KR102132730B1 - 구제역 바이러스 유사 입자 백신 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 구제역 바이러스 유사 입자 백신 및 그 제조방법을 제공한다. 코돈 최적화된 FMDV의 P12A 및 3C 유전자의 두개 ORF를 전달 벡터에 직렬연결로 삽입하여 재조합 발현 플라스미드를 구축하거나; 또는 프로모터 SV40 하에서 P12A3C 유전자를 포함하는 단일 ORF를 벡터에 클로닝하여 재조합 발현 플라스미드를 구축하며, 컴피턴트 세포에 형질전환시켜 재조합 Bacmid-DNA를 얻으며, sf9 세포에 형질주입시켜, 구제역 바이러스 유사 입자 단백질을 발현할 수 있는 곤충세포를 얻었다. 해당 세포를 배양한 후, 상등액을 수집하고, 한외여과 농축, 원심분리, 크로마토그래피로 VLP를 정제하여 구제역 바이러스 유사 입자 백신을 제조하였다. 본 발명의 구제역 바이러스 유사 입자 백신은 우수한 면역원성, 안전성을 가지고 있으며, 동물 자체의 중화항체 생성을 유도할 수 있고, 바이러스 공격 보호성을 제공할 수 있다. 무혈청, 무단백질 배지와 생물반응기 및 후속적인 연속 크로마토그래피 정제를 이용하여 대규모 제조와 정제가 가능하다.

Description

구제역 바이러스 유사 입자 백신 및 그 제조방법
본 발명은 유전자 공학 기술 분야에 관한 것으로서, 구체적으로, 구제역 바이러스 유사 입자 및 그 제조방법, 및 이로 제조된 구제역 백신에 관한 것이다.
구제역(Foot-and-mouth disease, FMD)은 전염성이 높은 급성 동물질병이다. 주로 우제목(artiodactyla) 동물을 침해하고, 인간과 기타 동물에서도 가끔 나타난다. 감수성이 높은 동물로는 주로 소, 물소, 양, 염소, 낙타 및 돼지 등과 같은 20개 과의 70여종의 우제류 가축 및 야생 포유류 동물을 포함한다. 구제역의 높은 전염성과 농업 경제에 대한 중대한 영향으로 인하여, 국제수역사무국(OIE)에서는 구제역을 A류 동물 전염병의 1위로 지정하였다.
2005년 아시아 1형 구제역의 유입, 2009년 A형 구제역의 유입, 특히 최근 몇 년간 O형 중화 도피 변이주의 광범위한 전염은 중국의 양돈업과 양우업에 이미 헤아릴수 없는 손실을 초래하였다. 대부분 국가에서 면역 예방을 위주로 하는 전략은 구제역을 제어하고 소멸하는 유일한 효과적인 방법이지만, 면역 예방의 난제는 구제역 바이러스의 높은 변이성과 다형성, 동물체 특히 돼지의 구제역 바이러스 백신 면역에 대한 낮은 감수성, 및 개발 도상국의 상대적으로 낮은 수준의 구제역 백신 제조 공정과 제품 품질로부터 기인된다. 충분한 조사와 연구에 근거하면, 중국의 기존 구제역 불활성화 전바이러스 백신은 면역효과가 열위할 뿐만 아니라, 부작용도 심하기에, 유행성 O형 변이주는 기본적으로 기존 백신의 보호작용을 회피할 수 있으며, 이로 인해, 국가에서 무료로 제공하는 백신을 사용하는 경우가 적고, 구제역은 계속 순환적으로 유행된다. 매번 유행되는 간헐기는 백신 접종의 결과가 아닌 자연적인 감염 면역이며; 상이한 혈청형 바이러스와 변이주가 동시에 존재하고 유행되기에, 구제역의 감염은 항상 반복적으로 발생하며, 이로 인해 신규 O형 구제역 백신의 연구와 생산이 매우 시급한 상황이다.
전통적인 백신은 불활성화 백신과 약독화 백신 두가지 종류를 포함한다. 그중, 약독화 백신은 바이러스를 약화시키는 전통적인 방식을 사용하는 바, 모 바이러스(parent virus)를 기니피그(guinea pig), 닭 배아 또는 세포에서 여러 세대의 배양을 통해 약화시켜, 바이러스가 점차 유전자 돌연변이를 발생하도록 하여, 약독화 바이러스주를 생성한다. 약독화 바이러스주를 조직 배양물에서 대량으로 증식시킨 후, 보조제 등을 첨가하여 백신으로 제조한다. 그러나, 바이러스의 병원성 복귀, 바이러스의 불완전한 불활성화, 백신 가공공장에서 생바이러스의 탈출 등 불안전한 요인으로 인하여, 세계적으로 일부 지역의 구제역의 발병은 불활성화 백신에 잔존하는 생바이러스와 연관이 있는 것으로 보이기에, 보다 안전하고 효과적인 구제역 백신에 대한 탐구가 필요하다. 구제역 약독화 백신은 면역 예방을 진행하는 과정에서 일정한 수준의 보호를 생성할 수 있으며, 구제역의 전염에 일정한 제어작용이 있다. 하지만, 약독화 백신도 생바이러스이기에, 예방 접종 과정에서 동물이 바이러스를 보유한 상태로 되는 것을 초래하며, 감수성이 높은 동물 체내에서 장기간 생존하는 과정에서 약독화된 구제역 바이러스주가 병원성을 회복할 가능성이 매우 높다. 한편, 감수성이 높은 동물 체내에서의 약독화 바이러스의 증식도 생선된 보호 면역에 대해 억제 작용이 있어 최상의 면역효과를 실현할 수 없다. 상술한 원인으로 인해, 약독화 백신은 이미 점차적으로 도태되고 있으나, 불활성화 백신은 여전히 많은 국가와 지역에서 광범위하게 사용되고 있다.
구제역 바이러스의 지속적인 변이와 신규 바이러스의 출현으로 인하여, 전통적인 불활성화 및 분할백신의 인간과 가축에 대한 보호율은 낮아지고 있으며, 불완전한 불활성화로 인한 바이러스의 확산은 수시로 발생하고 있어, 신규 아단위 백신의 개발이 시급한 상황이다. 바이러스 유사 입자(Virus Like Particle, VLP) 백신의 출현은 안전하고 효과적인 신규 백신의 개발에 새로운 계기를 제공하였다. VLP 백신은 분자 생물학 기술을 통하여, 바이러스의 하나 또는 다수의 구조단백질을 발현하며, 이러한 구조단백질은 천연적인 자기조립 능력을 가지고 있기에, 천연 바이러스 입자와 유사한 공간구조와 항원결정부를 형성할 수 있지만 바이러스 핵산이 없고, 면역원성이 강할 뿐만 아니라 감염성도 없어, 불완전한 불활성화 또는 병원성 복귀 위험성이 없고, 표면에 고밀도의 바이러스 항원이 존재하여 구조적 항원결정부를 보존하였으며, 전바이러스가 생체를 감염하는 것과 동일한 방식으로 면역세포에 전달될 수 있어, 생체 면역시스템의 체액성 면역과 세포성 면역을 효과적으로 유도하며, 잠복기를 단축시킬 수 있다. VLP 백신은 불활성화 과정에서 일부 중요한 항원결정기(antigenic determinant)에 대한 파괴 가능성을 방지하는 또 다른 장점이 있다. 또한, 수요에 따라 항원의 아미노산 서열을 임의로 변형시킬 수 있어, 생체를 보다 잘 자극하여 보호성 면역반응을 생성시킬 수 있는 또 다른 장점이 있다.
구제역 VLP 백신의 상업화의 관건은 효과적으로 구제역 VLP 제품을 대량 제조하는 것이다. 현재 재조합 백신에서 흔히 사용하는 발현 시스템인 원핵 발현 시스템과 효모 발현 시스템은 여러 개의 캡시드 단백질을 동시에 발현하여 바이러스 유사 입자로 자기조립 할 수 없으나, 곤충세포와 배큘로바이러스 시스템은 이러한 문제를 잘 해결할 수 있다. 구제역 등과 같은 여러 개의 단백질로 구성된 바이러스 캡시드를 발현하여야 하는데 있어서, 해당 시스템은 거대한 원가 우세와 제품의 보다 우수한 면역원성을 가지고 있다. 원핵 발현 시스템과 효모 시스템에 의해 발현되는 단일 단백질과 비교할 경우, 정제를 거친 후 다시 인공적으로 결합하여 VLP를 얻고, 곤충세포와 배큘로바이러스 시스템으로 VLP 백신을 생산하는 과정은 크게 간소화되어, 수율을 10~100배로 향상시킬 수 있어 대규모 생산을 실현 할 수 있다.
본 발명은 곤충 배큘로바이러스 발현 시스템으로부터 수득한 구제역 바이러스 유사 입자를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 구제역 백신을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 구제역 바이러스 P12A 유전자와 3C 유전자를 동시에 함유하는 재조합 발현 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.
