CN109207437A - 一株i群8型禽腺病毒毒株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体公开了一株I群8型禽腺病毒毒株及其应用。所述I群8型禽腺病毒毒株ZMYTAV‑8株，保藏编号为CGMCC No.14297。其具有产毒量高，免疫原性好的特点。可以有效预防由血清8型禽腺病毒引起的鸡类“包涵体肝炎”，因此，本发明还提供了所述I群8型禽腺病毒毒株ZMYTAV‑8株在制备预防包涵体肝炎的药物上的应用。进一步地，本发明提供一种禽腺病毒血清4型、血清8型的二价灭活疫苗，用于预防心包积液－肝炎综合征和包涵体肝炎。该疫苗具有良好的免疫原性，能够很好的预防近年流行的“包涵体肝炎”和“心包积液‑肝炎综合症”等由腺病毒引起的禽类疾病，对地方分离株具有100％的保护率，同时安全性高、抗体产生快、效力稳定。

Description

一株I群8型禽腺病毒毒株及其应用

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体涉及一株I群8型禽腺病毒毒株及其在一种病毒血清4型和血清8型的二价灭活疫苗中的应用。

背景技术

禽腺病毒可分为A、B、C、D、E5个种和12个血清型，可引起鸡、鸭、鹅等多种家禽或野禽多种病症，主要临床表现包括心包积液、包涵体肝炎、再生障碍性贫血、出血、轻度呼吸道疾病和产蛋量减少等。

禽腺病毒对外界环境具有很强的抵抗力，其复杂的传播方式使其近年来快速传播与流行，给国内家禽养殖业造成较大的影响和损失。尤其在2014年以来，其影响范围持续扩大，河南、山东、江苏、河北、安徽、湖北、辽宁等周边省份的鸡群陆续有地方流行病例的报道。本病毒传播速度快，发病急，死亡率高，给当地鸡群健康造成严重威胁。其中包涵体肝炎和心包积液－肝炎综合征影响最为严重。

包涵体肝炎，主要由血清8型禽腺病毒引起，常见于3～8周龄的鸡，主要感染肉仔鸡及育雏、育成阶段的蛋鸡或种鸡。潜伏期短，感染本病的鸡群初期见不到明显症状，个别鸡会突然死亡，死亡率急剧上升，并在第3～4d达到顶峰，通常第6～7d返回到正常范围内，总体死亡率通常在10％以下，但有时可达到30％。少数鸡表现出精神沉郁、食欲不振、嗜睡等症状，部分鸡只鸡冠褪色，颜面苍白，皮肤呈黄色，皮下出血并可在骨骼肌中观察到瘀血和条纹状出血。本病的特征性病理变化在肝脏，表现为肝脏褪色呈淡褐色至黄色，质脆易碎，肿胀、呈脂肪变性，表面有不同程度的出血点或出血斑，伴发局灶性坏死，在肝细胞核内可见嗜碱性或嗜酸性的包涵体，边缘较大而清晰，呈圆形或形状不规则。肾脏肿大、出血。

心包积液－肝炎综合征，由血清4型禽腺病毒引起，其典型症状是3～5周龄肉鸡突然死亡，并伴有心包积液和肝炎，因此而得名。本病主要发生于3～5周龄的肉鸡，肉杂鸡、麻鸡、种鸡和蛋鸡亦可在相似日龄段发病，死亡率在10％～80％不等，一般在30％左右。急性发病死亡临床症状不典型，个别鸡会出现腹泻，排黄色稀粪，很快达到死亡高峰，维持1～2周死亡逐渐下降；产蛋鸡特别是产蛋高峰期也有发病的病例，死亡率一般不超过10％，但可引起产蛋率10％～30％的下降。肉眼可见的主要病变表现为：心包腔中积聚5～20mL不等的淡黄色清亮水样或果冻样液体，肝脏颜色变浅，局灶性坏死，肺水肿充血，肾脏苍白、肿大、出血等。最特征性的组织学病变是肝脏，肝细胞坏死，伴随肝细胞出现嗜碱性核包涵体及出血，肺叶间隔有明显水肿。

