CN105727275A - 一种鸭肝炎二价活疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种鸭肝炎二价活疫苗及其制备方法。本发明具有：1)本发明的疫苗株DHV?1 QL1株通过尿囊腔接种SPF鸡胚培养，DHV?3 QL3株通过绒毛尿囊膜或卵黄囊接种SPF鸡胚培养，制备的疫苗抗原含量高，均≥108.5ELD50/ml，具有安全性好、免疫原性优良等特点，且突破了DHV?3型毒株只能在鸭胚增殖的局限；2)用SPF鸡胚培养的病毒液降低了外源致病微生物污染的风险，提高了劳动效率，降低了生产成本，更适合大规模生产；3)本发明的二价活疫苗可以同时预防DHV?1型和DHV?3型强毒对雏鸭的攻击；4)本发明的生产工艺简单，易于质量控制，批间差异性小，为生产安全合格的疫苗提供了保障。

Description

一种鸭肝炎二价活疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种鸭肝炎二价活疫苗及其制备方法。属于兽用生物制品领域。
背景技术
鸭肝炎(Duck Hepatitis，DH)是由鸭肝炎病毒(Duck Hepatitis virus，DHV)引起雏鸭的一种以肝脏呈现出血性炎症为特征，具有急性、高度接触性和致死性的传染性疾病。该病一年四季均可发生，自然暴发时仅发生于雏鸭，对养殖业造成了巨大经济损失。传统的鸭肝炎病毒有三个血清型，分别引起1型、2型和3型鸭肝炎(陆承平.兽医微生物学(第三版)[M].北京:中国农业出版社,2001,564)。近年来，由于免疫压力等因素，血清Ⅰ型鸭肝炎病毒呈现出新的流行态势。中国台湾地区和韩国的学者陆续分离出了与1型DHV基因组结构相近的典型小RNA病毒，称台湾新型和韩国新型,均不与DHV-1产生交叉中和反应,为避免混淆,已将鸭肝炎病毒改称为鸭甲肝病毒(DHAV)，分为血清I型(DHAV-1)、台湾新型(DHAV-2)和韩国新型(DHAV-3)。传统的DHV血清2型和3型分别归类为鸭星状病毒DAstV-1型和DAstV-2型。
在我国，鸭肝炎的流行大致分三个阶段：1958-1962年发生了DHAV-1型鸭肝炎的初次流行(黄均建.小鸭肝炎研究[M].上海:上海农业科学院畜牧兽医研究所.1963)；20世纪80年代初期起本病在我国再次流行，郭玉璞根据病毒中和实验和血清被动保护试验结果，证实我国流行的DHAV病原为1型鸭肝炎病毒(郭玉璞.北京鸭肝炎血清型的初步鉴定[A].中国畜牧兽医学会禽病研究会第三次学术讨论会论文摘要[C].1986,78)。其后，各地疫情此起彼伏，疫情能够被标准鸭肝炎I型弱毒疫苗的免疫所控制；1997年以来在某些地区出现较严重的流行，其疫情不能被标准鸭肝炎1型弱毒疫苗免疫完全的控制，3型鸭肝炎病毒在我国大陆首次被报道(林世棠,黄瑜,等.一种新的鸭传染病研究Ⅰ,流行情况与初步诊断[J].中国畜禽传染病,1996,4:14-17.舒敬良,黄瑜,等.新型鸭肝炎病毒的分离及初步鉴定[J].中国兽医科技,2002,32(1):15-16)。到目前为止，我国已有二十多个省市报道有本病发生，其中DHAV-3发病数量逐渐增多，使用现有的鸭肝炎疫苗和其高免血清以及高免卵黄抗体均未能防治该病。
我国目前肉鸭养殖规模已经超过35亿只，占到全球总量的70％以上，无论是存栏量还是鸭肉产量均稳居世界第一。在现代化、集约化和规模化的现代养殖业中，动物的疫病防治成为发展养殖业的关键。在众多动物传染性疾病中，防治好危害3周龄以下雏鸭，病死率达50％～90％的鸭肝炎对养鸭场具有重大的经济意义。
目前国内市场上用于预防鸭肝炎的活苗仅有鸭肝炎病毒血清1型单价苗。而3型鸭肝炎病毒的流行也很普遍，且已经出现了1型和3型鸭肝炎病毒的共感染。研制鸭肝炎二价活疫苗迫在眉睫。
据报道，经胚胎传代致弱的1型鸭肝炎病毒株接种后仍可引起轻微的、一过性的组织学变化，经雏鸭回复传代后可发生毒力返强现象(Woolcock,P.R and G.W.Crighton.Duck virushepatitis:serial passage of attenuated virus in duckling.Vet Rec.1979,105:30-32.Woolcock,P.Rand G.W.Crighton.Duck virus hepatitis:the effect of attenuation on virus stability in duckling.Avian Path.1981,10:113-119)。本发明中提供的1型鸭肝炎病毒QL1株和3型鸭肝炎病毒QL3株安全性好，经雏鸭回复传至第6～7代，雏鸭仍健活，无发病死亡。
发明内容
本发明人从疑似鸭肝炎发病鸭中采集肝脏组织，用鸡胚传代方法分别分离到一株1型鸭肝炎病毒QL1株和一株3型鸭肝炎病毒QL3株，随后对这两株病毒进行鸡胚传代致弱和免疫原性研究，证明这两株病毒已具有良好的安全性和免疫原性，可以作为疫苗株。