단백질의 발현량을 향상시키기 위하여, 본 발명에서는 곤충세포 선호 코돈을 이용하여 상기 핵산 서열을 코돈 최적화하였다. GenBank 서열 LOCUS AET43040 2332 aa linear VRL 15-FEB-2012 DEFINITION polyprotein [Foot-and-mouth disease virus - type O] ACCESSION AET43040에 따라, 중국에서 구제역의 전염을 초래한 주요 바이러스주(혈청 O형) 및 이의 유전자 서열을 확정하였다. 이의 기초상에서, 곤충세포의 번역 과정에서 코돈에 대한 선호도에 따라, 구제역 VLP에 필요한 코딩 유전자 단편을 화학적으로 합성하였다. 구제역 VLP의 패키징(packaging)에는 P12A 및 3C 단백질이 필요하기에, 화학적 합성 서열은 각각 P12A 유전자 및 3C 유전자에 대응된다. 구체적인 서열은 하기와 같다:
P12A 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1로 표시되며, 서열 구성의 구조는 RsrII-Kozak sequence-개시코돈-HBS 시그널 펩티드-VP4-VP2-VP3-VP1-2A-종결코돈-SV40 PolyA 시그널-EcoRI를 포함한다.
3C 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 2로 표시되며, 서열 구성의 구조는 SphI-Polyhedrin 프로모터-벡터 서열-개시코돈-HBS 시그널 펩티드-3C-종결코돈-HindIII로서, 각각 상이한 식별 표지로 표시된다.
우선, 본 발명에서는 구제역 바이러스 P12A 유전자와 3C 유전자를 함유하며; 상기 구제역 바이러스 P12A 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열목록의 서열번호 1로 표시되거나; 또는 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열이 하나 또는 복수개의 뉴클레오티드로 치환 또는 결실되어 얻은 P12A 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이며;
상기 구제역 바이러스 3C 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 2로 표시되거나; 또는 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열이 하나 또는 복수개의 뉴클레오티드로 치환 또는 결실되어 얻은 3C 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열인, 재조합 발현 백터를 제공한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 Sph I와 Hind III로 3C 유전자 단편과 pFastBac HT-B를 이중 절단(double digestion)하고, 절단 후 3C 윤전자 단편과 pFastBac HT-B를 결찰하여 형질전환하여 pFastBac HT-B-3C를 얻으며; Rsr II와 EcoR I로 P12A 유전자 단편과 pFastBac HT-B-3C를 이중 절단하고, 절단 후 결찰하여 형질전환하여, pFastBac HT-B-P12A-3C 재조합 발현 플라스미드를 구축하여 수득하는 방법으로 제조된다.
본 발명의 상술한 재조합 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포는 본 발명의 보호범위에 속한다.
나아가, 본 발명에서는 (1) 상술한 재조합 발현 벡터를 곤충세포에 형질주입시켜 구제역 바이러스 유사 입자 단백질을 발현할 수 있는 곤충세포를 얻으며; (2) 해당 세포를 5~7일 동안 배양한 후, 세포와 상등액을 수득하고, 상등액을 한외여과 농축하고, 원심분리하여, 상등액을 수집하며, 상등액은 이온교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피 또는 분자체 크로마토그래피를 거쳐 정제하여 구제역 바이러스 유사 입자를 얻는 방법으로 제조된, 구제역 바이러스 유사 입자를 제공한다.
상기 곤충세포는 sf9 세포이다.
(2) 단계에서 컷-오프 공경(cut-off pore diameter)이 200~500nm인 중공섬유(hollow fiber) 컬럼을 사용하여 정밀여과하여 정화하고, 다시 컷-오프 공경이 바람직하게 300kDa인 중공섬유 컬럼을 사용하여 한외여과 농축을 진행한다.
25000rpm으로 16h 동안 원심분리하거나 35000rpm으로 3h 동안 원심분리하는 원심분리 조건으로 농축 후의 시료에 대해 수크로스 밀도기울기 원심분리를 진행하며; 원심분리액은 중공섬유 컬럼 크로마토그래피와 이온교환 크로마토그래피, 용출을 거쳐, flow-through 피크 분획을 수집하여 정제된 구제역 바이러스 유사 입자를 얻는다. VLP를 대량 제조할 때, 분자체 크로마토그래피와 이온교환 크로마토그래피 2단계법을 사용하여 VLP를 정제한다.
본 발명에서는 구제역 바이러스 백신의 제조에 있어서, 상술한 구제역 바이러스 P12A 유전자와 3C 유전자를 함유하는 재조합 발현 벡터의 용도를 제공한다.
본 발명에서는 구제역 바이러스 백신의 제조에 있어서, 상술한 재조합 발현 벡터를 함유하는 숙주세포의 용도를 제공한다.
본 발명에서는 구제역 바이러스 백신의 제조에 있어서, 상술한 방법으로 제조된 구제역 바이러스 유사 입자의 용도를 제공한다.
본 발명에서는 동물의 구제역 바이러스 감염 예방에 있어서, 상술한 재조합 발현 벡터 또는 해당 재조합 발현 벡터를 함유하는 숙주세포 또는 상술한 구제역 바이러스 유사 입자의 용도를 제공한다.
더 나아가, 본 발명에서는 본 발명에 따른 구제역 바이러스 유사 입자를 함유하는 구제역 백신을 제공한다.
본 발명에서는 본 발명에 따른 구제역 바이러스 유사 입자를 206, 201, 알루미늄 보조제와 같은 상이한 보조제와 배합한 후 100μg/ml의 바이러스 유사 입자를 함유하는 백신으로 제조하는, 구제역 바이러스 유사 입자 백신의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 효과는 아래와 같다:
(1) 최신 발견된 유행성 구제역 O형 바이러스주(O-type virus strain)가 기존 백신 바이러스주의 유전정보(NCBI Genbank ACCESSION AET43040)와 구별되는 것을 이용하여, 바이러스의 전체 캡시드 단백질만 포함하는 바이러스 유사 입자 백신을 인공적으로 제조하며, 기존에 생산한 바이러스주의 항원결정부의 아미노산 서열과 구별된다.
(2) 본 발명에서는 인간과 동물에 무독무해한 곤충 배큘로바이러스 시스템과 아무런 동물 성분 유래도 없는 무혈청, 무단백질 배지를 사용하여 세포를 배양하여, 동물을 감염시킬 수 있는 어떠한 병원성 인자도 존재하지 않으며, 밀폐성이 높은 생산 장소도 필요 없다. 이는 구제역 불활성화 백신 생산에서의 안전상의 잠재적인 불안전 요인을 해소하였을 뿐만 아니라, 이에 의하여 백신의 생산원가도 절감하였다. 본 발명에서 제조한 구제역 바이러스 유사 입자 백신은 바이러스 유전물질을 포함하지 않기에 감염성이 없으며, 공장에서의 바이러스의 확산과 불완전한 불활성화로 인한 바이러스 확산의 위험이 존재하지 않으며, 백신의 안전성을 절대적으로 확보할 수 있다.
(3) 구제역 바이러스 유사 입자 백신은 완전한 바이러스와 동일한 면역학적 특성을 가지며, 전자현미경 하에서의 구조가 유사하며, 불활성화 처리 없이도 천연 항원결정부를 유지할 수 있기에, 체액성 면역 뿐만 아니라 세포성 면역도 유도할 수 있어, 동물에 접종한 후 강력하고 지속적인 면역반응을 유도할 수 있으며, 완전한 보호성 면역과 비교적 긴 면역 보호기간을 구비한다.
(4) 구제역 바이러스 유사 입자 백신은 바이러스의 비구조단백질인 3A, 3B, 3C를 함유하지 않기에, 3A, 3B, 3C 항체에 근거하여 감염 동물과 면역 접종 동물을 효과적으로 감별 및 진단할 수 있으며, 어떠한 간섭도 존재하지 않는다.
(5) VLP 구제역 백신을 동물에게 접종한 후, 면역보호가 신속히 이루어질 수 있고, 잠복기(window period)가 짧으며, 면역화 된 동물에서 생성된 면역력은 강력하며, 완전한 감염저항성 보호를 얻을 수 있어, 면역화 된 동물이 장기간 바이러스 매개체(carrier) 및 위험한 전염원으로 되는 것을 효과적으로 방지할 수 있기에, 면역 접종 방법으로 구제역을 제어하고 소멸하는 전략에 있어서 절대로적으로 필수적인 것이다.
(6) Lowry 및 Bradford법으로 본 발명에서 얻은 VLP 단백질 발현 수준을 측정하면 120mg/L배양상층액이다. 세포 배양조건을 최적화하면 보다 높은 수준을 실현할 수 있으며; BHK 세포에서의 발현 수준은 불활성화 백신에 비해 수십배 내지 수백배 높다. 투과 전자현미경으로 정제된 시료를 관찰하면 바이러스 유사 입자를 나타내며, 입자 직경은 30nm 정도이고, 입자는 완전하며 규칙적이다.
(7) 본 발명은 생산원가가 낮고, 고밀도 세포배양을 진행할 수 있으며, 이산화탄소가 필요 없고, 온도는 28℃이며, 외래단백질의 생산량은 현탁 배양한 BHK 세포보다 훨씬 높아 산업화 대규모 생산에 적합하다.
요약하면, 본 발명에서 제공하는 구제역 바이러스 유사 입자는 바이러스 핵산을 보유하지 않고, 잠재적인 발암 위험성과 바이러스 확산 리스크가 없으며, 우수한 안전성, 면역특성과 생물학적 활성을 구비하고, 대규모적인 제조와 정제가 가능하기에, 구제역 VLP 백신을 제조하는데 사용될 수 있으며, 비교적 우수한 경제적 가치와 응용전망이 있다.
