CN107988170A - 猪轮状病毒毒株及其制备的灭活疫苗和应用 - Google Patents

猪轮状病毒毒株及其制备的灭活疫苗和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107988170A
CN107988170A CN201711107884.0A CN201711107884A CN107988170A CN 107988170 A CN107988170 A CN 107988170A CN 201711107884 A CN201711107884 A CN 201711107884A CN 107988170 A CN107988170 A CN 107988170A
Authority
CN
China
Prior art keywords
porcine rotavirus
zyh25
plants
culture
preparation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201711107884.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107988170B (zh
Inventor
王国辉
董雅文
贾小营
张微
杨泽斌
李长艳
朱俊辉
于志刚
王英祺
廉唯
王石
何玉友
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jilin Zhengye Biological Products Co ltd
Original Assignee
Jilin Zhengye Biological Products Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jilin Zhengye Biological Products Co ltd filed Critical Jilin Zhengye Biological Products Co ltd
Priority to CN201711107884.0A priority Critical patent/CN107988170B/zh
Publication of CN107988170A publication Critical patent/CN107988170A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107988170B publication Critical patent/CN107988170B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
    • C12N2720/12321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
    • C12N2720/12334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
    • C12N2720/12351—Methods of production or purification of viral material

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一株猪轮状病毒毒株及其制备的灭活疫苗和应用。本发明首先公开了一株分离的猪轮状病毒zyh25株，其微生物保藏编号为CGMCC No.13792。本发明进一步公开了所述猪轮状病毒zyh25株在制备防治猪轮状病毒病的疫苗中的应用。本发明还公开了一种防治猪轮状病毒病的疫苗组合物，包括：预防或治疗上有效量的灭活的所述猪轮状病毒zyh25株和药学上可接受的佐剂。本发明所分离的猪轮状病毒zyh25株作为疫苗株具有良好的免疫原性，免疫动物后能产生较高的抗体水平，且能够耐受强毒株攻击。本发明所述猪轮状病毒zyh25株能够进行无血清全悬浮连续生产，制备的灭活疫苗具有生产成本低、产品批间差异小等优点。

Description

猪轮状病毒毒株及其制备的灭活疫苗和应用
技术领域
本发明涉及一株分离的猪轮状病毒毒株，还涉及所述猪轮状病毒毒株制备的灭活疫苗及在防治猪轮状病毒感染中的应用，属于猪轮状病毒毒株的分离及应用领域。
背景技术
猪轮状病毒(Porcine Rota Virus，PoRV)病是由轮状病毒感染引起的一种仔猪腹泻性疾病。轮状病毒种类很多，具有不同的血清型和基因型，且感染的宿主谱很广，人、鸡、猪、牛、马等动物的幼龄阶段皆有感染发生，主要临床表现为腹泻，并能与其他病原微生物发生协同作用，造成继发感染，从而引起猪群的高发病率和致死率，对各国养猪业的危害很大。
