CN112592921A - 引物组及其在构建g5型猪轮状病毒的重组杆状病毒样颗粒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种引物组及其在构建G5型猪轮状病毒的重组杆状病毒样颗粒中的应用，其中第一引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，第一引物的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，第二引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，第二引物的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；第三引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，第三引物的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；集中于同一病毒样颗粒中可表达式可以同时表达，具有多亚基蛋白结构，且其保留了自组装的能力，没有遗传物质，但模仿了天然病毒颗粒的整体结构且没有传染性。

Description

引物组及其在构建G5型猪轮状病毒的重组杆状病毒样颗粒中 的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种引物组，引物组在构建同时含有VP2、VP6以及VP7表达的目的蛋白的重组杆状病毒样颗粒中的应用，其中重组杆状病毒样颗粒的表达是基于Bac-to-Bac杆状病毒表达系统。

背景技术

猪轮状病毒(Rotavirus RV)属呼肠孤病毒科(Reoviridae)、轮状病毒属(Rotavirus)成员，为无囊膜的二十面体粒子，直径约为66-75nm，基因组大小为18,522bp，由11个分节段的双链RNA(dsRNA)组成，编码6个结构蛋白(VP1-VP4,VP6,VP7)和5或6个非结构蛋白(NSP1-NSP5/NSP6)。根据VP6蛋白的抗原性，轮状病毒(RV)分为9个不同的血清型(RVA-RVJ)，其中RVB、RVC、RVE、RVH和RVI可以感染各种哺乳动物，RVA、RVB、RVC、RVE和RVH可以感染猪，RVA、RVB、RVC、RVH可以感染人，而RVD、RVF和RVG可以感染家禽，如鸡和火鸡。根据两种含有中和抗原表位的外衣壳蛋白VP7和VP4，可将轮状病毒分为不同的G和P基因型，35种G和50种P基因型已在世界各地被报道。根据不同的血清型和VP7、VP4基因型，RCWG建议轮状病毒的命名方式为RV group/来源/分离鉴定的地区/名字/分离鉴定的时间/G型P型。

该轮状病毒是引起婴幼儿和幼畜急性非细菌性腹泻的重要病原之一。该轮状病毒感染宿主范围广泛，包括人、猪、牛、羊、兔、犬及多种畜禽等。该猪轮状病毒可引起婴幼儿及各品种幼龄动物发生非细菌性腹泻，并导致较高的死亡率。5岁以下的婴幼儿因轮状病毒而发生的急性腹泻和死亡占儿科肠道感染病例的50％以上。数据表明发展中国家，每年平均有527000个儿童因感染轮状病毒而死亡。我国以前每年因轮状病毒感染而发生腹泻的儿童住院率高达13％。给我国公共卫生事业造成了严重的危害。诸多发于8周龄以内的仔猪并且猪的轮状病毒感染具有明显的季节性多发于每年12月份至翌年1-2月，夏季也有该病爆发的报道。并且各种年龄、性别的猪都可感染轮状病毒。一周龄内的仔猪在无母源抗体保护的情况下，感染轮状病毒后死亡率高达100％，随着年龄的增长，猪感染轮状病毒的症状有所减轻。20日龄哺乳仔猪感染轮状病毒后症状较轻，死亡率也较低，常呈耐过状态或隐形带毒。仔猪轮状病毒腹泻是一种以腹泻、厌食、呕吐、脱水为特征的传染病，常爆发于两个阶段，第一，它易发生在哺乳期，尤其是缺乏母源抗体的后备母猪所生产的仔猪。第二，轮状病毒常引起断奶仔猪发生腹泻，因为断奶致使母源抗体突然丢失，仔猪抵抗力降低而出现感染。

RVA毒株至少鉴定出了11种不同G型，其中G5型(45.8％)是目前最流行的基因型，其次是G3型(11.2％)和G4型(9.6％)，在17种不同的P型中最普遍的是P[7]型(47.4％)，其次是P[6]型(15.9％)和P[13]型(3.2％)，在47种不同的G型和P型的组合中最常见的是G5P[7]型(37.4％)(Papp et al.2013)。在轮状病毒的9种不同的分型中，G5型RVA被认为是最普遍和最流行的毒株。

目前主要应用的是传统的灭活苗和弱毒苗。灭活疫苗制造工艺简单，性质比较稳定，易于保存和运输。但是灭活疫苗在灭活过程中可能损害或改变有效的抗原决定簇，因而可能需要抗原量大，成本比较高。弱毒活疫苗在仔猪体内可以增值，有较好的保护性，但弱毒活疫苗在动物体内有毒力返祖的潜在危险性，可能形成潜在感染或传播。传统疫苗的不稳定性，就迫切需要研制新型疫苗和探索新的免疫机制来预防和控制RV感染发病。

发明内容

针对传统的灭活苗在灭活过程中可能损害或改变有效的抗原决定簇，因而可能需要抗原量大，成本比较高；弱毒苗在动物体内有毒力返祖的潜在危险性，可能形成潜在感染或传播的问题，本发明提供一种引物组。

本发明的技术方案为：一种引物组，包括第一引物、第二引物以及第三引物；

其中第一引物的上游引物的核苷酸序列为：TCTAGAATGGCGTACAGGAAGCGYGG，第一引物的下游引物的核苷酸序列为：AAGCTTTTACAGTTCGTTCATDATGCGC；

第二引物的上游引物的核苷酸序列为：TCTAGAATGGAGGTTCTGTACTCATTG，第二引物的下游引物的核苷酸序列为：AAGCTTTCACTTAATC AACATGCTTCTA；

第三引物的上游引物的核苷酸序列为：TCTAGAATGTATGGTATTGAATATACCA，第三引物的下游引物的核苷酸序列为：AAGCTTCTAAACTCGRTARTARAATGC。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：该引物组具有良好的特异性，使得构建得到的VP2基因、VP6基因以及VP7基因能够准确表达得到相应的目的蛋白；引物用于前期质粒的正确构建，对后期的成功表达有一定的影响，是后期穿梭质粒感染细胞成功表达蛋白的基础。

本发明还提供了上述引物组在构建VP2基因、VP6基因以及VP7基因中的应用。

进一步限定，构建VP2基因、VP6基因以及VP7基因的具体步骤如下：

S1：从弱毒性疫苗中提取RNA；

S2：RNA进行PCR扩增反应；

S3：纯化得到上述VP2、VP6以及VP7各自的基因。

本发明还提供了上述所构建的VP2基因、VP6基因以及VP7基因在构建同时含有VP2基因、VP6基因以及VP7基因的重组杆状病毒样颗粒中的应用。

进一步限定，构建在构建同时含有VP2、VP6以及VP7表达的目的蛋白的重组杆状病毒样颗粒中的应用，具体步骤如下：

H1：利用VP2、VP6以及VP7各自的基因与载体连接且转化得到各自的重组质粒；

H2：重组质粒的提纯；

H3：重组质粒的酶切反应得到VP2、VP6以及VP7各自的基因片段；

H4：VP2、VP6以及VP7各自的基因片段与带有相同粘性末端的载体连接并转化第一感受态细菌；

H5：第一感受态细菌的鉴定结果为阳性则为VP2、VP6以及VP7各自的目的重组质粒；

H6：将VP2、VP6以及VP7各自的目的重组质粒转化第二感受态细菌，提取PCR鉴定为阳性的各自的重组质粒；

H7：将鉴定为阳性的各自的重组质粒转染对数生长期的细胞，得到各自的第一代重组杆状病毒样颗粒；

H8：各自的第一代重组杆状病毒样颗粒分别进行传代培养且培养完成后转染对数生长期的细胞且传代培养至第三代，收集各自表达得到第三代重组杆状病毒样颗粒；

H9：利用各自表达得到第三代重组杆状病毒样颗粒共感染对数期的细胞，得到同时含有VP2基因、VP6基因以及VP7基因的重组杆状病毒样颗粒。

进一步限定，所述第二感受态细菌中含有杆状病毒穿梭载体和具有编码转座酶和四环素抗性基因的辅助质粒。

进一步限定，所述第一感受态细菌为DH5α感受态细菌。

本发明还公开了上述所构建的同时含有VP2基因、VP6基因以及VP7基因表达的目的蛋白的重组杆状病毒样颗粒在预防非细菌性腹泻中的应用。

本发明还公开了上述所构建的同时含有VP2基因、VP6基因以及VP7基因表达的目的蛋白的重组杆状病毒样颗粒在细胞相互作用研究中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：同时含有VP2基因、VP6基因以及VP7基因表达的目的蛋白的重组杆状病毒样颗粒即将三种基因集中于同一病毒样颗粒中可表达式可以同时表达，具有多亚基蛋白结构，取代了传统的三联疫苗，且其保留了自组装的能力，没有遗传物质，但模仿了天然病毒颗粒的整体结构且没有传染性；同时含有VP2基因、VP6基因以及VP7基因的重组杆状病毒样颗粒的大小为20至100nm范围内，对于树突细胞摄取纳米颗粒和随后的T细胞活化是最佳的且提供用于展示构象表位的空间结构，并且可以用作在嵌合VLP上呈递外源表位或靶向分子的平台。

