CN103316334B - 一种鸡传染性法氏囊病活疫苗及其生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鸡传染性法氏囊病活疫苗的生产方法。通过对不同亚型鸡传染性法氏囊病毒的免疫原性、抗原谱、对法氏囊的致病性以及突破母源抗体能力等特性的研究，筛选出具有免疫原性好、抗原谱较广且具有免疫协同作用的毒株开展鸡传染性法氏囊病三价活疫苗的研究，研制出免疫原性好、能够突破较高水平母源抗体、免疫持续期长达3个月以上、对不同强毒株均有良好保护的活疫苗——鸡传染性法氏囊病三价活疫苗。

Description

一种鸡传染性法氏囊病活疫苗及其生产方法

技术领域

本发明涉及一种鸡传染性法氏囊病活疫苗及其生产方法。属于兽用生物制品领域。

背景技术

鸡传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）是由鸡传染性法氏囊病毒（Infectiousbursal disease virus,IBDV）引起的雏鸡的一种急性、接触传染性疾病，其临床症状以法氏囊水肿、出血、坏死、萎缩等为特征，发病率高，死亡率一般为5%～20%，有时甚至高达50%以上，是目前养禽业最重要的疾病之一。疫苗免疫接种是预防和控制该病的主要措施之一，虽然目前已有多种商品化的疫苗，对该病的预防和控制发挥了重要作用。但由于田间毒株抗原性发生变异，超强毒株和变异株不断出现，常规疫苗免疫失败常常出现，不能很好地控制IBD的发生和流行。美国学者JackWood等（Jackwood D H et al.Antigenic diversity of infectious bursaldisease viruses.Avi Diseases,1987,31:766-770；D J Jackwood et al.Infectious bursal disease viruses:Moleculardifferentiation of antigenic subtypes among serotype1viruses,Avi Diseases,38:531-537）将8个IBD疫苗毒株和5个野毒株的抗原性进行相关性比较，发现它们之间存在着显著性差异，交叉中和试验表明13个毒株可分为六个血清亚型；我国学者也利用交叉中和试验证明了IBDV血清亚型的存在。由于田间毒株抗原性发生变异，超强毒株和变异株不断出现，现有商品疫苗免疫失败常常出现，由此而导致巨大的经济损失。

发明内容

本发明的目的在于通过对不同亚型鸡传染性法氏囊病毒的免疫原性、抗原谱、对法氏囊的致病性以及突破母源抗体能力等特性的研究，筛选出具有免疫原性好、抗原谱较广且具有免疫协同作用的毒株，研制出免疫原性好、免疫持续期长、对不同强毒株均有良好保护的活疫苗，用鸡传染性法氏囊病的预防和控制工作，减少因疫病发生给养鸡业带来的经济损失，确保我市养鸡业持续健康稳定发展。

技术路线

1.本发明所涉及的一种鸡传染性法氏囊病活疫苗是含有鸡传染性法氏囊病病毒B87株、CA-C株、CF-C株的三价活疫苗；其中鸡传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus）CA-C株和CF-C株病毒已于2013年4月1日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号CA-C株为CGMCC No.7405,CF-C株为CGMCC No.7404。

2.本发明涉及的鸡传染性法氏囊病活疫苗的制备方法为：

（1）鸡胚的接种与收获用灭菌生理盐水/或磷酸盐缓冲肉汤将三株生产用毒种分别稀释至含1000～10000EID₅₀/0.1ml，；将稀释的B87和CA-C株病毒液经尿囊腔、CF-C株经绒毛尿囊膜分别接种10～11日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，置37℃孵育至96小时，弃去48小时前死胚；分别分组收取48～96小时死胚及96小时存活胚胎儿及尿囊膜，装于无菌容器内剪碎，置-20℃以下冻存；冻融2～3次后经离心或过滤去掉沉渣，上清分别为制苗用B87、CA-C和CF-C株半成品，检经无菌检验和病毒含量测定，应无菌检验合格的、用灭菌生理盐水/或磷酸盐缓冲肉汤分别稀释，使病毒含量B87株应≧10^5.0ELD₅₀/0.2ml和CA-C株应≧10^5.0ELD₅₀/0.2ml，CF-C株应≧10^4.5EID₅₀/0.2ml；

IBDVB87株可采用接种CEF细胞生产，方法为：取9～10日龄SPF鸡胚制备成纤维细胞，将B87株生产用毒种用Hank’s液稀释，按10^3.0EID₅₀/ml接种，培养72～96小时，待细胞病变达到70%时，收获细胞培养液，经检验。

IBDV CA-C株也可采用接种CEF细胞生产，方法为：取9～10日龄SPF鸡胚制备成纤维细胞，将CA-C株生产用毒种用Hank’s液适当稀释，按10^3.0TCID₅₀/ml病毒液接种，培养72～96小时，待细胞病变达到70%时，收获细胞培养液，经检验。

（2）配苗及分装取经过检验合格的三种病毒液按体积比1:1:1混合，加入常用冻干保护剂和抗生素经充分混匀，定量分装，分装后迅速进行冷冻真空干燥。

本发明的实施方式

1.病毒株来源及特征

（1）毒株来源：鸡传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）B87株、CA株与CF株均来自中国兽医药品监察所；其中B87株为国内商品化的鸡传染性法氏囊活疫苗生产毒株，CA株与CF株由中国兽医药品监察所分别于1994年和1995年在北京市分离鉴定的CA94株和CF95株经人工致弱而得到的弱毒株病毒，本发明人将2株毒株进行克隆纯化，获得较高滴度的克隆株，即CA-C株和CF-C株。

