CN102688486A

CN102688486A - 鸡新城疫、传染性法氏囊病、病毒性关节炎三联灭活疫苗的生产方法

Info

Publication number: CN102688486A
Application number: CN2012101999095A
Authority: CN
Inventors: 左青山; 李晓林; 王红; 范根成; 宫晓; 郭伟伟; 李芳�
Original assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yebio Bioengineering Co Ltd
Priority date: 2012-06-18
Filing date: 2012-06-18
Publication date: 2012-09-26

Abstract

本发明涉及一种鸡新城疫、传染性法氏囊病、病毒性关节炎三联灭活疫苗的生产方法。本发明采用新城疫病毒La Sota株、表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的大肠杆菌基因工程菌E.coli BL21/pET28a-VP2株和病毒性关节炎AV2311株作为生产菌毒种，超强浓缩工艺和优质佐剂制备成灭活疫苗，免疫动物后抗体产生快，效价高，保护期长，降低了疫病的发生及蔓延。

Description

鸡新城疫、传染性法氏囊病、病毒性关节炎三联灭活疫苗的生产方法

技术领域

本发明是一种用于预防鸡的新城疫、传染性法氏囊病、病毒性关节炎三种疫病油乳剂疫苗的制备方法，属于兽用生物制品领域。

背景技术

鸡新城疫（newcastle disease,ND）具有很高的发病率和病死率，世界各地多有发生，且一旦爆发将给禽养殖业带来毁灭性打击，是危害养禽业的一种主要传染病。OIE将其列为A类疫病。

鸡传染性法氏囊病（Infectious bursal disease virus,IBD）是由双RNA病毒科中的传染性法氏囊病病毒引起的一种特殊疾病，损害幼鸡法氏囊。特征是腹泻、衰竭，法氏囊先发生显著炎症和增大，继之以萎缩，最后患鸡死亡。本病除造成一些雏鸡死亡外，还常引起病愈鸡免疫抑制，导致免疫接种失败，增加雏鸡对鸡新城疫等许多疾病的易感性。

鸡病毒性关节炎(Avian viral arthritis,AVA)是由禽呼肠孤病毒鸡病毒性关节炎病毒(Avianviralarthritis virus,AVAV)引起的主要发生于肉用鸡的一种传染病,以侵害胫跖关节、趾关节及其肌腱为特征,故又称传染性腱鞘炎、腱裂综合症或腱滑膜炎等。目前本病分布广泛,世界各地均有发生。在急性发病鸡群中,特别是种鸡群,常因生长缓慢或停滞、体重减轻,饲养利用率低以及死淘率高等,给养鸡业带来巨大的经济损失。

国内外现在上市的商品化产品品种很多，但都是很单一的传统疫苗，多次使用疫苗尤其是灭活疫苗，不仅增加鸡场人力和物力负担，同时多次抓鸡的注射应激,还会影响生产性能，致使鸡群对疾病的易感性增大。加之近年来毒株的不断变异，使得虽然推出的多种选择的疫苗，但仍然出现控制不住疫情发展的局面。所以迫使我们在以往具有不散毒、抗体滴度高、免疫保护期长、受母源抗体影响小等优点的油乳剂灭活疫苗的基础上开发出更新更好更适合预防这三种流行性疾病的产品。

发明内容

本发明的目的是制备鸡新城疫、传染性法氏囊病、病毒性关节炎的三种抗原，并进行合理复配制成鸡新城疫、传染性法氏囊病、病毒性关节炎三种疫病油乳剂疫苗，可以有效预防鸡新城疫、传染性法氏囊病、病毒性关节炎的发生，同时也可以大大减少人们的劳动强度，降低养禽业养殖户的风险，而且保证了公众健康。

该三联苗技术的主要相关内容和所采用的技术手段：

（1）在传统全病毒灭活疫苗的基础上结合基因工程亚单位疫苗的复配，并且保证各单一病毒在联苗中均有和单苗一样的效果。

（2）利用美国进口的Millipore浓缩机将抗原经过超强浓缩，抗体产生快，效价高，保护期长，降低疫病的发生及蔓延。(浓缩机的生产厂家，美国密理博。型号为CUP50)。

（3）技术方案主要包括以下步骤：

1）生产用菌毒种为La Sota株鸡新城疫病毒、表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的大肠杆菌基因工程菌CCTCC M204038（E.coli BL21/pET28a-VP2）株和AV2311株病毒性关节炎病毒；

