CN110680914B

CN110680914B - 一种三联灭活疫苗及其制备方法

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Publication number: CN110680914B
Application number: CN201910899652.6A
Authority: CN
Inventors: 张贺伟; 杨振; 董均; 杨少宗; 李琛; 宋敏杰; 田文静; 郭少阳; 张淼丹; 程相朝; 张春杰
Original assignee: Yangzhou Uni Bio Pharmaceutical Co ltd; Luoyang Vocational and Technical College
Current assignee: Yangzhou Uni Bio Pharmaceutical Co ltd; Luoyang Vocational and Technical College
Priority date: 2019-09-23
Filing date: 2019-09-23
Publication date: 2021-11-26
Anticipated expiration: 2039-09-23
Also published as: CN110680914A

Abstract

本发明提供了一种三联疫苗，所述三联灭活疫苗的抗原为灭活的鸡新城疫La Sota病毒株、灭活的H9亚型禽流感QF01株和灭活的I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白，还提供其制备方法：I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白经二乙烯亚胺灭活后，与灭活的鸡新城疫病毒浓缩液、灭活的禽流感病毒浓缩液混合乳化后得到三联灭活疫苗。本发明的三联灭活疫苗灭活的I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白含量高，免疫原性强，甲醛和内毒素含量低，对当前流行的I群8b型禽腺病毒具有较好的保护效果，安全性能好，免疫效果确实，可以抵抗新城疫病毒、禽流感病毒以及I群8b型禽腺病毒对临床鸡群的感染，持续期长，仅使用一次0.3mL疫苗的情况下，免疫持续期能达到五个月，至少给鸡群提供70%的保护率。

Description

一种三联灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种三联灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒引起禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病。以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征。具有很高的发病率和病死率，是危害全球养禽业最为严重的烈性传染病之一。OIE将其列为A类疫病，是我国《国家中长期动物疫病防治规划》中规定优先防治和重点防范的5种一类动物疫病之一。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告的动物疫病。

禽流感(Avian influenza，AI)是由A型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)感染禽类引起的一类传染病，广泛发生于世界各地，并且经常变异，对人类和养禽业危害很大。禽流感H9亚型数与低致病性禽流感，在养殖场的发病率比较高，发病症状不太明显，但对鸡肠道和输卵管等影响非常大。

2013年以来，一种高致病性病原在我国多个省份流行，导致大量家禽死亡，主要病变表现为肝脏出血。经鉴定，该病为Ⅰ群禽腺病毒血清8b型感染。对该病进行流行病学调查发现，该病在我国鸡群中发病率较高，尤其对雏鸡致病严重，主要发生于雏鸡，病雏生长受阻、羽毛蓬乱、蹲伏。多于48h内死亡或逐减康复。鸡群发病后会突现3～5d的死亡高峰。死亡率低，可能至10％，个别可达30％。有时病程也可持续2～3d。由于目前临床无批准的禽腺病毒疫苗，禽腺病毒的流行给养殖业带来巨大的损失。

鸡新城疫、H9亚型禽流感是严重威胁家禽较为常见的2种重要疾病；同时，I群8b型禽腺病毒对鸡群的感染也给养殖业带来严重的损失。养殖场为减少成本投入和避免对鸡群的注射应激，急需安全高效和便于投放的多联疫苗，来应对不断变化的疫病防控形势。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种三联灭活疫苗，该疫苗内毒素含量低，安全性能好，免疫效果确实，可以抵抗新城疫病毒、禽流感病毒以及I群8b型禽腺病毒对临床鸡群的感染，持续期长，使用三联灭活疫苗仅仅使用一次0.3mL 疫苗的情况下，免疫持续期能达到五个月，至少给鸡群提供70％的保护率，该疫苗的制备方法中国使用I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白，是用表达鸡禽腺病毒(I群8b型)Hexon蛋白的重组杆状病毒rHexon 株F0代接种Sf9细胞，收获细胞培养物，离心后取上清液制得，与灭活的鸡新城疫病毒浓缩液、灭活的禽流感病毒浓缩液混合后乳化后得到三联灭活疫苗。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种三联灭活疫苗，所述三联灭活疫苗的抗原为灭活的鸡新城疫La Sota病毒株、灭活的H9亚型禽流感QF01株和灭活的I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白；所述I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2 所示；所述I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白的核苷酸如SEQ ID NO.1 所示；所述鸡新城疫La Sota病毒株的含量≥10^8.5EID₅₀/0.1mL；所述 H9亚型禽流感QF01株的含量≥10^7.5EID₅₀/0.1mL；所述I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白含量的琼扩效价≥1:32；所述H9亚型禽流感QF01株，属于流感病毒，于2019年08月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为：CGMCC No.18338。

本发明还提供了制备上述的三联灭活疫苗的方法，该方法为：

S1、I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白的制备：

S101、pMD-Hexon重组质粒的制备：

设计适于杆状病毒表达系统表达Hexon蛋白核酸序列的引物对，分别命名为FAdV-F和FAdV-R，所述FAdV-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述FAdV-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；以提取的I群8b型禽腺病毒DNA为模板，以FAdV-F和FAdV-R为引物，进行PCR扩增，得到Hexon目的片段，经琼脂糖凝胶电泳检测后，回收Hexon目的片段，并用T4 DNA连接酶连接到pMD-19T 载体上，然后在无菌条件下转化DH5α-T1感受态细胞，得到重组质粒a，将重组质粒a在含有浓度为50μg/mL的氨苄青霉素的LB固体培养基上培养12h～14h，挑取单菌落用M13-F引物和M13-R引物进行菌落PCR鉴定，阳性菌落进行测序验证，将测序正确的重组质粒a 命名为pMD-Hexon重组质粒；所述Hexon目的片段的的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸如SEQ ID NO.1所示；所述M13-F 引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，所述M13-R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

S102、pFastBac I-Hexon中转质粒的制备：

用BamH I限制性内切酶和EcoR I限制性内切酶将pFastBac I质粒和S101中得到的pMD-Hexon重组质粒分别进行双酶切，得到 pFastBac I酶切片段和pMD-Hexon酶切片段，经琼脂糖凝胶电泳检测后，分别回收pFastBac I酶切片段和pMD-Hexon酶切片段，然后用T4 DNA连接酶在温度为4℃的条件下连接12h～14h，然后在无菌条件下转化DH5α-T1感受态细胞，得到重组质粒b，将重组质粒b在含有浓度为50μg/mL的氨苄青霉素的LB固体培养基上培养12h～ 14h，挑取单菌落用M13-F引物和M13-R引物进行菌落PCR鉴定，阳性菌落进行测序验证，将测序正确的重组质粒b命名为pFastBac I-Hexon中转质粒；所述M13-F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述M13-R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

S103、重组杆粒pF-rBac-Hexon的构建：

将S102中得到的pFastBac I-Hexon中转质粒转入大肠杆菌 DH10Bac感受态细胞中，得到重组大肠杆菌DH10Bac，得到重组杆粒，将在含有浓度为50μg/mL的氨苄青霉素的LB固体培养基上培养12h～14h，挑选阳性单菌落用M13-F引物和M13-R引物进行菌落 PCR鉴定，经琼脂糖凝胶电泳检测与预期大小一致后回收，命名为重组杆粒pF-rBac-Hexon；所述M13-F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述M13-R引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示；

S104、重组杆粒转染sf9细胞：

用脂质体转染的方法，将S103中得到的重组杆粒pF-rBac-Hexon 转染昆虫细胞sf9，在温度为27℃的条件下培养96h～144h，收集细胞培养物，离心后取上清液，得到重组杆状病毒rHexon株F0代；

S105、重组杆状病毒的扩增：

将S104中得到的重组杆状病毒rHexon株F0代接种昆虫细胞sf9，在温度为27℃的条件下培养96h～144h，收集细胞培养物，离心后取上清液，得到F1代重组杆状病毒；