1）CA94株的分离和致弱

在北京市某疑似鸡传染性法氏囊病感染的鸡场中采集病死鸡法氏囊，经抗生素除菌处理后，接种鸡胚，连续传代，增殖分离病毒，经鉴定为IBDV毒株，对SPF鸡的法氏囊半数感染量为10^4.2BID₅₀/0.1ml，命名为CA94株，该毒株经鸡胚连续传代后，适应于鸡胚成纤维细胞（CEF）培养，细胞连续传代至24代后失去对鸡的致病力，命名为CA株。此后本发明人通过终点稀释法获对该毒株进行克隆纯化，获得病毒含量显著提高的克隆株，每0.2ml大于10^6.0ELD₅₀，传代稳定性良好，命名为鸡传染性法氏囊病毒（Infectious bursal disease virus）CA-C株（或简称CA株）。

该株病毒已于2013年4月1日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.7405。通过CA-C株在3～5周龄SPF鸡体内连续传5代后各代次鸡法氏囊病毒含量变化和基础种毒与第5代法氏囊毒毒力比较，检测CA-C株在易感鸡体内连续传代的后毒力的稳定性，结果表明CA-C株在易感鸡体内连传5代后未出现毒力返强，各代次鸡法氏囊均无病变，颜色和弹性正常，略小于正常对照鸡法氏囊。

2）CF95株的分离和致弱

在北京市某疑似鸡传染性法氏囊病毒感染的鸡场中采集病死鸡病变法氏囊，经抗生素除菌处理后，接种鸡胚，连续传代，增殖分离病毒，经鉴定为IBDV强毒株，对SPF鸡的法氏囊半数感染量为10^4.0BID₅₀/0.1ml，命名为CF95株，采用鸡胚传代致弱，传至90代时，病毒失去对鸡的致病力，命名为CF株，此后本发明人将CF株经终点稀释法克隆，获得的克隆株病毒含量得到显著提高，达到每0.2ml大于10^5.0ELD₅₀，传代稳定性良好，命名为鸡传染性法氏囊病毒（Infectious bursal disease virus）CF-C株（或简称CF株）。

该株病毒已于2013年4月1日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.7404。通过CF-C株在3～5周龄SPF鸡体内连续传5代后各代次鸡法氏囊病毒含量变化和基础种毒与第5代法氏囊毒毒力比较，检测CF-C株在易感鸡体内连续传代的后毒力的稳定性，结果表明CF-C株在易感鸡体内连传5代后，未出现毒力返强，各代次鸡法氏囊均无明显病变，颜色和弹性正常，略小于正常对照鸡法氏囊。

（2）毒株特点

1）毒株分型参考Jackwood等的分型方法（Jackwood D H et al.Antigenic diversity of infectiousbursal disease viruses.Avi Diseases,1987,31:766-770）对本发明中3个毒株进行亚型鉴定，结果表明B87株、CA-C株和CF-C株分别属于IBDV血清I型中的C亚型、A亚型和E亚型。

2）对鸡胚的毒力将B87株、CA-C株、CF-C株3个毒种分别用无菌生理盐水稀释，各经绒毛尿囊膜接种10枚10～11日龄SPF鸡胚，每胚接种0.2ml（含1000个ELD₅₀），鸡胚应在接种后48～168小时内死亡8只以上，剖检胎儿全身应明显水肿，脑部充血，脚趾充血，肝有斑驳状等病变。

3）对雏鸡的安全性将B87株、CA-C株、CF-C株分别用7～10日龄SPF雏鸡30只进行安全性试验。试验鸡分成两组，第一组20只，每只点眼或滴鼻接种10^4.0ELD₅₀的病毒液；第二组10只，不接种病毒作为对照，两组隔离饲养。接种后72小时，接种组剖检10只，对照组5只，雏鸡法氏囊均不应有出血、坏死、黄色粘液等病理变化出现。其余雏鸡继续饲养观察至21日，应健活。

4）病毒含量将3个毒种分别用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-4、10^-5和10^-63个稀释度，各绒毛尿囊膜上接种10～11日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.2ml，置37℃孵育168小时，计算ELD₅₀，B87和CA-C株每0.2ml病毒含量应≥10^5.0ELD₅₀，CF-C株每0.2ml病毒含量应≥10^4.5EID₅₀。

5）特异性将3个毒种分别用灭菌Hank’s液稀释至10^3.0ELD₅₀/0.1ml，与鸡传染性法氏囊病阳性血清等量混合，37℃中和60分钟，经绒毛尿囊膜上接种10～11日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.2ml；同时设病毒对照5个，每胚接种病毒液0.2ml（含10^3.0ELD₅₀），同条件观察培养168小时。血清中和组鸡胚应全部健活，病毒对照组应至少有4枚死亡，鸡胚尿囊液对鸡红细胞凝集试验(HA)应为阴性。

6）免疫原性将B87株、CA-C株、CF-C株分别用2～4周龄SPF雏鸡20只进行免疫原性试验。其中10只各滴鼻或点眼接种病毒液0.03ml，约含200ELD₅₀，另10只不接种作对照，分别隔离饲养。14日后，免疫鸡连同对照鸡5只，均用10个法氏囊最小感染剂量的强毒BC6-85株点眼0.1ml，72小时后，将所有鸡扑杀，剖检。攻毒对照鸡的法氏囊应至少4只出现明显病变，免疫鸡的法氏囊应至少有8只无病变，健康对照组5只鸡的法氏囊均应无任何变化。