도1은 제한 효소 Sph I 및 Hind III로 3C 유전자를 함유하는 플라스미드 및 벡터 pFastBac HT-B를 이중 절단한 후의 아가로스겔 전기영동 도면이며, 1은 1kb DNA Ladder Marker이고, 2는 3C 유전자이며, 3은 pFastBac HT-B이다.
도2는 제한 효소 Rsr II 및 EcoR I로 동정결과가 정확한 플라스미드 HT-B-3C와 P12A 유전자를 함유하는 플라스미드를 이중 절단한 후, 절단 산물에 대해 아가로스겔 전기영동을 수행한 도면이며, 그중 1: HT-B-3C ED RE, 2~3: P12A 단편 ED RE, 4: 1kb DNA Ladder Marker.
도3은 재조합 발현 플라스미드의 PCR을 통해 재조합 발현 벡터 pFastBac HT-B-P12A-3C로 형질전환된 대장균 클론을 동정한 측정 결과이며, 그중 1은 1kb DNA Ladder Marker이고, 2는 재조합 발현 벡터 pFastBac HT-B-P12A-3C이며, 3은 pFastBac HT-B이며, 4는 pFastBac HT-B-3C이며, 5는 pFastBac HT-B-P12A이다.
도4는 재조합 발현 벡터 pFastBac HT-B-P12A-3C로 Sf9세포를 감염시킨 후의 상등액 및 세포에 대해 Western blot 분석을 수행한 결과이며, 재조합 바이러스에 감염된 Sf9 세포에서 나타난 81kD, 47kD, 35kD 및 24kD의 목적 밴드는 각각 구제역 바이러스 P1 단백질, VP31 단백질, VP0 단백질 및 VP3/VP2/VP1 단백질에 상응하고, 예상한 단백질 분자량과 일치하였다.
도5는 분자체를 이용하여 구제역 바이러스 유사 입자를 정제한 피크 도면이며, 첫 번째 피크는 VLP이고, 두 번째, 세 번째 피크는 분자량이 비교적 작은 단백질이다.
도6은 구제역 바이러스 유사 입자를 음이온교환 크로마토그래피 컬럼에 적재한 피크도면이다.
도7은 정제된 구제역 바이러스 유사 입자에 대해 SDS-PAGE 동정을 진행한 도면이다. 그중, 1은 Marker이고, 2는 정제된 FMD VLP이다.
도8은 정제된 구제역 바이러스 유사 입자에 대한 Western blot 분석 결과를 나타낸 사진이다. 레인 1은 Protein Marker(170, 130, 100, 70, 55, 40, 35, 25, 15, 10 kDa)이고, 레인 2는 정제된 FMDV VLP이다. 그중, 30kDa 위치의 밴드는 VP0이고, 25kDa 위치의 밴드는 VP1이다.
도9는 정제된 구제역 바이러스 유사 입자의 투과 전자현미경 사진이다(확대배율: 200000배).
이하 실시예는 본 발명의 내용을 추가로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 이해하여서는 아니된다. 본 발명의 요지와 실체를 벗어나지 않은 상황하에서, 본 발명에 따른 방법, 단계 또는 조건에 대한 수정 또는 교체는 모두 본 발명의 범위에 속한다.
하기 실시예에서 구체적인 조건을 명시하지 않은 실험방법은 일반적으로 통상적인 실험조건에 따라 진행한다.
본 발명에 따른 실시예에서 사용한 배큘로바이러스 발현 시스템(벡터 pFastBacHT-B, 현탁 배양한 Sf9 세포와 컴피턴트 E.coli DH10Bac을 포함)은 미국 Invitrogen사에서 구입한 제품이다. 형질주입 시약 Cellfectin® II Reagent (Cat no. 10362-100)는 Invitrogen사의 제품이며; GPM-115 곤충세포 무혈청 배지는 본 사의 제품이며; SF900 III SFM은 life technologies사의 제품이며; 제한 효소(Restriction endonuclease) Rsr II, EcoRI, SphI, Hind III 및 DNA 연결효소(T4 DNA ligase)는 New England Biolabs사의 제품이며; Goldview 염료, TaqDNA 중합효소, pfu DNA 중합효소와 dNTPs는 SBS Genetech사의 제품이며; 카나마이신, 겐타마이신, 테트라사이클린, blu-gal 및 IPTG는 BioDee Biotechnology사의 제품이며; 기니피그 항A형 FMDV 다중클론항체는 LanZhou Veterinary Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences의 제품이며; Dlight 800 염소 항기니피그 IgG 항체(카탈로그 번호 GtxGP-003-D800NHSX)는 Immuno Reagents사의 제품이며; 겔 회수 키트(카탈로그 번호 DP103-02)는 Tiangen사의 제품이며; 플라스미드 추출 키트(카탈로그 번호 MK014-2)는 Tiangen사의 제품이다.
PCR 기기(모델: Mastercycler gradient)는 독일 Eppendorf사의 제품이며; 항온 인큐베이터(모델: DHP-9082)는 Shanghai Yiheng Technology사의 제품이며; 마이크로 원심분리기(모델: Lx-300)는 Kylin-Bell Experimental Equipment사의 제품이며; 수조(모델: DK-8K)는 Shanghai Jinghong Experimental Equipment사의 제품이며; 전기영동 장치(모델: DYY-6C)는 Beijing Liuyi Instrument Factory사의 제품이며; 겔 이미징 시스템(모델: 2020D)은 BINTA사의 제품이며; Odyssey(모델: LI-COR)는 Li-Cor사의 제품이며; 도립현미경(모델: 7S100)은 일본 Nikon사의 제품이다.
실시예1 구제역의 P12A 및 3C 단백질을 코딩하는 유전자 서열의 최적화
GenBank 서열번호 AET43040(2332 aa linear VRL 15-FEB-2012；DEFINITION polyprotein [Foot-and-mouth disease virus - type O] ACCESSION AET43040)에 따라, 최근 중국에서 구제역의 전염을 초래한 주요 바이러스주(혈청 O형) 및 이의 유전자 서열을 확정하였다. 이의 기초상에서, 곤충세포의 번역 과정에서 코돈에 대한 선호도에 따라, 구제역 VLP에 필요한 코딩 유전자 단편을 설계하였다. 구제역 VLP의 패키징은 P12A 및 3C 단백질이 필요하기에, 화합적 합성 서열은 각각 P12A 유전자와 3C 유전자에 대응된다.
P12A 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1로 표시되며, 서열 구성의 구조는: RsrII-Kozak sequence-개시코돈-HBS 시그널 펩티드-VP4-VP2-VP3-VP1-2A-종결코돈-SV40 PolyA 시그널-EcoRI이다.
3C 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 2로 표시되며, 서열 구성의 구조는: SphI-Polyhedrin프로모터-벡터 서열-개시코돈-HBS 시그널 펩티드-3C -종결코돈-HindIII이다.
실시예2 재조합 발현 벡터 pFastBac HT-B-P12A-3C의 구축
1. 구제역 바이러스 P12A 유전자 및 3C 유전자를 전달 벡터 pFastBac HT-B에 직렬연결로 삽입.
Sph I 및 Hind III로 3C 유전자 단편 및 pFastBac HT-B를 이중 절단하고, 절단 후 3C 유전자 단편 및 pFastBac HT-B를 결찰(ligation)하여 형질전환하여 pFastBac HT-B-3C를 얻으며; Rsr II 및 EcoR I로 P12A 유전자 단편 및 pFastBac HT-B-3C를 이중 절단하고, 절단 후 결찰하여 형질전환하였다. 절단 결과는 도1과 도2과 같다.
상술한 반응 혼합액을 균일하게 혼합하여 원심분리한 후 16℃에서 밤새 결찰시켰다. -80℃에서 동결보존한 E.coli DH5α 컴피턴트 세포를 꺼내어 녹을 때까지 얼음 위에 방치하고, 결찰 산물을 넣고 튜브 벽을 가볍게 두드려 균일하게 혼합하며, 30min동안 얼음욕하고, 42℃ 수욕에서 90sec동안 열충격(heat shock) 후, 즉시 1min동안 얼음욕하며, 무항생제 LB배지 800mL를 넣고, 37℃ 조건에서 150rpm으로 50min동안 진탕하며, 균액 100mL를 취하여 Amp/LB 플레이트에 도포하고 37℃에서 12~16h동안 배양하여 콜로니의 성장 상황을 관찰하였다. 플레이트에서 3개의 단일 콜로니를 선택하여 4mL의 Amp/LB 액체 배지에 각각 접종하고, 37℃ 조건에서 200rpm으로 진탕하여 밤새 배양하였다. 플라스미드를 추출한 후, Rsr II/EcoR I 및 Sph I/Hind III을 이용하여 각각 이중 절단에 의한 동정을 수행하였다. 37℃에서 3h동안 효소 절단 반응을 진행하고, 1% 아가로스겔 전기영동으로 분석하여, 효소 절단에 의한 동정 결과가 정확한 클론을 선택하여 시퀀싱을 통하여 확인하였다.
-80℃에서 동결보존한 E.coli DH10Bac 컴피턴트 세포를 꺼내어 녹을 때까지 얼음 위에 방치하고, 100mL를 취하여 재조합 플라스미드 2mL를 함유하는 1.5mL의 EppendorF 튜브에 넣고, 튜브 벽을 가볍게 두드려 균일하게 혼합하며, 30min동안 얼음욕하고, 42℃ 수욕에서 45s동안 열충격 후, 즉시 5min동안 얼음욕하며, 무항생제 LB배지 800mL를 넣고, 37℃에서 200rpm으로 5h동안 진탕하며, 균액 10mL를 취하여 LB 선택성 플레이트에 도포하고, 37℃에서 48h동안 배양하여 콜로니의 성장 상황을 관찰하였다.