本发明的目的在于提供鸭肝炎病毒1型和3型二价活疫苗，含有致弱的1型鸭肝炎病毒QL1株和3型鸭肝炎病毒QL3株；该二价活疫苗免疫后保护性抗体产生快，免疫攻毒保护率高，对1型和3型鸭肝炎的攻毒保护率均达到90％以上。
本发明的技术方案：
1.一种鸭肝炎二价活疫苗，其特征在于所述活疫苗含有1型鸭肝炎病毒DHV-1QL1株和3型鸭肝炎病毒DHV-3QL3株的活病毒，可同时预防由1型和3型鸭肝炎病毒引起的鸭肝炎。
2.如权利要求1所述鸭肝炎二价活疫苗其特征在于：所述1型鸭肝炎病毒DHV-1QL1株和3型鸭肝炎病毒DHV-3QL3株已于2016年01月29日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCCNo.12036、CGMCC No.12037。
3.如权利要求1所述的鸭肝炎二价活疫苗，其特征在于所述DHV-1QL1株P1基因的核苷酸序列为序列5、氨基酸序列为序列6。
4.如权利要求1所述的鸭肝炎二价活疫苗，其特征在于所述DHV-3QL3株P1基因的核苷酸序列为序列11、氨基酸序列为序列12。
5.如权利要求1所述鸭肝炎二价活疫苗，其特征在于所述DHV-1QL1株P1基因的氨基酸序列具有序列6的特征，第821至823位的氨基酸为LFD。
6.如权利要求1所述鸭肝炎二价活疫苗，其特征在于所述DHV-3QL3株P1基因的氨基酸序列具有序列12的特征，第10、224、352位的氨基酸分别为N、Y、Y。
7.如权利要求1所述鸭肝炎二价活疫苗的制备方法，其特征在于用所述DHV-1QL1株和DHV-3QL3株作为疫苗生产毒株，分别接种SPF鸡胚，收获感染胚尿囊液、胎儿及绒毛尿囊膜混合研磨，制备成病毒含量大于等于109.0ELD50/ml的DHV-1QL1株病毒液和病毒含量大于等于108.5ELD50/ml的DHV-3QL3株病毒液，再将其混合后加冻干保护剂经真空干燥制成鸭肝炎二价活疫苗。
本发明具体实施方式
1病毒疫苗株的选育
1.1DHV-1QL1株选育
将DHV-1QL1强毒株通过尿囊腔途径接种9～10日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，置37℃孵育，无菌收集24h后死亡鸡胚尿囊液，进行下一代传代。连续传至65代，进行致弱评价。将E25、E45、E65代毒株分别接种1日龄健康易感鸭，每只肌肉注射0.5ml，并设置生理盐水对照组。自接种之日起，每日观察、记录接种鸭的发病和死亡情况。E25代毒接种雏鸭后死亡率为4/10，E45代毒接种雏鸭后死亡率为1/10，E65代毒接种雏鸭后发病率和死亡率均为0，剖检未见肝脏肿大、出血等特异性病理变化，与对照鸭状态一致。说明该传代毒E65代已经致弱，可作为疫苗研制的候选毒株。
1.2DHV-3QL3株选育
将DHV-3QL3株强毒株通过绒毛尿囊膜途径接种8～10日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，置37℃孵育，无菌收集24h后死亡鸭胚尿囊液，进行下一代传代。连续传至110代，进行致弱评价。将E10、E30、E60、E90、E110代毒株分别接种1日龄健康易感鸭，每只肌肉注射0.5ml，并设置生理盐水对照组。自接种之日起，每日观察、记录接种鸭的发病和死亡情况。E10、E30、E60代毒接种雏鸭后死亡率依次为9/10、5/10、3/10，E90代毒接种雏鸭后死亡率为1/10，E110代毒接种雏鸭后发病率和死亡率均为0，剖检未见肝脏肿大、出血等特异性病理变化，与对照鸭状态一致。说明该传代毒E110代已经致弱，可作为疫苗研制的候选毒株。
2病毒特性
2.1病毒疫苗株的培养
将DHV-1QL1株疫苗株通过尿囊腔途径接种9～10日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，置37℃孵育96h，无菌收集36h后死亡鸡胚尿囊液，置-20℃保存。检测传代毒液毒价，病毒含量稳定在109.0ELD50/ml以上。
将DHV-3QL3株疫苗株通过绒毛尿囊膜途径接种8～10日龄SPF鸡胚或卵黄囊途径接种6～7日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，置37℃孵育96h，无菌收集36h后死亡鸭胚尿囊液，置-20℃保存。检测传代毒液毒价，病毒含量稳定在108.5ELD50/ml以上。
2.2特异性
将DHV-1QL1株病毒液用无菌生理盐水稀释成200ELD50/0.1ml，分两组，一组与等量的鸭肝炎病毒I型特异性血清混匀，另一组与等量生理盐水混合，37℃中和1小时后，经尿囊腔接种9～10日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.2ml，置37℃下培养并观察168小时。中和组应不发生特异性病变和死亡，且至少存活8枚，未中和对照组应至少有8枚鸡胚死亡。