7）免疫抑制性将B87株、CA-C株、CF-C株分别用20只1日龄SPF鸡做免疫抑制性试验。将试验鸡分成2组，每组10只，其中1组接种1个使用剂量的病毒液，另10只作为对照，分别隔离饲养。14日后每组鸡每只接种1个使用剂量的鸡新城疫疫苗，同条件下隔离饲养观察。免疫后14日采血，测定鸡新城疫的HI抗体效价，免疫组与鸡新城疫对照组之间鸡新城疫抗体效价的几何平均滴度（GMT）经统计学分析，应无显著性差异。

8）协同保护本发明用不同亚型的疫苗毒株B87株、CA-C株和CF-C株分别制成法氏囊单价及三价活疫苗，比较了它们与单价苗的免疫效力差异，三种不同亚型病毒混合制备成三价活疫苗，免疫SPF鸡后其免疫保护效果优于不同毒株制备的单苗。三价活疫苗接种后1周对强毒攻击的保护率即可达到100%，中和抗体效价即可达1：640，而单苗的保护率为20%-60%，中和抗体效价小于1:160（详细结果见表1）；三价苗免疫后免疫后3个月中和抗体水平仍达到1:1120，而单价苗小于1:680（详细结果见表2）。该研究结果表明，我们选用的鸡传染性法氏囊病毒三个不同亚型毒株具有较好的免疫协同作用，利用不同亚型毒株制备多价疫苗可使鸡群产生更好的免疫效果。

表14种疫苗免疫SPF鸡后的中和抗体效价及强毒攻击保护率

注：*“-”表示此项实验未做;“a”细胞中和试验均用B87作为抗原。

表24种疫苗免疫鸡群三个月的抗体水平

2.疫苗制造及半成品检验

（1）生产用毒种制备

将3个毒种分别用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲肉汤稀释至1000～10000EID₅₀/0.1ml，各经绒毛尿囊膜或尿囊腔接种10～11日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，置37℃孵育至96小时，弃去48小时前死胚。收取48～96小时死胚及96小时活胚胎儿及尿囊膜，装于无菌容器内剪碎，取样作无菌检验，胚液置-30℃冻存。将检验无菌的鸡胚液冻融2～3次，各毒株鸡胚液分组离心去沉渣，上清液加适量的抗生素混匀分装，置-30℃保存。注明收获日期、毒种代次及装量。经鉴定，符合标准的毒种作为生产用种子。毒种保存在-20℃以下保存，应不超过12个月，毒种继代应不超过3代。

（2）制苗病毒液的制备

1）鸡胚的接种、收获选择发育良好的10～11日龄SPF鸡胚或鸡胚成纤维细胞作为制苗材料。取生产用毒种，用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲肉汤稀释至含1000～10000EID₅₀/0.1ml，B87和CA-C株尿囊腔接种，CF-C株绒毛尿囊膜接种10～11日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，置37℃孵育至96小时，弃去48小时前死胚。分别分组收取48～96小时死胚及96小时存活胚胎儿及尿囊膜，装于无菌容器内剪碎，置-20℃以下冻存。冻融2～3次后经离心或过滤去掉沉渣，上清保存于-20℃以下待检。

2）细胞的接种、收获B87株和CA-C株也可采用接种CEF细胞生产。取9～10日龄SPF鸡胚制备成纤维细胞，将B87和CA-C株生产用毒种用Hank’s液适当稀释，按每毫升组织培养液含10^3.0EID₅₀或10^3.0TCID₅₀病毒液接种，培养72～96小时，待细胞病变达到70%时，收获细胞培养液，置-20℃以下冻存。

3）半成品检验

①无菌检验分别抽取鸡胚病毒液或细胞病毒培养液，按现行《中国兽药典》附录进行，应无菌生长。

②病毒含量测定

将3个毒种分别用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10^-4、10^-5和10^-63个稀释度，各绒毛尿囊膜上接种10～11日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.2ml，置37℃孵育168小时，计算ELD₅₀，B87和CA-C株每0.2ml病毒含量应≥10^5.0ELD₅₀，CF-C株每0.2ml病毒含量应≥10^4.5EID₅₀。

细胞测定法将B87和CA-C株病毒培养液也可用细胞测定法检测病毒含量。以Hank’s液进行10倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-6、10^-7四个滴度，接种含成纤维细胞悬液的48孔培养板，每孔0.1ml，每个稀释度5孔，同时设立病毒对照4孔，细胞对照4孔，37℃培养观察144小时，计算病毒含量，B87和CA-C株每0.1ml病毒含量应≥10^5.0TCID₅₀。

4）配苗及分装取检验合格的B87、CA-C和CF-C株病毒液按体积1:1:1混合，加适当比例的保护剂，同时加入适量的抗生素充分混匀，定量分装。

5）冻干分装后迅速进行冷冻真空干燥。

3.成品检验

（1）性状淡红色海绵状疏松团块，易于瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。

（2）无菌检验按现行《中国兽药典》（中国兽药典委员会编.中华人民共和国兽药典二○一○年三部.中国农业出版社，2011，本发明以下称现行《中国兽药典》）附录方法进行检验，应无菌生长。