2）分别按常规方法用鸡胚繁殖La Sota株鸡新城疫病毒和AV2311株病毒性关节炎病毒，收获病毒液后经浓缩和灭活工艺制备成灭活病毒液；用加卡那霉素的LB液体培养基培养表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的大肠杆菌基因工程菌CCTCC M204038（E.coliBL21/pET28a-VP2）株，经过破菌、硫酸铵提取和灭菌工艺制备成表达的传染性法氏囊病毒VP2蛋白；

3）将以上制备的三种灭活抗原混合后按常规方法制备灭活佐剂疫苗；

以上混合后灭活抗原制成的水相，每0.1ml中含鸡新城疫病毒含量不低于10^8.0EID₅₀，每0.1ml中含病毒性关节炎病毒含量不低于10^5.0EID₅₀；，每0.1ml中含传染性法氏囊病毒VP2蛋白效价按与鸡传染性法氏囊病毒标准阳性血清的琼扩效价计不低于1:16。

本发明的详细描述

1.疫苗生产用菌毒种的来源

（1）鸡新城疫病毒La Sota株（CVCC AV1615）和效检用鸡新城疫强毒北京株(CVCCAV1611株）均购于北京市海淀区中关村南大街8号中国兽医药品监察所（中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心.中国兽医菌种目录第二版,中国农业科学技术出版社，2002，p142-143）；

（2）表达Infectious bursal disease virus(IBDV)VP2蛋白的大肠杆菌基因工程菌CCTCCM204038（E.coli BL21/pET28a-VP2）株（武汉市武昌珞珈山，武汉大学中国典型培养物保藏中心保管，菌株保藏编号为CCTCC M204038，本专利权人所持有的专利号为ZL200410080065.8的发明专利“一种传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗的制备方法和应用”；荣俊.IBDV VP2基因重组质粒Pbv220表达条件的优化。《动物医学进展》2007年第4期；荣俊.传染性法氏囊病重组亚单位疫苗免疫效力及安全性试验.《浙江农业科学》2007年第6期）；传染性法氏囊病病毒BC6-85株（Infectious bursal disease virus,CVCC AV7株）购于北京市海淀区中关村南大街8号中国兽医药品监察所（中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心.中国兽医菌种目录第二版,中国农业科学技术出版社，2002，p135）；

（3）禽正呼肠孤病毒（Avian orthoreovirus,本发明又称鸡病毒性关节炎病毒）CVCCAV2311株购于北京市海淀区中关村南大街8号中国兽医药品监察所（中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心.中国兽医菌种目录第二版,中国农业科学技术出版社，2002，p151）。

2.生产用种毒的制备：

鸡新城疫病毒La Sota株生产用毒种制备将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释（如10^-4或1^0-5），尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。选接种后72～120小时死亡且病痕明显的鸡胚，分别收获鸡胚液（尿囊液及羊水），装于灭菌容器内。将检验无菌、对1%鸡红细胞凝集价不低于1:512（微量法）的鸡胚液混合，定量分装于无菌安瓿中，冷冻保存。注明收获日期、毒种代次等。

表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的生产用菌种制备一级种子繁殖和鉴定：将CCTCC M204038株冻干菌种接种于加卡那霉素的LB液体培养基中，35～36℃培养24小时，然后划线接种于加卡那霉素的LB固体培养基上培养，选取符合标准的典型菌落10个混合于少量LB培养液中，接种于LB琼脂斜面若干支、置35～36℃培养20～24小时，作为一级种子。在2～8℃保存，不超过14日；在培养基上传代，应不超过4代。二级种子繁殖：取一级种子接种于加卡那霉素的LB培养液中，35～36℃培养20～24小时。置2～8℃保存，应不超过3日。

鸡病毒性关节病毒AV2311株生产用毒种制备将毒种用灭菌生理盐水作适当稀释（如10^-3或10^-4），尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。选择接种后48～72小时的活胚，分别收获鸡胚液（尿囊液及羊水），装于灭菌容器内。收获时应逐个检查胚体，应有皮下出血、水肿、发育小等特异性病痕。将检验无菌的鸡胚液混合，定量分装于安瓿中，冷冻保存。注明收获日期、毒种代次等。

3.制苗用病毒液的制备：

（1）鸡新城疫病毒液的制备

接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释（如10^-4或10^-5），接种10～11日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。