将DHV-3QL3株病毒液用无菌生理盐水稀释成200ELD50/0.1ml，分两组，一组与等量的鸭肝炎病毒Ⅲ型特异性血清混匀，另一组与等量生理盐水混合，37℃中和1小时后，经绒毛尿囊膜途径接种8～10日龄SPF鸡胚10枚，每胚0.2ml，置37℃下培养并观察168小时。中和组应不发生特异性病变和死亡，且至少存活8枚，未中和对照组应至少有8枚鸡胚死亡。
2.3纯净性
按现行《中国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇一〇年版三部.中国农业出版社，2011)附录进行，DHV-1QL1株毒种和DHV-3QL3株毒种无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。
2.4免疫原性
20只1日龄健康易感雏鸭(DHV-1型、DHV-3型中和抗体效价≤1:4)随机分为2组，10只/组。第1组肌肉注射DHV-1QL1株毒种，每只0.1ml(含103.5ELD50)。第2组作为不接种对照组。免疫后7日，采集血清样品检测DHV-1中和抗体效价，同时第1组和第2组雏鸭肌肉注射DHV-1型强毒株，每只0.5ml。攻毒后观察7天，免疫组雏鸭10/10状态良好，无发病和死亡，DHV-1中和抗体效价均＞1:8。攻毒组雏鸭7/10死亡，DHV-1中和抗体效价均＜1:2。说明DHV-1QL1株毒具有良好的免疫原性。
20只1日龄健康易感雏鸭(DHV-1型、DHV-3型中和抗体效价≤1:4)随机分为2组，10只/组。第1组肌肉注射DHV-3QL3株毒种，每只0.1ml(含103.5ELD50)。第2组作为不接种对照组。免疫后7日，采集血清样品检测DHV-3中和抗体效价，同时第1组和第2组雏鸭肌肉注射DHV-3型强毒株，每只0.5ml。攻毒后观察7天，免疫组雏鸭10/10状态良好，无发病和死亡，DHV-3中和抗体效价均＞1:16。攻毒组雏鸭10/10死亡，DHV-3中和抗体效价均＜1:2。说明DHV-3QL3株毒具有良好的免疫原性。
2.5分子病毒学特性
参照GenBank上已发表的DHAV-1型序列，针对P1基因设计2对引物，引物序列分别为：DHAV-1-P1-1F：5′-TACACTGCCT GATAGGGTCG-3′(序列1)，
DHAV-1-P1-1R：5′-CATCCCCAGT CACAAACACA GAAT-3′(序列2)；
DHAV-1-P1-2F：5′-TTGGCAGCCA GTTCAACAC-3′(序列3)，
DHAV-1-P1-2R：5′-CCACAGGCTC TCACTAGAGA-3′(序列4)。
对DHV-1QL1株病毒液提取基因组总RNA，经反转录后用上述引物进行PCR扩增、测序和拼接，结果得到完整的P1基因，包含2653bp的核苷酸片段(见序列5)，编码氨基酸大小为823aa(见序列6)。与已发表DHV-1型毒株的核苷酸序列同源性为93.6％～96.9％，氨基酸序列同源性为95.6％～97.7％。
DHV-1QL1株P1基因与来源于GenBank的1型鸭肝炎病毒参考株相比，氨基酸序列存在多个位点的差异，具有特征性排列。具体结果见表1。
1)DHV-1QL1株P1基因的核苷酸序列为(序列5)
2)DHV-1QL1株P1基因的氨基酸序列为(序列6)
表1DHV-1QL1株与不同来源1型鸭肝炎病毒的P1蛋白氨基酸位点差异
参照GenBank上已发表的DHAV-3型序列，针对P1基因设计2对引物，引物序列分别为：DHAV-3-P1-1F：5′-CACACTGCCTGATAGGGTCG-3′(序列7)，
DHAV-3-P1-1R：5′-CGCAGGTGACAAACACAGAAT-3′(序列8)；
DHAV-3-P1-2F：5′-GACCTTTGGAAGCCAGTTTAAT-3′(序列9)，
DHAV-3-P1-2R：5′-CATCACAGGCACGAACAAGT-3′(序列10)。
对DHV-3QL3株病毒液提取基因组总RNA，经反转录后用上述引物进行PCR扩增、测序和拼接，结果得到完整的P1基因，包含2659bp的核苷酸片段(见序列11)，编码氨基酸大小为886aa(见序列12)。与已发表DHV-3型毒株的核苷酸序列同源性为92.5％～99.5％，氨基酸序列同源性为94.5％～99.0％。
DHV-3QL3株P1基因与来源于GenBank的3型鸭肝炎病毒参考株相比，氨基酸序列存在多个位点的差异，具有特征性排列。具体结果见表2。
1)DHV-3QL3株P1基因的核苷酸序列为(序列11)
2)DHV-3QL3株P1基因的氨基酸序列为(序列12)
表2DHV-3QL3株与不同来源3型鸭肝炎病毒的P1蛋白氨基酸位点差异
3鸭肝炎二价活疫苗的制备
(1)将本发明DHV-1QL1株生产用毒种，用灭菌生理盐水稀释100倍，经尿囊腔接种9～10日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，置37℃孵育，弃去24小时内死胚，无菌收集96h内死亡鸡胚尿囊液、胎儿及绒毛尿囊膜混合研磨、过滤后，置-20℃保存，同时做无菌检验和病毒含量测定，病毒含量应≧109.0ELD50/ml。