（3）支原体检验按现行《中国兽药典》附录方法进行检验，应无支原体生长。

（4）外源病毒检验按现行《中国兽药典》附录方法进行检验，应符合规定。

（5）鉴别检验将疫苗用生理盐水稀释至1羽份/0.1ml，与等量抗鸡传染性法氏囊病病毒特异性血清混合，37℃中和60分钟，绒毛尿囊膜接种10～11日龄SPF鸡胚5个，每胚0.2ml；同时设病毒对照5个，每胚接种稀释的病毒液0.2ml（含1羽份），同条件观察培养168小时，中和组鸡胚应全部健活，疫苗对照组鸡胚应4/5以上死亡。鸡胚尿囊液对鸡红细胞凝集试验(HA)阴性。

（6）安全检验用7～14日龄SPF鸡20只，其中10只，每只点眼或饮水10个使用剂量的疫苗，另10只不接种作对照，两组隔离饲养。观察21日，均应健活，如有非特异死亡，两组总和不应超过2只，且免疫组死亡数应不超过对照组。

（7）病毒含量测定

1）IBDVB87株病毒含量测定将疫苗用Hank’s液稀释至1羽份/0.5ml，加等量适当稀释的B34单克隆抗体（本发明人制备和保存），室温中和60分钟，作10倍系列稀释，取10^-2、10^-3、10^-4三个稀释度接种48孔细胞板，每个稀释度5孔，每孔0.1ml，37℃培养144小时，观察细胞病变，计算TICD₅₀，每羽份病毒含量应≥10^3.0TCID₅₀。

2）IBDVCA-C株病毒含量测定将疫苗用Hank’s液稀释至1羽份/0.5ml，加等量适当稀释的A49单抗（本发明人制备和保存），室温中和60分钟，作10倍系列稀释，取10^-2、10^-3、10^-4三个稀释度接种48孔细胞板，每个稀释度5孔，每孔0.1ml，37℃培养144小时，观察细胞病变，计算TICD₅₀，每羽份病毒含量应≥10^3.0TCID₅₀。

3）IBDVCF-C株病毒含量测定将疫苗用无菌生理盐水稀释至1羽份/0.5ml，加等量适当稀释的A49和B34单抗（本发明人制备和保存），室温中和60分钟，10倍系列稀释，取10^-1、10^-2、10^-3三个稀释度绒毛尿囊膜接种10～11日龄SPF鸡胚各5个，每胚0.2ml，37℃继续孵育168小时，记录接种后48～168小时死亡且病痕明显的鸡胚，计算ELD₅₀，每羽份病毒含量应≥10^2.0ELD₅₀。

（8）效力检验

用2～4周龄易感雏鸡25只，其中10只，每只点眼或饮水1/10个使用剂量的疫苗，另15只作对照，隔离饲养。免疫后21天，取全部免疫鸡连同对照鸡10只，每只点眼接种法氏囊强毒BC6-85株（含10～100个BID），72小时后剖杀所有鸡，检查法氏囊，攻毒对照组鸡的法氏囊应至少有8只出现病变，免疫组鸡的法氏囊应至少9只无病变，健康对照组鸡的法氏囊均应无任何变化。

（9）剩余水分测定按现行《中国兽药典》附录方法进行测定，应符合规定。

（10）真空度测定按现行《中国兽药典》附录方法进行测定，应符合规定。

4.鸡传染性法氏囊病病毒单克隆抗体

在本发明研究过程中，成功获得针对不同血清亚型的特异性单克隆抗体，可为鸡传染性法氏囊病三价活疫苗的质量提供保障，也可为鸡传染性法氏囊病毒的科学研究奠定物质基础。

（1）鸡传染性法氏囊病病毒单克隆抗体的制备

用纯化的鸡传染性法氏囊病病毒CA-C株和B87株抗原脾内免疫BALB/C小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接ELISA方法进行筛选，选择阳性孔分别进行克隆。通过与其它禽源病毒的交叉试验检测2株杂交瘤细胞的特异性，并进一步通过中和试验，筛选出能稳分泌特异中和IBDV CA-C株和B87株的单克隆抗体的杂交瘤细胞，分别命名为B₃₄和A₄₉，用于疫苗成品质量检验。

（2）鸡传染性法氏囊病病毒单克隆抗体的应用

通过中和试验证明，Mab B₃₄对鸡传染性法氏囊病病毒CA-C株的中和效价细胞上清为1:89，小鼠腹水高达1:420000，对B87株中和效价均<1:10。经10倍稀释后，能等量中和含毒量为10^6.625TCID₅₀/ml的IBDV CA-C株细胞毒。按现行规程规定，鸡传染性法氏囊病病毒活疫苗的病毒含量标准是：不低于10^3.5TCID₅₀/羽份，对于每瓶装量（1ml）1000羽份的疫苗来说，疫苗病毒的总量应不低于10^6.5TCID₅₀/ml。在实际分装时，如果高出标准一个滴度，即为10^7.5TCID₅₀/ml。按照本试验的结果，实际中和时，将疫苗作10倍稀释，即可保证完全被10倍稀释的B₃₄腹水MAb中和。

Mab A₄₉对IBDV B₈₇株的中和抗体效价细胞上清为1:100，小鼠腹水高达和1:11300，对IBDV CA-C株均无中和作用。

5.作用与用途用于预防雏鸡的传染性法氏囊病。

6.用法及用量滴鼻/点眼或饮水免疫。

（1）适用于各品种雏鸡。根据母源抗体水平，应在7～21日龄进行免疫。

（2）按瓶签注明羽份用灭菌生理盐水稀释疫苗。

滴鼻/点眼免疫每只鸡滴鼻/点眼1滴（约0.03ml）。

饮水免疫剂量加倍，其饮水量根据鸡龄大小而定。5～10日龄鸡每只饮水量为5～10ml，20～30日龄鸡为10～20ml，成年鸡为20～30ml。应确保疫苗在2小时内饮完。