孵育与观察鸡胚接种后，每日照胚1次，将60小时前死亡的鸡胚弃去。此后，每4～6小时照胚1次，死亡的胚随时取出，至96小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上，置于2～8℃冷却12～24小时。

收获将冷却的鸡胚取出，收获鸡胚尿囊液（先收活胚后收死胚）。吸取胚液放于50000ml灭菌容器内，抽样测定红细胞凝集价。凝集价低于1:256（微量法）者应弃去。同时按现行《中国兽药典》进行无菌检验（可不移植），应无菌生长。收获的胚液灭活前在2～8℃保存，应不超过5日。

浓缩将收获的胚液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，至少浓缩3倍，抽样测定红细胞凝集价，凝集价不低于1:1024（微量法）时停止浓缩，按中华人民共和国兽药典（中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○○五年版三部.中国农业出版社，2005，本发明以下简称为《中国兽药典》）规定的方法进行无菌检验（可不移植），应无菌生长，并留样备测毒价。浓缩后的胚液随即进行灭活。

灭活将鸡新城疫病毒液导入灭活罐内，计量加入10%甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1%。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时（以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌）后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。

（2）鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的制备

菌液培养用培养罐通气培养，按容积装入70％培养基（加卡那霉素的LB液体培养基）及花生油消泡剂。灭菌后按培养基量的2％～4％接种CCTCC M204038二级种子菌液，37℃培养，待菌液的OD600值达到0.6～1.0，加入0.2mol/Lα-乳糖，使终浓度达到0.02mol/L，再继续培养5～8h。开始小量通气，逐渐增大气量。

破菌培养结束后，离心收集菌体。收集的菌体用PBS液清洗2次，将收集的菌体加适量PBS液进行重悬，在4℃下用超声波破碎。破碎后的菌液，3000r/min，离心30min，收集上清液。经硫酸铵沉淀后，收集VP2蛋白液随即进行灭活。

灭菌将收集的上清液中按比例加入10%的甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.2%，然后将胚液导入另一灭活罐内，37℃灭活12小时（以罐内液体温度达到37℃开始计时），以灭活残存的大肠杆菌及毒素。2～8℃保存，不超过7日；-15℃以下保存，不超过60日。

（3）鸡病毒性关节炎病毒液的制备

接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作适当稀释（如10^-2或10^-3），接种9～10日龄易感鸡胚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻胚。

孵育和观察鸡胚接种后，每日照胚1次，将30小时前死亡的鸡胚弃去。此后，每4～6小时照胚1次，死亡鸡胚随时取出，直至96小时，无论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却12～24小时。

收获将冷却的鸡胚取出，收获鸡胚尿囊液（先收活胚后收死胚）。吸取胚液放于50000ml灭菌容器内，抽样测定病毒含量，应≥10^5.0EID₅₀/0.1ml。同时按现行《中国兽药典》进行无菌检验(可不移植)，应无细菌生长。收获的胚液灭活前在2～8℃保存，应不超过5日。

浓缩将收获的鸡胚病毒液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，至少浓缩3倍，抽样测定病毒含量，病毒含量不低于10^5.5EID₅₀/0.1ml时停止浓缩。按现行《中国兽药典》进行无菌检验（可不移植），应无细菌生长，并留样备测毒价。浓缩后的胚液随即进行灭活。

灭活将病毒性关节炎病毒液导入灭活罐内，计量加入10%甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1%。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时（以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌）后取出，放2～8℃保存，应不超过1个月。

4.灭活疫苗的制备：

经过检验合格后的半成品抗原进行疫苗制备。

油相制备取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份，在油相制备罐中混合均匀并加热至80℃后，再加司本-80 6份，至温度达到125℃时维持30分钟，冷却后备用。

水相制备将检验合格的鸡新城疫病毒液、鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白、病毒性关节炎病毒液等量混合，每0.1ml水相中鸡新城疫病毒含量不低于10^8.0EID₅₀，病毒性关节炎病毒含量不低于10^5.0EID₅₀，传染性法氏囊病毒VP2蛋白与鸡传染性法氏囊病毒标准阳性血清的琼扩效价不低于1:16。取灭菌后的吐温-804份，加入配液罐中，同时加混合抗原液96份，充分振摇，开动搅拌电机搅拌20～30分钟，使吐温-80完全溶解。