预防猪轮状病毒感染发生与传播的最有效手段是疫苗接种。目前，市售的猪轮状病毒疫苗绝大多数为转瓶培养工艺制备的活疫苗，相对于无血清全悬浮培养工艺而言，其具有用工人数多、生产成本高、培养过程无法实时监测、产品批次之间差异较大、副反应大、安全性差等诸多缺点。因此，分离能够进行无血清全悬浮培养的猪轮状病毒毒株，对于有效预防猪轮状病毒的感染具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一株分离的猪轮状病毒毒株；
本发明所要解决的第二个技术问题是提供所述猪轮状病毒毒株制备的灭活疫苗及其在防治猪轮状病毒病中的应用。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
本发明从中国吉林省某养猪场疑似猪轮状病毒感染的猪群中，分离得到一株猪轮状病毒毒株。病毒分离后，经在Marc-145细胞上进行3次蚀斑克隆纯化，得到一株免疫原性良好的疫苗株。血清学鉴定结果表明，该病毒只能被PoRV阳性血清特异性抑制，因此鉴定该病毒为猪轮状病毒，并命名为zyh25株。RT-PCR鉴定结果表明，用PoRV VP7基因的特异性引物对分离的病毒细胞培养物进行RT-PCR扩增，得到1062bp的目的基因片段，与预期结果相符。
本发明测定了分离的病毒zyh25株的病毒半数感染量(TCID50)，试验中对转瓶培养工艺和无血清全悬浮培养工艺进行了同步试验，以比较不同培养方式繁殖的病毒液在毒力方面的差异。测定结果显示，病毒zyh25株经Marc-145细胞转瓶培养、无血清全悬浮培养的病毒半数感染量分别为107.0TCID50/ml、108.0TCID50/ml。可见，单位体积内无血清全悬浮培养工艺所产的病毒含量更高。因此，本发明所分离的病毒zyh25株为能够进行无血清全悬浮连续生产的猪轮状病毒毒株。病毒zyh25株经转瓶工艺、悬浮工艺所制备的病毒液均能感染仔猪，造成仔猪的轮状病毒腹泻，对仔猪的最小感染剂量均为105.0TCID50/ml；不同生产工艺制备的灭活液对仔猪的最小免疫剂量都是105.0TCID50/ml。测定结果显示，本发明所分离的病毒zyh25株为致病性猪轮状病毒。
本发明将分离的猪轮状病毒zyh25株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.13792；分类命名为：猪轮状病毒。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2017年4月14日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明进一步公开了所述的猪轮状病毒zyh25株在制备防治猪轮状病毒病的疫苗中的应用。
本发明还公开了一种防治猪轮状病毒病的疫苗组合物，包括：预防或治疗上有效量的灭活的所述猪轮状病毒zyh25株和药学上可接受的佐剂。
本发明还公开了一种猪轮状病毒灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)培养所述的猪轮状病毒zyh25株，收获病毒液，离心，取上清液；(2)将上清液加入灭活剂进行灭活；(3)将灭活的上清液与佐剂混合，乳化，即得。
其中，步骤(1)用Marc-145细胞培养所述的猪轮状病毒zyh25株；优选的，所述培养是将猪轮状病毒zyh25株接种Marc-145细胞进行转瓶培养，收集细胞培养上清；或者，将猪轮状病毒zyh25株接种无血清全悬浮培养的Marc-145细胞，进行无血清全悬浮培养，收集培养物上清液；更优选的，所述培养是将猪轮状病毒zyh25株接种无血清全悬浮培养的Marc-145细胞，进行无血清全悬浮培养，收集培养物上清液。步骤(1)所述离心为5 000r/min离心30min。
步骤(2)所述灭活剂为福尔马林；优选的，所述灭活剂福尔马林的终浓度为0.1％(v/v)。所述灭活为37℃灭活48h。
步骤(3)所述佐剂为油佐剂；优选的，按照体积比计，灭活的上清液：佐剂＝1：2.5。本发明对所述油佐剂的种类没有特殊限制，例如Marcol52白油佐剂等常用于灭活疫苗制备的油佐剂均适用于本发明。
本发明进一步公开了所述制备方法制备得到的猪轮状病毒灭活疫苗。