本发明涉及的微生物资源信息

本发明涉及的微生物有：鸡传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus）B87株为国内商品化的鸡传染性法氏囊活疫苗生产毒株，购自中国兽医药品监察所；鸡传染性法氏囊病病毒CA株和CF株分别由中国兽医药品监察所从北京市1994年分离鉴定鸡传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）CA94株和1995年分离鉴定CF95株经人工致弱而得到，本发明人将两株毒株通过终点稀释法克隆后，获得较高病毒滴度的克隆株，该两株：鸡传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus）CA-C株和CF-C株已于2013年4月1日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号CA-C株为CGMCC No.7405,CF-C株为CGMCC No.7404。

本发明的积极意义

本发明涉及一种鸡传染性法氏囊病活疫苗及其生产方法。本发明是采用鸡传染性法氏囊病毒血清1型中的3个不同血清亚型的鸡传染性法氏囊病病毒CA-C株、CF-C株和传统B87株作为生产毒株联合制备疫苗，不同毒株之间具有一定的协同免疫作用，能够突破较高水平母源抗体，显著提高鸡群的免疫效果。

附图说明

图1：疫苗制备工艺流程图。

实施例

以下实施例为进一步对本发明进行阐述，但这些实施例不构成对本发明的限制。

实施例1

————疫苗制造

1.材料

（1）鸡传染性法氏囊病病毒B87株病毒含量10^6.38ELD₅₀/0.2ml，由吉林正业生物制品有限责任公司提供。

（2）鸡传染性病法氏囊病病毒CA-C株病毒含量10^6.5ELD₅₀/0.2ml，由北京海淀中海动物保健科技公司提供。

（3）鸡传染性法氏囊病病毒CF-C株病毒含量10^6.5ELD₅₀/0.2ml，北京海淀中海动物保健科技公司提供。

（4）检验用强毒鸡传染性法氏囊病BC6-85强毒株，由中国兽医药品监察所提供。

（5）SPF鸡胚购自广东大华农和北京蓝风家禽养殖有限公司。

2.生产用种毒制备

（1）鸡传染性法氏囊病病毒B87株

1）种毒繁殖将鸡传染性法氏囊病病毒B87株用灭菌生理盐水/或磷酸盐缓冲肉汤稀释至50倍（体积比），经绒毛尿囊膜接种于11日龄SPF鸡胚100个，每胚0.2ml，37℃、65%湿度孵化观察，72h死2个，72～112h死97个，活1个，共收获800g组织，装于无菌容器内剪碎，取样作无菌检验，胚液置-30℃冻存。将检验无菌的鸡胚液冻融2～3次，鸡胚液离心去沉渣，上清液加适量的抗生素混匀分装，置-30℃保存。注明收获日期、毒种代次及装量。经鉴定，符合标准的毒种作为生产用种子。毒种保存在-20℃以下保存，应不超过12个月，毒种继代应不超过3代。

2）无菌检验按现行《中国兽药典》附录方法进行测定，结果为阴性，无菌生长。

3）病毒含量测定将上述种毒液按10^-4、10^-5、10^-6稀释，每个滴度经绒毛尿囊膜接种5个10日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，37℃、65%湿度培养168h，判定病毒含量为10^6.5ELD₅₀/0.2ml，为合格。

4）特异性检验将毒种稀释为10^3.0ELD₅₀/0.1ml，毒种与血清1∶1中和，37℃中和60min，绒毛尿囊膜接种10日龄鸡胚（SPF）每胚0.2ml，中和组5个，对照组5个，37℃、65%湿度孵化观察168h，中和组5/5活，病毒对照组0/5活，判为合格。

5）安全性检验将毒液10倍稀释后点眼接种于7日龄SPF雏鸡10只，0.2ml/只，观察21天。接种后72h剖检各5只，接种鸡和对照鸡法氏囊均无出血、坏死、黄色粘液样等变化。21日时，5/5健活。

6）支原体检验取毒液5ml，接种于改良Frey氏培养基中，移植4次，37℃观察28天，微黄，pH值为7.6，结果为阴性。

7）鸡胚的毒力经绒毛尿囊膜接种11日龄SPF鸡胚20个，每胚，，每胚接种0.2ml含1000个ELD₅₀，观察7天，累计死亡19只，结果合格。

（2）鸡传染性法氏囊病毒CA-C株

1）接种及收获将CA-C株鸡传染性法氏囊病毒用灭菌生理盐水/或磷酸盐缓冲肉汤稀释100倍稀释（体积比），接种于11日龄SPF鸡胚100个，每胚0.2ml，绒毛尿囊膜，放在37℃，65%湿度孵化观察，48h早死12个，56～96h共死86个，活胚2个，共收获800g组织，装于无菌容器内剪碎，取样作无菌检验，胚液置-30℃冻存。将检验无菌的鸡胚液冻融2～3次，鸡胚液离心去沉渣，上清液加适量的抗生素混匀分装，置-30℃保存。注明收获日期、毒种代次及装量。经鉴定，符合标准的毒种作为生产用种子。毒种保存在-20℃以下保存，应不超过12个月，毒种继代应不超过3代。

2）无菌检验按现行《中国兽药典》附录方法进行测定，结果为阴性，无菌生长。

3）病毒含量测定将上述种毒液按10^-4、10^-5、10^-6稀释，每个滴度接种5个10日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，用绒毛尿囊膜接种，37℃、65%湿度培养168h，测得0.2ml含10^6.5ELD₅₀，判定（7天）2010年10月3日检验合格。