附图说明

图1是纯化染色后的同时含有VP2基因、VP6基因以及VP7基因表达的目的蛋白的重组杆状病毒样颗粒的透射电镜图；

图2是各VP2、VP6以及VP7各自的第一代重组杆状病毒样颗粒表达得到的目的蛋白的电泳图；

图3是纯化的同时含有VP2基因、VP6基因以及VP7基因表达的目的蛋白的重组杆状病毒样颗粒的形成情况图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的实施例进行详细、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)，具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语，应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非被特定定义，否则不会用理想化或过于正式的含义来解释。

实施例1

毒株的获取

大肠杆菌DH5α感受态细胞购自大连宝生物公司(Takara)；pGEM-TEasy(pT)VectorSystem购自Promega公司；pFastbac-1质粒、大肠杆菌DH10Ba感受态细胞、Sf9昆虫细胞购自Invitrogen公司。

实施例2

VP2、VP6和VP7基因的构建

1.购买市面上哈兽研发的猪轮状病毒弱毒疫苗，该弱毒疫苗是G5型，是我国流行的主要猪轮状病毒类型。随后将该弱毒疫苗置于超净工作台中提取病毒RNA，操作步骤如下：

2.将300μL弱毒疫苗液体和700μL 4℃预冷的RNAlso Plus温和混匀，室温静置5min；

3.加入200μL氯仿，振荡混匀后，室温静置15min,12000r/min，4℃离心10min；

4.弃沉淀，将上清移至新的无菌离心管中，加入700μL 4℃预冷的异丙醇，室温静置10min；

5.7500r/min，4℃离心10min；

6.弃上清，用1ml 75％的乙醇重悬洗涤沉淀后，12000r/min，4℃离心15min；

7.弃上清后，将离心管敞口在超净台中风干沉淀；

8.用适量的RNase-free水溶解沉淀，-20℃保存备用。

将上一步获得的病毒总RNA为模板，按照TakaRa公司的PrimeScript RT reagentkit反转录试剂盒标准步骤合成cDNA，反应体系：

总RNA	8.4μL
		5×PrimeScript Buffer	2μL
Oligo dT Primer	0.5μL
		Random 6mers	0.5μL
PrimeScript RT Enzyme Mix1	0.5μL

反应体系在PCR管中混匀后，置于PCR仪，条件为：37℃，15min；85℃,5s。cDNA产物置于-20℃保存备用。

分别使用表1中引物扩增VP2、VP6及VP7基因。

表1.扩增VP2、VP6及VP7基因引物

注：表中下划线碱基为限制性内切酶识别位点；

用NEB公司的Q5超保真DNA聚合酶进行PCR反应，体系如下：

Q5 High-Fidelity 2×Master Mix	25μL
		上游引物(10μM)	2.5μL
下游引物(10μM)	2.5μL
		cDNA	2μL
Nuclease-Free H<sub>2</sub>O	18μL

PCR反应条件：98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸60s，循环30次；72℃延伸5min。

分别取5μL上述PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳初步鉴定与预期相符后，用Omega公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购纯化回收目的DNA片段。操作步骤如下：DNA经凝胶电泳分离后，从凝胶中切下目的条带，转移至1.5mL无菌离心管中，称重，加入其质量相对3倍体积的溶液PN，50℃水浴中放置10min，待琼脂完全融化；将溶液转入吸附柱CA2中(CA2放于收集管中)，室温放置2min，12000r/min离心1min，弃废液，向CA2中加入600μL漂洗液PW，12000r/min离心1min，重复漂洗一次；弃废液后，将CA2放回收集管中，12000r/min离心2min，弃除残留的PW，室温放置5min；将CA2转入无菌的1.5mL离心管中，加入20μL去离子水，室温放置2min，12000r/min离心2min，收集的溶液中即含有相应的目的片段；置于-20℃保存备用。

随后将VP2、VP6及VP7基因分别与pGEM-T Easy(pT)Vector连接，反应体系如下：

2×T<sub>4</sub> DNA Ligase Buffer	5μL
		目的基因	3μL
T<sub>4</sub> DNA Ligase	1μL
		pGEM-T Easy	1μL