免疫保护实验结果表明，病毒zyh25株分别经Marc-145细胞转瓶培养及无血清全悬浮培养扩增得到的两种病毒液，制备得到的油乳剂灭活疫苗免疫仔猪，在免疫后1周猪群就可检测到低水平的中和抗体效价，免疫后2周免疫组所有猪只都产生明显的抗体，平均中和抗体水平达1:32，免疫后3周各试验组的中和抗体水平达到高峰，平均效价达1:64以上，表明本发明分离的病毒zyh25株作为疫苗株具有良好的免疫原性，免疫动物以后能产生较高的抗体水平。并且，从抗体检测结果可以看出，在各个时间点无血清全悬浮工艺制备疫苗免疫组的抗体水平均要比转瓶培养工艺制备疫苗免疫组高，抗体水平上升也较快。从免疫保护结果可以看出，攻毒后，不同免疫组与对照组相比均起到良好的保护结果。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明从疑似猪轮状病毒感染猪群中分离得到一株致病性的猪轮状病毒zyh25株，该毒株作为疫苗株具有良好的免疫原性，免疫动物以后能产生较高的抗体水平，并且在各个时间点无血清全悬浮培养工艺制备疫苗免疫组的抗体水平均要比转瓶培养工艺制备疫苗免疫组高，抗体水平上升也较快。因此，本发明所分离的病毒zyh25株为能够进行无血清全悬浮连续生产的猪轮状病毒毒株，利用该毒株经无血清全悬浮培养工艺制备灭活疫苗具有生产成本低、产品批次之间差异小、安全性好等优点。
附图说明
图1为本发明所分离的猪轮状病毒zyh25毒株VP7基因的RT-PCR扩增结果；其中，M：DL2000Marker；1：分离的病毒的细胞培养液；2：不接种病毒的细胞培养液。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1猪轮状病毒zyh25毒株的分离及鉴定
1、实验方法
1.1病毒的分离
2016年从中国吉林省某养猪场的疑似猪轮状病毒发病的猪群中，无菌采取具有典型临床症状病猪的小肠组织剪碎，按1:5(W/V)比例加入灭菌生理盐水后，研钵研磨后，-40℃/室温冻融3次，3 000r/min离心15min，取上清液备用。
将上述病料上清液通过0.22μm微孔滤器除菌，接种含终浓度10μg/ml的trypsin的细胞维持液(含2万单位双抗的无血清DMEM培养基)，已长满Marc-145单层细胞的T25方瓶，每份病料接种4瓶细胞，每瓶接种0.2mL，同时作不接种对照，37℃，5％二氧化碳培养箱中培养。每天观察记录细胞病变情况，培养至72h无论细胞是否出现病变都收获细胞液，-40℃保存备用。
病毒分离后需要在Marc-145细胞上进行3次蚀斑克隆纯化，即每一次均取最高稀释度有蚀斑的点作为下一次传代纯化的种毒。如此经三次纯化后，以10-3稀释度接种含终浓度10μg/ml的trypsin的细胞维持液(含2万单位双抗的无血清DMEM培养基)，已长满Marc-145单层细胞的培养瓶，当接种细胞出现70-80％细胞病变时收获细胞悬液，经菌检证明无污染后，分装于小管中作为种毒贮存于-70℃。
1.2所分离的病毒株的血清学鉴定
将收获得到病毒细胞培养物悬液分别与PRRSV、CSFV、PRV、PEDV、TGEV及PPV等猪病的特异性阳性血清体外中和后，接种Marc-145细胞，除猪轮状病毒(PoRV)特异性阳性血清外，其余猪源病毒均能引起细胞病变。
1.3所分离的病毒株的RT-PCR鉴定
根据GenBank已发表的猪轮状病毒的基因序列，用Primer 5.0软件设计一对PoRVVP7基因的特异性引物，用于其序列的扩增。预期扩增产物片段长度为1062bp。引物序列如下：
上游引物：5′-GGCTTTAAAAGAGAGAAT-3′；
下游引物：5′-GGTCACATCATACAATTC-3′；
反应体系为：
PCR反应条件为：94℃3min；94℃30s；53℃30s；72℃3min，共35个循环，72℃延伸10min。
以上引物由长春库美生物科技有限公司合成。用PoRV VP7基因的特异性引物对分离病毒的细胞培养物进行RT-PCR扩增，另设空白对照。
2、实验结果
2.1病毒株的分离
病料经过3代细胞培养后，细胞病变逐渐稳定，出现细胞病变的时间开始缩短，细胞病变逐渐明显。病毒经适当稀释后，接种Marc-145细胞，收获60-70h病变典型的细胞培养物，经菌检证明无污染后，分装于小管中作为种毒贮存于-70℃。
2.2病毒株的血清学鉴定
取病毒分离为阳性的细胞液，用PRRSV、CSFV、PRV、PEDV、TGEV及PPV抗血清进行中和试验，不产生中和现象，表明分离株并非上述病毒株，结果只能被PoRV阳性血清所抑制。经中和试验，该病毒只能被PoRV阳性血清特异性抑制。因此，鉴定结果为猪轮状病毒，并命名为zyh25。
2.3病毒株的RT-PCR鉴定
用PoRV VP7基因的特异性引物对分离的病毒细胞培养物进行RT-PCR扩增，得到1062bp的目的基因片段(图1)，与预期结果相符。