4）特异性检验将毒种稀释为10^3.0ELD₅₀/0.1ml，毒种与血清1∶1中和60min，经绒毛尿囊膜接种10日龄鸡胚（SPF）每胚0.2ml，中和组5个，对照组5个，37℃、65%湿度孵化观察168h，中和组5/5活，病毒对照组0/5活，判为合格。

5）安全性检验将毒液10倍稀释后点眼接种7日龄雏鸡（SPF）10只，0.2ml/只，留10只不接种，隔离饲养做对照组，观察21天。接种后72h剖检（5只/组），接种鸡和对照鸡法氏囊均无出血、坏死、黄色粘液样等变化，接种后21日，接种鸡和对照鸡均5/5健活。

6）支原体检验取毒5ml接种于改良Frey氏培养基中，移植4次，观察28天，颜色微黄，pH值为7.6，为阴性合格。

7）鸡胚的毒力11日龄SPF鸡胚20个，每胚经绒毛尿囊膜接种接种0.2ml含病毒1000个ELD₅₀，，，观察7天，累计死亡20个，判为合格。

（3）鸡传染性法氏囊病病毒CF-C株

1)接种及收获将CF-C株鸡传染性法氏囊病病毒液用灭菌生理盐水/或磷酸盐缓冲肉汤稀释100倍稀释（体积比），接种于11日龄鸡胚的绒毛尿囊膜每胚0.2ml，共100个，37℃、65%湿度孵化观察，48h早死11个，56～96h收89个，共收获组织800g，装于无菌容器内剪碎，取样作无菌检验，胚液置-30℃冻存。将检验无菌的鸡胚液冻融2～3次，鸡胚液离心去沉渣，上清液加适量的抗生素混匀分装，置-30℃保存。注明收获日期、毒种代次及装量。经鉴定，符合标准的毒种作为生产用种子。毒种保存在-20℃以下保存，应不超过12个月，毒种继代应不超过3代。

2)无菌检验按现行《中国兽药典》附录方法进行测定，结果为阴性，无菌生长。

3)病毒含量测定将上述种毒液按10^-3、10^-4、10^-5稀释，每个滴度接种5个10日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，用绒毛尿囊膜接种，37℃、65%湿度培养168h，判定病毒含量为10^5.38ELD₅₀/0.2ml，为合格。

4)特异性检验将病毒液稀释为10^3.0ELD₅₀/0.1ml，毒种与血清1：1中和，37℃中和60min，绒毛尿囊膜接种10日龄鸡胚（SPF）每胚0.2ml，中和组5个，对照组5个，37℃、65%湿度孵化观察168h，中和组5/5活，病毒对照组0/5活，判为合格。

5)安全性检验将病毒液10倍稀释后点眼接种7日龄SPF雏鸡10只，0.2ml/只，，留10只不接种做对照组，隔离饲养，观察21天。接种后72h剖检（5只/组），接种鸡和对照鸡法氏囊均无出血、坏死、黄色粘液样等变化。21天观察期内，接种鸡和对照鸡均5/5健活。

6)支原体检验将5ml毒种接种于改良Frey氏培养基中，移植4次，37℃观察28天，微黄，pH值为7.6，阴性为合格。

7)鸡胚的毒力经绒毛尿囊膜接种11日龄SPF鸡胚鸡胚20个，每胚接种0.2ml含1000个ELD₅₀，观察7天，累计死亡20只，剖检胎儿全身水肿，脑部充血，肝有斑驳状病变，心脏呈熟肉状灰白色。结果为合格。

3.病毒液制备

（1）鸡传染性法氏囊病B87株

1)接种及收获将毒种用灭菌生理盐水/或磷酸盐缓冲肉汤稀释进行100倍稀释（体积比），尿囊腔接种3300枚11日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml。置37℃、65%湿度孵化观察48～96h，48h早死胚为111枚，弃去。48～96h收获3189枚鸡胚，收获组织为27730g，装于无菌容器内剪碎，置-20℃以下冻存。冻融2～3次后经离心或过滤去掉沉渣，上清保存于-20℃以下待检。

2)无菌检验取样进行无菌检验，结果无细菌、霉菌生长。

3)病毒含量测定将病毒液进行10倍系列稀释至10^-6，取10^-4、10^-5、10^-6三个稀释度分别绒毛尿囊膜接种10日龄SPF鸡胚各5枚，每胚0.2ml，37℃、65%湿度观察168h，该批病毒含量为10^6.4ELD₅₀/0.2ml，判定为合格。

（2）鸡传染性法氏囊病CA-C株病毒液的制备

1)接种及收获将毒种用灭菌生理盐水/或磷酸盐缓冲肉汤稀释200倍稀释（体积比），尿囊腔接种11日龄SPF鸡胚3000枚，每胚0.1ml，37℃、65%湿度孵化观察48～96h。48h早死胚为79枚，弃去不用。48～96h收获2921枚鸡胚于4℃冷库过夜，收获组织为26080g，标记为1024批，装于无菌容器内剪碎，置-20℃以下冻存，标记为1024批。冻融2～3次后经离心或过滤去掉沉渣，上清保存于-20℃以下待检。2)无菌检验取样进行无菌检验，均无细菌、霉菌生长。

3)病毒含量测定取样，将病毒液进行10倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-6三个稀释度，分别绒毛尿囊膜接种10日龄SPF鸡胚各5枚，每胚0.2ml，37℃、65%湿度观察168h，该批病毒含量为10^6.5ELD₅₀/0.2ml，判定为合格。