플레이트에서 흰색 단일 콜로니 3~4개를 선택하고, LB 선택성 배양 플레이트에 각각 스트리킹(streaking)하고, 37℃에서 24h동안 배양하여 콜로니 표현형의 변화를 관찰하였다. 상이한 콜로니 유래의 스트리킹 플레이트에서 여전히 흰색 반점인 콜로니 3개를 랜덤으로 선택하여 KTG/LB(50μg/mL의 카나마이신, 7μg/mL의 겐타마이신, 10μg/mL의 테트라사이클린을 포함)배지 3mL에 넣고, 37℃에서 200rpm으로 16h동안 진탕 배양하였다. 배양물 1.5mL를 취하여 실온조건에서 13,000rpm으로 1min동안 원심분리하여 침전물을 수집하였다. 용액I(50mmol/L의 포도당, 25mmol/L의 Tris-HCl, 10mmol/L의 EDTA, 100μg/mL의 RNase A, pH 8.0) 200mL를 침전물에 첨가하고, 세균 침전물을 재현탁시킨 후 볼텍스 기기로 균일하게 혼합하며, 새로 배합한 용액II(0.2 mol/L NaOH, 1% SDS) 200mL를 넣고 가볍게 균일하게 혼합하고, 실온에서 5min동안 방치하며, 3mol/L의 아세트산칼륨(pH 5.5) 200mL를 첨가하고, 가볍게 아래위로 뒤집으면서 균일하게 혼합한 다음, 10min동안 얼음욕 후, 실온에서 12,000rpm으로 10min동안 원심분리하여, 상등액을 별도의 새로운 Eppendorf 튜브로 옮기고, 동일 부피의 이소프로판올을 첨가하고 아래위로 뒤집으면서 균일하게 혼합하며, 실온에서 10min동안 방치한 후 12,000rpm으로 15min동안 원심분리하였다. 침전물을 70% 에탄올로 세척한 후, 실온에서 12,000rpm으로 5min동안 원심분리하고, 침전물을 건조시킨 후, TE 완충액(10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA, pH 8.0) 40mL를 첨가하여 용해하였다.
2. 목적 유전자를 보유하는 재조합 Bacmid DNA의 PCR 동정
재조합 Bacmid mini-attTn 7 양쪽 말단의 M13 프라이머를 이용하여, 삽입된 유전자에 대한 PCR 동정을 진행할 수 있다.
M13 프라이머 서열(Shanghai Shenggong Bioengineering사에서 합성)은 하기와 같다:
M13F: 5'GTTTTCCCAGTCACGAC 3'
M13R: 5'CAGGAAACAGTCATGAC 3'
PCR 증폭 조건은 94℃에서 5min동안 전변성(pre-denaturation); 94℃에서 50s동안 변성, 55℃에서 50s동안 어닐링; 72℃에서 8min동안 연장(extending); 30 사이클, 72℃에서 10min동안 연장(extending)하는 것이다.
PCR 증폭 산물 5mL를 취하여, 0.5% 아가로스겔 전기영동으로 분석하였다. 산물의 크기에 따라 트랜스포존(Transposon)의 성공 여부를 판단하였다. PCR 동정 결과는 도3과 같다. 발현 벡터 pFastBac HT-B-P12A-3C를 정확하게 구축하여 얻었음을 나타낸다.
실시예3 재조합 배큘로바이러스 목적 단백질의 발현 동정
1. rBacmid DNA로 형질주입된 Sf9 세포
1) Sf9 세포의 배양 SF900 III SFM으로 Sf9 현탁 세포를 배양하고, 27℃에서 110rpm으로 진탕 배양하였다. 형질주입 하루 전, Sf9 세포를 6웰 플레이트에 계대배양하고, 웰당 밀도는 8Х105이다.
2) 형질주입 Eppendorf 튜브 두개를 취하여 용액 A 및 용액 B를 각각 첨가하고, 체계는 하기와 같다:
용액 A: 재조합 Bacmid DNA 10mL와 무혈청, 무항생제 SF900 III 배지 90mL를 혼합하였다.
용액 B: 형질주입 시약 리포좀 Cellfectin II 6mL(사용 전 5~10회 아래위로 충분히 뒤집어 균일하게 혼합)를 취하여 무혈청, 무항생제 SF900 III 배지 94mL와 혼합하였다.
용액 A 및 용액 B를 실온에서 5min동안 정치한 후, 용액 A와 용액 B를 혼합하고, 튜브 벽을 가볍게 두드려 균일하게 혼합하며, 실온에서 30min동안 방치하였다. 무혈청, 무항생제 SF900 III 배지 2mL를 사용하여 세포를 2회 세척하고, 웰당 무혈청, 무항생제 SF900 III 배지 800mL를 넣은 다음, 상술한 용액 A와 용액 B의 혼합물을 적하하는 방식으로 각 웰에 첨가하고, 가볍게 흔들어 균일하게 혼합하여 27℃에서 5h동안 부화하였다. 형질주입 용액을 제거하고, 신선한 SF900 III SFM 배지로 교체하여 27℃에서 배양하며, 매일 세포의 변화를 관찰하였다.
2. 재조합 배큘로바이러스의 동정
형질주입 5일 후, 정상대조 Sf9세포의 크기가 균일하고 세포핵이 치밀하며 세포의 병변이 일어나지 않는 반면, 세포에서 전형적인 CPE(세포가 둥글고, 팽창되는 것)가 나타나면, 재조합 배큘로바이러스의 패키징이 성공적으로 되었음을 설명한다. 상등액을 수집하고, 실온조건에서 500g을 5min동안 원심분리하여 무균 동결보존 튜브에 분주하였으며, 이것이 재조합 배큘로바이러스를 함유하는 초대 바이러스주(primary seed virus)이다. 세포에서 전형적인 CPE가 나타나지 않는 경우, 상등액을 수집하고 다시 새로운 세포를 감염시킨다.
세포를 0.5-1×106/ml까지 계대배양시켰을 때, 재조합 배큘로바이러스를 세포에 접종하여 바이러스주를 증폭시키고, 5~7일 동안 배양한 후 배양 상등액을 수집하며, 실온조건에서 500g을 5min동안 원심분리하여 무균 동결보존 튜브에 분주하여, -80℃에서 보존하며, 동시에 세포를 PBS(pH 7.4)로 세척한 후 원심분리하여 침전시키며, 상등액과 세포 침전물은 후속의 Western blot 동정에 사용하였다.
재조합 배큘로바이러스의 목적 단백질 발현의 Western blot 동정
시료의 제조: 수집한 재조합 배큘로바이러스를 발현하는 세포를 세포 용해 버퍼(0.1M의 탄산수소나트륨 용액)로 용해한 후, 원심분리하여 상등액을 취하고, 6×SDS 단백질 전기영동 로딩 완충액을 각각 첨가하여 100℃에서 5min동안 끓이며, 웰당 시료 10~20ul씩 적재하고, 사전 염색된 2색 Marker 2μL를 첨가하고, 농축겔 80v, 분리겔 120v에서 단백질 전기영동을 진행하였다.
웨스턴 블롯: 겔을 PVDF막(PVDF막은 미리 메탄올 용액에서 30s동안 활성화시킴) 위에 놓고, 위와 아래에 여과지를 각각 3장씩 놓은 다음, 상술한 물질을 막전이 전기영동 완충액에 15min동안 침지하여, 여과막에 잔존하는 기포를 제거하였다. 전기 전이(electro-transfer) 장치를 순서대로 설치하고, 음극판(cathode plate)에 여과지 3장, 겔, PVDF막, 여과지 3장을 순차적으로 방치하며, 각 층은 정확하게 맞추어야 하며(아래로부터 위로), 각 층 사이의 기포를 제거하고 방향을 표기한 후 양극판을 닫았다.
막전이(Transmembrane): 60V 전압을 1h동안 유지하며; 블로킹: 5% 탈지 분유, 4℃에서 밤새; 1차 항체: 기니피그 항FMDV다중클론항체(5% 탈지 분유는 1:500으로 희석)를 사용하여 실온에서 막을 3h동안 배양하며; 막의 세척: PBST(Tween은 1??임)를 사용하여 5min씩 3회 세척하며; 2차 항체: 염소 항기니피그 Dlight800 항체(5% 탈지 분유는 1:2000으로 희석)를 실온에서 빛을 차단하고 40min동안 배양하며; 막의 세척: PBST(Tween은 1??임)를 사용하여 10min씩 3회 세척하며; 측정: Odyssey의 700 및 800 두 형광채널을 이용하여 스캔 및 검증을 진행하였다.
세포를 0.5-1×106/ml까지 계대배양시켰을 때, 재조합 배큘로바이러스로 SF9세포를 감염시키고, 감염 5~7일 후 감염된 세포 배양 상등액을 수집하며, 4℃에서 6000rpm으로 10min동안 원심분리하고, 동정 및 정제를 위해 상등액과 세포를 수집하였다. Western blot 동정은 도4와 같으며, 그 결과 재조합 바이러스에 감염된 Sf9 세포에서 나타난 81kD, 47kD, 35kD 및 24kD의 목적 밴드는 각각 구제역 바이러스 P1 단백질, VP31 단백질, VP0 단백질 및 VP3/VP2/VP1 단백질에 상응하고, 예상한 단백질 분자량과 일치하였다. 그 결과, P1 단백질은 곤충세포에서 발현되었고, 일부 P1은 3C 단백질의 절단에 의하여 성공적으로 VP31, VP0, VP3/VP2/VP1로 절단되었음을 제시하였다.
