｐｆｕ／ｍｌであった。投与された平均ワクチン用量が、０．２ｍｌの標準的なＨＶＴ／ＣＥＦ希釈剤において動物あたり１６９４ＰＦＵであり、これを、標準的な手順を使用して頸部に皮下接種した。

１つの群は、対照として役立たせるためにｒＨＶＴの元になったベクターＨＶＰ３６０をワクチンとして受けた。ヒヨコはふ化後すぐに陰圧アイソレーターに入れられ、その後すぐに標識されワクチン接種されたので、順化は何ら適用されなかった。

血液サンプルを、ワクチン接種後１５日目、２２日目、３２日目および４２日目にワクチン接種ヒヨコから採取した。血液サンプルを、凝固活性化因子を含むチューブに翼静脈から集め、周囲温度で保った。

ウイルス血症：
脾臓からのウイルス血症サンプル採取を下記のように行った：ワクチン接種後１５日目に、脾臓を群あたり６羽のヒヨコから死後に単離した。清浄なピンセットをそれぞれのヒヨコについて使用した。脾臓を、フェノールレッド指示薬および抗生物質を含む５ｍｌの１０ｍＭ ＰＢＳを含むチューブに集め、処理するまで氷上に保った。次に、脾臓をホモジナイズし、新鮮な培地に入れ、計数した。５．０×１０＾６個の脾臓細胞あたりのｒＨＶＴウイルス血症を判定するために、その数の細胞を、確立されたＣＥＦ単層を有するディッシュに加え、３８℃で３日間～４日間インキュベーションした。ウイルスが細胞に存在したならば、プラークとして視認されるＣＥＦに対する細胞変性効果が引き起こされた。３つのプレートを動物サンプルあたり計数した。プレートを、９６％のエタノールを使用して固定し、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）を、抗原ＶＰ２、抗原Ｆ、または抗原ｇＤ－ｇＩの１つについての染色との組み合わせで、ウイルス感染細胞を抗ＨＶＴ抗血清により染色するために適用した。その結果として、３つの別個の二重染色が行われた。

血清学
血清学的応答の試験のための血液サンプルを、ワクチン接種後２２日目、３２日目および４２日目に採取した。サンプルを遠心分離し、血清を集め、補体を不活性化した。血清を、発現した異種遺伝子に対するワクチン接種ニワトリの血清応答を判定するために種々の試験で使用した：ＩＢＤＶ－ＶＰ２応答を、典型的ＩＢＤＶウイルス株Ｄ７８を使用するウイルス中和（ＶＮ）アッセイによって測定し、ＮＤＶ－Ｆ、ＩＢＤＶ－ＶＰ２およびＩＬＴＶ－ｇＤ－ｇＩに対する血清学的応答をＥＬＩＳＡによって測定し、標準サンプルに対する相対的なユニット数で表した。

２．３．結果および結論
ウイルス血症
ｒＨＶＴウイルス血症が、群あたり６匹の動物からの脾臓においてワクチン接種後１５日で検出された。対照ベクターＨＶＰ３６０についての平均ウイルス血症が５００万個の脾臓細胞あたり９３ＰＦＵであった。それ以外のｒＨＶＴワクチンを受ける群あたりの平均ウイルス血症数の結果は、以下の通りであった：
・ＵＬ３９の中央部における、または３’でのｇＤ－ｇＩ挿入物：ＨＶＴウイルス血症は検出不能；インビボでの複製は認められず、
・ＵＬ４０－４１における、またはＵＬ４７－４８におけるｇＤ－ｇＩ挿入物：それぞれ、３６、４５ＰＦＵ／５×１０＾６：ＨＶＰ３６０よりも低い低下したウイルス血症；低下したインビボでの複製、
・ＵＬ４４－４５における、またはＵＬ４５－４６におけるｇＤ－ｇＩ挿入物：それぞれ、８１、９２ＰＦＵ／５×１０＾６：ＨＶＰ３６０と同程度の良好なウイルス血症；良好なインビボでの複製

インビボでの遺伝的安定性
ウイルス血症アッセイで得られるｒＨＶＴウイルスを異種遺伝子の継続した発現について試験した。ワクチン接種後１５日での脾臓由来のすべての単離体から、約１００個のｒＨＶＴプラークをＩＦＡによって分析した。