(2)将本发明DHV-3QL3株生产用毒种，用灭菌生理盐水稀释100倍，经绒毛尿囊膜接种8～10日龄SPF鸡胚或经卵黄囊接种6～7日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，置37℃孵育，弃去24小时内死胚，无菌收集96h内死亡鸡胚尿囊液、胎儿及绒毛尿囊膜混合研磨、过滤后，置-20℃保存，同时做无菌检验和病毒含量测定，病毒含量应≧108.5ELD50/ml。
(3)将无菌检验和病毒含量测定合格的DHV-1QL1株毒液和DHV-3QL3株毒液按1:2混合后再与耐热冻干保护剂按1:1(病毒液：保护剂)配苗，迅速冷冻真空干燥，加盖密封。
本发明涉及的微生物资源信息
本发明涉及鸭肝炎病毒(duck hepatitis virus)1型QL1株和3型QL3株，以上2个毒株已于2016年01月29日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号：DHV-1QL1株为CGMCCNo.12036，DHV-3QL3株为CGMCC No.12037。
本发明的优点
(1)本发明的疫苗株DHV-1QL1株通过尿囊腔接种SPF鸡胚培养，制备的疫苗抗原含量高，均≥109.0ELD50/ml，具有安全性好、免疫原性优良等特点。
(2)本发明的疫苗株DHV-3QL3株通过绒毛尿囊膜或卵黄囊接种SPF鸡胚培养，制备的疫苗抗原含量高，均≥108.5ELD50/ml，具有安全性好、免疫原性优良等特点。突破了DHV-3型毒株只能在鸭胚增殖的局限。
(2)用SPF鸡胚培养的病毒液降低了外源致病微生物污染的风险，提高了劳动效率，降低了生产成本，益于大规模生产。
(3)本发明的二价活疫苗可以同时预防DHV-1型和DHV-3型强毒对雏鸭的攻击。
(4)本发明的生产工艺简单，易于质量控制，批间差异性小，为生产安全合格的疫苗提供了保障。
实施例
本发明的实施例为进一步描述本发明的技术方案，但不构成对本发明的限制。
实施例1
——毒种的检验
1无菌检验和支原体检验
DHV-1QL1株毒种按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验和支原体检验，均无细菌、霉菌和支原体污染。
DHV-3QL3株毒种按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验和支原体检验，均无细菌、霉菌和支原体污染。
2外源病毒检验
DHV-1QL1株毒种按现行《中国兽药典》附录用鸡胚培养、细胞培养和ELISA试验(禽白血病病毒检测)进行外源病毒检测，无外源病毒污染。
DHV-3QL3株毒种按现行《中国兽药典》附录用鸡胚培养、细胞培养和ELISA试验(禽白血病病毒检测)进行外源病毒检测，无外源病毒污染。
3病毒含量测定
取DHV-1QL1株毒的鸡胚尿囊液，依次做10倍系列稀释，选择4个合适稀释倍数的病毒悬液分别接种9～10日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种5枚，每枚鸡胚接种0.1ml，置37℃温箱内孵育7天，每天照胚，记录鸡胚的死亡数和存活数，按Reed-Muench法计算ELD50，为108.38ELD50/0.1ml。
取DHV-3QL3株毒的鸡胚尿囊液，依次做10倍系列稀释，选择-10-6、10-7、10-8、10-94个稀释倍数的病毒悬液分别接种8～9日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种5枚，每枚鸡胚接种0.1ml，置37℃温箱内孵育7天，每天照胚，记录鸡胚的死亡数和存活数，按Reed-Muench法计算ELD50，为107.68ELD50/0.1ml。
4特异性检验
用无菌生理盐水将DHV-1QL1株病毒液稀释成200ELD50/0.1ml，分3组，第1组与等量的鸭肝炎病毒1型特异性血清混匀，第2组与等量的鸭肝炎病毒3型特异性血清混匀，第3组与等量生理盐水混合，37℃中和1小时后，经尿囊腔接种9～10日龄SPF鸡胚各10枚，每胚0.2ml，置37℃下培养并观察168小时。第1组均未出现特异性病变和死亡，第2组和第3组分别有8枚和9枚鸡胚死亡，存活胚剖检胚体出血，肝脏有出血点。
用无菌生理盐水将DHV-3QL3株病毒液稀释成200ELD50/0.1ml，分3组，第1组与等量的鸭肝炎病毒3型特异性血清混匀，第2组与等量的鸭肝炎病毒1星特异性血清混匀，第3组与等量生理盐水混合，37℃中和1小时后，经绒毛尿囊膜接种8～10日龄SPF鸡胚各10枚，每胚0.2ml，置37℃下培养并观察168小时。第1组均未发生特异性病变和死亡，第2组有9枚鸡胚死亡，存活胚剖检胚体出血，肝脏有出血点，第3组鸡胚全部死亡。
5安全性检验