乳化取油相2份放入乳化罐中，开动电机，慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份后，再以4000r/min搅拌30～40分钟，在终止搅拌前加入1%硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01%。乳化后，取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应≤0.5ml。

5成品检验

（1）性状

外观乳白色乳剂。

剂型油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均不扩散。

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相为0.1ml。

黏度按现行《中国兽药典》附录进行，黏度为52cP，符合规定。

（2）装量检查按现行《中国兽药典》附录进行，测定3瓶结果为251.3ml、252.1ml、251.5ml，符合规定。

（3）无菌检验按现行《中国兽药典》进行，无菌生长。

（4）安全检验用7日龄SPF鸡10只，每只肌肉或颈部皮下注射疫苗1ml，观察14日，结果试验鸡均健活，无任何局部和全身不良反应。

（5）效力检验

1）鸡新城疫部分效力检验采用血清学方法进行检验，结果不符合规定时，可采用免疫攻毒法进行检验。

血清学方法用30日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20μl，另5只不免疫作对照。接种后21日，每只鸡分别采血，分离血清，按现行《中国兽药典》进行HI抗体效价测定。免疫组HI抗体效价的几何平均值应不低于1:16（微量法），未免疫对照组HI抗体效价的几何平均值应不高于1:4（微量法）。

免疫攻毒法用30日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20μl，另5只不免疫作对照。接种后21日，每只鸡各肌肉注射鸡新城疫病毒北京株强毒（CVCC AV1611株）10^5.0ELD₅₀，观察14日。对照组应全部死亡，免疫组应保护至少7只。

2）鸡传染性法氏囊病部分效力检验以下方法任择其一。

血清学方法取21日龄SPF鸡20只，其中10只各肌肉或颈部皮下注射疫苗0.2ml，另外10只不免疫作为对照，同群饲养。接种后21日，每只鸡分别采血，分离血清，做琼脂免疫扩散试验。免疫鸡应至少有8只琼扩效价不低于1:8，对照鸡应全部阴性。

免疫攻毒法取21日龄SPF鸡20只，其中10只各肌肉或颈部皮下注射疫苗0.2ml，另外10只不免疫作为对照，同条件下隔离饲养。接种后21日，所有免疫鸡和对照鸡，每只点眼途径接种100倍稀释的鸡传染性法氏囊病强毒BC6-85株毒液0.1ml(实含毒量≥100个BID)。攻毒后，每天观察鸡只的临床表现，记录发病和死亡鸡数，至72～96小时，扑杀存活鸡，逐只剖解，观察法氏囊等病变。免疫鸡应至少8只正常，不出现法氏囊病变；对照鸡应至少8只发病，出现明显的法氏囊病变（如胸肌或腿肌条状出血、法氏囊肿大或萎缩、发黄、内有胶冻样分泌物等一种以上病变）。

3）病毒性关节炎部分效力检验以下方法任择其一。

血清学方法取21日龄SPF鸡15只，其中10各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另外5只不免疫作为对照，同群饲养。21日后，每只鸡分别采血、分离血清，做琼脂免疫扩散试验，免疫鸡抗体阳性数应不少于9只，对照鸡应全部阴性。

免疫攻毒法取21日龄SPF鸡15只，其中10各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另外5只不免疫作为对照，同群饲养。21～28日后，每只鸡经脚垫接种鸡病毒关节炎病毒AV2311株强毒，0.2ml（含2×10⁴ELD₅₀）/只，观察120小时，检查趾、跗关节病变。对照组应至少有8只鸡发病，免疫组应全部保护。

（6）甲醛、汞类防腐剂残留量测定

按现行《中国兽药典》进行测定，结果应符合规定。

本发明的积极意义

本发明涉及一种鸡新城疫、传染性法氏囊病、病毒性关节炎三联灭活疫苗的生产方法。本发明采用新城疫病毒La Sota株（CVCCAV1615）、表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的大肠杆菌基因工程菌E.coli BL21/pET28a-VP2株（CCTCC M204038株）和病毒性关节炎CVCC AV2311株作为生产菌毒种，超强浓缩工艺和优质佐剂制备成灭活疫苗，免疫动物后抗体产生快，效价高，保护期长，降低了疫病的发生及蔓延。