（3）鸡传染性法氏囊病毒CF-C株病毒液的制备

1)接种及收获将毒种用灭菌生理盐水/或磷酸盐缓冲肉汤稀释进行200倍稀释（体积比），绒毛尿囊膜接种11日龄SPF鸡胚3000枚，每胚0.2ml。37℃、65%湿度孵化观察48～96h，48h早死胚为66枚，弃去不用。48～96h收获2934枚于4℃冷库过夜，收获鸡胚组织26240g，标记为1029批，装于无菌容器内剪碎，置-20℃以下冻存，。冻融2～3次后经离心或过滤去掉沉渣，上清保存于-20℃以下待检。

2)无菌检验取样进行无菌检验，无细菌、霉菌生长。

3)病毒含量测定将病毒液进行10倍系列稀释，取10^-3、10^-4、10^-5三个稀释度，分别绒毛尿囊膜接种10日龄SPF鸡胚各5个，每胚0.2ml，37℃、65%湿度观察168h，该批病毒含量为10^4.8ELD₅₀/0.2ml，判定为合格。

4.配苗和分装冻干（1）配苗将检验合格并用用灭菌生理盐水/或磷酸盐缓冲肉汤分别稀释的B87株、CA-C株和CF-C株半成品，其病毒含量分别为：B87株10^6.4ELD₅₀/0.2ml、CA-C株10^6.5ELD₅₀/0.2ml、CF-C株10^4.8ELD₅₀/0.2ml，将其三种病毒液按比例混合配苗，共13000ml，加入6500ml5%蔗糖脱脂牛奶，共19500ml，加入一定量双抗。

（2）分装冻干经灌装加塞机分装，3ml/瓶，后送入真空冷冻干燥机冻干而成。

实施例2

————成品检验（实施例制备的疫苗，批号为01批）

1.性状疫苗为淡红色海绵状疏松团块，易于瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。

2.无菌检验疫苗按现行《中国兽药典》附录进行，无细菌、霉菌生长。

3.支原体检验疫苗按现行《中国兽药典》附录进行，无支原体生长。

4.外源病毒检验疫苗按现行《中国兽药典》附录进行检验，无外源病毒污染。

5.鉴别检验将疫苗稀释至1羽份/0.1ml，与等量抗鸡传染性法氏囊病毒特异血清混合，37℃中和60min，绒毛尿囊膜接种10～11日龄SPF鸡胚5个，每胚0.2ml；同时设疫苗毒对照5个，每胚接种稀释的疫苗毒液0.2ml（含1羽份），同条件观察培养168小时，中和组鸡胚全部健活，疫苗毒对照组鸡胚4/5以上死亡。鸡胚尿囊液对鸡红细胞凝集试验(HA)阴性。

6.安全检验将01批疫苗稀释为10羽份/0.1ml，接种14日龄SPF鸡10只，0.1ml/只，另10只不接种作为对照，隔离饲养，观察21日，均健活。

7.病毒含量测定

（1）IBDV B87株稀释的疫苗加等量B34单抗，室温中和60min，进行10倍系列稀释，取10^-2、10^-3、10^-4、10^-5四个稀释度接种48孔细胞板各5孔，每孔0.1ml，37℃培养观察6天，根据细胞病变计算TCID₅₀，疫苗每羽份病毒含量为10^4.2TCID₅₀、10^4.9TCID₅₀、10^4.5TCID₅₀/0.1ml。

（2）IBDV CA-C株稀释的疫苗加等量A49单抗，室温中和60min，进行10倍系列稀释，取10^-2、10^-3、10^-4、10^-5四个稀释度接种48孔细胞板各5孔，每孔0.1ml，37℃培养观察6天，根据细胞病变计算TCID₅₀，疫苗每羽份的病毒含量为10^4.6TCID₅₀/0.1ml。

（3）IBDV CF-C株稀释的疫苗加等量A49和B34单抗混合液，室温中和60min，进行10倍系列稀释，取10^-1、10^-2、10^-3稀释度绒毛尿囊膜接种10～11日龄SPF鸡胚各5个，每胚0.2ml，37℃孵育168小时，计算ELD₅₀，01批疫苗每羽份病毒含量为10^2.5ELD₅₀/0.1ml。

8.效力检验取14日SPF鸡60只，分为6组，每组10只，其中5组每只鸡经点眼分别接种1/10个使用剂量的01批疫苗，另10只作对照，隔离饲养。免疫后21天，取全部免疫鸡连同对照鸡10只，每只点眼接种10个BID BC6-85强毒株，72小时后剖杀所有鸡，检查法氏囊，攻毒对照组法氏囊病变100%；疫苗免疫组100%保护。

9.剩余水分测定按现行《中国兽药典》附录进行，抽检的4瓶疫苗剩余水分分别为2.34%、1.96%、2.24%、2.08%。

10.真空度测定按现行《中国兽药典》附录进行，80/80出现紫色辉光。

实施例3

————临床试验

本发明人用鸡传染性法氏囊病三价活疫苗（B87株+CA-C株+CF-C株）3批中试产品进行了临床试验。试验共免疫农大三号蛋鸡16000多只，罗斯（Ross）308肉鸡18000只。试验疫苗经推荐剂量、超剂量（10倍推荐剂量）接种蛋鸡和肉鸡后，均没有观察到因疫苗引起的不良反应。超剂量接种后14日，随机取蛋鸡和肉鸡进行剖检，观察法氏囊、肝脏、肾脏、脾脏、腺胃、肌胃、胸、腿和翼部肌肉，除法氏囊有轻度萎缩外，其他器官和肌肉均无肉眼可见鸡传染性法氏囊病引起的病理变化。使用剂量和1/2使用剂量免疫肉鸡和蛋鸡后14天，用强毒BC6-85株（100～1000个BID）进行攻击，其平均保护率达80%以上；商品蛋鸡免疫后90天其ELISA抗体阳性率仍在90%以上。