30只1日龄健康易感雏鸭(DHV-1型、DHV-3型中和抗体效价≤1:4)随机分为3组，10只/组。第1组肌肉注射DHV-1QL1株毒种(108.38ELD50/0.1ml)，第2组肌肉注射DHV-3QL3株毒种(107.68ELD50/0.1ml)，每只0.2ml。第3组作为对照组，每只肌肉注射0.2ml灭菌生理盐水。自接种之日起，每天观察记录接种鸭的发病和死亡情况，连续观察14日，所有鸭均健活。
6免疫原性试验
20只1日龄健康易感雏鸭(DHV-1型、DHV-3型中和抗体效价≤1:4)随机分为2组，10只/组。第1组肌肉注射DHV-1QL1株毒种，每只0.1ml(含103.5ELD50)。第2组对照组，每只肌肉注射0.1ml灭菌生理盐水。免疫后7日，采集血清样品检测DHV-1中和抗体效价，同时2组雏鸭肌肉注射DHV-1型强毒株，每只0.5ml。攻毒后观察7天，免疫鸭状态良好，无发病和死亡，DHV-1中和抗体效价均＞1:8。攻毒组雏鸭8/10死亡，DHV-1中和抗体效价均＜1:2。说明DHV-1QL1株毒种具有良好的免疫原性。结果见表3。
表3DHV-1QL1株免疫原性评价
20只1日龄健康易感雏鸭(DHV-1型、DHV-3型中和抗体效价≤1:4)随机分为2组，10只/组。第1组肌肉注射DHV-3QL3株毒种，每只0.1ml(含103.5ELD50)。第2组作为对照组，每只肌肉注射0.1ml灭菌生理盐水。免疫后7日，采集血清样品检测DHV-3中和抗体效价，同时2组雏鸭肌肉注射DHV-3型强毒株，每只0.5ml。攻毒后观察7天，免疫组鸭状态良好，无发病和死亡，DHV-3中和抗体效价均＞1:16。攻毒组雏鸭10/10死亡，DHV-3中和抗体效价均＜1:2。说明DHV-3QL3株毒种具有良好的免疫原性。结果见表4。
表4DHV-3QL3株免疫原性评价
实施例2
——毒种的毒力返强试验
1材料
1.1毒株1型鸭肝炎病毒QL1株毒种，病毒含量为108.38ELD50/0.1ml；3型鸭肝炎病毒QL3株毒种，病毒含量为107.68ELD50/0.1ml。
1.2 8～10日龄SPF鸡胚购自济南斯帕法斯家禽有限公司。
1.3 1日龄健康易感鸭来源于无鸭肝炎病史、DHAV抗体阴性(中和抗体效价＜1:4)的健康种鸭群。
2方法
2.1DHV-1QL1株的毒力返强试验
2.1.1接种1日龄健康易感鸭将1型鸭肝炎病毒QL1株毒种经肌肉注射接种1日龄健康易感鸭5只，0.5ml/只。接种后每日观察、记录雏鸭的精神、饮食、粪便等临床表现，3日后剖杀，观察各脏器有无病理变化，并采集肝脏研磨，加入灭菌生理盐水制成1:3的组织匀浆液，反复冻融2次，10000rpm离心5min，取上清过滤除菌，-70℃保存备用。
2.1.2QL1株在雏鸭上传代将肝脏组织处理液经肌肉注射接种1日龄健康易感鸭，每只0.5ml。接种后每日观察、记录雏鸭的精神、饮食、粪便等临床表现，第3日剖杀，观察各脏器有无病理变化，并采集肝脏按2.1.1方法制成组织匀浆液，-70℃保存备用；以同样方法通过1日龄易感鸭连传5代，第6代接种1日龄健康易感鸭15只，其中5只在接毒后第3日剖杀，观察有无病变，并取肝脏进行病毒分离和RT-PCR检测。另外10只观察至21日剖杀，取肝脏组织，研磨处理后进行病毒分离和RT-PCR检测。
2.2DHV-3QL3株的毒力返强试验
2.2.1接种1日龄健康易感鸭将3型鸭肝炎病毒QL3株毒种经肌肉注射接种1日龄健康易感鸭5只，0.5ml/只。接种后每日观察、记录雏鸭的精神、饮食、粪便等临床表现，3日后剖杀，观察各脏器有无病理变化，并采集肝脏按2.1.1方法制成组织匀浆液，-70℃保存备用。
2.2.2QL3株在雏鸭上传代将肝脏组织处理液经肌肉注射接种1日龄健康易感鸭，每只0.5ml。接种后每日观察、记录雏鸭的精神、饮食、粪便等临床表现，第3日剖杀，观察各脏器有无病理变化，并采集肝脏按2.1.1方法制成组织匀浆液，-70℃保存备用；以同样方法通过1日龄易感鸭连传7代，第7代接种1日龄健康易感鸭15只，其中5只在接毒后第3日剖杀，观察有无病变，并取肝脏进行病毒分离和RT-PCR检测。另外10只观察至21日剖杀，取肝脏组织，研磨处理后进行病毒分离和RT-PCR检测。
3结果
3.1DHV-1QL1株的毒力返强试验结果
3.1.1传代过程中的临床症状和剖检结果将1型鸭肝炎病毒QL1株毒种经肌肉注射大剂量接种1日龄健康易感鸭，第3日剖检取肝脏组织毒继续接种雏鸭传代。病毒在雏鸭连传6代，每代雏鸭接种后精神状态、饮食、粪便等均正常，剖检观察肝脏、脾脏、胆囊、肾脏等均无肉眼可见病变(结果见表5)。
表5鸭肝炎病毒QL1株在雏鸭连传6代的临床表现和病理剖检结果
3.1.2病毒分离结果DHV-1QL1株在雏鸭上连传6代，每一代在感染后第3日采集肝脏，无菌制备匀浆，接种鸡胚，均成功分离到鸭肝炎病毒。传代第6代，观察至接种后第21日，剖杀后采集肝脏制备匀浆，接种鸡胚未分离到病毒(结果见表6)。