本发明涉及的微生物信息

（2）表达Infectious bursal disease virus(IBDV)VP2蛋白的大肠杆菌基因工程菌E.coliBL21/pET28a-VP2株（武汉市武昌珞珈山，武汉大学中国典型培养物保藏中心保管，菌株保藏编号为CCTCC M204038，本专利权人所持有的专利号为ZL200410080065.8的发明专利“一种传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗的制备方法和应用”；荣俊.IBDV VP2基因重组质粒Pbv220表达条件的优化。《动物医学进展》2007年第4期；荣俊.传染性法氏囊病重组亚单位疫苗免疫效力及安全性试验.《浙江农业科学》2007年第6期）；传染性法氏囊病病毒BC6-85株（Infectious bursal disease virus,CVCC AV7株）购于北京市海淀区中关村南大街8号中国兽医药品监察所（中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心.中国兽医菌种目录第二版,中国农业科学技术出版社，2002，p135）；

附图说明：

图1本发明工艺流程图

A1熏蒸消毒：是指消毒剂采用熏蒸的方法对培养鸡胚的孵化器进行彻底消毒。

A3NDV、AVA接种鸡胚：指鸡胚在孵化至10～11日龄时接种鸡新城疫病毒、病毒性关节炎病毒在鸡胚内进行繁殖。

A4收毒：在培养到规定的时期，将鸡胚中繁殖的鸡胚液病毒进行收获。

A5病毒浓缩：将收获的含毒鸡胚液在2～8℃条件下采用美国Millipore超滤浓缩机进行抗原的浓缩，使其提高抗原含量，并同时对抗原做了进一步的纯化。

A6测毒价：测NDV抗原的血凝价、AVA抗原的病毒含量。

B5破碎：指传染性法氏囊的VP2蛋白离心后收集菌体，加适量的PBS液进行重悬，在4℃下用超声波破碎，使其菌体内的蛋白充分释放出来。

C灭活：将A组和B组的抗原液都用适量的甲醛溶液进行灭活，灭活掉抗原活性及细菌外毒素。

D半成品检验：是指要进行灭活检验、VP2蛋白含量检测、无菌检验、内毒素检验，使其各个指标在半成品时合格，才能进行下一步。

E抗原配比：指水相中鸡新城疫、传染性法氏囊病、病毒性关节炎的抗原配比是1:1:1。

F乳化：指将含有抗原的水相和油相按照一定的配比方法充分的混合在一起，即成为成品的疫苗状态。

最佳实施方式：

实施例1

（一）抗原制备以及半成品检验：

1．鸡新城疫病毒液的制备

（1）接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作10^-4稀释，接种10日龄易感鸡胚200枚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置37℃继续孵育，不翻胚。

（2）孵育与观察鸡胚接种后，每日照胚1次，将60小时前死亡的鸡胚11枚弃去。此后，每4～6小时照胚1次，死亡的胚随时取出，至96小时，共死亡155枚，全部取出，气室向上，置于2～8℃冷却12小时。

（3）收获将冷却的鸡胚取出，收获鸡胚尿囊液（先收活胚后收死胚）。共收鸡胚189枚，约2450ml尿囊液，抽样测定红细胞凝集价。凝集价为1:256（微量法）。按现行《中国兽药典》进行无菌检验。收获的胚液灭活前在2～8℃保存。

（4）浓缩将收获的胚液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩，浓缩至800ml，抽样测定红细胞凝集价，凝集价为1:1024（微量法），按《中国兽药典》进行无菌检验，并留样备测毒价。浓缩后的胚液随即进行灭活。

（5）灭活将鸡新城疫病毒液导入灭活罐内，加入10%甲醛溶液8ml，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛的最终浓度为0.1%。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时（以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌）后取出，放2～8℃保存。

2．鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的制备

（1）菌液培养用培养罐通气培养，按容积装入70％培养基（加卡那霉素的LB液体培养基）及花生油消泡剂。灭菌后按培养基量的4％接种二级种子菌液，37℃培养，待菌液的OD600值达到0.8，加入0.2mol/Lα-乳糖，使终浓度达到0.02mol/L，再继续培养8h。开始小量通气，逐渐增大气量。

（2）破菌培养结束后，离心收集菌体。收集的菌体用PBS液清洗2次，将收集的菌体加适量PBS液进行重悬，在4℃下用超声波破碎。破碎后的菌液，3000r/min，离心30min，收集上清液1000ml。经硫酸铵沉淀后，收集VP2蛋白液随即进行灭活。