反应条件：混匀后，4℃连接过夜。

转化反应：将5μL上述连接产物，加入到100μL DH5α感受态细菌中；轻轻混匀后，冰浴30min，42℃热休克2min，再冰浴2min；加入不含抗生素的LB液体培养基900μL，于37℃恒温摇床中120r/min培养45min，3000r/min离心2min，弃部分上清，将剩余的100μL左右菌液中沉淀悬起；混匀后涂布于含有X-gal和IPTG的50μg/mL氨苄青霉素抗性的LB平板上，置于37℃恒温生化培养箱中，培养16h左右，通过蓝白斑筛选出阳性克隆；接种于50μg/mL氨苄青霉素抗性的LB培养液中，于37℃恒温摇床中200r/min摇菌16h左右。

实施例3

VP2、VP6及VP7的重组杆状病毒的构建

提取pFastbac-1载体、pGEM-T-VP2、pGEM-T-VP6及pGEM-T-VP7质粒：方法步骤：收集菌液于干净的1.5mL离心管中，12000r/min离心1min，弃上清，向沉淀中加入250μL溶液P1，振荡混匀，重悬沉淀，再加入250μL溶液P2，温和翻转6～8次使菌体充分裂解，加入350μL溶液P3，充分混匀，12000r/min离心10min；此时收集上清于吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，12000r/min离心1min，弃收集管中废液，向CP3中加入600μL漂洗液PW，12000r/min离心1min，重复漂洗一次；将CP3放入收集管中，12000r/min离心2min，去除残留PW，将CP3转入干净的1.5mL离心管中，向CP3中滴加50μL无菌的去离子水，室温静置2min后，12000r/min离心2min，收集质粒溶液。质粒置于-20℃保存备用。

pFastbac-1载体，pGEM-T-VP2、pGEM-T-VP6及pGEM-T-VP7分别用Xba I和Hind III双酶切，反应体系如下：

pFastbac-1/pGEM-T-VP2/pGEM-T-VP6/pGEM-T-VP7	8μL
		EcoR I	0.5μL
Hind III	0.5μL
		10×CutSmart Buffer	1μL

酶切反应条件：将上述反应体系在离心管中混匀后，金属浴37℃孵育2h。

酶切后的基因片段及载体片段胶回收纯化后，分别将切下的VP2,VP6及VP7与带有相同粘性末端的pFastbac-1载体连接并转化DH5α感受态细菌。鉴定为阳性的菌分别命名为：pFB-VP2、pFB-VP6及pFB-VP7。

分别提取pFB-VP2、pFB-VP6及pFB-VP7质粒，并转化含有杆状病毒穿梭载体(Bacmid)和具有编码转座酶和四环素抗性基因的辅助质粒(Helper)的DH10Bac感受态细胞。提取经PCR鉴定为阳性的质粒，具体方法如下：首先，平衡过滤柱：在过滤柱中2ml EQ1溶液，是其在重力作用下自由沉降；收集菌体：对1.5mL菌液9000r/min离心10min，除去上清；加入400μL含有RNase A的R3溶液重悬混匀沉淀；加入400μL裂解液L7，轻轻混匀，不可采用漩涡振荡，静置于室温，使其反应5min；加入400μL N3溶液，立即上下颠倒轻微混匀后，室温，15000r/min离心20min；将上清转移到已经过平衡处理过滤柱中，液体通过重力作用自然流下，然后用2.5mL漂洗液PW洗涤两次；此后的操作转移到超净工作台中进行。将过滤柱置于干净的1.5mL离心管中，加入900μL洗脱液E4，随重力自然沉降，将DNA洗脱下来；加630μL异丙醇至洗出液中，混匀后冰浴10min，4℃，12000r/min低温离心30min，小心弃除上清；用1mL70％乙醇重悬DNA沉淀，4℃，15000r/min低温离心5min，弃上清；在超净台内使离心管敞口、自然风干10min，用20μL无热源水重悬、溶解DNA 10min，保存于-20℃，分别命名为rB-VP2、rB-VP6及rB-VP7，备用。