3.1.3RT-PCR检测结果DHV-1QL1株在雏鸭上连传6代，接种后第3日，采集肝脏，经处理后用鸭肝炎病毒特异性引物DHAV-P1/DHAV-P2进行RT-PCR检测，均扩增到488bp左右的目的条带。传代第6代，观察至接种后21日剖杀，采集肝脏制备匀浆，RT-PCR检测为阴性。(结果见表6)
表6DHAV-1QL1株在雏鸭连传6代的RT-PCR检测和病毒分离结果
3.2DHV-3QL3株的毒力返强试验结果
3.2.1传代过程中的临床症状和剖检结果将DHV-3QL3株毒种经肌肉注射大剂量接种1日龄健康易感鸭，第3日剖检取肝脏组织毒继续接种雏鸭传代。病毒在雏鸭连传7代，每代雏鸭接种后精神状态、饮食、粪便等均正常，剖检观察肝脏、脾脏、胆囊、肾脏等均无肉眼可见病变(结果见表7)。
表7QL3株在雏鸭连传7代的临床表现和病理剖检结果
3.2.2病毒分离结果DHV-3QL3株在雏鸭上连传7代，每一代在感染后第3日采集肝脏，无菌制备匀浆，接种鸡胚，均成功分离到鸭肝炎病毒。传代第7代，观察至接种后第21日，剖杀后采集肝脏制备匀浆，接种鸡胚未分离到病毒(结果见表8)。
3.2.3RT-PCR检测结果DHV-3QL3株在雏鸭上连传7代，接种第3日，采集肝脏，经处理后用鸭肝炎病毒特异性引物DHAV-3-F/DHAV-3-R进行RT-PCR检测，均扩增到600bp左右的目的条带。传代第7代，观察至接种后21日剖杀，采集肝脏制备匀浆，RT-PCR检测为阴性。(结果见表8)
表8QL3株在雏鸭连传7代的RT-PCR检测和病毒分离结果
实施例3
——疫苗制备
1毒种繁殖
取DHV-1QL1株毒种，用灭菌生理盐水稀释100倍，通过尿囊腔途径接种9～10日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，置37℃孵育，弃去24小时内死胚，无菌收集36～96h内死亡鸡胚尿囊液，置-20℃保存，同时做无菌检验和病毒含量测定，测得病毒含量应≥109.0ELD50/ml。经无菌检验和病毒含量测定合格的病毒尿囊液做为生产用毒种。
取DHV-3QL3株毒种，用灭菌生理盐水稀释100倍，通过绒毛尿囊膜途径接种8～10日龄SPF鸡胚或卵黄囊途径接种6～7日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，置37℃孵育，弃去24小时内死胚，无菌收集36～96h内死亡鸡胚尿囊液，置-20℃保存，同时做无菌检验和病毒含量测定，测得病毒含量应≥108.5ELD50/ml。经无菌检验和病毒含量测定合格的病毒尿囊液做为生产用毒种。
2制苗用毒液的制备
取DHV-1QL1株生产用毒种，用灭菌生理盐水稀释100倍，通过尿囊腔途径接种9～10日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，置37℃孵育，弃去24小时内死胚，无菌收集36～96h内死亡鸡胚尿囊液、胎儿、羊水及绒毛尿囊膜混合研磨、过滤，置-20℃保存，同时做无菌检验和病毒含量测定，测得病毒含量应≥109.0ELD50/ml。此为半成品。
取DHV-3QL3株毒种，用灭菌生理盐水稀释100倍，通过绒毛尿囊膜途径接种8～10日龄SPF鸡胚或卵黄囊途径接种6～7日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，置37℃孵育，弃去24小时内死胚，无菌收集36～96h内死亡鸡胚尿囊液、胎儿、羊水及绒毛尿囊膜混合研磨、过滤，置-20℃保存，同时做无菌检验和病毒含量测定，测得病毒含量应≥108.5ELD50/ml。此为半成品。
3冻干
将无菌检验和病毒含量测定合格的DHV-1QL1株毒液、DHV-3QL3株毒液和耐热冻干保护剂按体积比1:2:3配苗，分装，2.0ml/瓶，迅速冷冻真空干燥，加盖密封。
按上述方法连续生产3批疫苗，批号分别为2014001、2014002、2014003，100羽份/瓶
实施例4
——疫苗的检验
1无菌检验按现行《中国兽药典》附录方法进行检验，均无细菌、霉菌生长。
2支原体检验按现行《中国兽药典》附录方法进行检验，均无支原体生长。
3鉴别检验
将疫苗用灭菌生理盐水溶解后稀释至400ELD50/0.1ml，分别与等量DHV-1型特异性抗血清和DHV-3型特异性抗血清(各1/2)混合，置37℃中和60分钟后，分别经尿囊腔接种9～10日龄SPF鸡胚和经绒毛尿囊膜接种8～10日龄SPF鸡胚，每种胚各接种10枚，每枚0.1ml。同时设不中和对照组(将疫苗用灭菌生理盐水溶解后稀释至400ELD50/0.1ml，与等量灭菌生理盐水混合)和生理盐水对照组(接种生理盐水)，分别经尿囊腔接种9～10日龄SPF鸡胚10枚和经绒毛尿囊膜接种8～10日龄SPF鸡胚10枚，每枚0.1ml。将接种胚置37℃温箱培养，观察120～144小时，中和组和生理盐水对照组鸡胚均不引起特异性死亡，每组至少8枚存活，不中和组鸡胚每组至少8枚死亡。
4外源病毒检验按现行《中国兽药典》附录方法进行检验，均无外源病毒污染。