ｇＤ－ｇＩ挿入物をＵＬ３９に有するｒＨＶＴベクターはインビボで複製せず、そのため、安定性を判定することができなかった。

ｇＤ－ｇＩ挿入物をＵＬ４０－４１に有するｒＨＶＴベクターは、インビボでの１５日間の複製の後では、試験されたプラークの７５％のみがＮＤＶ－Ｆ遺伝子の発現を示し、かつ、プラークの半分のみがＩＢＤＶ－ＶＰ２遺伝子の発現を示したように、遺伝的に不安定であることが明らかにされた。

それ以外のｒＨＶＴ構築物については、ｇＤ－ｇＩ挿入物をＵＬ４４－４５に有するｒＨＶＴ（ＨＶＰ４１２）、ＵＬ４５－４６に有するｒＨＶＴ（ＨＶＰ４１３）、またはＵＬ４７－４８に有するｒＨＶＴの分析されたすべてのプラークが、インビボでの１５日間の複製の後、すべての異種遺伝子（ＩＢＤＶ－ＶＰ２、ＮＤＶ－Ｆ、ならびにＩＬＴＶ－ｇＤおよびｇＩ）の発現を維持した。

血清学
自然界では、これら３つの異種抗原が由来する病原体（ＩＢＤＶ、ＮＤＶ、およびＩＬＴＶ）に対する免疫応答は、すべて体液性免疫応答に非常に大きく依拠している。その結果として、ワクチン接種によって生じる抗体応答の計測は、これらの病原体からの感染および／または疾患に対するインビボ保護の信頼できる相関である。

様々なｒＨＶＴベクターによるニワトリへのワクチン接種によって誘発される血清学的応答をＥＬＩＳＡによって分析した。陰性対照は、ワクチン接種前に試験された同じ一群の動物に由来するふ化仲間であった。ＮＤＶおよびＩＢＤＶに対する抗体保有（ｓｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）についての陽性対照が、ＨＶＰ３６０ベクターによるワクチン接種であった。

１日目のふ化仲間のいずれもが、これらの病原体の１つ（ＮＤＶ、ＩＢＤＶまたはＩＬＴＶ）に対する検出可能な抗体価を何ら有しなかった。

抗ＩＬＴＶ血清反応を、市販のＥＬＩＳＡ試験（ＩＤ Ｓｃｒｅｅｎ（商標）ＩＬＴ ｇＩ Ｉｎｄｉｒｅｃｔ、ＩＤ ｖｅｔから得られる）を使用して試験した。この試験では、６１１を超える結果値が防御免疫応答を示している。

ワクチン接種後の特定の日における種々の群についての平均ＥＬＩＳＡスコア（ｎ＝６）の結果が表３に示される。

表３に示されるＥＬＩＳＡ結果から明らかであるように、ｇＤ－ｇＩがＵＬ４７－４８の間に挿入されるｒＨＶＴは、試験されたワクチン接種後２２日目、３２日目および４２日目のそれぞれにおいて、非常に低いレベルに過ぎない抗ＩＬＴ抗血清を誘発し、したがって、防御レベルを常に下回っていた。その結果として、ｇＤ－ｇＩ挿入物をＵＬ４７－４８の間に有するｒＨＶＴは、たとえインビトロおよびインビボで安定であるとしても、ＩＬＴＶ感染に対する多価ベクターワクチンとして有用ではないであろう。

しかしながら、ｇＤ－ｇＩがＵＬ４４－４５の間に挿入されるｒＨＶＴ構築物（ＨＶＰ４１２）、またはＵＬ４５－４６の間に挿入されるｒＨＶＴ構築物（ＨＶＰ４１３）は、ワクチン接種後３２日目および４２日目において、防御レベルを十分に超えるスコアを有した。

加えて、構築物ＨＶＰ４１２および構築物ＨＶＰ４１３によるワクチン接種によって誘発される、ＮＤＶおよびＩＢＤＶに対する血清応答は、元のベクターＨＶＰ３６０によって誘発されるＥＬＩＳＡスコア値に非常に近いＥＬＩＳＡスコア値をすべての試験日で示した。その結果として、これらの構築物（ＨＶＰ４１２およびＨＶＰ４１３）では、ＮＤＶ－Ｆ遺伝子およびＩＢＤＶ－ＶＰ２遺伝子の発現および送達が、ＩＬＴＶのｇＤ遺伝子およびｇＩ遺伝子のＵＬ領域への追加挿入によって影響を受けていなかった。

ＨＶＰ３６０は、ＭＤＶ、ＮＤＶおよびＩＢＤＶに対して効果的な広く知られた市販のワクチン（Ｉｎｎｏｖａｘ ＮＤ－ＩＢＤ）であるので、そのため、ＨＶＰ４１２およびＨＶＰ４１３は、ＭＤＶ、ＮＤＶおよびＩＢＤＶに対して等しく効果的であり、今や、加えて、ＩＬＴＶに対してもまた効果的である。

実施例３：ワクチン接種－抗原暴露治験
３．１．序論
実施例２に記載される血清学データが、実際に様々な病原体（ＮＤＶ、ＩＢＤＶおよびＩＬＴＶ）によって引き起こされる感染および疾患に対する良好な保護に対応することを明らかにするために、一連のワクチン接種－抗原暴露実験を行った：１日齢のＳＰＦニワトリに、本発明の三価ベクター構築物の１つ（ＨＶＰ４１２またはＨＶＰ４１３）によるワクチン接種を行った。次に、ワクチン接種体に、ワクチン接種後数週で、ＮＤＶ、ＩＢＤＶまたはＩＬＴＶに由来する毒性のウイルス株による抗原暴露を行い、いくつかの感染パラメーターを測定した。

別々の治験を、異なる抗原暴露を調べるために行い、それによって、本発明による同じｒＨＶＴベクターワクチンが使用され、これらが同じ用量で与えられた。これらの実験の設定は、本質的には上記の実施例２に記載される通りであった。抗原暴露は、大半が以前に記載されたように行われ、例えば、ＮＤＶまたはＩＢＤＶの抗原暴露は、国際公開第２０１６／１０２６４７号に関して行われたように行われ、ＩＬＴＶ抗原暴露は、国際公開第２０１９／０７２９６４号に関して行われたように行われた。

３．２．材料および方法
一般的なワクチン接種
・ＳＰＦ白色レグホン産卵鶏をアイソレーターにおいてふ化させた：鶏にはタグ番号の札をつけ、同日に、２０００ｐｆｕ（＝１０＾３．３）のＨＶＰ４１２またはＨＶＴ４１３のどちらかを０．２ｍｌの標準希釈剤における感染ＣＥＦとして、頸部に皮下経路によってワクチン接種した。

・陽性対照として、類似用量の商用二価ｒＨＶＴベクターワクチンの１つ、すなわち、ＨＶＴ－ＮＤ－ＩＢＤ（ＨＶＰ３６０、国際公開第２０１６／１０２６４７号；Ｉｎｎｏｖａｘ（登録商標）ＮＤ－ＩＢＤ｛ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ｝）ベクター、または国際公開第２０１３／０５７２３６号に開示されるＨＶＴ－ＮＤ－ＩＬＴベクター（Ｉｎｎｏｖａｘ（登録商標）ＮＤ－ＩＬＴ｛ＭＳＤ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ｝のどちらかを使用した。ＨＶＰ４１２ウイルスおよびＨＶＰ４１３ウイルスを１５または１６の細胞継代レベルで使用した。

・陰性対照はワクチン非接種であり、その群サイズは群あたり９羽のヒヨコであった。

・ＩＢＤＶ抗原暴露治験およびＩＬＴＶ抗原暴露治験については群サイズが群あたり１０羽のヒヨコであり、ＮＤＶ抗原暴露試験については群サイズが群あたり１５羽のヒヨコであり、それぞれの群が異なるアイソレーターに収容された。それぞれの実験のために、１０羽のふ化仲間が、血清陰性状態を実験開始時に確認するために採血された。

・ワクチン接種後（ｐｖ）３週で、血液および脾臓を、実施例２に記載されるように、発現について血清学によって調べるために、また、ｒＨＶＴベクターウイルス血症について調べるために、群あたり５羽のヒヨコから集めた。