本发明将分离的猪轮状病毒zyh25株提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.13792。
实验例1分离的猪轮状病毒zyh25株的致病性测定
1、实验方法
1.1病毒zyh25株在无血清全悬浮Marc-145细胞中的增殖
将纯化的病毒zyh25株用灭菌生理盐水稀释后，接种细胞密度为3-5*106cells/ml的无血清全悬浮的Marc-145细胞，37℃5％二氧化碳培养箱中，110rpm的摇床上悬浮培养60～72h，死亡病变细胞数量超过75％时，收获细胞悬液，放入-70℃冰箱中冻融3次，收获病毒液。传代10次，直至病毒在无血清全悬浮的Marc-145细胞增殖良好。
1.2病毒半数感染量(TCID50)测定
将状态良好的Marc-145细胞以2～3×104个/孔接种96孔细胞培养板，置37℃，5％CO2培养箱培养12～24h。弃去培养基，用无菌PBS洗涤已培养成单层的Marc-145细胞3遍，以去除培养基中的血清成分，避免血清对病毒吸附的影响。
用含10μg/ml的trypsin的细胞维持液(含2万单位双抗的无血清DMEM培养基)将zyh25株病毒液进行10倍梯度稀释，设置10-3～10-8 6个稀释梯度。将每个稀释度的病毒接种于Marc-145细胞，每个稀释度接种8孔，100μL/孔，37℃吸附1h左右。弃去吸附液，用灭菌PBS洗涤Marc-145细胞一遍，加入含终浓度10μg/ml的trypsin的细胞维持液(含2万单位双抗的无血清DMEM培养基)，置37℃，5％CO2培养箱培养，每隔12h观察1次，观察5-7日。待到细胞病变(CPE)不再发生变化时，用Reed-Muench公式计算TCID50。
根据TCID50结果，将病毒zyh25株稀释至不同剂量接种初生仔猪5ml/头，正常饲喂管理，每日观察详细记录仔猪发病情况，以评定分离的病毒zyh25株对仔猪的致病性。
2、实验结果
试验中对转瓶工艺和无血清全悬浮培养工艺进行了同步试验，以比较不同培养方式繁殖的病毒液在毒力方面的差异。测定结果显示(表1、表2)，病毒zyh25株转瓶工艺、无血清全悬浮工艺的病毒半数感染量分别为107.0TCID50/ml和108.0TCID50/ml。
根据TCID50结果，将猪轮状病毒zyh25株以不同剂量接种10头初生仔猪(5ml/头)后，72h内9头仔猪开始陆续出现腹泻现象，经RT-PCR检测，发病猪只均为猪轮状病毒感染，发病率为90％。转瓶工艺、悬浮工艺所制备的病毒液均能感染仔猪，造成仔猪的轮状病毒腹泻，对仔猪的最小感染剂量均为105.0TCID50/ml。测定结果显示，本发明所分离的病毒zyh25株为致病性猪轮状病毒。
表1转瓶培养病毒TCID50测定结果
表2悬浮培养病毒TCID50测定结果
实验例2猪轮状病毒zyh25株的免疫保护实验
1、实验方法
1.1病毒的扩增
分离的病毒zyh25株分别经Marc-145细胞转瓶培养扩增(收集细胞培养上清)及接种无血清全悬浮培养Marc-145细胞(收集培养上清液)，收获培养物上清液，分装，置于-70℃保存备用。
1.2灭活疫苗的制备
经转瓶工艺和无血清全悬浮工艺扩增的两种病毒液5 000r/min离心30min，取上清，加入终浓度0.1％(v/v)的福尔马林溶液，于37℃灭活48h。经过无菌性检验之后，将灭活病毒液上清分别与Marcol 52白油佐剂按体积比1：2.5混合，乳化后用于动物免疫。
1.3免疫及攻毒
为了排除免疫抗原量对免疫效果的影响，根据试验中测得的数据，通过用空白DMEM培养基稀释的方法，将经转瓶工艺和悬浮工艺扩增的两种病毒液调整为具有相同TCID50的2组病毒液，分别制备成油乳剂灭活苗，各组免疫相同的剂量后，观察免疫及保护效果。
实验动物分组：
NC/NE—表示未经稀释的转瓶工艺毒和全悬浮工艺毒制备疫苗免疫组；
TC/TE—表示经稀释得到的具有相同TCID50的转瓶毒和悬浮毒制备疫苗免疫组；
每组5头仔猪，同时设置哈尔滨维科生物技术开发公司生产销售的商品化疫苗猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒(G5型)三联活疫苗(弱毒华株+弱毒CV777株+NX株)2016024批做参考疫苗、5头不免疫作为攻毒空白对照组。
所有试验猪进行免疫，免疫前采血，血清中和抗体检测均为1:4以下。灭活疫苗按每头仔猪2m1的剂量经后海穴接种免疫。首次免疫后第7、14、21天采血，用血清中和法检测抗体效价。免疫4周后，用分离的病毒zyh25株F5代细胞培养物上清做攻毒试验。攻毒剂量均为每头猪2*105.0TCID50。攻毒后的第3、5、7天分别采取咽喉和肛门拭子，进行病毒分离检测，取处理后的样本上清液，采用RT-PCR鉴定，如果扩增得到1062bp的目的基因片段，则确定病毒分离为阳性。