실시예4 재조합 배큘로바이러스의 구제역 VLP 발현의 정제 및 동정
1. 중공섬유 컬럼에 의한 구제역 VLP의 한외여과 농축
실시예3의 감염된 SF9 세포의 배양 상등액을 수집하고, 0.8um여과를 거친 후 4℃에서 방치하며, 세포는 -20℃에서 보존하거나 즉시 정제에 사용하였다. 세포 파쇄: 수집한 세포의 중량을 측정하고, 20배 부피의 0.1M NaHCO3(pH 8.3)를 첨가하며, 실온에서 30min동안 용해(lysis)시켰다. 4℃에서 12000rpm으로 15min동안 원심분리(3회)하고, 상등액을 수집하며, 세포를 제거하였다. 0.8um, 0.45um 및 0.2um의 여과막을 사용하여 순차적으로 여과하였다. 농축: 중공섬유 컬럼의 세척 및 평형: NaOH에 침지한 중공섬유 컬럼(300kDa 차단(cut-off))을 다량의 순수로 세척한 후, PBS(pH 7.4)로 평형시켰다. 중공섬유 컬럼, 펌프 및 농축하고자 하는 액체를 연결하여 액체 회로 사이클을 형성하였다. 펌프(10ml/min)를 작동하여 정제를 시작하고, 원액을 필요한 부피로 농축하였다. 다량의 PBS(pH 7.4)로 세척하고(10배 부피), 불순 단백질을 제거하였다. 나머지 액체를 회수하고, 0.2um 필터로 여과하여 목적하는 VLP 입자를 얻었다.
2. 초속 원심분리법에 의한 구제역 VLP의 정제
20%, 30%, 40%, 50% 및 60%의 수크로스 용액을 각각 제조하고, 1×PBS용액으로 희석하였다. 60%, 50%, 40%, 30% 및 20%의 수크로스 용액(1ml씩)을 초속 원심분리 튜브(Beckman)에 순차적으로 넣은 후 초속 원심분리를 진행하고자 하는 시료를 넣고, 표기를 하였다. 4℃에서 25000rpm으로 16hr동안 원심분리하며, 원심분리기는 Beckman Optima X-100을 사용하였다. 각 원심분리 성분을 순차적으로 취하여 SDS-PAGE 및 western blotting 동정 후, 상응하는 성분을 투석하여 수크로스를 제거하여 정제된 시료를 얻었다.
3. 컬럼 크로마토그래피법에 의한 구제역 VLP의 정제
FMDV 곤충세포 배양 상등액을 300KDa 중공섬유 컬럼으로 30배 농축시키고, PBS 완충액을 이용하여, Sepharose 6 FF컬럼(XK16Х70 크로마토그래피 컬럼, 크로마토그래피 매질의 높이는 63.5cm)인 크로마토그래피 매질, 유속 1ml/min으로 VLP 및 불순 단백질을 크로마토그래피로 분리하였다. 결과는 도5와 같다. 제2차 컬럼 크로마토그래피는 CaptoQ ImpRes 이온교환 크로마토그래피 컬럼을 사용하며, 10mM Tris-HCl(pH 8.0)으로 제1컬럼의 VLP 피크 분획을 투석하고, 용출액은 10mM Tris-HCl(pH 8.0), 1M NaCl이다. flow-through 피크 분획을 수집하여 정제된 VLP로 하였으며, 결과는 도6과 같다.
4. 정제된 FMD VLP의 SDS-PAGE 및 Western blotting
결과는 도7, 8과 같다. 도7은 VLP 정제 후의 SDS-PAGE 스펙트럼이며, VLP를 구성한 VP1 및 VP0 위치에 상응하는 밴드를 구비하며, 도8은 웨스턴 블롯으로 VLP를 구성한 단백질은 특이적인 것임을 추가로 증명한 것이다.
Lowry법으로 본 발명에서 얻은 정제 단백질의 최종 농도는 1800μg/ml인 것을 측정하였고, 백신의 제조에 있어서, 주사에 필요한 항원 농도를 용이하게 실현할 수 있다.
5. 전자현미경에 의한 VLP의 관찰
120KV 투과 전자현미경의 시료 처리: 시료 농도는 0.1mg/ml이고, 플로팅(floating)법으로 음성염색을 진행하고, 즉, 15μl의 시료 액체 비드를 취하고, 지지필름을 구비한 구리 메쉬로 액체 비드를 2분동안 덮은 다음, 구리 메쉬를 제거하고, 가장자리에서 여과지로 여분의 시료를 흡수하여 제거한 후, 다시 구리 메쉬를 0.5% 우라늄 아세테이트 염색액 액체 비드 15μl에 2분동안 덮은 다음, 구리 메쉬를 제거하고, 가장자리에서 여과지로 여분의 염색액을 흡수하여 제거하면 전자현미경으로 관찰할 수 있다. 결과는 도9와 같으며, 바이러스 유사 입자를 나타내며, 입자 직경은 30nm 정도이고, 입자는 완전하고 규칙적이다.
6. 바이러스 공격 실험
면역 동물: VLP 시료를 206 보조제로 유화한 후, 구제역 음성 돼지를 면역시키고, 랜덤으로 대조군 3마리 및 시험군 7마리로 나누었다. 면역 후 7, 14, 21, 28일째에 혈청을 채취하여 Elisa로 구제역 항체의 역가를 검증하고, 발병 상황을 통계하였다.
(1) 면역 후 O형 LB-ELISA로 측정한 항체 상황은 표1과 같다.
면역 후 일자수
동물번호		 7d 14d 21d 28d
202 <8 45 45 22
203 <8 11 11 22
206 <8 90 90 45
207 <8 16 <8 22
208 <8 180 22 22
212 90 720 360 180
215 <8 45 32 22
VLP 면역 후 O형 항체의 측정
(2) 바이러스 공격 상황의 결과는 표2와 같다.
바이러스 공격 투여량 O형 구제역 바이러스 ID50≥5
동물번호 바이러스 공격 시간 1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d 8d 9d 10d
101 비경
사족 왼쪽앞 사족 사족 사족 사족 사족 사족
102 비경
사족
103 비경 + + + +
사족 왼쪽앞, 왼쪽뒤 왼쪽앞, 왼쪽뒤 사족 사족
대조군 동물의 바이러스 공격 실험 결과
바이러스 공격 실험에서 7마리 동물 중 6마리는 구제역 병변이 발생하지 않고 완전한 보호를 받았다. 한 마리 동물, 즉, 436번 동물의 사족에서만 발병하였으나, 대조 항체에 대한 측정에 의하여, 해당 동물의 항체 수준은 7마리 동물 중에서 가장 높은 것으로서, 주사 14일 후 720에 달하였으며, 나머지는 11~180인 것을 발견하였다. 이는 항체 측정에 사용된 키트는 전바이러스 다중클론항체에서 유래된 것이며, VLP 백신에 대한 특이성이 열위하다는 것을 설명한다. 하지만, VLP 백신 항원은 돼지가 구제역 바이러스에 감염되지 않도록 잘 보호할 수 있으며, 매우 효과적인 항원 제조 기술이다.
실시예5 실시예2와 다른 방법으로 구축된 FMDV 캡시드 단백질을 발현하는 직렬연결 벡터
프로모터 SV40 하에서 P12A3C유전자를 포함하는 단일 ORF를 pFastBac HT-B에 클로닝하여 재조합 발현 플라스미드를 구축하였다. VP0(VP2+VP4)-VP3-VP1-2A-3B3-3C의 직렬연결 방식에 따라, FMDV 관련 단백질 유전자를 SV40 프로모터 하에서 발현하도록 직렬연결로 배치하였다. 프라이머 FMDF1 및 FMDR1을 통하여, P12A 유전자를 PCR 증폭하고, 프라이머 FMDF2 및 FMDR2를 통하여 3B3 및 3C 유전자를 PCR 증폭하였다. 증폭하여 얻은 PCR 산물을 정제한 후, 심리스 결찰 키트(seamless ligation kit)로 이들을 결찰시켰다. 단일 프로모터의 직렬연결 발현 카세트를 구성하였다. 최종 얻은 서열은 서열번호 9로 표시된다.
프라이머 FMDF1:
CCATCGGGCGCGGATCTCGGTCCGAAACCATGGGAGCTGGACAGTCCTCCCCTGC，
프라이머 FMDR1:
TTACCT TTA GAG CGA CTG GCT TCT TAA CAG GTC CTT CAT AAG GAC CTC CAG GGT TGG ACT CCA CGT CTC
프라이머 FMDF2:
GCCAGTCGCTCTAAAGGTAAAGGCCAAGAACTTGATTGTGACTGAAtccggagctcctcctactgacctg
프라이머 FMDR2:
CTA GTA CTT CTC GAC AAG CTT ACT CGT GGT GAG GCT CAG GGT CGA TGT GAG CC
실시예3, 4의 방법을 참조하여 발현의 동정, VLP의 정제와 동정을 진행하며, 최종적으로 해당 직렬연결 방법으로 얻은 VLP의 수율은 약 33mg/L배양액이다.