虽然包涵体肝炎和心包积液-肝炎综合征引起的病症在病理组织变化上十分相似，但引起这两种病症的病毒在血清型上并不相同，且在流行规律和病变特征上存在差异，故防治上应区别对待，不可混为一谈。同时也有研究表明，禽腺病毒不同血清型之间交叉保护较弱而造成疫苗不对型，保护效果不好，故疫苗研制的关键在于结合疫苗使用地区所流行的禽腺病毒血清型研制相对应的产品，做好对型的防控至关重要。到目前为止，尚无商品化的禽腺病毒血清4、血清8型的二价灭活疫苗。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一株I群8 型禽腺病毒毒株及其在一种禽腺病毒血清4型和血清8型的二价灭活疫苗中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明首先提供一种禽腺病毒血清8型ZMYTAV-8株，经鉴定为禽腺病毒8型，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏日期为2017年6月19日，保藏号为：CGMCC No.14297。

该禽腺病毒血清8型ZMYTAV-8株，为自然分离株，并经过蚀斑纯化筛选所获得，具有产毒量高，免疫原性好的特点。可以有效预防由血清8型禽腺病毒引起的鸡类“包涵体肝炎”。

因此，本发明还提供了所述I群8型禽腺病毒毒株ZMYTAV-8株在制备预防包涵体肝炎的药物上的应用。

进一步地，本发明提供一种禽腺病毒血清4型、血清8型的二价灭活疫苗，用于预防心包积液－肝炎综合征和包涵体肝炎。该二价灭活疫苗含有分离自禽腺病毒感染组织样品的禽腺病毒血清4型毒株和禽腺病毒血清8型ZMYTAV-8株。

作为优选，所述禽腺病毒血清4型毒株和禽腺病毒血清8型 ZMYTAV-8株的病毒量体积比为1∶1。

更为优选，其中，所述禽腺病毒血清4型毒株为禽腺病毒血清4 型ZMXZAV-4株，禽腺病毒4型，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏日期为2017年6月19 日，保藏号为：CGMCC No.14296。

该疫苗禽腺病毒血清4型ZMXZAV-4株是由中牧研究院分离的流行性强毒株，且经过纯化，细胞适应性强，免疫原性强，对心包积液综合症具有良好的保护性。

本发明还提供了所述二价灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：

1)油相制备：

取矿物油95份，硬脂酸铝1份，在油相制备管中混合均匀并加热至75-85℃后，再加5份司本80，至温度达到110-120℃时维持20-40分钟，冷却后完成油相制备；

2)水相制备：

将血清4型ZMXZAV-4株与血清8型ZMYTAV-8株分别接种LMH 细胞，待细胞发生80％病变后，收获培养物为病毒液；

将灭活的禽腺病毒血清4型病毒液、禽腺病毒血清8型病毒液混合；取混合抗原液95份灭菌的5份吐温80，充分混匀；

3)乳化：

取2份油相，1份水相，放入乳化罐中搅拌，即得。

作为优选，所述制备方法包括如下步骤：

1)油相制备：

取矿物油95份，硬脂酸铝1份，在油相制备管中混合均匀并加热至80℃后，再加5份司本80，至温度达到115℃时维持30分钟，冷却后完成油相制备；

2)水相制备：

将灭活的禽腺病毒血清4型病毒液、禽腺病毒血清8型病毒液混合；取混合抗原液95份灭菌的5份吐温80，充分混匀；

3)乳化：

取2份油相，1份水相，放入乳化罐中，3500r/min搅拌30分钟，即得。

进一步地，病毒的灭活采用甲醛灭活。

本发明涉及到的原料或试剂如无特殊说明均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

本发明的有益效果在于：

(1)使用毒株为从分离鉴定的流行毒株中筛选出的免疫原性好、增殖滴度高的病毒株作为禽腺病毒二价灭活疫苗制苗毒株，通过最佳接种剂量、最适收获时间等培养条件的优化，培育出效价稳定的血清 4型、血清8型禽腺病毒；(2)同时对鸡包涵体肝炎、心包积液-肝炎综合征具有预防作用；(3)对疫苗的生产工艺、安全性、保护效果、免疫程序和有效期研究表明该疫苗安全性好，免疫效果稳定，免疫持续期长；(4)使用灭活病毒制成，安全性好。