2、实验结果
将分离的病毒zyh25株油乳剂灭活疫苗免疫猪只，并排除了免疫时抗原量对各组免疫保护效果的影响，在免疫后1周猪群就可检测到低水平的中和抗体效价，免疫后2周免疫组所有猪只都产生明显的抗体，平均中和抗体水平达1:32，免疫后3周各试验组的中和抗体水平达到高峰，平均效价达1:64以上(表3)，表明分离的病毒zyh25株作为疫苗株具有良好的免疫原性，免疫动物以后能产生较高的抗体水平。并且从抗体检测结果可以看出，在各个时间点悬浮工艺毒制备疫苗免疫组的抗体水平均要比转瓶毒制备疫苗免疫组高，抗体水平上升也较快。从免疫保护结果可以看出(表4)，不同攻毒试验组免疫后与对照组相比均起到良好的保护结果。
RT-PCR鉴定结果表明，对照组扩增得到1062bp的目的基因片段，与预期结果相符，确定病毒分离为阳性；免疫组PCR电泳产物无条带。
本发明所分离的病毒zyh25株为能进行无血清全悬浮连续生产的猪轮状病毒毒株。
表3不同试验组在免疫后不同时间的抗体水平
表4不同试验组免疫攻毒后保护结果
SEQUENCE LISTING
<110> 吉林正业生物制品股份有限公司
<120> 猪轮状病毒毒株及其制备的灭活疫苗和应用
<130> JL-3002-170904A
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 1
ggctttaaaa gagagaat 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> artifical sequence
<400> 2
ggtcacatca tacaattc 18

Claims (10)

1.一株分离的猪轮状病毒zyh25株，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.13792。
2.权利要求1所述的猪轮状病毒zyh25株在制备防治猪轮状病毒病的疫苗中的应用。
3.一种防治猪轮状病毒病的疫苗组合物，其特征在于，包括：预防或治疗上有效量的灭活的权利要求1所述猪轮状病毒zyh25株和药学上可接受的佐剂。
4.一种猪轮状病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)培养权利要求1所述的猪轮状病毒zyh25株，收获病毒液，离心，取上清液；(2)将上清液加入灭活剂进行灭活；(3)将灭活的上清液与佐剂混合，乳化，即得。
5.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)用Marc-145细胞培养权利要求1所述的猪轮状病毒zyh25株；
优选的，所述培养是将猪轮状病毒zyh25株接种Marc-145细胞进行转瓶培养；或者，将猪轮状病毒zyh25株接种无血清全悬浮培养的Marc-145细胞，进行无血清全悬浮培养；
更优选的，所述培养是将猪轮状病毒zyh25株接种无血清全悬浮培养的Marc-145细胞，进行无血清全悬浮培养。
6.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述灭活剂为福尔马林；优选的，按照体积比计，所述灭活剂的终浓度为0.1％。
7.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述灭活为37℃灭活48h。
8.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)按照体积比计，灭活的上清液：佐剂＝1：2.5。
9.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述离心为5 000r/min离心30min；
步骤(3)所述佐剂为油佐剂。
10.权利要求4至9任何一项所述制备方法制备得到的猪轮状病毒灭活疫苗。
CN201711107884.0A 2017-11-10 2017-11-10 猪轮状病毒毒株及其制备的灭活疫苗和应用 Active CN107988170B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711107884.0A CN107988170B (zh) 2017-11-10 2017-11-10 猪轮状病毒毒株及其制备的灭活疫苗和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711107884.0A CN107988170B (zh) 2017-11-10 2017-11-10 猪轮状病毒毒株及其制备的灭活疫苗和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107988170A true CN107988170A (zh) 2018-05-04