利用脂质体介导的方法，将构建的各重组穿梭质粒：rB-VP2、rB-VP6及rB-VP7分别转染对数生长期的Sf9昆虫细胞，以下为具体操作方法：用不含抗生素和血清的Unsupplement Grace培养基将生长在对数期的Sf9昆虫细胞接种到六孔板，每孔2ml，室温贴壁15min；制备DNA和脂质体混合物：先分别用100μL转染用的Unsupplement Grace细胞培养液将8μL的脂质体CellfectinⅡ和1μg的重组穿梭载体稀释，然后再将制备的CellfectinⅡ与质粒稀释液轻轻混合均匀(体积约为210μL)，室温孵育30min；在6孔板内的细胞中逐滴加入约210μL的上述DNA与脂质体的混合物；同时，以仅含8μL转染试剂而不含DNA的等量转染用培养基一孔Sf9昆虫细胞中作为阴性对照，以排除由于脂质体本身对细胞的毒性作用而对试验结果造成的干扰；27℃培养4h；除去6孔板中Unsupplement Grace细胞培养液，每孔加入2mL的完全培养基sf-900IISFM，置于27℃继续培养；每日在显微镜下观察细胞的生长状态，直到细胞出现变大、结团、脱壁甚至破裂等明显的病变症状。此时，收获6孔板内细胞培养混合物，500r/min低速离心5min以除去混合物中细胞及碎片。弃沉淀后，将上清收获并分装于干净的离心管中，作为第一代重组杆状病毒(P1)，-80℃保存。将各重组病毒分别命名为rBV-VP2、rBV-VP6及rBV-VP7。

实施例4

Western blot鉴定蛋白表达

将上述各第一代重组杆状病毒传至第3代，分别以5个MOI单独感染T25细胞培养瓶中生长在对数期的Sf9昆虫细胞，感染3d后，分别收集培养上清和细胞沉淀。细胞沉淀样品由PBS重悬，再经过超声破碎和-80℃冻融处理后，4℃，12,000r/min离心10min弃除杂质，收集上清。再将之前收集的细胞培养上清样品与经过处理的细胞沉淀样品分别与2×SDS上样缓冲液混匀，沸水浴10min。再通过离心去除样品中残渣，以防样品中仍有杂质会对之后的电泳试验带来影响。然后进行12％的SDS-PAGE电泳。电泳结束后，利用Western-blot试验检测目的蛋白，一抗为鼠源HIS标签抗体，二抗为羊抗鼠IgG抗体。

Western-blot试验的具体步骤为：通过半干转方法将蛋白转印至NC膜上，采用恒电流方式，电流大小以及转膜时间根据NC膜面积和蛋白分子量大小相应调整。将转好的NC膜放入5％脱脂奶中，4℃封闭过夜；将NC膜从封闭液中取出，用1×PBS洗膜3次，10min/次；加入1:500稀释后的一抗，室温，摇床孵育2h；用1×PBS洗4次，3min/次；然后加入1:1000稀释的二抗，室温，摇床孵育1h；用1×PBS洗5次，3min/次；用DAB显色，结果如图1所示，如图1所示，WB鉴定各目的蛋白在Sf9细胞中的表达情况，注：M为蛋白Marker，条带对应的蛋白分子量标于图1的左部分；泳道1到3分别对应Baculovirus-vp2、Baculovirus-vp6以及Baculovirus-vp7感染细胞样品。

实施例5

同时含有VP2基因、VP6基因以及VP7基因表达的目的蛋白的重组杆状病毒样颗粒的纯化

用rBV-VP2、rBV-VP6及rBV-VP7以5MOI共感染对数期的SF9昆虫细胞96小时后，4000r/min，4℃离心20分钟。取上清80000r/min，4℃超速离心1.5小时，将沉淀用PBS重悬，配制20％、30％、40％和50％的蔗糖梯度，进行蔗糖密度梯度离心，将溶于PBS的沉淀样品缓缓加入到蔗糖密度梯度的最上层；80000r/min，4℃，超速离心4h；用长针头将30％-40％蔗糖密度梯度之间明显的白色条带缓慢吸出；再将此样品加入另一个装满PBS的超速离心管中，混匀，80000r/min，4℃，离心4h，弃上清，用PBS重悬VLPs沉淀，置于-80℃保存，备用。

利用透射电镜(JEM-100CX,JEOL,Japan)观察经蔗糖密度梯度离心纯化后的同时含有VP2基因、VP6基因以及VP7基因表达的目的蛋白的重组杆状病毒样颗粒的形态。具体方法为：取1μL的VLPs样品滴加到200目铜网上，吸附5min；用吸水纸将多余的样品吸除，用2％的磷钨酸(PTA)对样品负染色1min；风干后，转到电镜下观察，结果如图2所示。

rBV-VP2、rBV-VP6及rBV-VP7蛋白的表达

样品经适当处理后，通过10％的分离胶进行SDS-PAGE电泳，然后转移到PVDF膜上进行Western-blot检测试验，检测同时含有VP2基因、VP6基因以及VP7基因的病毒中目的蛋白的表达情况。检测结果显示：rBV-VP2、rBV-VP6及rBV-VP7这三种病毒感染的细胞样品中，均检测到相应的特异性免疫印迹。