附图说明

图1为不同代次ZMXZAV-4株hexon基因序列比较；

图2为不同代次ZMYTAV-8株hexon基因序列比较。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 毒株分离与筛选

1.禽腺病毒毒株分离与鉴定

本发明人自2014年以来，在辽宁、山东、河南、江苏等地收集多份疑似禽腺病毒感染组织样品，患病鸡只主要表观剖检病变：可见心包腔中积聚约5～10mL不等的淡黄色清亮水样或胶冻样液体；肝脏颜色较浅，有局部坏死性病灶，肾脏苍白、肿大、出血等。

采集出现典型症状和病理变化的病鸡肝脏、脾脏组织，剪碎研磨，称重量后分别按照1∶3的重量比加入灭菌的PBS，4℃、 6000r/min离心10min，4℃、8000r/min离心10min，取上清液转入另一无菌1.5mL离心管中，加入双抗(终浓度为青霉素2000IU/mL，链霉素2mg/mL)，37℃作用1h，经卵黄囊接种5日龄SPF鸡胚各5枚， 0.2mL/枚。弃去24h内死亡的鸡胚，以后每隔6h观察1次，收取死亡鸡胚的尿囊液及胚体，至216小时取出所有鸡胚尿囊液及胚体，组织捣碎，用含青链霉素的无菌PBS做2倍稀释，留样检测，病毒分离物置于-70℃保存。

2.PCR扩增鉴定

取分离毒接种鸡胚后的尿囊液，按常规方法进行病毒基因组DNA 的提取。进行PCR检测，扩增hexon基因。在紫外灯照射下切取特异性条带，并用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化。连接并转化于大肠杆菌感受态细胞。将阳性样品进行hexon基因测序，并进行遗传进化分析。

同时，样品进行纯净度检测，利用本实验室已建立的PCR， RT-PCR等检测方法，对分离毒株中是否含其他常见杂病毒进行检测。检测项目包括禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、马立克病毒(MDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、减蛋综合症病毒(EDSV)、禽痘病毒(Aviposvirus)、呼肠孤病毒(ARV)等。

按常规方法配制不同浓度(0.8％～2％)的鸡、鸭和大鼠红细胞。检测分离毒株是否具有凝集这些红细胞的特性。同时设减蛋综合症病毒(EDSV-76)为凝集反应阳性对照。结果显示，分离病毒均不具有凝集鸡、鸭和大鼠红细胞的能力，即使改变不同红细胞的浓度也不能使之凝集。减蛋综合症病毒能够凝集鸡、鸭的红细胞，但不能使大鼠的红细胞发生凝集现象。

病毒滴度测定，将分离到的病毒液在离心管中用DMEM将病毒液作连续10倍的稀释，从10^-5～10^-10。将稀释好的病毒接种到长势良好的LMH细胞96孔培养板中，每一稀释度接种8孔，每孔接种100μl；同时设病毒阳性对照孔和细胞阴性对照孔，37℃、5％CO₂培养箱吸附2小时后加入细胞维持液，继续培养168小时，观察细胞病变，出现细胞病变者判为阳性，按Reed-Muench法计算TCID₅₀。

将以上初步分离及鉴定的病毒液，根据纯净性，稳定性，及在增殖能力，筛选出1株2014年分离自河南的禽腺病毒血清4型病毒，命名为ZMXZAV-4株；1株2015年分离自山东的禽腺病毒血清8型病毒，命名为ZMYTAV-8株。