실시예6 구제역 바이러스 유사 입자 백신의 제조
실시예4에서 제조한 FMDV VLP 항원 및 Montanide ISA 201 VG 보조제의 혼합 유액의 제조방법:
1. 동일한 질량의 FMDV VLP 수상 항원과 보조제를 취한다.
2. 수욕을 31℃까지 가열한다.
3. 비커의 바닥이 교반기로부터 1cm 떨어지도록 보조제를 담은 비커를 수욕에 넣는다. 교반속도는 350rpm이다.
4. 수상 항원을 신속히 보조제에 첨가한다. 5min동안 교반한다.
5. 교반을 정지시킨다. 20도까지 온도를 낮추고, 1h동안 정치한다.
6. 유액 제조가 완료된다. 20도에서 하룻밤 동안 정치시킨 후, 품질관리 테스트를 진행한다. 구제역 바이러스 유사 입자를 상이한 보조제로 흡착한 후, 50~5000μg/ml의 바이러스 유사 입자를 함유하는 백신으로 제조한다.
각 지표의 측정 결과:
성상: 외관은 약간의 점성을 갖는 유제이다.
제형: 수중유중수형(water-in-oil-in-water). 깨끗한 흡입관을 사용하여 소량의 백신을 취하여 청결한 냉수 표면에 떨어뜨리는 경우 운무 형태로 확산되어야 한다.
안정성: 백신 10mL를 취하여, 원심분리 튜브에 첨가하고, 3000r/min으로 15min동안 원심분리하는 경우, 원심분리 튜브의 바닥에 석출된 수상은 0.5mL를 초과하지 말아야 한다.
본 발명은 구제역 바이러스 유사 입자 백신 및 그 제조방법을 제공한다. 코돈 최적화된 구제역 바이러스의 P12A 유전자 및 3C 유전자를 전달 벡터 pFastBac HT-B에 직렬연결로 삽입하여 pFastBac HT-B-P12A-3C 재조합 발현 플라스미드를 구축하고, 이를 DH10Bac 컴피턴트 세포에 형질전환시켜 재조합 Bacmid-DNA를 얻으며, sf9 현탁세포에 형질주입시켜, 구제역 바이러스 유사 입자 단백질을 발현할 수 있는 현탁 곤충세포를 얻을 수 있다. 해당 세포를 무혈청, 무단백질 배지에서 배양한 후, 상등액을 수집하여 한외여과 농축하고, 원심분리하며, 분자체 크로마토그래피 및 이온교환 크로마토그래피를 통하여 VLP를 정제하여, 구제역 바이러스 유사 입자 백신을 제조한다. 본 발명에서 제공하는 구제역 바이러스 유사 입자 백신은 우수한 면역원성, 안전성, 면역특성 및 생물학적 활성을 가지며, 대규모적으로 제조 및 정제할 수 있고, 구제역 감염을 예방하기 위한 백신의 제조에 사용될 수 있으며, 유전자 돌연변이에 의한 구제역 바이러스주의 변이로 인해 전염되는 신규 바이러스주에 대하여, 백신화가 빠르고, 바이러스의 약독화 및 숙주세포에 적응 등 과정이 필요 없이 가장 빠르게 바이러스의 전염을 차단할 수 있는 장점이 있다. 바이러스 자체와 접촉하지 않고 모델 생물의 생산 원가가 낮아 비교적 우수한 경제적 가치와 응용전망이 있다.
<110> Gproan Biotechnologies (Suzhou), Inc.
<120> A foot-and-mouth disease virus-like particle vaccine and preparation method there of
<130> KHP183110236.5
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2587
<212> DNA
<213> P12A
<400> 1
cggtccgaaa ccatgaaatt cttagtcaac gttgcccttg tttttatggt cgtatacatt 60
tcttacatct atgcgggagc tggacagtcc tcccctgcta ctggatccca gaaccagtcc 120
ggaaacactg gatccatcat caacaactac tacatgcagc agtaccagaa ctccatggac 180
actcagctgg gagacaacgc tatctccgga ggatccaacg agggatccac tgacactact 240
tccactcaca ctactaacac tcagaacaac gactggttct ccaagctggc ttcctccgct 300
ttctccggac tgttcggagc tctgctggct gacaagaaga ctgaggagac tactctgctg 360
gaggacagaa tcctgactac tagaaacgga cacactactt ccactactca gtcctccgtg 420
ggaatcactc acggatacgc tactgctgag gacttcgtga acggacctaa cacttccgga 480
ctggagacta gagtggtgca ggctgagaga ttcttcaaga ctcacctgtt cgactgggtg 540
acttccgacc ctttcggaag atgctacctg ctggagctgc ctactgacca caagggagtg 600
tacggatccc tgactgactc ctacgcttac atgagaaacg gatgggacgt ggaggtgact 660
gctgtgggaa accagttcaa cggaggatgc ctgctggtgg ctatggtgcc tgagctgtgc 720
tccatcgaga gaagagagct gttccagctg actctgttcc ctcaccagtt catcaaccct 780
agaactaaca tgactgctca catcaaggtg cctttcgtgg gagtgaacag atacgaccag 840
tacaaggtgc acaagccttg gactctggtg gtgatggtgg tggctcctct gactgtgaac 900
actgagggag ctcctcagat caaggtgtac gctaacatcg ctcctactaa cgtgcacgtg 960
gctggagagt tcccttccaa ggagggaatc ttccctgtgg cttgctccga cggatacgga 1020
ggactggtga ctactgaccc taagactgct gaccctgtgt acggaaaggt gttcaaccct 1080
cctagaaaca tgctgcctgg aagattcact aacctgctgg acgtggctga ggcttgccct 1140
actttcctgc acttcgacgg agacgtgcct tacgtgacta ctaagactga ctccgacaga 1200
gtgctggctc agttcgacct gtccctggct gctaagcaca tgtccaacac tttcctggct 1260
ggactggctc agtactacac tcagtactcc ggaactgtga acctgcactt catgttcact 1320
ggacctactg acgctaaggc tagatacatg atcgcttacg ctcctcctgg aatggagcct 1380
cctaagactc ctgaggctgc tgctcactgc atccacgctg agtgggacac tggactgaac 1440
tccaagttca ctttctccat cccttacctg tccgctgctg actacgctta cactgcttcc 1500
gacgctgctg agactactaa cgtgcaggga tgggtgtgcc tgttccagat cactcacgga 1560
aaggctgagg gagacgctct ggtggtgctg gcttccgctg gaaaggactt cgagctgaga 1620
ctgcctgtgg acgctagaca gcagactact tccactggag agtccgctga ccctgtgact 1680
gctactgtgg agaactacgg aggagagact caggtgcaga gaagacacca cactgacgtg 1740
tccttcatcc tggacagatt cgtgaaggtg actcctaagg actccatcaa cgtgctggac 1800
ctgatgcaga ctccttccca cactctggtg ggagctctgc tgagaactgc tacttactac 1860
ttcgctgacc tggaggtggc tgtgaagcac gagggagacc tgacttgggt gcctaacgga 1920
gctcctgagg ctgctctgga caacactact aaccctactg cttaccacaa ggctcctctg 1980
actagactgg ctctgcctta cactgctcct cacagagtgc tggctactgt gtacaacgga 2040
aactgcaagt acgctggagg atccctgcct aacgtgagag gagacctgca ggtgctggct 2100
cagaaggctg ctagacctct gcctacttcc ttcaactacg gagctatcaa ggctactaga 2160
gtgactgagc tgctgtacag aatgaagaga gctgagactt actgccctag acctctgctg 2220
gctgtgcacc cttccgctgc tagacacaag cagaagatcg tggctcctgt gaagcagtcc 2280
ctgaacttcg acctgctgaa gctggctgga gacgtggagt ccaaccctgg aacttcctaa 2340
gatcataatc agccatacca catttgtaga ggttttactt gctttaaaaa acctcccaca 2400
cctccccctg aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact tgtttattgc 2460
agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt 2520
ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggat 2580
cgaattc 2587
<210> 2
<211> 861
<212> DNA
<213> 3C
<400> 2
gcatgcatca tggagataat taaaatgata accatctcgc aaataaataa gtattttact 60
gttttcgtaa cagttttgta ataaaaaaac ctataaatat tccggattat tcataccgtc 120
ccaccatcgg gcgcggatct cgctgcgaaa ccatgaaatt cttagtcaac gttgcccttg 180
tttttatggt cgtatacatt tcttacatct atgcgtccgg agctcctcct actgacctgc 240
agaagatggt gatgggaaac actaagcctg tggagctgat cctggacgga aagactgtgg 300
ctatctgctg cgctactgga gtgttcggaa ctgcttacct ggtgcctaga cacctgttcg 360
ctgagaagta cgacaagatc atgctggacg gaagagctat gactgactcc gactacagag 420
tgttcgagtt cgagatcaag gtgaagggac aggacatgct gtccgacgct gctctgatgg 480
tgctgcacag aggaaacaga gtgagagaca tcactaagca cttcagagac actgctagaa 540
tgaagaaggg aactcctgtg gtgggagtga tcaacaacgc tgacgtggga agactgatct 600
tctccggaga ggctctgact tacaaggaca tcgtggtgtg catggacgga gacactatgc 660
ctggactgtt cgcttacaga gctgctacta aggctggata ctgcggagga gctgtgctgg 720
ctaaggacgg agctgacact ttcatcgtgg gaactcactc cgctggagga aacggagtgg 780
gatactgctc ctgcgtgtcc agatccatgc tgctgaagat gaaggctcac atcgaccctg 840
agcctcacca cgagtaagct t 861
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gttttcccag tcacgac 17
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
caggaaacag tcatgac 17
<210> 5
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ccatcgggcg cggatctcgg tccgaaacca tgggagctgg acagtcctcc cctgc 55
<210> 6
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ttacctttag agcgactggc ttcttaacag gtccttcata aggacctcca gggttggact 60
ccacgtctc 69
<210> 7
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gccagtcgct ctaaaggtaa aggccaagaa cttgattgtg actgaatccg gagctcctcc 60