特異的な抗原暴露：
ＩＢＤＶ
ＩＢＤＶ抗原暴露を、使用された群サイズがより小さかったが、Ｐｈ．Ｅｕｒ．ｍｏｎｏｇｒａｐｈ ０５８７に従って行った。具体的には、ワクチン接種後３週で、それぞれのヒヨコが、３０ ＣＩＤ５０のＩＢＤＶ株ＣＳ８９を０．１ｍｌのＰＢＳにおいて、点眼によって、両眼を覆うように分割されて受けた。

抗原暴露後、ヒヨコをＩＢＤの臨床徴候について１０日間モニターし、臨床スコアを、０から３までのスケールで、すなわち、それぞれ、徴候なし－いくつかの徴候－重篤な徴候－死亡について、毎日、それぞれのヒヨコに割り当てた。ＩＢＤの臨床徴候として、元気消失、うずくまる、蒼白、食欲不振、逆立った羽毛、および異常な糞便がある。次に、すべての残存する鳥を安楽死させ、ファブリキウス嚢を肉眼によりスコアづけし、組織学的分析のためにサンプル採取した。この場合、一般的な判断基準、例えば、肉眼的には肥大および浮腫が、顕微鏡的には、リンパ球枯渇、壊死、および偽好酸球の流入を（２５％のブロックにおいて）示した濾胞の割合が使用された。これらの試験のいずれかにおける所見もまた、総臨床スコアに寄与した。

ＩＬＴＶ
ＩＩＬＴＶ抗原暴露を、使用された群サイズがより小さかったが、Ｐｈ．Ｅｕｒ．ｍｏｎｏｇｒａｐｈ １０６８に従って行った。具体的には、ワクチン接種後４週で、それぞれのヒヨコが、３．０ Ｌｏｇ１０ ＥＩＤ５０のＩＬＴＶ株９６－３を標準的な細胞培養培地におけるＣＡＭホモジネートとして受けた。ＩＬＴＶ抗原暴露ウイルスを、シリンジを介して気管の中央部にヒヨコあたり０．１ｍｌで投与した。

抗原暴露後７日間、ヒヨコをＩＬＴの臨床徴候について１日に２回（午前および夕方）観察し、それぞれの午前において、臨床スコアを０から３までのスケールで、すなわち、それぞれ、徴候なし－いくつかの徴候－重篤な徴候－死亡について、それぞれのヒヨコに割り当てた。ＩＬＴＶ感染について典型的な臨床徴候として、顕著な呼吸困難、努力呼吸、あえぎ、血液喀出、鼻汁、結膜炎、および副鼻腔の腫脹がある。

抗原暴露後７日でヒヨコを安楽死させ、気管を単離し、赤色度ならびに内容物のタイプおよびコンシステンシーについて調べることによってＩＬＴＶ感染の徴候についてスコアづけした。これらの試験のいずれかにおける所見もまた、総臨床スコアに寄与した。

ＮＤＶ
ＮＤＶ抗原暴露を、使用された群サイズがより小さかったが、Ｐｈ．Ｅｕｒ．ｍｏｎｏｇｒａｐｈ ０４５０に従って行った。具体的には、抗原暴露をワクチン接種後５週で、筋肉内経路によって与えられる０．２ｍｌのＰＢＳにおいて、５ Ｌｏｇ１０ ＥＩＤ５０のＮＤＶ株Ｈｅｒｔｓ ３３／５６をヒヨコあたり投与することによって行った。ヒヨコを抗原暴露後最大で１４日間にわたって毎日観察し、ＮＤＶ臨床スコアを、０から３までのスケールで、すなわち、それぞれ、徴候なし－いくつかの徴候－重篤な徴候－死亡について、毎日、それぞれのヒヨコに割り当てた。ＮＤＶ感染の典型的な徴候として、神経学的症状、例えば、ねじれた首、明らかに垂れ下がる翼、非協調的歩行、筋振戦、および後方に湾曲した身体がある。

３．３．結果
ＨＶＰ４１２ベクターワクチンまたはＨＶＰ４１３ベクターワクチンを受けるすべてのワクチン接種体が、ｒＨＶＴベクターの良好なウイルス血症、およびワクチン接種後３週での異種遺伝子挿入物のすべての良好な発現（これは、実施例２で認められる発現と類似していた）を示した。