病毒纯化，将ZMXZAV-4株，ZMYTAV-8株病毒液分别在离心管中用DMEM将病毒液作连续10倍的稀释，从10^-5～10^-9，将稀释好的病毒接种到长势良好的LMH细胞6孔培养板中，每孔接种1mL；同时设病毒阳性对照孔和细胞阴性对照孔，37℃、5％CO₂培养箱吸附2小时后，弃去病毒液，加入细胞维持液，加入含1％低熔点琼脂糖的DMEM培养液，待细胞孔出现单个蚀斑，挑取单个蚀斑接种新的空白LMH细胞，进行病毒增殖，如此重复克隆三次。测定第四次挑选的是蚀斑毒病毒含量，各挑选蚀斑毒五株，测定病毒含量，分别挑选病毒含量最高的两株毒，作为基础种毒F1代，并通过LMH细胞连续传代至15代。

实施例2 ZMXZAV-4株，ZMYTAV-8株鉴定及性质

1.无菌检验

按照现行《中国兽药典》附录进行检验，ZMXZAV-4株， ZMYTAV-8株F1代种毒样品分别接种后，无菌生长。

2.病毒含量测定

将ZMXZAV-4株，ZMYTAV-8株F1、F5、F10、F15代病毒液 10倍系列稀释后，取10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10六个稀释度，分别接种长势良好的LMH细胞96孔培养板，置37℃、5％CO₂孵育 2小时后，加入维持液，继续培养168小时。168小时后，逐孔观察细胞病变，以接种细胞出现典型病变判为感染，按Reed-Muench方法计算病毒含量。结果表明ZMXZAV-4株各代病毒液的病毒含量均≥ 10^7.5TCID₅₀/0.1mL，ZMYTAV-8株各代病毒液的病毒含量均≥10^6.5TCID₅₀/0.1mL。

3.ZMXZAV-4株，ZMYTAV-8株稳定性评价

分别对ZMXZAV-4株，ZMYTAV-8株F1、F5、F10、F15病毒液进行病毒滴度测定，结果表明ZMXZAV-4株每0.1mL病毒液均≥10^7.50 TCID₅₀，ZMYTAV-8株每0.1mL病毒液均≥10^6.50TCID₅₀。并分别对 hexon基因进行测定，对序列进行比较，结果见图1、2。

4.外源病毒检测

分别将ZMXZAV-4株，ZMYTAV-8株收获的病毒液用无菌PBS稀释至10⁴TCID₅₀/0.1mL，0.2％甲醛灭活后，以颈部皮下进行接种，每只鸡接种0.2mL，21天后，按上述方法和剂量重复接种1次。第1次接种后42日采血分离血清，分别使用血凝抑制(HI)、琼扩(AGP)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、中和试验(VN)、免疫荧光(IFA)等方法，检测血清中鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡马立克病毒 (MDV)、鸡新城疫病毒(NDV)、禽网状内皮组织增殖症病毒(REV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、禽流感病毒(AIV)、禽白血病病毒 (ILV)、鸡传染性喉气管炎病毒(LTV)、禽脑脊髓炎病毒(AEV)、鸡痘病毒(POX)的抗体阳性率。血清中除检测到禽腺病毒抗体外，无其它病毒抗体，证明种毒纯净，无其它外源病毒的污染。使用SPF 鸡进行实验，结果可靠。

表1外源病毒血清学检验结果

5.ZMXZAV-4株，ZMYTAV-8株毒力测定

(1)致细胞病变作用

分别将ZMXZAV-4株，ZMYTAV-8株F1、F5、F10、F15代病毒液，接种于单层LMH细胞，接种量为0.1％，置37℃，5％CO₂培养，接种后每6小时观察一次，观察至168小时，记录细胞病变，结果显示ZMXZAV-4株，接种后48小时逐渐开始出现细胞病变，接种72小时后，约有80％细胞崩解。ZMYTAV-8株，72小时逐渐开始出现细胞病变，接种96小时后，约有80％细胞崩解。