tactgacctg 70
<210> 8
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
ctagtacttc tcgacaagct tactcgtggt gaggctcagg gtcgatgtga gcc 53
<210> 9
<211> 2989
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
cggtccgaaa ccatgggagc tggacagtcc tcccctgcta ctggatccca gaaccagtcc 60
ggaaacactg gatccatcat caacaactac tacatgcagc agtaccagaa ctccatggac 120
actcagctgg gagacaacgc tatctccgga ggatccaacg agggatccac tgacactact 180
tccactcaca ctactaacac tcagaacaac gactggttct ccaagctggc ttcctccgct 240
ttctccggac tgttcggagc tctgctggct gacaagaaga ctgaggagac tactctgctg 300
gaggacagaa tcctgactac tagaaacgga cacactactt ccactactca gtcctccgtg 360
ggaatcactc acggatacgc tactgctgag gacttcgtga acggacctaa cacttccgga 420
ctggagacta gagtggtgca ggctgagaga ttcttcaaga ctcacctgtt cgactgggtg 480
acttccgacc ctttcggaag atgctacctg ctggagctgc ctactgacca caagggagtg 540
tacggatccc tgactgactc ctacgcttac atgagaaacg gatgggacgt ggaggtgact 600
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tccatcgaga gaagagagct gttccagctg actctgttcc ctcaccagtt catcaaccct 720
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tacaaggtgc acaagccttg gactctggtg gtgatggtgg tggctcctct gactgtgaac 840
actgagggag ctcctcagat caaggtgtac gctaacatcg ctcctactaa cgtgcacgtg 900
gctggagagt tcccttccaa ggagggaatc ttccctgtgg cttgctccga cggatacgga 960
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gctgtgcacc cttccgctgc tagacacaag cagaagatcg tggctcctgt gaagcagtcc 2220
ctgaacttcg acctgctgaa gctggctgga gacgtggagt ccaaccctgg aggtccttat 2280
gaaggacctg ttaagaagcc agtcgctcta aaggtaaagg ccaagaactt gattgtgact 2340
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gcttacctgg tgcctagaca cctgttcgct gagaagtacg acaagatcat gctggacgga 2520
agagctatga ctgactccga ctacagagtg ttcgagttcg agatcaaggt gaagggacag 2580
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actaagcact tcagagacac tgctagaatg aagaagggaa ctcctgtggt gggagtgatc 2700
aacaacgctg acgtgggaag actgatcttc tccggagagg ctctgactta caaggacatc 2760
gtggtgtgca tggacggaga cactatgcct ggactgttcg cttacagagc tgctactaag 2820
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actcactccg ctggaggaaa cggagtggga tactgctcct gcgtgtccag atccatgctg 2940
ctgaagatga aggctcacat cgaccctgag cctcaccacg agtaagctt 2989
SEQUENCE LISTING <110> Gproan Biotechnologies (Suzhou), Inc. <120> A foot-and-mouth disease virus-like particle vaccine and preparation method thereof <130> KHP183110236.5 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2587 <212> DNA <213> P12A <400> 1 cggtccgaaa ccatgaaatt cttagtcaac gttgcccttg tttttatggt cgtatacatt 60 tcttacatct atgcgggagc tggacagtcc tcccctgcta ctggatccca gaaccagtcc 120 ggaaacactg gatccatcat caacaactac tacatgcagc agtaccagaa ctccatggac 180 actcagctgg gagacaacgc tatctccgga ggatccaacg agggatccac tgacactact 240 tccactcaca ctactaacac tcagaacaac gactggttct ccaagctggc ttcctccgct 300 ttctccggac tgttcggagc tctgctggct gacaagaaga ctgaggagac tactctgctg 360 gaggacagaa tcctgactac tagaaacgga cacactactt ccactactca gtcctccgtg 420 ggaatcactc acggatacgc tactgctgag gacttcgtga acggacctaa cacttccgga 480 ctggagacta gagtggtgca ggctgagaga ttcttcaaga ctcacctgtt cgactgggtg 540 acttccgacc ctttcggaag atgctacctg ctggagctgc ctactgacca caagggagtg 600 tacggatccc tgactgactc ctacgcttac atgagaaacg gatgggacgt ggaggtgact 660 gctgtgggaa accagttcaa cggaggatgc ctgctggtgg ctatggtgcc tgagctgtgc 720 tccatcgaga gaagagagct gttccagctg actctgttcc ctcaccagtt catcaaccct 780 agaactaaca tgactgctca catcaaggtg cctttcgtgg gagtgaacag atacgaccag 840 tacaaggtgc acaagccttg gactctggtg gtgatggtgg tggctcctct gactgtgaac 900 actgagggag ctcctcagat caaggtgtac gctaacatcg ctcctactaa cgtgcacgtg 960 gctggagagt tcccttccaa ggagggaatc ttccctgtgg cttgctccga cggatacgga 1020 ggactggtga ctactgaccc taagactgct gaccctgtgt acggaaaggt gttcaaccct 1080 cctagaaaca tgctgcctgg aagattcact aacctgctgg acgtggctga ggcttgccct 1140 actttcctgc acttcgacgg agacgtgcct tacgtgacta ctaagactga ctccgacaga 1200 gtgctggctc agttcgacct gtccctggct gctaagcaca tgtccaacac tttcctggct 1260 ggactggctc agtactacac tcagtactcc ggaactgtga acctgcactt catgttcact 1320 ggacctactg acgctaaggc tagatacatg atcgcttacg ctcctcctgg aatggagcct 1380 cctaagactc ctgaggctgc tgctcactgc atccacgctg agtgggacac tggactgaac 1440 tccaagttca ctttctccat cccttacctg tccgctgctg actacgctta cactgcttcc 1500 gacgctgctg agactactaa cgtgcaggga tgggtgtgcc tgttccagat cactcacgga 1560 aaggctgagg gagacgctct ggtggtgctg gcttccgctg gaaaggactt cgagctgaga 1620 ctgcctgtgg acgctagaca gcagactact tccactggag agtccgctga ccctgtgact 1680 gctactgtgg agaactacgg aggagagact caggtgcaga gaagacacca cactgacgtg 1740 tccttcatcc tggacagatt cgtgaaggtg actcctaagg actccatcaa cgtgctggac 1800 ctgatgcaga ctccttccca cactctggtg ggagctctgc tgagaactgc tacttactac 1860 ttcgctgacc tggaggtggc tgtgaagcac gagggagacc tgacttgggt gcctaacgga 1920 gctcctgagg ctgctctgga caacactact aaccctactg cttaccacaa ggctcctctg 1980 actagactgg ctctgcctta cactgctcct cacagagtgc tggctactgt gtacaacgga 2040 aactgcaagt acgctggagg atccctgcct aacgtgagag gagacctgca ggtgctggct 2100 cagaaggctg ctagacctct gcctacttcc ttcaactacg gagctatcaa ggctactaga 2160 gtgactgagc tgctgtacag aatgaagaga gctgagactt actgccctag acctctgctg 2220 gctgtgcacc cttccgctgc tagacacaag cagaagatcg tggctcctgt gaagcagtcc 2280 ctgaacttcg acctgctgaa gctggctgga gacgtggagt ccaaccctgg aacttcctaa 2340 gatcataatc agccatacca catttgtaga ggttttactt gctttaaaaa acctcccaca 2400 cctccccctg aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact tgtttattgc 2460 agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt 2520 ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggat 2580 cgaattc 2587 <210> 2 <211> 861 <212> DNA <213> 3C <400> 2 gcatgcatca tggagataat taaaatgata accatctcgc aaataaataa gtattttact 60 gttttcgtaa cagttttgta ataaaaaaac ctataaatat tccggattat tcataccgtc 120 ccaccatcgg gcgcggatct cgctgcgaaa ccatgaaatt cttagtcaac gttgcccttg 180 tttttatggt cgtatacatt tcttacatct atgcgtccgg agctcctcct actgacctgc 240 agaagatggt gatgggaaac actaagcctg tggagctgat cctggacgga aagactgtgg 300 ctatctgctg cgctactgga gtgttcggaa ctgcttacct ggtgcctaga cacctgttcg 360 ctgagaagta cgacaagatc atgctggacg gaagagctat gactgactcc gactacagag 420 tgttcgagtt cgagatcaag gtgaagggac aggacatgct gtccgacgct gctctgatgg 480 tgctgcacag aggaaacaga gtgagagaca tcactaagca cttcagagac actgctagaa 540 tgaagaaggg aactcctgtg gtgggagtga tcaacaacgc tgacgtggga agactgatct 600 