CN107988170B CN107988170B (zh) 2021-06-15

Family

ID=62030342

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711107884.0A Active CN107988170B (zh) 2017-11-10 2017-11-10 猪轮状病毒毒株及其制备的灭活疫苗和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107988170B (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112592921A (zh) * 2020-12-23 2021-04-02 四川大学 引物组及其在构建g5型猪轮状病毒的重组杆状病毒样颗粒中的应用
CN113186170A (zh) * 2021-05-26 2021-07-30 西南民族大学 一株猪轮状病毒株及其制备的灭活疫苗和用途
CN114751978A (zh) * 2022-04-07 2022-07-15 武汉科前生物股份有限公司 一种猪轮状病毒特异性阳性血清及其制备方法
CN114854697A (zh) * 2022-04-09 2022-08-05 武汉科前生物股份有限公司 一种猪轮状病毒g4-g5-g9型三价灭活疫苗及其制备方法和用途
CN115786276A (zh) * 2022-09-26 2023-03-14 西南民族大学 牦牛轮状病毒分离株及其应用
CN117737005A (zh) * 2024-01-31 2024-03-22 金宇保灵生物药品有限公司 一株猪轮状病毒毒株及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009038283A1 (en) * 2007-09-21 2009-03-26 REPUBLIC OF KOREA(Management : Ministry of Agriculture and Forestry, National Veterinary Research & Quarantive Service Vector for cell surface expression of pig igg fc domain, host cell transformed with the vector, and method of manufacturing vaccine against viruses related to pig diseases using the host cell

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009038283A1 (en) * 2007-09-21 2009-03-26 REPUBLIC OF KOREA(Management : Ministry of Agriculture and Forestry, National Veterinary Research & Quarantive Service Vector for cell surface expression of pig igg fc domain, host cell transformed with the vector, and method of manufacturing vaccine against viruses related to pig diseases using the host cell

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
史月明: "猪轮状病毒油乳剂灭活疫苗的制备及免疫性试验", 《万方数据知识服务平台》 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112592921A (zh) * 2020-12-23 2021-04-02 四川大学 引物组及其在构建g5型猪轮状病毒的重组杆状病毒样颗粒中的应用