(2)对SPF鸡致病力

将25只14日龄SPF鸡随机分成3组，其中两组每组10只，分别经肌肉接种ZMXZAV-4株，ZMYTAV-8株病毒液，每只0.2mL (10^6.0TCID₅₀/0.1mL)，另一组5只，相同途径接种等量的灭菌生理盐水做为正常对照组。接种后每天观察各组鸡只临床表现，对病死鸡进行剖检，并记录死亡数量及病理变化。

ZMXZAV-4株组接种后1天鸡只开始发病，2-4天达到死亡高峰，鸡群发病率、发病率均达到100％，病鸡羽毛蓬松，采食减少，扎堆，精神萎靡。剖检可见心包积液明显，心包腔中积聚5～15mL不等的淡黄色清亮水样或果冻样液体。肝脏肿大、质脆，外观呈浅黄至深黄色，并有坏死灶。肾脏肿大。腺胃乳头出血，腺胃与肌胃交界处出血尤为明显。

ZMYTAV-8株组接种后3天鸡只开始发病，发病鸡只精神沉郁，羽毛散乱，并在第4天出现死亡，接种后第6～7天存活鸡只返回到正常状态，发病率达到40％。病死鸡剖检可见肝脏呈土黄色，肿胀、质脆易碎，肾脏肿大、有尿酸盐沉积。

表2禽腺病毒血清4、8型对14日龄SPF鸡的致病性试验

实施例3 ZMXZAV-4株，ZMYTAV-8株毒种制备

1.最适接种量

将ZMXZAV-4株，ZMYTAV-8株种毒分别按照1∶100、1:1000、 1:10000接种于长势良好的单层LMH细胞上，每个样品重复3次，置37℃，5％CO₂培养，观察细胞病变，当80％以上的细胞病变后，收获病毒液，反复冻融2次后，采用real-time PCR方法测定培养物中病毒颗粒，选取浓度最高者确定最佳接种剂量。

2.最佳收获时间

根据最佳接种剂量试验结果，选择最佳接种剂量，接种于长势良好的单层LMH细胞上，分别在接毒后24、48、72、96、120、144、 168、192小时后，冻融3次，收集细胞培养物，采用real-time PCR 方法测定培养物中病毒颗粒，选取浓度最高者确定最佳收获时间。

根据比较试验，确定最佳接种量及最佳收获时间。

实施例4 抗原制备及半成品检验

1.生产用毒种的制备

(1)ZMXZAV-4株抗原制备

选取长势良好的LMH细胞，弃掉原培养液，加入含有1％毒种的细胞维持液，置于37℃，5％CO₂培养，当细胞病变达80％以上时，冻融2次，收获病毒液，分装注明毒种代次及收获时间等，并留样进行检测。

待检样品根据现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，支原体检验，外源病毒检验，应无细菌、真菌、支原体、外源病毒污染，并且灭活前病毒含量每0.1mL病毒液含量应≥10^7.5TCID₅₀。收获的病毒液灭活前置2～8℃保存，应不超过3日。

(2)ZMYTAV-8株抗原制备

选取长势良好的LMH细胞，弃掉原培养液，加入含有1％毒种的细胞维持液，置于37℃，5％CO₂培养，当细胞病变达80％以上时，冻融2次，收获病毒液，分装注明毒种代次及收获时间等，并留样进行检测。

待检样品根据现行《中国兽药典》附录进行无菌检验，支原体检验，外源病毒检验，应无细菌、真菌、支原体、外源病毒污染，并且灭活前病毒含量每0.1mL病毒液含量应≥10^6.5TCID₅₀。收获的病毒液灭活前置2～8℃保存，应不超过3日。

ZMXZAV-4株，ZMYTAV-8株病毒培养液用最终含量为0.2％的甲醛，37℃灭活24小时。灭活完成后取样做无菌检验及灭活检验，置2～8℃保存，应不超过7日。

2.半成品检验

(1)无菌检验，按现行《中国兽药典》附录，对灭活后的 ZMXZAV-4株，ZMYTAV-8株进行无菌检验，应无菌生长。

(2)灭活检验检

取3批灭活病毒培养液，按1％接种长势良好的LMH细胞24孔培养板中，37℃培养、5％CO₂，每12小时观察一次，观察至168小时，其后盲传1代，检测样品孔应均不出现细胞病变，判定为灭活完全。

实施例5 疫苗制备及检验

1.疫苗制备

(1)油相制备：取矿物油95份，硬脂酸铝1份，在油相制备管中混合均匀并加热至80℃后，再加5份司本80，至温度达到115℃时维持30分钟，冷却后完成油相制备；

(2)水相制备：

将血清4型毒株与血清8型ZMYTAV-8株分别接种LMH细胞，待细胞发生80％病变后，收获培养物为病毒液；

将灭活的禽腺病毒血清4型病毒液、禽腺病毒血清8型病毒液以 1∶1混合；取混合抗原液95份，灭菌的5份吐温80，充分混匀；

(3)乳化，取2份油相，1份水相，放入乳化罐中，3500r/min 搅拌5分钟，8000r/min搅拌15分钟，完成乳化制备。

(4)定量分装，加盖密封，并贴标签，置2～8℃保存。

2.疫苗的安全试验

(1)最小使用日龄不同途径一次单剂量接种安全试验

将70只7日龄SPF鸡分成4组，1～3组免疫组各为20只，第4 组对照组10只，1～3组免疫组每组再分成两小组各10只SPF鸡，通过不同的免疫途径(肌肉注射或颈部皮下注射)分别接种禽腺病毒4、血清8型二价灭活疫苗，sy20160301、sy20160302、sy20160303，剂量为0.5mL/只；对照组10只颈部皮下注射0.5mL/只灭菌生理盐水。各组鸡在同条件下分别饲养管理，连续观察14日；如有死亡，将死亡的鸡逐一剖检，观察内脏有无病变；观察活鸡有无不良反应。14 天将存活的鸡全部剖杀，观察内脏有无病变。

最小使用日龄不同途径单剂量接种的安全试验，结果见表3。

表3最小使用日龄不同途径单剂量接种的安全试验结果

(2)单剂量重复接种安全性试验

将40只14日龄SPF鸡分成4组，每10只，通过颈部皮下注射禽腺病毒4、血清8型二价灭活疫苗，sy20160301、sy20160302、 sy20160303，剂量为0.5mL/只；对照组10只颈部皮下注射0.5mL/只灭菌生理盐水。在同条件下饲养管理，连续观察14日；观察鸡只有无不良反应，如有死亡，将死亡的鸡逐一剖检，观察内脏有无病变。于第一次免疫后14天再以同样剂量重复接种，继续观察14天，观察鸡只有无不良反应，如有死亡，将死亡的鸡逐一剖检，观察内脏有无病变。对鸡只的局部炎症、组织病变等进行评判。第二次免疫后14 天将存活的鸡全部剖杀，观察内脏有无病变。

单剂量重复接种安全性试验，结果见表4。

表4单剂量重复接种的安全性试验结果

(3)一次超剂量接种安全性试验

将40只14日龄SPF鸡分成4组，每10只，通过颈部皮下注射禽腺病毒4、血清8型二价灭活疫苗，sy20160301、sy20160302、 sy20160303，剂量为2.0mL/只；对照组10只颈部皮下注射2.0mL/只灭菌生理盐水。在同条件下饲养管理，连续观察14日，将存活的鸡全部剖杀，观察内脏有无病变。

超剂量接种的安全性试验，结果见表5。

表5超剂量接种的安全性试验结果

3.疫苗效力试验

取14日龄SPF鸡80只，分成8组，每10只，1～6组分别颈部皮下接种3批禽腺病毒4、血清8型二价灭活疫苗(批号为： sy20160301、sy20160302、sy20160303)，每只0.5mL。同时设非免疫攻毒对照组，颈部皮下注射0.5mL/只灭菌生理盐水。于免疫后14 天采集血清，用琼扩方法检测抗体，并分别肌肉注射10^6.0TCID₅₀的禽腺病毒血清4型ZMXZAV-4株，和禽腺病毒血清8型ZMYTAV-8 株，连续观察14日。如有死亡，对死亡鸡只进行剖检，攻毒14后将全部存活鸡只逐一剖检，观察内脏有无病变。

免疫效力试验，结果见表6。

表6免疫效力检验结果

4.免疫产生期与持续期试验

将3批禽腺病毒4、血清8型二价灭活疫苗，接种免疫14日龄 SPF鸡，每只0.5mL，同时分别设立禽腺病毒血清4型，禽腺病毒8 型攻毒对照，同条件下隔离饲养。将接种疫苗的SPF鸡于接种后7、 14、21、28、35、42、60、90、120、150天，分别采集血清，检测血清抗体。取其中20只免疫鸡连同攻毒对照组10只，分别各静脉注射10^6.0ELD₅₀的禽腺病毒血清4型ZMXZAV-4株，和ZMYTAV-8株，连续观察14日。

免疫产生期与持续期试验，结果见表7。

表7二价灭活疫苗免疫持续期抗体测定及攻毒保护试验结果

注：“/”表示相应时间未做该部分试验。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但均属于本发明要求保护的范围内。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一株I群8型禽腺病毒毒株ZMYTAV-8株，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.14297。

2.由权利要求1所述毒株或由其重组毒株制备的生物制品。

3.权利要求1所述的I群8型禽腺病毒毒株ZMYTAV-8株在制备预防包涵体肝炎的药物上的应用。

4.一种禽腺病毒血清4型/血清8型的二价灭活疫苗，其特征在于，所述疫苗的抗原来自I群4型禽腺病毒毒株和权利要求1所述的I群8型禽腺病毒毒株。

5.根据权利要求4所述的二价灭活疫苗，其特征在于，所述禽腺病毒血清4型毒株和禽腺病毒血清8型ZMYTAV-8株的病毒量体积比为1∶1。

6.根据权利要求5所述的二价灭活疫苗，其特征在于，所述I群4型禽腺病毒毒株为I群4型禽腺病毒ZMXZAV-4株，保藏编号为CGMCC No.14296。

7.根据权利要求4～6任一项所述的二价灭活疫苗，其特征在于，其制备方法包括如下步骤：

1)油相制备：

取矿物油95份，硬脂酸铝1份，在油相制备管中混合均匀并加热至75-85℃后，再加5份司本80，至温度达到110-120℃时维持20-40分钟，冷却后完成油相制备；

2)水相制备：

将血清4型毒株与血清8型ZMYTAV-8株分别接种LMH细胞，待细胞发生80％病变后，收获培养物为病毒液；

将灭活的禽腺病毒血清4型病毒液、禽腺病毒血清8型病毒液混合；取混合抗原液95份灭菌的5份吐温80，充分混匀；

3)乳化：

取2份油相，1份水相，放入乳化罐中搅拌，即得。

8.根据权利要求7所述的二价灭活疫苗，其特征在于，其制备方法包括如下步骤：

1)油相制备：

取矿物油95份，硬脂酸铝1份，在油相制备管中混合均匀并加热至80℃后，再加5份司本80，至温度达到115℃时维持30分钟，冷却后完成油相制备；

2)水相制备：

将灭活的禽腺病毒血清4型病毒液、禽腺病毒血清8型病毒液混合；取混合抗原液95份灭菌的5份吐温80，充分混匀；

3)乳化：

取2份油相，1份水相，放入乳化罐中，3500r/min搅拌30分钟，即得。