（3）灭菌将收集的上清液中按比例加入10%的甲醛溶液，开启搅拌机搅拌，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.2%，然后将胚液导入另一灭活罐内，37℃灭活12小时（以罐内液体温度达到37℃开始计时），以灭活残存的大肠杆菌及毒素。2～8℃保存。

3.鸡病毒性关节炎病毒液的制备

（1）接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作10^-3稀释，接种10日龄易感鸡胚200枚，每胚0.1ml，接种后密封针孔，置37℃继续孵育。

（2）孵育和观察鸡胚接种后，每日照胚1次，将30小时前死亡的鸡胚5枚弃去。此后，每4～6小时照胚1次，死亡鸡胚随时取出，直至96小时，死亡168枚，全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷却12小时。

（3）收获将冷却的鸡胚取出，收获195枚鸡胚的尿囊液（先收活胚后收死胚）共2500ml。抽样测定病毒含量。同时按现行《中国兽药典》进行无菌检验，收获的胚液灭活前在2～8℃保存。

（4）浓缩将收获的鸡胚病毒液在2～8℃条件下，用超滤浓缩机浓缩至800ml，抽样测定病毒含量。按现行《中国兽药典》进行无菌检验。浓缩后的胚液随即进行灭活。

（5）灭活将病毒性关节炎病毒液导入灭活罐内，加入10%甲醛溶液8ml，开启搅拌机搅拌，使其充分混合。加甲醛溶液后导入另一灭活罐中，以避免罐口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时（以罐内温度达到37℃开始计时，开启搅拌机连续搅拌）后取出，放2～8℃保存。

5.半成品检验

（1）鸡新城疫病毒液

1）病毒含量测定将浓缩后灭活前取出的胚液进行10倍系列稀释，取10^-7、10^-8、10^-93个稀释度，各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1m1，置37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日，无论死胚、活胚均应测定红细胞凝集价，凝集价不低于1:128（微量法）者，判为感染，计算EID₅₀，结果0.1ml病毒含量为10^8.7EID₅₀的胚液。

2）红细胞凝集价测定取浓缩后灭活前的胚液，按现行《中国兽药典》进行测定，其凝集价为1:1024（微量法）。

3）灭活检验取10日龄SPF鸡胚6个，尿囊腔内接种灭活病毒液，每个0.2ml，置37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日。鸡胚健活，对所有胚液分别测定红细胞凝集价，均不出现凝集，将胚液收获再盲传一代，仍无凝集价，灭活完全。

4）无菌检验取灭活的胚液按现行《中国兽药典》进行检验，结果无菌生长。

（2）鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白

1）VP2含量检测将制苗用VP2蛋白液对鸡传染性法氏囊病病毒阳性血清（购自中国兽医药品监察所）按常规方法进行琼脂扩散试验，上清液中表达产物VP2的滴度（AGP效价）为1:64。

2）无菌检验按《中国兽药典》进行，结果无菌生长。

3）内毒素检测将灭菌后的VP2蛋白液按“附注”方法进行内毒素检测，用内毒素＜0.125EU/ml的氯化钠注射液将VP2蛋白稀释1000倍，鲎试剂盒检测为阴性。

（3）病毒性关节炎病毒液

1）无菌检验取灭活的胚液按现行《中国兽药典》进行检验，结果无菌生长。

2）灭活检验取7日龄SPF鸡胚6个，卵黄囊接种灭活浓缩胚液，每胚0.2ml，置37℃继续孵育，每日照胚2次，观察5日。鸡胚均健活，收获胚液并逐个检查胎儿，没有任何病变。将阴性样品的胚液混合，再盲传一代，仍无特异性病痕，灭活完全。

3）病毒含量测定将浓缩后灭活前的病毒也用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-63个稀释度，分别卵黄囊接种7日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1ml，记录24～168小时内死亡且胎儿病变明显的鸡胚数，结果每0.1ml病毒含量为10^5.7EID₅₀，可用于制苗。

（二）疫苗制备：

（1）油相制备取优质注射用白油3760ml，硬脂酸铝80ml，在油相制备罐中混合均匀并加热至80℃后，再加司本-80240ml，至温度达到125℃时维持30分钟，冷却后备用。

（2）水相制备将检验合格的鸡新城疫病毒液、传染性法氏囊病病毒VP2蛋白、病毒性关节炎病毒液各700ml混合（混合后每0.1ml中含鸡新城疫病毒含量不低于10^8.0EID₅₀，每0.1ml中含病毒性关节炎病毒含量不低于10^5.0EID₅₀；，每0.1ml中含传染性法氏囊病毒VP2蛋白效价按与鸡传染性法氏囊病毒标准阳性血清的琼扩效价计不低于1:16）。取灭菌后的吐温-80 28ml，加入配液罐中，同时加混合抗原液2100ml，充分振摇，开动搅拌电机搅拌30分钟，使吐温-80完全溶解。

（3）乳化取油相4200ml放入乳化罐中，开动电机，慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份后，再以4000r/min搅拌30分钟，在终止搅拌前加入1%硫柳汞溶液60ml。乳化后，取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底无析出的水相。

（4）分装分装100ml/瓶，共60瓶，加盖密封。

实施例2

成品检验——实验室试制一批三联灭活疫苗约6000ml，批号为2010001。

1．性状

外观乳白色乳剂。

2.装量检查按现行《中国兽药典》附录进行，测定3瓶结果为251.3ml、252.1ml、251.5ml，符合规定。

3.无菌检验按现行《中国兽药典》进行，无菌生长。

4.安全检验用7日龄SPF鸡10只，每只肌肉或颈部皮下注射疫苗1ml，观察14日，结果试验鸡均健活，无任何局部和全身不良反应。

5.效力检验

（1）鸡新城疫部分效力检验采用血清学方法进行检验，结果不符合规定时，可采用免疫攻毒法进行检验。

1）血清学方法用30日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20μl，另5只不免疫作对照。接种后21日，每只鸡分别采血，分离血清，按现行《中国兽药典》进行HI抗体效价测定。免疫组HI抗体效价的几何平均值应不低于1:24.3（微量法），未免疫对照组HI抗体效价的几何平均值均不高于1:2（微量法）。

2）免疫攻毒法用30日龄SPF鸡15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20μl，另5只不免疫作对照。接种后21日，每只鸡各肌肉注射鸡新城疫病毒北京株强毒（CVCCAV1611株）10^5.0ELD₅₀，观察14日。对照组5只全部死亡，免疫组10只全部保护。

（2）鸡传染性法氏囊病部分效力检验以下方法任择其一。

1）血清学方法取21日龄SPF鸡20只，其中10只各肌肉或颈部皮下注射疫苗0.2ml，另外10只不免疫作为对照，同群饲养。接种后21日，每只鸡分别采血，分离血清，做琼脂免疫扩散试验。免疫鸡10只琼扩效价为1:21，对照鸡全部阴性。

2）免疫攻毒法取21日龄SPF鸡20只，其中10只各肌肉或颈部皮下注射疫苗0.2ml，另外10只不免疫作为对照，同条件下隔离饲养。接种后21日，所有免疫鸡和对照鸡，每只点眼途径接种100倍稀释的鸡传染性法氏囊病强毒BC6-85株毒液0.1ml(实含毒量≥100个BID)。攻毒后，每天观察鸡只的临床表现，记录发病和死亡鸡数，至72～96小时，扑杀存活鸡，逐只剖解，观察法氏囊等病变。免疫鸡10只均为正常，未出现法氏囊病变；对照鸡10只均发病（死亡？），剖检出现明显的法氏囊病变（如胸肌或腿肌条状出血、法氏囊肿大或萎缩、发黄、内有胶冻样分泌物等一种以上病变）。

（3）病毒性关节炎部分效力检验以下方法任择其一。

1）血清学方法取21日龄SPF鸡15只，其中10各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另外5只不免疫作为对照，同群饲养。21日后，每只鸡分别采血、分离血清，做琼脂免疫扩散试验，免疫鸡10只鸡血清抗体全部阳性，对照鸡全部阴性。

2）免疫攻毒法取21日龄SPF鸡15只，其中10各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.2ml，另外5只不免疫作为对照，同群饲养。21～28日后，每只鸡经脚垫接种鸡病毒关节炎病毒AV2311株强毒，0.2ml（含2×10⁴ELD₅₀）/只，观察120小时，检查趾、跗关节病变。对照组5只鸡发病，免疫组10只鸡保护。