３つすべての抗原暴露治験について、１日目に試験されたふ化仲間は、ＮＤＶ、ＩＢＤＶおよびＩＬＴＶに対する抗体について血清陰性であった。

ＩＬＴＶおよびＩＢＤＶの結果のために使用される総臨床スコアは、群あたり１０羽のヒヨコのすべてに対して観察期間を通して割り当てられるすべての臨床スコア、並びに、行われた肉眼検査および顕微鏡検査から得られるスコアを合計したものである。

ＮＤＶ
ワクチン接種後５週で、本発明の三価ｒＨＶＴベクターワクチンによって誘発されるＮＤＶ抗原暴露感染に対する保護が、二価ＨＶＴ－ＮＤ－ＩＬＴによって得られる保護と少なくとも同程度であることが判明した：ＨＶＴ－ＮＤ－ＩＬＴワクチンベクターおよびＨＶＰ４１２ベクターワクチンの両方で、８７％のヒヨコが保護され、２／１５の死亡、およびそれら以外のヒヨコの一部における数日間にわたる軽度の臨床徴候が示された。ＨＶＰ４１３ワクチンでは、ヒヨコの１００％が重症ＮＤＶ感染に対して保護され、死亡が認められないこと、および、ほとんどがただ１日間だけであったが、３／１５のヒヨコにおける軽度に過ぎない症状が示された。ワクチン非接種ヒヨコは、すべてのこれらのヒヨコが死亡したか、または抗原暴露後２日目までに安楽死させる必要があったように、抗原暴露感染に対する保護が０％であることを示した。

ＩＬＴＶ
ＩＬＴＶ抗原暴露に対する保護をワクチン接種後４週で試験し、すべてのベクターワクチンからの優れた保護が示された：ＨＶＰ４１２は１００％の保護および２０の総臨床スコアを示し、ＨＶＰ４１３は１００％の保護および３７の総臨床スコアを示し、ＨＶＴ－ＮＤ－ＩＬＴは１００％の保護および１の総臨床スコアを示した。ワクチン非接種の抗原暴露ヒヨコは、数日間にわたるＩＬＴＶ感染の中程度から重症の臨床兆候、すなわち、抗原暴露感染に対する保護が認められないこと、および１２５９の総臨床スコアを示した。

ＨＶＰ４１２ワクチンおよびＨＶＰ４１３ワクチンによって誘発される血清学的応答は、ＨＶＴ－ＮＤ－ＩＬＴワクチンによって誘発される血清学的応答ほどには高くなかった。しかしながら、この技術分野では広く知られているように、および防御データによってもまた確認されるように、ＩＬＴＶ防御は体液性免疫応答に（有意に）依存していない。

ＩＢＤＶ
ＩＢＤＶワクチン接種効力をワクチン接種後３週で試験し、重篤な抗原暴露感染に対する優れた保護もまた示された：ＨＶＰ４１２は１００％の保護および７に過ぎない総臨床スコアをもたらし、ＨＶＰ４１３は１００％の保護を示し、総臨床スコアが５に過ぎなかった。ＨＶＰ３６０からの保護が９０％であり、総臨床スコアが１６６であった。ワクチン非接種の抗原暴露ヒヨコは保護されず、１５４１の総臨床スコアを有した。

この実験における陽性対照ＨＶＰ３６０について認められる保護は、他の例において認められているよりもわずかに小さかった。代わりに、本発明のベクターワクチンは、ＩＢＤＶ感染に対して商用ベクターワクチンと少なくとも同じくらい効果的であることが明らかである。

３．４．結論
これらのワクチン接種－抗原暴露実験により、実施例２において既に記された結果、すなわち、本発明の両方のｒＨＶＴベクター構築物（ＨＶＰ４１２およびＨＶＰ４１３）が、ＮＤＶ、ＩＬＴＶおよびＩＢＤＶの家禽病原体のそれぞれによる重篤な抗原暴露感染に対するベクターワクチンとして効果的であることが確認された。

実際、測定されたワクチン効力は、商用の二価ベクターワクチンについて認められる効力と少なくとも同じくらい良好であったか、またはそれよりも一層良好であった。

Claims (13)

1. 伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）のウイルスタンパク質２（ＶＰ２）遺伝子およびニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）の融合（Ｆ）タンパク質遺伝子を、ｒＨＶＴのゲノムのユニークショート（Ｕｓ）領域に挿入される第１の発現カセットから発現するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルス（ｒＨＶＴ）であって、
   前記ｒＨＶＴがまた、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）の糖タンパク質Ｄ遺伝子および糖タンパク質Ｉ遺伝子（ｇＤ遺伝子およびｇＩ遺伝子）を、前記ｒＨＶＴのゲノムのユニークロング（ｕｎｉｑｕｅ ｌｏｎｇ：ＵＬ）領域においてＵＬ４４遺伝子とＵＬ４５遺伝子との間またはＵＬ４５遺伝子とＵＬ４６遺伝子との間のどちらかで挿入される第２の発現カセットから発現する、ことを特徴する、
   シチメンチョウの組換えヘルペスウイルス（ｒＨＶＴ）。
2. 前記第１の発現カセットが、５’から３’への方向で、かつ、次に述べる順に、
   ａ．マウスサイトメガロウイルス前初期１遺伝子（ｍＣＭＶ－ＩＥ１）プロモーター、
   ｂ．ＩＢＤＶのＶＰ２遺伝子、
   ｃ．転写ターミネーター、
   ｄ．ヒトサイトメガロウイルス前初期１遺伝子（ｈＣＭＶ－ＩＥ１）プロモーター、
   ｅ．ＮＤＶのＦタンパク質遺伝子、および
   ｆ．転写ターミネーター
   を含み、
   それによって、前記プロモーターおよびターミネーターが、前記ＶＰ２遺伝子に、前記Ｆ遺伝子にそれぞれ機能的に連結されることを特徴とする、請求項１に記載のｒＨＶＴ。
3. 前記第１の発現カセットがＵｓ２遺伝子に挿入されることを特徴とする、請求項１または２に記載のｒＨＶＴ。
4. 前記第２の発現カセットが、５’から３’への方向で、かつ、次に述べる順に、
   ａ．上流側プロモーターおよび下流側ターミネーターを伴うＩＬＴＶのｇＤ遺伝子、ならびに
   ｂ．上流側プロモーターおよび下流側ターミネーターを伴うＩＬＴＶのｇＩ遺伝子
   を含み、
   それによって、前記プロモーターおよびターミネーターが、前記ｇＤ遺伝子に、前記ｇＩ遺伝子に、それぞれ機能的に連結されることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載のｒＨＶＴ。
5. 請求項１～４のいずれか一項に記載のｒＨＶＴを含む宿主細胞。
6. 家禽用ワクチンにおける使用のための、請求項１～４のいずれか一項に記載のｒＨＶＴ、および／または、請求項５に記載の宿主細胞。
7. 請求項１～４のいずれか一項に記載のｒＨＶＴ、および／または、請求項５に記載の宿主細胞と、医薬的に許容され得るキャリアとを含む家禽用ワクチン。
8. 少なくとも１つの追加の免疫活性成分を含む請求項７に記載のワクチン。
9. 請求項７または８に記載の家禽用ワクチンを調製するための方法であって、該方法は、
   下記の工程；
   ａ．宿主細胞にインビトロで請求項１～４のいずれか一項に記載のｒＨＶＴを感染させる工程、
   ｂ．感染した宿主細胞を採取する工程、および
   ｃ．採取された感染宿主細胞を医薬的に許容され得るキャリアと混合する工程
   を含む方法。
10. 家禽用ワクチンを製造するための、請求項１～４のいずれか一項に記載のｒＨＶＴ、請求項５に記載の宿主細胞、または任意のそれらの組み合わせの使用。
11. ＭＤＶ、ＩＢＤＶ、ＮＤＶおよび／またはＩＬＴＶによる感染、あるいはそれらの関連する疾患徴候を防止するための、または軽減するための、請求項７または８に記載の家禽用ワクチンの使用。
12. ＭＤＶ、ＩＢＤＶ、ＮＤＶおよび／またはＩＬＴＶによる感染、あるいはそれらの関連する疾患徴候を防止または軽減するための方法であって、請求項７または８のいずれか一項に記載のワクチンを家禽に投与することを含む方法。
13. ＭＤＶ、ＩＢＤＶ、ＮＤＶおよび／またはＩＬＴＶによる感染、あるいはそれらの関連する疾患徴候を防止または軽減するために家禽にワクチン接種する方法であって、前記家禽に請求項７または８に記載のワクチンを接種する工程を含む方法。

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