5病毒含量测定
5.1DHV-1QL1株病毒含量测定用灭菌生理盐水将疫苗稀释至1羽份/0.1ml，然后加入等量的DHV-3型特异性抗血清，置37℃中和60分钟后，做10倍系列稀释，取102、103、104、1054个稀释度，分别接种9～10日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种5枚，每枚0.1ml，同时设不接种对照5枚，置37℃温箱内孵育168h，每天照胚，记录鸡胚的死亡数和存活数，按Reed-Muench法计算ELD50，每羽份疫苗病毒含量≥103.5ELD50。
5.2DHV-3QL3株病毒含量测定用灭菌生理盐水将疫苗稀释至1羽份/0.1ml，然后加入等量的DHV-1型特异性抗血清，置37℃中和60分钟后，做10倍系列稀释，取102、103、104、1054个稀释度，分别接种8～9日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种5枚，每枚0.1ml，同时设不接种对照5枚，置37℃温箱内孵育168h，每天照胚，记录鸭胚的死亡数和存活数，按Reed-Muench法计算ELD50，每羽份疫苗病毒含量≥103.5ELD50。
6剩余水分测定按现行《中国兽药典》附录方法进行测定，均符合规定。
7真空度测定按现行《中国兽药典》附录方法进行测定，均符合规定。
实施例5
——疫苗的效力试验
1材料
3批鸭肝炎二价活疫苗(QL1株+QL3株)，批号为2014001、2014002、2014003，100羽份/瓶，由齐鲁动物保健品有限公司研制。2～8℃保存，有效期为12个月。
1日龄健康易感雏鸭，DHV-1型、DHV-3型中和抗体效价≤1:4。
2方法
2.1主动免疫试验
取80只1日龄健康易感雏鸭(DHV-1型、DHV-3型中和抗体效价≤1:4)随机分为8组，10只/组。第1、2组分别肌肉注射接种2014001批疫苗，每只含1.5羽份；第3、4组分别肌肉注射接种2014002批疫苗，每只1.5羽份；第5、6组分别肌肉注射接种2014003批疫苗，每只1.5羽份；第7、8组不接种作为攻毒对照。免疫后7日第1、3、5、7组肌肉注射攻击DHV-1型强毒，第2、4、6、8组肌肉注射攻击DHV-3型强毒，每只0.5ml。攻毒后观察7日，记录发病和死亡情况。
2.2被动免疫试验
取80只健康易感种鸭(DHV-1型、DHV-3型中和抗体效价≤1:4)随机分为4组，20只/组。第1、2、3组分别肌肉注射接种3批疫苗，每只0.5ml(含2羽份)；第4组肌肉注射灭菌生理盐水，每只0.5ml。免后14日加强免疫一次。二次免疫14日后，每组取适量鸭胚进行孵化。雏鸭出壳后，从每组随机取1日龄健康雏鸭30只分别于7、10、14日攻击DHV-1型强毒，每只0.5ml；另从每组随机取1日龄健康雏鸭30只分别于7、10、14日攻击DHV-3型强毒，每只0.5ml。攻毒后观察7日，记录发病和死亡情况。
3结果
3.1主动免疫试验结果
3批疫苗免疫组免疫7日后，攻击DHV-1型强毒，攻毒对照组7/10死亡，2014001批、2014002批和2014003批疫苗免疫组无发病死亡，疫苗免疫后攻毒保护率均可达到100％。攻击DHV-3型强毒，攻毒对照组10/10死亡，2014001批、2014002批和2014003批疫苗免疫组无发病死亡，疫苗免疫后攻毒保护率均可达到100％。结果见表9。
表9鸭肝炎二价活疫苗主动免疫效力试验结果
3.3被动免疫试验结果
鸭肝炎二价活疫苗免疫健康易感种鸭所产种蛋孵化的雏鸭在10日内均能获得较好保护，能够抵抗DHV-1型强毒和DHV-3型强毒的感染，攻毒保护率在80％(8/10)以上。结果见表10。
表10鸭肝炎二价活疫苗被动免疫效力试验结果
实验结果表明，鸭肝炎二价活疫苗免疫雏鸭的主动免疫保护率在80％以上，免疫种鸭对雏鸭10日龄内的被动免疫保护率在90％以上，说明鸭肝炎二价活疫苗(QL1株+QL3株)对鸭肝炎具有良好保护力。
实施例6
——疫苗的安全性检验
1材料
3批鸭肝炎二价活疫苗(QL1株+QL3株)，批号为2014001、2014002、2014003，100羽份/瓶，由齐鲁动物保健品有限公司研制。2～8℃保存。
1日龄健康易感雏鸭，DHV-1型、DHV-3型中和抗体效价≤1:4。
2方法
雏鸭超剂量接种安全性试验将40只1日龄健康易感雏鸭随机分为4组，每组10只。第1组肌肉注射接种鸭肝炎二价活疫苗2014001批，0.2ml/只(含10羽份)；第2组肌肉注射接种鸭肝炎二价活疫苗2014002批，0.2ml/只(含10羽份)；第3组肌肉注射接种鸭肝炎二价活疫苗2014003批，0.2ml/只(含10羽份)；第4组作为对照。隔离饲养。接种后每日观察精神状态、饮食及粪便性状，有无局部或全身不良反应，至接种后10日。并在第10日时全部剖杀，观察各脏器有无病理变化。
3结果