2010001批疫苗的效检结果见表1。

表1 2010001批疫苗的效检结果

6.甲醛、汞类防腐剂残留量测定按现行《中国兽药典》进行测定，结果甲醛残留0.06%，汞类防腐剂残留0.009%，符合规定。

实施例3

我们进行了三联疫苗与各组分单苗（本发明人公司生产的商品化产品）的免疫效果对比试验，试验方法如下：

用21日龄SPF鸡50只，三联苗和新城疫、传染性法氏囊病、病毒性关节炎单苗各免疫10只，皮下注射疫苗0.5ml/只，另10只不免疫作对照。同群饲养。各组鸡分别于免疫前及免疫后7、14、21、28、35日采血，分离血清，测血清抗体。结果比较见下表2。

表2三联疫苗与各组分单苗的免疫效果对比试验结果

附注：

凝胶法检查细菌内毒素

Pyrosate内毒素快速检测试剂盒

Pyrosate凝胶法内毒素快速检测试剂盒作为世界上唯一的凝胶法内毒素快速检测试剂，主要用于水、裂解液、透析液等终产品的内毒素的快速检测。

【成分】样品检测管（SPL）：管内壁有鲎试剂

样品阳性检测对照管（PPC）：管内壁有内毒素

吸管

【特异性】Pyrosate凝胶法内毒素快速检测试剂盒只对内毒素产生特异性，并排除了（1,3）-β-D-glucans引起的假阳性结果。

【敏感性】本试剂盒的灵敏度为1EU/ml。

【作用与用途】用于水、裂解液、透析液等终产品的内毒素检测。

【贮藏】室温保存，有效期为120个月。

【规格】10次/盒。

操作述式：

（1）在37℃温箱中预热所用器具。

（2）将供试品用氯化钠注射液（内毒素＜0.125EU/ml)适当稀释成不同倍数，待测。

（3）将0.5ml稀释不同倍数的供试品小心加入样品检测管（SPL），并轻轻混匀。

（4）用无热原的吸管小心地从样品检测管中吸取0.25ml的供试品加入样品阳性检测管（PPC），轻轻混合60秒，即可。

（5）将完全混匀后的样品检测管和样品阳性检测管放置于37℃培养30min。

（6）倒置样品检测管和样品阳性检测管，观察有无凝集。

（7）当阳性对照检测管（PPC）完全凝集判试验成立。

（8）若样品检测管有凝集反应，说明该稀释度的供试品中内毒素的含量≥1.0EU/ml；若样品检测管中无凝集反应，说明该稀释度的供试品中内毒素含量＜1.0EU/ml。根据稀释度计算原供试品中内毒素含量。

Claims

1.一种鸡新城疫、传染性法氏囊病、病毒性关节炎三联灭活疫苗，其特征在于该疫苗主要成分是灭活的La Sota株鸡新城疫病毒、AV2311株病毒性关节炎病毒和CCTCC M204038（E.coli BL21/pET28a-VP2）株大肠杆菌基因工程菌表达的传染性法氏囊病毒VP2蛋白和疫苗佐剂。

2.如权利要求1所述一种鸡新城疫、传染性法氏囊病、病毒性关节炎三联灭活疫苗的生产方法，其特征在于：

（1）生产用菌毒种为La Sota株鸡新城疫病毒、表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的大肠杆菌基因工程菌CCTCC M204038（E.coli BL21/pET28a-VP2）株和AV2311株病毒性关节炎病毒；

（2）分别按常规方法用鸡胚繁殖La Sota株鸡新城疫病毒和AV2311株病毒性关节炎病毒，收获病毒液后经浓缩和灭活工艺制备成灭活病毒液；用加卡那霉素的LB液体培养基培养表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的大肠杆菌基因工程菌CCTCC M204038（E.coliBL21/pET28a-VP2）株，经过破菌、硫酸铵提取和灭菌工艺制备成表达的传染性法氏囊病毒VP2蛋白；

（3）将以上制备的三种灭活抗原混合后按常规方法制备灭活佐剂疫苗。

3.如权利要求2所述一种鸡新城疫、传染性法氏囊病、病毒性关节炎三联灭活疫苗的生产方法，其特征在于混合后灭活抗原制成的水相，每0.1ml中含鸡新城疫病毒含量不低于10^8.0EID₅₀，每0.1ml中病毒性关节炎病毒含量不低于10^5.0EID₅₀。

4.如权利要求2所述一种鸡新城疫、传染性法氏囊病、病毒性关节炎三联灭活疫苗的生产方法，其特征在于混合后灭活抗原制成的水相，每0.1ml中含传染性法氏囊病毒VP2蛋白效价按与鸡传染性法氏囊病毒标准阳性血清的琼扩效价计不低于1:16。