对纯化后的同时含有VP2基因、VP6基因以及VP7基因表达的目的蛋白的重组杆状病毒样颗粒进行磷钨酸负染色处理之后，用透射电镜观察VLPs的形成情况。结果显示，在MOI为5的情况下观察到了典型球形的病毒样颗粒，如图3所示：病毒样颗粒的大小和形态与天然的IBV病毒粒子比较接近，直径在100nm左右，图3中左部的颗粒周围环绕一层明显的状若皇冠的突起。

本发明不局限于上述可选实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是落入本发明权利要求界定范围内的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 四川大学

<120> 引物组及其在构建G5型猪轮状病毒的重组杆状病毒样颗粒中的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 猪轮状病毒(Rotavirus RV)

<400> 1

tctagaatgg cgtacaggaa gcgygg 26

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 猪轮状病毒(Rotavirus RV)

<400> 2

aagcttttac agttcgttca tdatgcgc 28

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 猪轮状病毒(Rotavirus RV)

<400> 3

tctagaatgg aggttctgta ctcattg 27

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 猪轮状病毒(Rotavirus RV)

<400> 4

aagctttcac ttaatcaaca tgcttcta 28

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 猪轮状病毒(Rotavirus RV)

<400> 5

tctagaatgt atggtattga atatacca 28

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 猪轮状病毒(Rotavirus RV)

<400> 6

aagcttctaa actcgrtart araatgc 27

Claims (9)

1.一种引物组，其特征在于，包括第一引物、第二引物以及第三引物；

其中第一引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，第一引物的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

第二引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，第二引物的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

第三引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，第三引物的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。

2.如权利要求1所述的引物组在构建G5型猪轮状病毒的VP2基因、VP6基因以及VP7基因中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，构建VP2基因、VP6基因以及VP7基因的具体步骤如下：

S1：从弱毒性疫苗中提取RNA；

S2：RNA进行PCR扩增反应；

S3：纯化得到上述VP2、VP6以及VP7各自的基因。

4.如权利要求3所述的应用中所构建的构建G5型猪轮状病毒的VP2基因、VP6基因以及VP7基因在构建同时含有VP2、VP6以及VP7表达的目的蛋白的G5型猪轮状病毒的重组杆状病毒样颗粒中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，构建同时含有VP2基因、VP6基因以及VP7基因的重组杆状病毒样颗粒的具体步骤如下：

H1：利用VP2、VP6以及VP7各自的基因与载体连接且转化得到各自的重组质粒；

H2：重组质粒的提纯；

H3：重组质粒的酶切反应得到VP2、VP6以及VP7各自的基因片段；

H4：VP2、VP6以及VP7各自的基因片段与带有相同粘性末端的载体连接并转化第一感受态细菌；

H5：第一感受态细菌的鉴定结果为阳性则为VP2、VP6以及VP7各自的目的重组质粒；

H6：将VP2、VP6以及VP7各自的目的重组质粒转化第二感受态细菌，提取PCR鉴定为阳性的各自的重组质粒；

H7：将鉴定为阳性的各自的重组质粒转染对数生长期的细胞，得到各自的第一代重组杆状病毒样颗粒；

H8：各自的第一代重组杆状病毒样颗粒分别进行传代培养且培养完成后转染对数生长期的细胞且传代培养至第三代，收集各自表达得到第三代重组杆状病毒样颗粒；

H9：利用各自表达得到第三代重组杆状病毒样颗粒共感染对数期的细胞，得到同时含有VP2基因、VP6基因以及VP7基因的重组杆状病毒样颗粒。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述第二感受态细菌中含有杆状病毒穿梭载体和具有编码转座酶和四环素抗性基因的辅助质粒。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述第一感受态细菌为DH5α感受态细菌。

8.根据权利要求5所述的应用中所构建的同时含有VP2、VP6以及VP7表达的目的蛋白的G5型猪轮状病毒的重组杆状病毒样颗粒中的应用在预防非细菌性腹泻中的应用。

9.根据权利要求5所述的应用中所构建的同时含有VP2、VP6以及VP7表达的目的蛋白的G5型猪轮状病毒的重组杆状病毒样颗粒中的应用在细胞相互作用研究中的应用。

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