S106、I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白的获得：

将S105中得到的F1代重组杆状病毒接种昆虫细胞sf9，在温度为27℃的条件下培养96h～144h，收集细胞培养物，离心后取上清液，得到I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白；

S2、制备油相：

取注射用白油、硬脂酸铝，置于油相制备罐中加热到80℃时，再加入司本80，至温度达到116℃时维持30min，自然冷却至室温后，得到油相；注射用白油、硬脂酸铝和司本80的质量比为94:1:6；

S3、制备水相：

将鸡新城疫La Sota病毒株培养得到鸡新城疫病毒液，将H9亚型禽流感QF01株培养得到禽流感病毒液，将得到的鸡新城疫病毒液和禽流感病毒液分别经过滤、浓缩、用甲醛灭活，分别得到灭活的鸡新城疫病毒浓缩液和灭活的禽流感病毒浓缩液，将S106中得到的I 群8b型禽腺病毒Hexon蛋白用二乙烯亚胺灭活，得到灭活的I群8b 型禽腺病毒Hexon蛋白；将灭活的鸡新城疫病毒浓缩液、灭活的禽流感病毒浓缩液和灭活的I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白等质量混合，得到混合抗原液，向混合抗原液中加入吐温80，混合均匀，得到水相；所述水相中混合抗原液和吐温80的质量比为96:4；

S4、乳化：

将S2中得到的油相放入乳化罐内，以150r/min的搅拌速率，边搅拌边加入S3中得到的水相，待水相加入完后，继续搅拌30min，得到乳化液，然后在温度为20℃～25℃的条件下，将所述乳化液在剪切速率为4000r/min的条件下剪切2次后，得到三联灭活疫苗。

优选地，S101中所述PCR扩增的反应体系为：I群8b型禽腺病毒 DNA 1.0μL、浓度为10mmol/L的FAdV-F 2.0μL、浓度为10mmol/L 的FAdV-R 2.0μL、5U/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL、dNTPs 5μ L、缓冲液5μL、无菌重蒸水补足至50μL；所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min。

优选地，S101、S102和S103中所述菌落PCR鉴定的反应体系均为：菌落DNA 1.0μL、浓度为10mmol/L的M13-F 0.5μL、浓度为 10mmol/L的M13-R 0.5μL、2×Taq DNA聚合酶预混液12.5μL、无菌重蒸水补足至25μL；所述菌落PCR鉴定的反应条件均为：95℃ 预变性5min；95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min。

优选地，S104、S105和S106中离心的转速均为4000rpm～ 10000rpm，离心的时间均为30min～60min。

优选地，S105中所述重组杆状病毒rHexon株F0代接种昆虫细胞sf9的感染复数为0.1～3.0；S106中所述F1代重组杆状病毒接种昆虫细胞sf9的感染复数为0.1～3.0。

优选地，S3中所述鸡新城疫病毒液和禽流感病毒液的浓缩的倍数均为3～4倍。

优选地，S4中所述三联灭活疫苗的保存条件为温度为2℃～8℃ 的条件下密封保存。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、目前，I群8b型禽腺病毒的培养多以禽胚接种和细胞培养为主，培养过程相对复杂。本发明使用的I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白，是用表达鸡禽腺病毒(I群8b型)Hexon蛋白的重组杆状病毒 rHexon株F0代接种Sf9细胞，收获细胞培养物，离心后取上清液制得，在制备三联灭活疫苗的过程中，经二乙烯亚胺灭活后得到灭活的 I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白用作本发明的三联灭活疫苗中的抗原，再与灭活的鸡新城疫病毒浓缩液、灭活的禽流感病毒浓缩液混合后得到混合抗原液经乳化后得到三联灭活疫苗，本发明的灭活的I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白含量高，免疫原性强，甲醛含量和内毒素含量低，对当前流行的I群8b型禽腺病毒具有较好的保护效果，制备的三联灭活疫苗甲醛和内毒素含量低，对鸡群无注射应激，本发明将传统疫苗生产工艺和基因工程相结合，为疫苗工艺的提升和质量的保证打下基础。

2、本发明制备的三联灭活疫苗安全性能好，免疫实验鸡后未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应，效力试验和免疫持续期试验的分析，免疫效果确实，可以抵抗新城疫病毒、禽流感病毒以及I 群8b型禽腺病毒对临床鸡群的感染，持续期长，使用本发明的三联灭活疫苗仅仅使用一次0.3mL疫苗的情况下，免疫持续期能达到五个月，至少给鸡群提供70％的保护率，本发明的三联灭活疫苗可以作为预防鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒和I群8b型禽腺病毒的优秀选择。

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。

具体实施方式

实施例1

本实施例的三联灭活疫苗，所述三联灭活疫苗的抗原为灭活的鸡新城疫La Sota病毒株、灭活的H9亚型禽流感QF01株和灭活的I群 8b型禽腺病毒Hexon蛋白；所述I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白的核苷酸如SEQ ID NO.1所示；所述鸡新城疫La Sota病毒株的含量 ≥10^8.5EID₅₀/0.1mL；所述H9亚型禽流感QF01株的含量≥ 10^7.5EID₅₀/0.1mL；所述I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白含量的琼扩效价≥1:32；

所述鸡新城疫La Sota病毒株来源于中国兽医药品监察所；

所述H9亚型禽流感QF01株，属于流感病毒，于2019年08月 22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为：CGMCC No.18338；所述H9亚型禽流感QF01株的血凝价为211，毒价为10^7.0EID₅₀/0.1mL，适于疫苗的生产，在同源性上，与近些年临床分离株交叉血凝高，且氨基酸同源性与近些年临床分离的流行株的同源性为97.3％～98.0％；与目前使用的疫苗株的同源性为90.7～91.5％，表明H9亚型禽流感QF01株与流行株匹配，对临床的H9亚型禽流感具有良好保护作用。本实施例还提供了上述的三联灭活疫苗的方法，该方法为：

S1、I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白的制备：

S101、pMD-Hexon重组质粒的制备：

设计适于杆状病毒表达系统表达Hexon蛋白核酸序列的引物对，分别命名为FAdV-F和FAdV-R，所述FAdV-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述FAdV-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；以提取的I群8b型禽腺病毒DNA为模板，以FAdV-F和FAdV-R为引物，进行PCR扩增，得到Hexon目的片段，经琼脂糖凝胶电泳检测后，回收Hexon目的片段，并用T4 DNA连接酶连接到pMD-19T 载体上，然后在无菌条件下转化DH5α-T1感受态细胞，得到重组质粒a，将重组质粒a在含有浓度为50μg/mL的氨苄青霉素的LB固体培养基上培养12h～14h，挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，阳性菌落进行测序验证，将测序正确的重组质粒a命名为pMD-Hexon重组质粒；所述Hexon目的片段的的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸如SEQ ID NO.1所示；所述M13-F引物的核苷酸序列如SEQ I D NO.5所示，所述M13-R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述PCR扩增的反应体系为：I群8b型禽腺病毒DNA 1.0μL、浓度为10mmol/L的FAdV-F 2.0μL、浓度为10mmol/L的FAdV-R 2.0 μL、5U/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL、dNTPs 5μL、缓冲液5 μL、无菌重蒸水补足至50μL；所述PCR扩增的反应条件为：94℃ 预变性5min；94℃变性1min，55℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min；所述菌落PCR鉴定的反应体系为：菌落DN A 1.0μL、浓度为10mmol/L的M13-F 0.5μL、浓度为10mmol/L的 M13-R 0.5μL、2×Taq DNA聚合酶预混液12.5μL、无菌重蒸水补足至25μL；所述菌落PCR鉴定的反应条件为：95℃预变性5min；9 5℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸1 0min；

S102、pFastBac I-Hexon中转质粒的制备：

用BamH I限制性内切酶和EcoR I限制性内切酶将pFastBac I质粒和S101中得到的pMD-Hexon重组质粒分别进行双酶切，得到 pFastBac I酶切片段和pMD-Hexon酶切片段，经琼脂糖凝胶电泳检测后，分别回收pFastBac I酶切片段和pMD-Hexon酶切片段，然后用T4 DNA连接酶在温度为4℃的条件下连接12h～14h，然后在无菌条件下转化DH5α-T1感受态细胞，得到重组质粒b，将重组质粒b在含有浓度为50μg/mL的氨苄青霉素的LB固体培养基上培养12h～ 14h，挑取单菌落用M13-F引物和M13-R引物进行菌落PCR鉴定，阳性菌落进行测序验证，将测序正确的重组质粒b命名为pFastBac I-Hexon中转质粒；所述M13-F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述M13-R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述菌落 PCR鉴定的反应体系为：菌落DNA 1.0μL、浓度为10mmol/L的 M13-F 0.5μL、浓度为10mmol/L的M13-R 0.5μL、2×Taq DNA聚合酶预混液12.5μL、无菌重蒸水补足至25μL；所述菌落PCR鉴定的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，65℃退火30s，72℃ 延伸90s，30个循环；72℃延伸10min；

S103、重组杆粒pF-rBac-Hexon的构建：

将S102中得到的pFastBac I-Hexon中转质粒转入大肠杆菌 DH10Bac感受态细胞中，得到重组大肠杆菌DH10Bac，得到重组杆粒，将在含有浓度为50μg/mL的氨苄青霉素的LB固体培养基上培养12h～14h，挑选阳性单菌落用M13-F引物和M13-R引物进行菌落 PCR鉴定，经琼脂糖凝胶电泳检测与预期大小一致后回收，命名为重组杆粒pF-rBac-Hexon；所述M13-F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述M13-R引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示；所述菌落PCR鉴定的反应体系为：菌落DNA 1.0μL、浓度为10mmol/L 的M13-F0.5μL、浓度为10mmol/L的M13-R 0.5μL、2×Taq DNA 聚合酶预混液12.5μL、无菌重蒸水补足至25μL；所述菌落PCR鉴定的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min；

S104、重组杆粒转染sf9细胞：

用脂质体转染的方法，将S103中得到的重组杆粒pF-rBac-Hexon 转染昆虫细胞sf9，在温度为27℃的条件下培养96h～144h，收集细胞培养物，在转速为4000rpm～10000rpm的条件下离心30min～ 60min后取上清液，得到重组杆状病毒rHexon株F0代；

S105、重组杆状病毒的扩增：

将S104中得到的重组杆状病毒rHexon株F0代接种昆虫细胞sf9，在温度为27℃的条件下培养96h～144h，收集细胞培养物，在转速为 4000rpm～10000rpm的条件下离心30min～60min后取上清液，得到 F1代重组杆状病毒；所述重组杆状病毒rHexon株F0代接种昆虫细胞sf9的感染复数为0.1～3.0；

S106、I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白的获得：

将S105中得到的F1代重组杆状病毒接种昆虫细胞sf9，在温度为27℃的条件下培养96h～144h，收集细胞培养物，在转速为 4000rpm～10000rpm的条件下离心30min～60min后取上清液，得到 I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白；所述F1代重组杆状病毒接种昆虫细胞sf9的感染复数为0.1～3.0；

(1)对S106中得到的I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白进行表达蛋白的鉴定：

SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)鉴定：将 S106中得到的I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白进行SDS-PAGE电泳；电泳结束后，经染色和脱色后发现，大约在30kDa的位置，其分子量与理论大小相符，说明I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白表达成功；

Western Blot(蛋白质印迹法)鉴定：取所述SDS-PAGE电泳后的凝胶，直接用型号为BIO-LAB转印装置将其转印到NC膜(硝酸纤维素膜)上，转印结束后，按常规方法进行Western blot鉴定，用鸡源抗禽腺病毒(I群8b型)多抗阳性血清参考品IgG(1:200)作为一抗；用辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡二抗IgG(1:2000)作为酶标二抗；最后用TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)显色(购于碧云天生物技术研究所)，一抗与I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白结合后加入酶标过的二抗，二抗与一抗识别并结合，结果表明，I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白在30kDa左右处出现1条明显的特异性条带，而空白的细胞培养物阴性对照则在30kDa左右处无此特异性反应，说明I群8b 型禽腺病毒Hexon蛋白可被禽腺病毒I群8b型阳性血清中的抗体识别，具有良好的特异性和反应原性；所述羊抗鸡二抗IgG(1:2000) 市购；

(2)对S106中得到的I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白的含量鉴定：

使用琼扩法对表达的I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白进行含量的检测，阳性血清为禽腺病毒(I群8b型)多抗血清(市购)，阴性对照为生理盐水。禽腺病毒(I群8b型)多抗血清中含有针对禽腺病毒 (I群8b型)的抗体，在琼扩检测板上，禽腺病毒(I群8b型)多抗血清孔与I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白孔之间进行抗原抗体反应而出现沉淀线，判为阳性，以出现清晰沉淀线的样品最高稀释倍数为被测抗原琼扩琼扩效价。阳性血清孔与生理盐水孔之间不发生抗原抗体反应，不会出现沉淀线，为阴性。对I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白预先进行2倍系列的梯度稀释，阳性血清与不同浓度的蛋白进行抗原抗体反应，当Hexon蛋白稀释到32倍以后仍能被阳性血清反应，继续稀释后不能被阳性血清识别，表明I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白的琼扩效价为1:32；

琼扩结果显示当I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白稀释32倍均出现较为明显的琼扩线，表明I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白含量的琼扩效价为1:32；

S2、制备油相：

S3、制备水相：

将鸡新城疫La Sota病毒株培养得到鸡新城疫病毒液，将H9亚型禽流感QF01株培养得到禽流感病毒液，将得到的鸡新城疫病毒液和禽流感病毒液分别过滤去除颗粒杂质，得到透明或半透明的溶液，然后用超滤浓缩系统进行浓缩，浓缩3～4倍，用甲醛灭活，分别得到灭活的鸡新城疫病毒浓缩液和灭活的禽流感病毒浓缩液，将S106 中得到的I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白用二乙烯亚胺灭活，得到灭活的I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白；将灭活的鸡新城疫病毒浓缩液、灭活的禽流感病毒浓缩液和灭活的I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白等质量混合，得到混合抗原液，向混合抗原液中加入吐温80，混合均匀，得到水相；所述水相中混合抗原液和吐温80的质量比为96:4；

S3中所述鸡新城疫病毒液的培养方法为：取生产用的鸡新城疫病La Sota株毒种，用灭菌生理盐水稀释10⁴或10⁵倍，接种10～11 日龄健康易感鸡胚，每胚经尿囊腔内接种0.1～0.2mL，密封针孔，置 36℃～37℃继续孵育，将48小时内死亡的鸡胚弃去，此后，每日照蛋2～3次至96小时，将死亡的鸡胚随时取出，96小时后取出全部未死亡鸡胚，气室向上直立，置2℃～8℃冷却4～24小时；将冷却的鸡胚取出，活胚与死胚分开，无菌收获鸡胚液；每若干枚鸡胚混为一组，吸取尿囊液放于同一灭菌容器内，每组抽样进行无菌及1％红细胞凝集检验，血凝价低于1∶512(微量法)者弃去，收获得到鸡新城疫病毒液，置-20℃以下保存，应不超过6个月；

S3中所述禽流感病毒液的培养方法为：取生产用H9亚型禽流感 QF01株毒种，用灭菌生理盐水稀释10⁴或10⁵倍，接种10～11日龄健康易感鸡胚，每胚经尿囊腔内接种0.1～0.2mL，密封针孔，置36℃～ 37℃继续孵育，将48小时内死亡的鸡胚弃去，此后，每日照蛋2～3 次至96小时，将死亡的鸡胚随时取出，96小时后取出全部未死亡鸡胚，气室向上直立，置2℃～8℃冷却4～24小时；将冷却的鸡胚取出，活胚与死胚分开，无菌收获鸡胚液；每若干枚鸡胚混为一组，吸取尿囊液放于同一灭菌容器内，每组抽样进行无菌及1％红细胞凝集检验，血凝价低于1：256(微量法)者弃去，收获得到禽流感病毒液，置-20℃ 以下保存，应不超过6个月；

对S3中未经过过滤、浓缩和灭活的鸡新城疫病毒液中的鸡新城疫病La Sota株的含量测定，得到鸡新城疫La Sota病毒株的含量≥ 10^7.0EID₅₀/0.1mL；对S3中所述禽流感病毒液中的H9亚型禽流感 QF01株的含量测定，得到H9亚型禽流感QF01株的含量≥10^8.0EID₅₀/0.1mL；

S3中经过过滤、浓缩后的鸡新城疫病毒液和经过过滤、浓缩后的禽流感病毒液的灭菌方法为：将经过过滤、浓缩后的鸡新城疫病毒液和经过过滤、浓缩后的禽流感病毒液，分别放入灭活罐中，然后分别边搅拌边加入10％甲醛溶液至甲醛溶液的终浓度为0.1％，加完后，再搅拌混合5min，然后升温至37℃灭活24小时(以罐内鸡新城疫病毒液或禽流感病毒液的温度达到37℃开始计时)，灭活结束后分别取样进行灭活检验和无菌检验，得到的灭活的鸡新城疫病毒浓缩液和灭活的禽流感病毒浓缩液在2℃～8℃保存，应不超过1个月；

所述灭活的鸡新城疫病毒浓缩液或灭活的禽流感病毒浓缩液检验灭活完全的方法为：取灭活的鸡新城疫病毒浓缩液或灭活的禽流感病毒浓缩液经尿囊腔内接种10日龄SPF(无特定病原)鸡胚10枚，每胚0.2mL，37℃孵育至120小时，剔除24小时内死亡鸡胚，非特异性死亡鸡胚均应不超过1个，逐胚测定血凝价，均应不出现血凝。将鸡胚液等量混合后按上述方法盲传1代，测定血凝价，均不出现血凝，判为灭活完全；

S3中的I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白的灭活方法为：

(1)2－溴乙胺氢溴酸盐的环化：将浓度2mol/L的2－溴乙胺氢溴酸盐和浓度为2mol/L的NaOH溶液等体积混合，然后放置在温度为37℃的水浴中，每隔10分钟振摇1次，1小时后终止环化，得到浓度为1mol/L的二乙烯亚胺溶液；

(2)灭活和阻断：将I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白导入灭活罐中，边搅拌边加入浓度为1mol/L的二乙烯亚胺溶液，至二乙烯亚胺溶液的终浓度为0.005mol/L，加完后，再搅拌混合10min，然后升温至32℃时灭活20小时(以I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白的温度达到32℃开始计时)，立即在I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白中加入过滤除菌的2mol/L的Na₂S₂O₃溶液至Na₂S₂O₃溶液的终浓度为 0.005mol/L进行灭活阻断，搅拌混合均匀，停止灭活后，灭活的I群 8b型禽腺病毒Hexon蛋白在2℃～8℃保存，应不超过3个月；

所述灭活的I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白检验灭活完全的方法为：取灭活的I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白，按培养基总质量的5％接种于已形成良好单层的Sf9细胞，置27℃培养观察3日后再盲传1 代，继续培养3日后吸取培养基中的培养液，接种于Sf9细胞的灭活的I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白作为样品接种在6孔板中的4个孔中，同时设阴性对照、阳性对照各1孔，1mL/孔，所述阴性对照为正常的Sf9细胞，所述阳性对照为表达I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白的杆状病毒，进行空斑实验，培养7～10天，阴性对照孔出现蚀斑，样品孔及阳性对照孔均无蚀斑出现，判为灭活完全；

对S3中灭活的鸡新城疫病毒浓缩液的鸡新城疫病La Sota株的含量测定，得到鸡新城疫La Sota病毒株的含量≥10^8.5EID₅₀/0.1mL；对 S3中所述灭活的禽流感病毒浓缩液中的H9亚型禽流感QF01株的含量测定，得到H9亚型禽流感QF01株的含量≥10^7.5EID₅₀/0.1mL；对 S3中所述灭活的I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白进行蛋白含量的测定，琼扩效价≥1:32；

S4、乳化：

将S2中得到的油相放入乳化罐内，以150r/min的搅拌速率，边搅拌边加入S3中得到的水相，待水相加入完后，继续搅拌30min，得到乳化液，然后在温度为20℃～25℃的条件下，将所述乳化液在剪切速率为4000r/min的条件下剪切2次后，得到三联灭活疫苗；所述三联灭活疫苗的保存条件为温度为2℃～8℃的条件下密封保存。

实施例2

按照实施例1的三联灭活疫苗的制备方法制备得到三批次的三联灭活疫苗，批号分别为NAFs01、NAFs02和NAFs03，分别进行安全试验：

(一)单剂量一次接种安全试验

取10日龄SPF(无特定病原)鸡，所述三联灭活疫苗的注射剂量为0.3mL/只，10只/组，共三组，第一组的10日龄SPF鸡注射批号为NAFs01的三联灭活疫苗，第二组的10日龄SPF鸡注射批号为 NAFs02的三联灭活疫苗，第三组的10日龄SPF鸡注射批号为 NAFs03的三联灭活疫苗；同时设10只未注射三联灭活疫苗的10日龄SPF鸡为阴性对照组，阴性对照组的10日龄SPF鸡的颈部注射生理盐水的注射剂量为0.3mL/只；

取5日龄的AA白羽肉鸡(简称肉鸡)，所述三联灭活疫苗的注射剂量为0.3mL/只，10只/组，共三组，第一组的5日龄的AA白羽肉鸡注射批号为NAFs01的三联灭活疫苗，第二组的5日龄的AA白羽肉鸡注射批号为NAFs02的三联灭活疫苗，第三组的5日龄的AA 白羽肉鸡注射批号为NAFs03的三联灭活疫苗；同时设10只未注射三联灭活疫苗的5日龄的AA白羽肉鸡为阴性对照组，阴性对照组的 5日龄的AA白羽肉鸡的颈部注射生理盐水的注射剂量为0.3mL/只；

取180日龄的海兰褐蛋鸡(简称蛋鸡)，所述三联灭活疫苗的注射剂量为0.3mL/只，10只/组，共三组，第一组的180日龄的海兰褐蛋鸡注射批号为NAFs01的三联灭活疫苗，第二组的180日龄的海兰褐蛋鸡注射批号为NAFs02的三联灭活疫苗，第三组的180日龄的海兰褐蛋鸡注射批号为NAFs03的三联灭活疫苗；同时设10只未注射三联灭活疫苗的180日的龄海兰褐蛋鸡为阴性对照组，阴性对照组的 180日的龄海兰褐蛋鸡的颈部注射生理盐水的注射剂量为0.3mL/只；

上述各组的鸡均在隔离器内饲养，连续观察21日，每天观察各组鸡的饮食饮水、全身、局部反应及其它临床症状，并于接种后7日、 14日、21日触摸检查各免疫组鸡注射部位，检查是否有红肿等局部注射反应，免疫21天，剖杀所有鸡，重点检查注射部位的变化，包括注射部位组织病变，180日龄的海兰褐蛋鸡统计免疫后21天各组产蛋率及畸形蛋比例。

如表1所示，结果表明，三批次疫苗对注射部位及全身没有引起明显不良反应，在整个观察期内试验鸡采食饮水均正常，免疫后21 日解剖，注射部位吸收良好，证明该疫苗对靶动物是安全的。

表1靶动物单剂量一次接种安全性试验

注：表中“/”表示该项未进行，下表同。

(二)单剂量重复接种安全性试验

取10日龄SPF(无特定病原)鸡，分两次注射所述三联灭活疫苗，在第一次注射14天后，再次以相同的剂量和注射批号进行第二次注射，所述三联灭活疫苗的每次的注射剂量为0.3mL/只，10只/组，共三组，第一组的10日龄SPF鸡注射批号为NAFs01的三联灭活疫苗，第二组的10日龄SPF鸡注射批号为NAFs02的三联灭活疫苗，第三组的10日龄SPF鸡注射批号为NAFs03的三联灭活疫苗；同时设10只未注射三联灭活疫苗的10日龄SPF鸡为阴性对照组，分两次注射生理盐水，第一次注射14天后，再次以相同的剂量进行第二次注射，阴性对照组的10日龄SPF鸡的颈部注射生理盐水的每次注射剂量为0.3mL/只；

取5日龄的AA白羽肉鸡(简称肉鸡)，分两次注射所述三联灭活疫苗，在第一次注射14天后，再次以相同的剂量和注射批号进行第二次注射，所述三联灭活疫苗的每次注射剂量为0.3mL/只，10只/ 组，共三组，第一组的5日龄的AA白羽肉鸡注射批号为NAFs01的三联灭活疫苗，第二组的5日龄的AA白羽肉鸡注射批号为NAFs02 的三联灭活疫苗，第三组的5日龄的AA白羽肉鸡注射批号为NAFs03 的三联灭活疫苗；同时设10只未注射三联灭活疫苗的5日龄的AA 白羽肉鸡为阴性对照组，分两次注射生理盐水，第一次注射14天后，再次以相同的剂量进行第二次注射，阴性对照组的5日龄的AA白羽肉鸡的颈部注射生理盐水的每次注射剂量为0.3mL/只；

取180日龄的海兰褐蛋鸡(简称蛋鸡)，分两次注射所述三联灭活疫苗，在第一次注射14天后，再次以相同的剂量和注射批号进行第二次注射，所述三联灭活疫苗的每次注射剂量为0.3mL/只，10只/ 组，共三组，第一组的180日龄的海兰褐蛋鸡注射批号为NAFs01的三联灭活疫苗，第二组的180日龄的海兰褐蛋鸡注射批号为NAFs02 的三联灭活疫苗，第三组的180日龄的海兰褐蛋鸡注射批号为 NAFs03的三联灭活疫苗；同时设10只未注射三联灭活疫苗的180 日的龄海兰褐蛋鸡为阴性对照组，分两次注射生理盐水，第一次注射 14天后，再次以相同的剂量进行第二次注射，阴性对照组的180日的龄海兰褐蛋鸡的颈部注射生理盐水的每次注射剂量为0.3mL/只；

上述各组的鸡均在隔离器内饲养，第二次注射后连续观察28日，如表2所示，结果表明，SPF鸡、AA白羽肉鸡和海兰褐蛋鸡都未表现出任何临床症状和全身不良反应，第二次注射后28天进行剖检后发现个别鸡的注射部位有局部少量疫苗残留，未完全吸收，但并未对组织造成的明显的损伤，其它鸡均正常。

三组注射了三联灭活疫苗的AA白羽肉鸡与对照组增重率相比均差异不显著；三组注射了三联灭活疫苗的海兰褐蛋鸡在第二次注射三联灭活疫苗后3天出现轻微掉蛋，第二次注射三联灭活疫苗后1周产蛋恢复正常，三组注射了三联灭活疫苗的海兰褐蛋鸡的产蛋率与对照组无显著差异，各组均无畸形蛋。

因此，单剂量重复注射接种三联灭活疫苗对SPF鸡、AA白羽肉鸡和海兰褐蛋鸡均是安全的。

表2靶动物单剂量重复接种安全性试验

(三)超剂量一次接种安全试验

取10日龄SPF(无特定病原)鸡，所述三联灭活疫苗的注射剂量为1.0mL/只，10只/组，共三组，第一组的10日龄SPF鸡注射批号为NAFs01的三联灭活疫苗，第二组的10日龄SPF鸡注射批号为 NAFs02的三联灭活疫苗，第三组的10日龄SPF鸡注射批号为 NAFs03的三联灭活疫苗；同时设10只未注射三联灭活疫苗的10日龄SPF鸡为阴性对照组，阴性对照组的10日龄SPF鸡的颈部注射生理盐水的注射剂量为1.0mL/只；

取5日龄的AA白羽肉鸡(简称肉鸡)，所述三联灭活疫苗的注射剂量为1.0mL/只，10只/组，共三组，第一组的5日龄的AA白羽肉鸡注射批号为NAFs01的三联灭活疫苗，第二组的5日龄的AA白羽肉鸡注射批号为NAFs02的三联灭活疫苗，第三组的5日龄的AA 白羽肉鸡注射批号为NAFs03的三联灭活疫苗；同时设10只未注射三联灭活疫苗的5日龄的AA白羽肉鸡为阴性对照组，阴性对照组的 5日龄的AA白羽肉鸡的颈部注射生理盐水的注射剂量为1.0mL/只；

取180日龄的海兰褐蛋鸡(简称蛋鸡)，所述三联灭活疫苗的注射剂量为1.5mL/只，10只/组，共三组，第一组的180日龄的海兰褐蛋鸡注射批号为NAFs01的三联灭活疫苗，第二组的180日龄的海兰褐蛋鸡注射批号为NAFs02的三联灭活疫苗，第三组的180日龄的海兰褐蛋鸡注射批号为NAFs03的三联灭活疫苗；同时设10只未注射三联灭活疫苗的180日的龄海兰褐蛋鸡为阴性对照组，阴性对照组的 180日的龄海兰褐蛋鸡的颈部注射生理盐水的注射剂量为1.5mL/只；

上述各组的鸡均在隔离器内饲养，SPF鸡和AA白羽肉鸡注射三联灭活疫苗后4小时内表现出轻微的临床症状，与对照鸡相比，注射三联灭活疫苗了的SPF鸡和注射三联灭活疫苗了的AA白羽肉鸡均喜卧、聚堆、对外界声音刺激不敏感；4小时之后，注射三联灭活疫苗了的SPF鸡和注射三联灭活疫苗了的AA白羽肉鸡均开始恢复走动，对外界声音刺激敏感；10小时后，注射三联灭活疫苗了的SPF鸡和注射三联灭活疫苗了的AA白羽肉鸡均精神、饮食与对照组比较均无差异；

如表3所示，结果表明海兰褐蛋鸡注射三联灭活疫苗后精神饮食均正常，注射三联灭活疫苗后3日内产蛋量稍有下降，之后恢复正常；注射了三联灭活疫苗的白羽肉鸡增重率与对照组无显著差异，免疫后观察21天各免疫组均无鸡死亡。免疫后21天剖杀，注射了三联灭活疫苗的各组部分鸡在注射部位有少量疫苗残留，并沿颈部皮下有迁移现象，但注射部位未出现出血和水肿症状，造成各组注射了三联灭活疫苗的试验鸡在注射初期表现出一定的临床症状，其原因可能是由于鸡只小或注射剂量过大，刺激注射局部短时间内疼痛，导致精神稍差或产蛋略有下降，并非疫苗毒性所致的全身反应。

表3靶动物超剂量一次接种安全试验

(四)三批次的三联灭活疫苗的内毒素含量、甲醛含量以及黏度测定：

用终点显色法测定疫苗中内毒素含量，用显色基质鲎试剂盒检测三联灭活疫苗的内毒素含量，所述显色基质鲎试剂盒购自厦门市鲎试剂实验厂有限公司；

三联灭活疫苗中甲醛含量和疫苗黏度测定根据规程标准《中华人民共和国兽药典》2015年版(三部)附录3102和3203方法测定；

检测三批次的三联灭活疫苗(批号分别为批号分别为NAFs01、 NAFs02和NAFs03)的内毒素含量、甲醛含量以及黏度测定，结果如表4所示，甲醛含量以及黏度远远低于规程标准，疫苗中内毒素含量规程无特殊规定，一般企业企业内控标准为疫苗中内毒素含量≤900EU/mL，本发明的三联灭活疫苗的内毒素含量远远低于市售同类疫苗内毒素含量，本发明的三联灭活疫苗具备充分的安全性。

表4三批次的三联灭活疫苗内毒素等的含量测定

检测项	检测结果	规程标准
			甲醛含量	0.04％～0.08％	<0.2％
内毒素含量	20EU/mL	企业内控≤900EU/mL
			黏度	31cP	<200cP

由表4测定结果表明，按照实施例1的三联灭活疫苗的制备方法制备的三联灭活疫苗甲醛含量和内毒素含量远远低于市售疫苗，对鸡群无注射应激，安全性高。

实施例3

用实施例2中的批号分别为NAFs01、NAFs02和NAFs03的三批次的三联灭活疫苗，分别进行免疫效力试验：

(一)鸡新城疫病毒效力实验

分别采用血清学方法和免疫攻毒法进行鸡新城疫病毒效力实验；

(1)血清学方法：取21日龄SPF鸡，所述三联灭活疫苗的皮下接种的免疫剂量为20μL/只，10只/组，共三组，所述三组均为免疫组，第一组的21日龄SPF鸡皮下接种批号为NAFs01的三联灭活疫苗，第二组的21日SPF鸡皮下接种批号为NAFs02的三联灭活疫苗，第三组的21日SPF鸡皮下接种批号为NAFs03的三联灭活疫苗；同时设5只未注射三联灭活疫苗的21日龄SPF鸡为阴性对照组，阴性对照组的21日龄SPF鸡皮下接种等剂量的PBS(磷酸缓冲盐溶液)；隔离器内饲养。免疫后21天，每只鸡分别采血，分离血清，进行HI (血凝抑制)抗体效价测定，结果如表5所示，免疫后21日血清HI 抗体平均几何效价均高于1:16，符合疫苗规程要求。

(2)免疫攻毒法：将经过上述血清学方法免疫后21天的三组免疫组和阴性对照组的鸡采血后，将三组免疫组与阴性对照组同时用鸡新城疫强毒株北京株F3代湿毒攻毒，肌肉注射0.2mL/只(0.2mL鸡新城疫强毒株北京株F3代的攻毒剂量为10^5.0EID₅₀)，观察14日，结果如表5所示，表明三批次的三联灭活疫苗免疫后21日血清HI抗体平均几何效价均高于4log2；如表6所示，三组免疫组攻毒后14天鸡均健活，对攻毒鸡新城疫病毒的攻毒保护率均达到100％，阴性对照组攻毒后5日内5只全部死亡，死亡率为100％。

鸡新城疫病毒效力实验表明，疫苗组攻毒后14天鸡均健活，而对照组5只全部死亡。说明疫苗对鸡群的保护率均达到100％，在临床使用疫苗可以对鸡群新城疫提供完全保护。

表5三批次的三联灭活疫苗的鸡新城疫病毒抗体检测

表6三批次的三联灭活疫苗的鸡新城病毒疫免疫攻毒保护结果

(二)H9亚型禽流感病毒效力实验

分别采用血清学方法和免疫攻毒法进行H9亚型禽流感病毒效力实验；

(1)血清学方法：取21日龄SPF鸡，所述三联灭活疫苗的皮下接种的免疫剂量为0.3mL/只，10只/组，共三组，所述三组均为免疫组，第一组的21日龄SPF鸡皮下接种批号为NAFs01的三联灭活疫苗，第二组的21日SPF鸡皮下接种批号为NAFs02的三联灭活疫苗，第三组的21日SPF鸡皮下接种批号为NAFs03的三联灭活疫苗；同时设5只未注射三联灭活疫苗的21日龄SPF鸡为阴性对照组，阴性对照组的21日龄SPF鸡皮下接种等剂量的PBS(磷酸缓冲盐溶液)；隔离器内饲养。免疫后21天，每只鸡分别采血，分离血清，进行HI 抗体效价测定，结果如表7所示，免疫后21日血清中禽流感(H9亚型)HI抗体几何平均值均高于6log2，对照组HI抗体效价几何平均值均不高于2log2，实验结果符合规程规定要求。

(2)免疫攻毒法：将经过上述血清学方法免疫后21天的三组免疫组和阴性对照组的鸡采血后，将三组免疫组与阴性对照组同时用 H9亚型禽流感QF01株F3代湿毒进行1：10的稀释后静脉注射， 0.2mL/只，攻毒后5日，分别采集每只鸡泄殖腔棉拭子样品，将每只鸡采集的泄殖腔棉拭子样品经尿囊腔分别接种5枚10日龄SPF胚，每个SPF胚接种的泄殖腔棉拭子的剂量为0.2mL，孵育观察5日，测定所有鸡胚液HA(血凝)效价，每个棉拭子样品接种的5枚10日龄SPF胚中只要有1个SPF胚的尿囊液HA效价≥1:16，即可判定为 H9亚型鸡禽流感病毒分离阳性，对H9亚型鸡禽流感病毒分离阴性的样品，应盲传1代后再进行判定，表8所示，结果表明三组免疫组对H9亚型禽流感病毒免疫保护率为100％，阴性对照组的攻毒感染的排毒率为80％，达到疫苗效力标准。

表7三批次的三联灭活疫苗的H9亚型禽流感病毒抗体检测

表8三批次的三联灭活疫苗的H9亚型禽流感病毒攻毒保护结果

(三)I群8b型禽腺病毒效力实验

分别采用血清学方法和免疫攻毒法进行I群8b型禽腺病毒效力实验；

(1)血清学方法：取21日龄SPF鸡，所述三联灭活疫苗的皮下接种的免疫剂量为0.3mL/只，10只/组，共三组，所述三组均为免疫组，第一组的21日龄SPF鸡皮下接种批号为NAFs01的三联灭活疫苗，第二组的21日SPF鸡皮下接种批号为NAFs02的三联灭活疫苗，第三组的21日SPF鸡皮下接种批号为NAFs03的三联灭活疫苗；同时设10只未注射三联灭活疫苗的21日龄SPF鸡为阴性对照组，阴性对照组的21日龄SPF鸡皮下接种等剂量的PBS(磷酸缓冲盐溶液)；隔离器内饲养。免疫后21天，每只鸡分别采血，分离血清，进行AGP(卵黄抗体的琼脂扩散实验)抗体效价测定，结果如表9所示，三批次疫苗分别以每只免疫0.3mL免疫21日龄SPF鸡，第一组免疫后抗体阳性率达到80％，第二组和第三组免疫后21日血清中腺病毒(Ⅰ群4型)AGP抗体均阳性以上，对照组AGP抗体均为阴性，实验结果符合规程标准。

(2)免疫攻毒法：将经过上述血清学方法免疫后21天的三组免疫组和阴性对照组的鸡采血后，将三组免疫组与阴性对照组同时用I 群8b型禽腺病毒效检毒株YC01株F3代湿毒攻毒，颈部皮下注射， 0.2mL/只(0.2mL的I群8b型禽腺病毒效检毒株YC01株F3代的攻毒剂量为100EID₅₀)，观察14日，结果显示三个免疫组的每只鸡均健活，保护率均为100％；非免疫的阴性对照组攻毒后3～4天陆续发病， 14天内有9只病鸡6只10天内开始亡鸡与发病鸡剖检均有明显典型的的心包积液症状，肝脏淤血肿大，有的肝脏表面出现针尖状出血点等脏器病变，表10的攻毒结果表明，三个免疫组对I群8b型禽腺病毒的攻毒保护率均为100％，非免疫的阴性对照组攻毒后14天，90％鸡发病，60％鸡死亡，死亡鸡与发病鸡剖检均有心包积液典型安卡拉病病理变化。

表9三批次的三联灭活疫苗的I群8b型禽腺病毒抗体检测

注：“+”表示琼扩抗体阳性，“-”表示琼扩抗体阴性，“1”表示琼扩效价为1log2。

表10三批次的三联灭活疫苗的I群8b型禽腺病毒攻毒保护结果

通过表9～10效力检验说明，三联灭活疫苗效果确实，可以抵抗新城疫病毒、禽流感病毒以及I群8b型禽腺病毒对临床鸡群的感染。

实施例4

用实施例2中的批号分别为NAFs01、NAFs02和NAFs03的三批次的三联灭活疫苗，分别进行免疫持续期试验：

(1)免疫持续期抗体检测结果：

取21日龄SPF鸡270只，平均分成三组，每一组分别免疫NAFs01、 NAFs02和NAFs03的三批次的三联灭活疫苗，颈部皮下注射的免疫剂量为0.3mL/只，得到三个批次的免疫组，同时每批次的三联灭活疫苗均设置同日龄非免疫对照SPF鸡60只，作为非免疫对照组，隔离器内饲养。免疫后1周、2周、3周、2个月、3个月、4个月、5 个月进行抗体检测，如表11所示，表中ND(HI)表示免疫后鸡只血清中新城疫血凝抑制抗体，H9(HI)表示免疫后鸡只血清中禽流感(H9 亚型)血凝抑制抗体FAdV-8b(AGP)表示免疫后鸡只血清中I群8b型禽腺病毒琼扩抗体，结果显示，0.3mL/只剂量组免疫21日龄SPF鸡， 3批次疫苗各免疫组免疫后1周、2周、3周、2个月、3个月、4个月、5个月抗体检测结果见表11。3批次疫苗免疫21日龄SPF鸡抗体消长均呈正态分布曲线，免疫后14天抗体水平开始提升，免后3 周新城疫、禽流感(H9亚型)HI抗体均值分别达到5log2、7log2以上，腺病毒(I群4型)AGP抗体均100％阳性；免后2个月抗体水平达到高峰，新城疫、禽流感(H9亚型)HI抗体均值分别达到7log2、 8log2以上，腺病毒(I群4型)AGP抗体均值在2log2以上；之后抗体水平逐渐下降，免后3个月、4个月各免疫组新城疫和禽流感(H9 亚型)HI抗体均值分别在5log2、7log2以上、腺病毒(I群4型)AGP抗体均值均1log2以上；免后5个月新城疫抗体均值在3.8～ 4.3log2、禽流感(H9亚型)HI抗体均值在6.5～6.8log2、腺病毒(I 群4型)AGP抗体阳性率为80％～100％。3批次疫苗每个时间段抗体水平差异不显著。每个时间段非免疫对照组新城疫、禽流感(H9 亚型)HI抗体均值均不高于2log2，腺病毒(I群4型)AGP抗体均 100％阴性。

表11三批次的三联灭活疫苗免疫持续期抗体检测

(2)免疫持续期攻毒结果：

21日龄SPF鸡免疫后3周、免疫后4个月和免疫后5个月，均在三个批次的免疫组分别任选30只免疫组鸡和20只非免疫对照组鸡，其中30只免疫组鸡每10只为一组，分别用鸡新城疫La Sota病毒株、H9亚型禽流感QF01株、I群8b型禽腺病毒进行新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、I群8b型禽腺病毒攻毒，非免疫的阴性对照组 20只鸡根据规程5只攻新城疫、5只攻H9亚型禽流感病毒、10只攻 I群8b型禽腺病毒，攻毒结果见表12，表中NNDV表示新城疫攻毒用病毒，AIV(H9N2)表示禽流感攻毒用病毒，FAdV-8b表示禽腺病毒攻毒用病毒。

表12三批次的三联灭活疫苗的免疫持续期攻毒结果

由表12可知，批号分别为NAFs01、NAFs02和NAFs03的三批次的三联灭活疫苗以0.3mL/只的剂量免疫21日龄SPF鸡后，新城疫病毒和H9亚型禽流感病毒的HI抗体100％在规程标准以上，I群8b 型禽腺病毒抗体阳性率达到100％，攻毒结果显示，新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒和I群8b型禽腺病毒保护率为100％。免疫到4个月后，各组分抗体水平均在规程标准以上，攻毒结果显示，各组分免疫保护率在90％以上。在免疫后5个月，各组分抗体水平降低，但攻毒结果显示，新城疫病毒均能达到70％以上，H9亚型禽流感病毒的攻毒保护率能达到90％以上；I群8b型禽腺病毒的攻毒保护率能达到 80％以上结果表明使用发明疫苗只使用一次0.3mL的情况下，免疫持续期能达到五个月，给集群提供至少70％的保护率所以该三联疫苗可以作为预防鸡新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒和I群8b型禽腺病毒的优秀选择。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

序列表

<110> 洛阳职业技术学院、张贺伟、扬州优邦生物药品有限公司

<120> 一种三联灭活疫苗及其制备方法

<130> 20180613

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 855

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 1

atgaatgtca ctaccgagaa ggcccagcgg cttcagatca ggttctatcc cacccagacg 60

gacgacaccc ccaacagtta ccgggttcgg tacagcttaa acgtggggga cagctgggtg 120

ttggacatgg gagcgaccta cttcgacatc aaaggggtgc tcgacagagg tccttccttc 180

aagccctacg gcggcacggc ttacaacccc ctggcccctc gcgaagcctt ctttaacaac 240

tggatcgagg acgatgaaaa caacacaacc atcaccgggc aaatgaccaa tccgtacaag 300

aacgagcagc aaaacacagc tacggcaaca gctggggcaa tcgccagcgt ttcaggctct 360

tatcctaacc ctaacgtggg gctggccatt agcgaaatgg gagccctcac cccgacacaa 420

gcagcacagg tcggtctggc cggtcggttt gccaaggtgt cgagcgagaa cacgcggctg 480

gcttatggag cgtacgtgaa gcctctaaaa gacgacggct ctcagtcact tggaacaacg 540

ccttactacg tgttagacac cactgcacag aaatacttgg gcgtcatggg ggtagaagac 600

tttacgcaaa gtcttaccta cccagacagt ctgttaatcc cccctccttc tgagtacgga 660

gcggttaaca gcggggtgat gaaagccaac agacccaact acatcgggtt ccgtgacaat 720

ttcatcaacc tcctgtacca cgataccggc gtgtgctccg ggaccctcaa ctccgaacgg 780

tcaggcatga acgtggtggt ggaattgcag gaccgaaata ccgaactcag ttaccagtac 840

atgctcgccc agtaa 855

<210> 2

<211> 284

<212> PRT

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 2

Met Asn Val Thr Thr Glu Lys Ala Gln Arg Leu Gln Ile Arg Phe Tyr

1 5 10 15

Pro Thr Gln Thr Asp Asp Thr Pro Asn Ser Tyr Arg Val Arg Tyr Ser

20 25 30

Leu Asn Val Gly Asp Ser Trp Val Leu Asp Met Gly Ala Thr Tyr Phe

35 40 45

Asp Ile Lys Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Ser Phe Lys Pro Tyr Gly

50 55 60

Gly Thr Ala Tyr Asn Pro Leu Ala Pro Arg Glu Ala Phe Phe Asn Asn

65 70 75 80

Trp Ile Glu Asp Asp Glu Asn Asn Thr Thr Ile Thr Gly Gln Met Thr

85 90 95

Asn Pro Tyr Lys Asn Glu Gln Gln Asn Thr Ala Thr Ala Thr Ala Gly

100 105 110

Ala Ile Ala Ser Val Ser Gly Ser Tyr Pro Asn Pro Asn Val Gly Leu

115 120 125

Ala Ile Ser Glu Met Gly Ala Leu Thr Pro Thr Gln Ala Ala Gln Val

130 135 140

Gly Leu Ala Gly Arg Phe Ala Lys Val Ser Ser Glu Asn Thr Arg Leu

145 150 155 160

Ala Tyr Gly Ala Tyr Val Lys Pro Leu Lys Asp Asp Gly Ser Gln Ser

165 170 175

Leu Gly Thr Thr Pro Tyr Tyr Val Leu Asp Thr Thr Ala Gln Lys Tyr

180 185 190

Leu Gly Val Met Gly Val Glu Asp Phe Thr Gln Ser Leu Thr Tyr Pro

195 200 205

Asp Ser Leu Leu Ile Pro Pro Pro Ser Glu Tyr Gly Ala Val Asn Ser

210 215 220

Gly Val Met Lys Ala Asn Arg Pro Asn Tyr Ile Gly Phe Arg Asp Asn

225 230 235 240

Phe Ile Asn Leu Leu Tyr His Asp Thr Gly Val Cys Ser Gly Thr Leu

245 250 255

Asn Ser Glu Arg Ser Gly Met Asn Val Val Val Glu Leu Gln Asp Arg

260 265 270

Asn Thr Glu Leu Ser Tyr Gln Tyr Met Leu Ala Gln

275 280

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 3

ataggatcaa tgaatgtcac taccgagaag 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 4

atagaattct tactgggcga gcatgtactg 30

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 5

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial synthesis)

<400> 6

caggaaacag ctatgac 17

Claims

1.一种三联灭活疫苗，其特征在于，所述三联灭活疫苗的抗原为灭活的鸡新城疫LaSota病毒株、灭活的H9亚型禽流感QF01株和灭活的I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白片段；所述I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述鸡新城疫La Sota病毒株的含量≥10^8.5EID₅₀/0.1mL；所述H9亚型禽流感QF01株的含量≥10^7.5EID₅₀/0.1mL；所述I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白片段含量的琼扩效价≥1:32；所述H9亚型禽流感QF01株，属于流感病毒，于2019年08月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为：CGMCC No. 18338。

2.在一种制备如权利要求1所述的三联灭活疫苗的方法，其特征在于，该方法为：

S1、I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白片段的制备：

S101、pMD-Hexon重组质粒的制备：

设计适于杆状病毒表达系统表达Hexon蛋白核酸序列的引物对，分别命名为FAdV-F和FAdV-R；以提取的I群8b型禽腺病毒DNA为模板，以FAdV-F和FAdV-R为引物，进行PCR扩增，得到Hexon目的片段，经琼脂糖凝胶电泳检测后，回收Hexon目的片段，并用T4 DNA连接酶连接到pMD-19T载体上，然后在无菌条件下转化DH5α-T1感受态细胞，得到重组质粒a，将重组质粒a在含有浓度为50μg/mL的氨苄青霉素的LB固体培养基上培养12h～14h，挑取单菌落用M13-F引物和M13-R引物进行菌落PCR鉴定，阳性菌落进行测序验证，将测序正确的重组质粒a命名为pMD-Hexon重组质粒；

其中：所述FAdV-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述FAdV-R的核苷酸序列如SEQID NO.4所示；所述M13-F引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述M13-R引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述Hexon目的片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸如SEQ ID NO.1所示；

S102、pFastBac I-Hexon中转质粒的制备：

用BamH I限制性内切酶和EcoR I限制性内切酶将pFastBac I质粒和S101中得到的pMD-Hexon重组质粒分别进行双酶切，得到pFastBac I酶切片段和pMD-Hexon酶切片段，经琼脂糖凝胶电泳检测后，分别回收pFastBac I酶切片段和pMD-Hexon酶切片段，然后用T4DNA连接酶在温度为4℃的条件下连接12h～14h，然后在无菌条件下转化DH5α-T1感受态细胞，得到重组质粒b，将重组质粒b在含有浓度为50μg/mL的氨苄青霉素的LB固体培养基上培养12h～14h，挑取单菌落用M13-F引物和M13-R引物进行菌落PCR鉴定，阳性菌落进行测序验证，将测序正确的重组质粒b命名为pFastBac I-Hexon中转质粒；

S103、重组杆粒pF-rBac-Hexon的构建：

将S102中得到的pFastBac I-Hexon中转质粒转入大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中，得到重组大肠杆菌DH10Bac，得到重组杆粒，将在含有浓度为50μg/mL的氨苄青霉素的LB固体培养基上培养12h～14h，挑选阳性单菌落用M13-F引物和M13-R引物进行菌落PCR鉴定，经琼脂糖凝胶电泳检测与预期大小一致后回收，命名为重组杆粒pF-rBac-Hexon；

S104、重组杆粒转染sf9细胞：

用脂质体转染的方法，将S103中得到的重组杆粒pF-rBac-Hexon转染昆虫细胞sf9，在温度为27℃的条件下培养96h～144h，收集细胞培养物，离心后取上清液，得到重组杆状病毒rHexon株F0代；

S105、重组杆状病毒的扩增：

S106、I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白的获得：

将S105中得到的F1代重组杆状病毒接种昆虫细胞sf9，在温度为27℃的条件下培养96h～144h，收集细胞培养物，离心后取上清液，得到I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白片段；

S2、制备油相：

S3、制备水相：

将鸡新城疫La Sota病毒株培养得到鸡新城疫病毒液，将H9亚型禽流感QF01株培养得到禽流感病毒液，将得到的鸡新城疫病毒液和禽流感病毒液分别经过滤、浓缩、用甲醛灭活，分别得到灭活的鸡新城疫病毒浓缩液和灭活的禽流感病毒浓缩液，将S106中得到的I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白片段用二乙烯亚胺灭活，得到灭活的I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白片段；将灭活的鸡新城疫病毒浓缩液、灭活的禽流感病毒浓缩液和灭活的I群8b型禽腺病毒Hexon蛋白片段等质量混合，得到混合抗原液，向混合抗原液中加入吐温80，混合均匀，得到水相；所述水相中混合抗原液和吐温80的质量比为96:4；

S4、乳化：

将S2中得到的油相放入乳化罐内，以150r/min的搅拌速率，边搅拌边加入S3中得到的水相，待水相加入完后，继续搅拌30min，得到乳化液，然后在温度为20℃～25℃的条件下，将所述乳化液在剪切速率为4000r/min的条件下剪切2次后，得到三联灭活疫苗；

S101中所述PCR扩增的反应体系为：I群8b型禽腺病毒DNA 1.0μL、浓度为10mmol/L的FAdV-F 2.0μL、浓度为10mmol/L的FAdV-R 2.0μL、5U/μL的Taq DNA聚合酶0.5 μL、dNTPs 5μL、缓冲液5μL、无菌重蒸水补足至50μL；所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min；

S101、S102和S103中所述菌落PCR鉴定的反应体系均为：菌落DNA 1.0μL、浓度为10mmol/L的M13-F 0.5μL、浓度为10mmol/L的M13-R 0.5μL、2×Taq DNA聚合酶预混液12.5μL、无菌重蒸水补足至25μL；所述菌落PCR鉴定的反应条件均为：95℃预变性5min；95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min；

S104、S105和S106中离心的转速均为4000rpm～10000rpm，离心的时间均为30min～60min。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S105中所述重组杆状病毒rHexon株F0代接种昆虫细胞sf9的感染复数为0.1~3.0；S106中所述F1代重组杆状病毒接种昆虫细胞sf9的感染复数为0.1~3.0。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S3中所述鸡新城疫病毒液和禽流感病毒液的浓缩的倍数均为3～4倍。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S4中所述三联灭活疫苗的保存条件为温度为2℃～8℃的条件下密封保存。