tctccggaga ggctctgact tacaaggaca tcgtggtgtg catggacgga gacactatgc 660 ctggactgtt cgcttacaga gctgctacta aggctggata ctgcggagga gctgtgctgg 720 ctaaggacgg agctgacact ttcatcgtgg gaactcactc cgctggagga aacggagtgg 780 gatactgctc ctgcgtgtcc agatccatgc tgctgaagat gaaggctcac atcgaccctg 840 agcctcacca cgagtaagct t 861 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 3 gttttcccag tcacgac 17 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 4 caggaaacag tcatgac 17 <210> 5 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 5 ccatcgggcg cggatctcgg tccgaaacca tgggagctgg acagtcctcc cctgc 55 <210> 6 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 6 ttacctttag agcgactggc ttcttaacag gtccttcata aggacctcca gggttggact 60 ccacgtctc 69 <210> 7 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 7 gccagtcgct ctaaaggtaa aggccaagaa cttgattgtg actgaatccg gagctcctcc 60 tactgacctg 70 <210> 8 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 8 ctagtacttc tcgacaagct tactcgtggt gaggctcagg gtcgatgtga gcc 53 <210> 9 <211> 2989 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 9 cggtccgaaa ccatgggagc tggacagtcc tcccctgcta ctggatccca gaaccagtcc 60 ggaaacactg gatccatcat caacaactac tacatgcagc agtaccagaa ctccatggac 120 actcagctgg gagacaacgc tatctccgga ggatccaacg agggatccac tgacactact 180 tccactcaca ctactaacac tcagaacaac gactggttct ccaagctggc ttcctccgct 240 ttctccggac tgttcggagc tctgctggct gacaagaaga ctgaggagac tactctgctg 300 gaggacagaa tcctgactac tagaaacgga cacactactt ccactactca gtcctccgtg 360 ggaatcactc acggatacgc tactgctgag gacttcgtga acggacctaa cacttccgga 420 ctggagacta gagtggtgca ggctgagaga ttcttcaaga ctcacctgtt cgactgggtg 480 acttccgacc ctttcggaag atgctacctg ctggagctgc ctactgacca caagggagtg 540 tacggatccc tgactgactc ctacgcttac atgagaaacg gatgggacgt ggaggtgact 600 gctgtgggaa accagttcaa cggaggatgc ctgctggtgg ctatggtgcc tgagctgtgc 660 tccatcgaga gaagagagct gttccagctg actctgttcc ctcaccagtt catcaaccct 720 agaactaaca tgactgctca catcaaggtg cctttcgtgg gagtgaacag atacgaccag 780 tacaaggtgc acaagccttg gactctggtg gtgatggtgg tggctcctct gactgtgaac 840 actgagggag ctcctcagat caaggtgtac gctaacatcg ctcctactaa cgtgcacgtg 900 gctggagagt tcccttccaa ggagggaatc ttccctgtgg cttgctccga cggatacgga 960 ggactggtga ctactgaccc taagactgct gaccctgtgt acggaaaggt gttcaaccct 1020 cctagaaaca tgctgcctgg aagattcact aacctgctgg acgtggctga ggcttgccct 1080 actttcctgc acttcgacgg agacgtgcct tacgtgacta ctaagactga ctccgacaga 1140 gtgctggctc agttcgacct gtccctggct gctaagcaca tgtccaacac tttcctggct 1200 ggactggctc agtactacac tcagtactcc ggaactgtga acctgcactt catgttcact 1260 ggacctactg acgctaaggc tagatacatg atcgcttacg ctcctcctgg aatggagcct 1320 cctaagactc ctgaggctgc tgctcactgc atccacgctg agtgggacac tggactgaac 1380 tccaagttca ctttctccat cccttacctg tccgctgctg actacgctta cactgcttcc 1440 gacgctgctg agactactaa cgtgcaggga tgggtgtgcc tgttccagat cactcacgga 1500 aaggctgagg gagacgctct ggtggtgctg gcttccgctg gaaaggactt cgagctgaga 1560 ctgcctgtgg acgctagaca gcagactact tccactggag agtccgctga ccctgtgact 1620 gctactgtgg agaactacgg aggagagact caggtgcaga gaagacacca cactgacgtg 1680 tccttcatcc tggacagatt cgtgaaggtg actcctaagg actccatcaa cgtgctggac 1740 ctgatgcaga ctccttccca cactctggtg ggagctctgc tgagaactgc tacttactac 1800 ttcgctgacc tggaggtggc tgtgaagcac gagggagacc tgacttgggt gcctaacgga 1860 gctcctgagg ctgctctgga caacactact aaccctactg cttaccacaa ggctcctctg 1920 actagactgg ctctgcctta cactgctcct cacagagtgc tggctactgt gtacaacgga 1980 aactgcaagt acgctggagg atccctgcct aacgtgagag gagacctgca ggtgctggct 2040 cagaaggctg ctagacctct gcctacttcc ttcaactacg gagctatcaa ggctactaga 2100 gtgactgagc tgctgtacag aatgaagaga gctgagactt actgccctag acctctgctg 2160 gctgtgcacc cttccgctgc tagacacaag cagaagatcg tggctcctgt gaagcagtcc 2220 ctgaacttcg acctgctgaa gctggctgga gacgtggagt ccaaccctgg aggtccttat 2280 gaaggacctg ttaagaagcc agtcgctcta aaggtaaagg ccaagaactt gattgtgact 2340 gaatccggag ctcctcctac tgacctgcag aagatggtga tgggaaacac taagcctgtg 2400 gagctgatcc tggacggaaa gactgtggct atctgctgcg ctactggagt gttcggaact 2460 gcttacctgg tgcctagaca cctgttcgct gagaagtacg acaagatcat gctggacgga 2520 agagctatga ctgactccga ctacagagtg ttcgagttcg agatcaaggt gaagggacag 2580 gacatgctgt ccgacgctgc tctgatggtg ctgcacagag gaaacagagt gagagacatc 2640 actaagcact tcagagacac tgctagaatg aagaagggaa ctcctgtggt gggagtgatc 2700 aacaacgctg acgtgggaag actgatcttc tccggagagg ctctgactta caaggacatc 2760 gtggtgtgca tggacggaga cactatgcct ggactgttcg cttacagagc tgctactaag 2820 gctggatact gcggaggagc tgtgctggct aaggacggag ctgacacttt catcgtggga 2880 actcactccg ctggaggaaa cggagtggga tactgctcct gcgtgtccag atccatgctg 2940 ctgaagatga aggctcacat cgaccctgag cctcaccacg agtaagctt 2989

Claims (10)

  1. 구제역 바이러스 P12A 유전자와 3C 유전자를 포함하며;
    상기 구제역 바이러스 P12A 유전자는 서열목록의 서열번호 1로 표시되거나; 또는 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드 서열이 하나 또는 복수개의 중복된 뉴클레오티드로 치환 또는 결실 또는 삽입되어 얻은 P12A 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이며;
    상기 구제역 바이러스 3C 유전자는 서열번호 2로 표시되거나; 또는 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 서열이 하나 또는 복수개의 중복된 뉴클레오티드로 치환 또는 결실 또는 삽입되어 얻은 3C 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열인, 재조합 발현 벡터.
  2. 제1항에 있어서, Sph I와 Hind III로 3C 유전자 단편과 pFastBac HT-B를 이중 절단하고, 절단 후 3C 유전자 단편과 pFastBac HT-B를 결찰하여 pFastBac HT-B-3C를 얻으며; Rsr II와 EcoR I로 P12A 유전자 단편과 pFastBac HT-B-3C를 이중 절단하고, 절단 후 상기 P12A 유전자 단편과 상기 pFastBac HT-B-3C를 결찰하여, pFastBac HT-B-P12A-3C 재조합 발현 플라스미드를 구축하여 수득하는 방법으로 제조되는 것을 특징으로하는, 재조합 발현 벡터.
  3. 제1항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 곤충세포.
  4. 제3항의 곤충세포의 배양액으로부터 수득된 상등액을 여과하여 농축하는 단계;
    농축된 상등액을 원심분리하여 상등액을 얻는 단계;
    원심분리하여 얻어진 상등액을 크기 배제 크로마토그래피로 정제하여 바이러스 유사 입자와 불순 단백질을 분리하는 단계; 및
    크기 배제 크로마토그래피로부터 분리된 바이러스 유사 입자 피크 분획을 이온교환 크로마토그래피로 정제하는 단계;를 포함하는 방법으로 제조된 구제역 바이러스 유사 입자.
  5. 제4항에 있어서, 상기 곤충세포는 sf9, sf21 및 High5 세포로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인 것인, 구제역 바이러스 유사 입자.
  6. 제4항에 있어서, 상기 여과하여 농축하는 단계는 컷-오프 공경이 200nm 내지 500nm인 중공섬유 컬럼을 사용하여 배양액을 정화하고, 컷-오프 공경 300kDa을 선택하여 한외여과 농축하는 것인, 구제역 바이러스 유사 입자.
  7. 삭제
  8. 제1항 및 제2항 중 어느 한 항의 재조합 발현 벡터 또는 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 바이러스 유사 입자를 포함하는 구제역 바이러스 감염증 예방용 백신 조성물.
  9. 삭제
  10. 제8항에 있어서, 상기 조성물 전체 대비 보조제 50μg/ml 내지 5000μg/ml를 포함하는, 구제역 바이러스 감염증 예방용 백신 조성물.
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