实施例4

————与同类产品比较试验

1.免疫保护力试验

疫苗毒株之间具有一定的免疫协同作用，三价苗免疫14日龄SPF鸡后产生的抗体水平显著高于B87株疫苗，对商品鸡的免疫效力高于国内外同类产品。鸡传染性法氏囊病三价活疫苗（B87株+CA-C株+CF-C株，批号0101批）、国内商品化的鸡传染性法氏囊病活疫苗（B87株，批号0305批）和国外商品化的鸡传染性法氏囊病中等偏强毒力活疫苗（2512株，批号IBD1505批）分别免疫14日龄SPF鸡和10日龄商品黄羽肉鸡，免疫后21天采血同时用BC6-85株（100个BID）攻毒。结果表明，三种疫苗免疫SPF鸡后攻毒均100%保护，免疫鸡的ELISA抗体水平几何平均滴度分别为4892、2831和4200，详细结果见表1；而商品肉鸡免疫后21天攻毒，三种疫苗的免疫保护率分别为90%、0和70%，详细结果见表2。

表1三种疫苗免疫SPF鸡后的攻毒保护结果和血清ELISA抗体水平

注：a“++++”、“+++”、“++”、“+”和“—”指法氏囊肉眼病变的程度，“++++”表示法氏囊严重水肿，有淡黄色胶冻样渗出液，“+++”、“++”、“+”表示病变程度逐渐减轻，“—”表示法氏囊质地柔软，色泽粉嫩，无肉眼可见病变；b抗体滴度>394判为阳性。（下表同）

表2三种疫苗免疫黄羽肉鸡后的攻毒保护结果和血清ELISA抗体水平

2.能突破较高母源抗体

由表2可以看出，三价苗免疫母源抗体水平不一的商品鸡后所产生的免疫保护效果明显高于中等毒力B87株疫苗和中等偏强毒力2512株疫苗。

3.安全性与同类产品无显著差异

超剂量安全性试验结果三种疫苗用10倍剂量免疫SPF鸡和商品黄羽肉鸡后，在观察期内均没有出现因疫苗引起的不良反应，免疫鸡的食欲、精神均正常。21天剖检时，0101批和09IBD1505批疫苗免疫的SPF鸡法氏囊明显小于正常对照组，而0305批疫苗免疫的SPF鸡法氏囊比正常组稍小，但免疫组鸡法氏囊的色泽弹性与对照组没有明显差异；三种疫苗免疫的商品黄羽肉鸡的法氏囊与正常对照鸡的法氏囊没有差异。

Claims (4)

1.一种鸡传染性法氏囊病活疫苗，其特征在于该活疫苗含有鸡传染性法氏囊病病毒B87株、CA-C株、CF-C株的三价活疫苗，其中鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal diseasevirus)CA-C株和鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus)CF-C株病毒已于2013年4月1日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号CA-C株为CGMCC No.7405，CF-C株为CGMCC No.7404。

2.权利要求1所述一种鸡传染性法氏囊病活疫苗的制备方法，其特征在于：

(1)鸡胚的接种与收获用灭菌生理盐水/或磷酸盐缓冲肉汤将三株生产用毒种分别稀释至含1000～10000EID₅₀/0.1ml；将稀释的B87和CA-C株病毒液经尿囊腔、CF-C株经绒毛尿囊膜分别接种10～11日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，置37℃孵育至96小时，弃去48小时前死胚；分别分组收取48～96小时死胚及96小时存活胚胎儿及尿囊膜，装于无菌容器内剪碎，置-20℃以下冻存；冻融2～3次后经离心或过滤去掉沉渣，其上清分别为制苗用B87、CA-C和CF-C株半成品；将经无菌检验和病毒含量测定合格的B87、CA-C和CF-C株半成品用灭菌生理盐水/或磷酸盐缓冲肉汤分别稀释，使病毒含量B87株应≥10^5.0ELD₅₀/0.2ml和CA-C株应≥10^5.0ELD₅₀/0.2ml，CF-C株应≥10^4.5EID₅₀/0.2ml；

(2)配苗及分装取经过检验合格的三种病毒液按体积比1∶1∶1混合，加入常用冻干保护剂和抗生素经充分混匀，定量分装，分装后迅速进行冷冻真空干燥。

3.如权利要求2所述的一种鸡传染性法氏囊病活疫苗的制备方法，其特征在于IBDVB87株可采用接种CEF细胞生产，方法为：取9～10日龄SPF鸡胚制备成纤维细胞，将B87株生产用毒种用Hank’s液稀释，按10^3.0EID₅₀/ml接种，培养72～96小时，待细胞病变达到70％时，收获细胞培养液，经检验。

4.如权利要求2所述的一种鸡传染性法氏囊病活疫苗的制备方法，其特征在于IBDVCA-C株也可采用接种CEF细胞生产，方法为：取9～10日龄SPF鸡胚制备成纤维细胞，将CA-C株生产用毒种用Hank’s液适当稀释，按10^3.0TCID₅₀/ml病毒液接种，培养72～96小时，待细胞病变达到70％时，收获细胞培养液，经检验。