鸭肝炎二价活疫苗超剂量接种1日龄雏鸭。接种后在观察期内，接种雏鸭的精神、饮食、粪便等均正常，无局部或全身不良反应。雏鸭在接种后第10日剖检，肝脏、脾脏及其它脏器等均无明显病理变化。说明疫苗对雏鸭的安全性好。结果见表11。
表11雏鸭超剂量接种的安全试验结果
实施例7
——弱毒疫苗株P1基因的克隆
1材料
DHV-1QL1株、DHV-3QL3株，由齐鲁动物保健品有限公司分离、鉴定和保存。
引物参照已发表的DHV-1型和DHV-3型P1基因设计，由上海生工生物工程有限公司合成。DHV-1型引物的核苷酸序列为：
DHAV-1-P1-1F：5′-TAC ACTGCCT GATAGGGTCG-3′(序列1)，
DHAV-1-P1-1R：5′-CATCCCCAGT CACAA ACACA GAAT-3′(序列2)；
DHAV-1-P1-2F：5′-TTGGCAGCCA GTTCAACAC-3′(序列3)，
DHAV-1-P1-2R：5′-CCACAGGCTC TCACTAGAGA-3′(序列4)。
DHV-3型引物的核苷酸序列为：
DHAV-3-P1-1F：5′-CACACTGCC TGA TAGGGT CG-3′(序列7)，
DHAV-3-P1-1R：5′-CGCAGGTGAC AAACACAGAA T-3′(序列8)；
DHAV-3-P1-2F：5′-GACCTTTGGA AGCCAGTTTA AT-3′(序列9)，
DHAV-3-P1-2R：5′-CATCACAGGC ACGAACAAGT-3′(序列10)。
RNA提取试剂盒，购自上海生工生物工程有限公司。
2方法
2.1病毒基因组RNA的提取按试剂盒说明方法进行。
2.2DHV-1型和DHV-3型P1基因的扩增、克隆和测序对提取的病毒总RNA进行反转录合成cDNA，并以此为模板用特异性引物对DHV-1QL1株和DHV-3QL3株的P1基因进行分段扩增，扩增产物经克隆、鉴定后，对阳性重组质粒送上海生工生物工程有限公司进行核苷酸序列测定。
3结果
3.1基因的扩增、克隆和测序应用RT-PCR方法对DHV-1QL1株和DHV-3QL3株的P1基因进行分段扩增，得到了与预期大小相符的核苷酸片段。扩增片段经克隆、鉴定得到了阳性重组质粒。重组质粒测序后DHV-1QL1株的两段核苷酸序列拼接得到了大小为2653bp的P1基因。DHV-3QL3株的两段核苷酸序列拼接得到了大小为2659bp的P1基因。
3.2序列分析
3.2.1DHV-1QL1株P1基因序列分析
对DHV-1型疫苗毒QL1株的P1基因测序发现，QL1株P1基因长为2653bp，编码氨基酸大小为823aa，包含结构蛋白VP0、VP1和VP3基因。同源性比较显示，QL1疫苗株P1基因与已发表DHV-1型毒株的核苷酸序列同源性为93.6％～96.9％，氨基酸序列同源性为95.6％～97.7％。
3.2.2DHV-3QL3株P1基因序列分析
对DHV-3型疫苗毒QL3株的P1基因测序发现，QL3株P1基因长为2659bp，编码氨基酸大小为886aa，包含结构蛋白VP0、VP1和VP3基因。同源性比较显示，QL3疫苗株P1基因与已发表DHV-3型毒株的核苷酸序列同源性为92.5％～99.5％，氨基酸序列同源性为94.5％～99.0％。

Claims (7)

1.一种鸭肝炎二价活疫苗，其特征在于所述活疫苗含有1型鸭肝炎病毒DHV-1QL1株和3型鸭肝炎病毒DHV-3QL3株的活病毒，可同时预防由1型和3型鸭肝炎病毒引起的鸭肝炎。
2.如权利要求1所述鸭肝炎二价活疫苗其特征在于：所述1型鸭肝炎病毒DHV-1QL1株和3型鸭肝炎病毒DHV-3QL3株已于2016年01月29日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCCNo.12036、CGMCC No.12037。
3.如权利要求1所述的鸭肝炎二价活疫苗，其特征在于所述DHV-1QL1株P1基因的核苷酸序列为序列5、氨基酸序列为序列6。
4.如权利要求1所述的鸭肝炎二价活疫苗，其特征在于所述DHV-3QL3株P1基因的核苷酸序列为序列11、氨基酸序列为序列12。
5.如权利要求1所述鸭肝炎二价活疫苗，其特征在于所述DHV-1QL1株P1基因的氨基酸序列具有序列6的特征，第821至823位的氨基酸为LFD。
6.如权利要求1所述鸭肝炎二价活疫苗，其特征在于所述DHV-3QL3株P1基因的氨基酸序列具有序列12的特征，第10、224、352位的氨基酸分别为N、Y、Y。
7.如权利要求1所述鸭肝炎二价活疫苗的制备方法，其特征在于用所述DHV-1QL1株和DHV-3QL3株作为疫苗生产毒株，分别接种SPF鸡胚，收获感染胚尿囊液、胎儿及绒毛尿囊膜混合研磨，制备成病毒含量大于等于109.0ELD50/ml的DHV-1QL1株病毒液和病毒含量大于等于108.5ELD50/ml的DHV-3QL3株病毒液，再将其混合后加冻干保护剂经真空干燥制成鸭肝炎二价活疫苗。
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