CN113186170A (zh) * 2021-05-26 2021-07-30 西南民族大学 一株猪轮状病毒株及其制备的灭活疫苗和用途
CN113186170B (zh) * 2021-05-26 2022-08-23 西南民族大学 一株猪轮状病毒株及其制备的灭活疫苗和用途
CN114751978A (zh) * 2022-04-07 2022-07-15 武汉科前生物股份有限公司 一种猪轮状病毒特异性阳性血清及其制备方法
CN114751978B (zh) * 2022-04-07 2023-10-27 武汉科前生物股份有限公司 一种猪轮状病毒特异性阳性血清及其制备方法
CN114854697A (zh) * 2022-04-09 2022-08-05 武汉科前生物股份有限公司 一种猪轮状病毒g4-g5-g9型三价灭活疫苗及其制备方法和用途
CN114854697B (zh) * 2022-04-09 2023-09-19 武汉科前生物股份有限公司 一种猪轮状病毒g4-g5-g9型三价灭活疫苗及其制备方法和用途
CN115786276A (zh) * 2022-09-26 2023-03-14 西南民族大学 牦牛轮状病毒分离株及其应用
CN115786276B (zh) * 2022-09-26 2024-04-09 西南民族大学 牦牛轮状病毒分离株及其应用
CN117737005A (zh) * 2024-01-31 2024-03-22 金宇保灵生物药品有限公司 一株猪轮状病毒毒株及其应用
CN117737005B (zh) * 2024-01-31 2024-05-14 金宇保灵生物药品有限公司 一株猪轮状病毒毒株及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN107988170B (zh) 2021-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107988170A (zh) 猪轮状病毒毒株及其制备的灭活疫苗和应用
CN104788561B (zh) 抗猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒卵黄抗体及其制备方法
CN102220287B (zh) 鸡传染性支气管炎冷适应致弱疫苗株及其应用
CN104805060B (zh) 一种伪狂犬病病毒及其应用
CN107177001B (zh) 一种防治猪流行性腹泻病的卵黄抗体及其制备方法
CN108486067A (zh) 猪流行性腹泻病毒变异株及其制备的灭活疫苗和应用
CN107899007B (zh) 猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪δ冠状病毒的三联灭活疫苗及其制备方法
CN106591244A (zh) 一种猪流行性腹泻病毒、灭活疫苗及其制备方法
CN103497934B (zh) 鸡传染性支气管炎病毒疫苗株（hf2株）及其应用
CN101818163B (zh) 表达亚洲1型口蹄疫病毒vlp的重组腺病毒及其应用
CN107893057A (zh) 鸡传染性支气管炎病毒弱毒株及其构建方法和应用
CN102747092B (zh) 表达o型口蹄疫病毒空衣壳的重组缺损腺病毒及其应用
CN104087559B (zh) 一种传染性法氏囊病毒、灭活疫苗及其制备方法
CN103705918B (zh) 抗猪流行性腹泻病毒高免血清及其制备方法
CN103146654B (zh) 一株人工弱化的鸡传染性支气管炎病毒及其应用
CN102533798B (zh) 表达a型口蹄疫病毒空衣壳重组腺病毒及其应用
CN102727883A (zh) 猪繁殖与呼吸综合征与猪瘟二联疫苗及其用途
CN104388396B (zh) 猪伪狂犬病毒毒株及由其制备的灭活疫苗和应用
CN111647568A (zh) 鸡传染性法氏囊病病毒新型变异株反向遗传疫苗株及其应用
CN104130981A (zh) 鸡传染性支气管炎病毒疫苗株及其在制备灭活疫苗中的应用
CN108251382A (zh) 一种猪伪狂犬病病毒致弱方法、及其致弱的病毒株、疫苗组合物和应用
CN103937753A (zh) H9n2亚型禽流感病毒毒株及其灭活疫苗和应用
CN110302374A (zh) 犬用疫苗及其制备方法和应用
CN104208666A (zh) 一种疫苗组合物及其制备方法和应用
CN104069489B (zh) 鸡新城疫和传染性法氏囊二联灭活疫苗及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant