CN117836000A - 产生口蹄疫病毒病毒样颗粒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在杆状病毒表达系统中产生口蹄疫病毒(FMDV)病毒样颗粒(VLP)的方法，所述方法包括以下步骤：(i)用杆状病毒表达载体感染昆虫细胞，(ii)感染后在细胞培养基中培养昆虫细胞5天或更长，以及(iii)从细胞培养基中收获FMDV VLP。本发明还涉及用于保护受试者免受FMDV感染的疫苗，所述疫苗可通过本发明的方法获得。

Description

产生口蹄疫病毒病毒样颗粒的方法
本发明涉及兽医学和病毒学领域。本发明特别涉及在杆状病毒表达系统中产生Asia1和SAT2株的口蹄疫病毒(FMDV)病毒样颗粒(VLP)的方法，该方法包括以下步骤：(i)用杆状病毒表达载体感染昆虫细胞，(ii)感染后在细胞培养基中培养昆虫细胞5天或更长，以及(iii)从培养基中收获FMDV VLP。本发明还涉及用于针对FMDV感染保护受试者的疫苗，所述疫苗通过本发明的方法可获得。
发明背景
口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是偶蹄类的驯养动物和野生动物的一种高度传染性的急性病毒性疾病。联合国粮食及农业组织(FAO)将其归类为跨境动物疾病。它也是一种法定报告的疾病。口蹄疫在非洲、南美洲、中东和亚洲的大部分地区流行，是全球经济上最重要的牲畜传染病，影响牛、猪、绵羊、山羊和其他偶蹄动物物种，如水牛和鹿。FMD曾在世界范围内传播，但在一些地区(包括北美和西欧)已被根除。在流行国家，FMD对国际牲畜贸易施加了经济限制，并且除非采取严格的预防措施，否则可以很容易地将其重新引入无病区域。FMD影响整个畜牧业，导致当地农民收入损失。
目前的疫苗由灭活的病毒制成。在病毒灭活之前，活的FMD病毒是在高度控制的设施中生产的，限制了FMD疫苗的生产。这种设施的建造成本和维护成本高于常规设施的建造成本和维护成本，并且由于控制带来的限制，操作成本也更高。
针对FMD的有效疫苗接种需要存在完整的FMDV衣壳(也称为146S颗粒)，而非已经被证明免疫原性不足的衣壳构建单元(Doel and Chong,1982,Archives of Virology)。灭活的FMD病毒结构脆弱，在酸性pH值或升高的温度下易分裂成衣壳构建单元。因此，需要冷链将有效的FMD疫苗递送至牲畜饲养者。因此，在全球，特别是在非洲，疫苗供应严重不足。因此，需要一种用于商业FMD疫苗的新疫苗技术，其能够克服目前经典灭活病毒疫苗的许多缺点。
需要一种用于商业FMD疫苗的新疫苗技术，其可克服目前灭活病毒疫苗的许多缺点。
病毒样颗粒(VLP)技术是目前被认为是少数有可能成为传统灭活疫苗的可行替代方案的技术之一。与现有技术相比，VLP技术的优点是例如更高的产品稳定性、更大的生产地点灵活性(低控制生产)以及对新毒株爆发的更快响应。基于VLP的疫苗被设计为标志疫苗，其减轻了实施生产步骤以去除非结构蛋白的必要性。
FMDV基因组编码单个开放阅读框(ORF)，其产生被加工成12个成熟病毒蛋白的前体多蛋白，图1(来自：Balinda et al.Virology Journal 2010,7:199)。P1多蛋白中间体由四个衣壳结构蛋白VP1-VP4组成，位于2A蛋白的紧邻上游，其在翻译过程中引起P1和P2多蛋白的非蛋白水解分离以从P2释放P1-2A。P1-2A多蛋白随后被FMDV 3C蛋白酶加工成2A、VP0(也称为1AB)、VP3(1C)和VP1(1D)。据信VP0蛋白在包封过程中分离成VP4和VP2。FMDV病毒体由加工的病毒结构蛋白通过自组装形成。
用于基于VLP的疫苗的VLP可通过在合适的宿主细胞中重组表达FMDV前体蛋白而产生，类似于FMDV病毒体的自组装。杆状病毒表达载体平台目前被用作VLP生产的优选平台之一。例如，可以使用对昆虫细胞毒性较小的经修饰的3C蛋白酶在杆状病毒表达系统中进行重组表达(Porta et al(2013)J Virol Methods)。VLP由加工的病毒结构蛋白VP0、VP3和VP1自组装而成，这些蛋白在病毒编码的3C蛋白酶的作用下从结构蛋白前体P1-2A中释放出来。P1-2A-3C盒中的3C酶的中等和无毒活性允许P1-2A前体表达和加工成结构蛋白，所述结构蛋白组装成空衣壳。可以通过在衣壳蛋白之间引入共价连接，例如半胱氨酸桥(WO2002/000251)，或通过引入其他合理设计的突变(Porta et al.(2013)PLoS Pathog)来改善VLP对低pH的热稳定性和抗性。
然而，杆状病毒表达平台提供的FMDV VLP相对低的表达水平限制了基于VLP的FMD疫苗的开发。此外，我们已经发现从昆虫细胞培养物中收获的FMDV VLP仅表现出中等的热稳定性，特别是对于某些血清型。
在杆状病毒表达系统中产生的蛋白质通常最终在昆虫细胞内，除非蛋白质含有将它们靶向细胞外环境的信号序列。被捕获在昆虫细胞内的重组蛋白可通过本领域已知的细胞破碎技术释放。获得的细胞裂解物含有所有细胞组分和碎片，并且通常需要费力的纯化以获得更纯形式的重组蛋白。此外，细胞破碎技术还释放大量不需要的细胞蛋白质，例如蛋白酶，其可以降解所需的蛋白质，从而降低蛋白质产率和质量。因此，如果目标蛋白质应该靶向至其可以从中轻松被收获的上清液，则通常会故意将靶向序列设计到蛋白质序列中。此外，我们发现从裂解的昆虫细胞中纯化的FMDV VLP仅具有中等的热稳定性，特别是对于某些血清型。
因此，本领域需要在昆虫细胞中产生FMDV VLP的改进方法，该方法导致所产生的VLP的高产率和良好的热稳定性。
发明概述
在本发明中，令人惊奇地发现，如果培养至少5天，即通过在感染后最早5天(dpi)收获VLP，Asia1或SAT2株的FMDV VLP具有增加的稳定性。发现，尽管没有用信号序列进行工程化，但很大部分VLP被转运到细胞培养基中，这似乎是一个活跃的过程，因为据观察，在细胞因杆状病毒感染而破裂之前，VLP在细胞培养基中变得丰富。据信，VLP在移动到细胞外基质时成熟。由于很大部分VLP最终被转运至细胞外基质，这解释了本发明中令人惊讶的观察结果，即来源于感染至少5天后的细胞培养基的VLP总体上(即，如果需要，包括形成细胞的VLP，例如在裂解细胞后释放到周围介质中)比在更早时间点(4dpi或更早)收获的VLP更稳定。
因此，本发明的第一方面提供了在杆状病毒表达系统中产生Asia1和SAT2株的口蹄疫病毒(FMDV)病毒样颗粒(VLP)的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)用杆状病毒表达载体感染昆虫细胞，其中所述昆虫细胞能够重组产生FMDVVLP，
(ii)在所述昆虫细胞产生FMDV VLP的条件下在细胞培养基中培养所述昆虫细胞，其中培养在感染后进行5天或更长，
(iii)从所述细胞培养基(包括上清液和任选的细胞内容物，例如在裂解这些细胞之后)收获所述昆虫细胞产生的FMDV VLP。
在第二方面，本发明提供了用于针对FMDV感染保护受试者的疫苗，所述疫苗通过本发明的方法可获得。
在第三方面，本发明提供了针对FMDV感染保护受试者的方法，其包括通过本发明的方法产生FMDV VLP，通过添加药学上可接受的载体将VLP掺入疫苗中，和将所述疫苗施用于所述受试者的步骤。
发明详述
术语定义
病毒“衣壳”在本领域中通常被理解为病毒的蛋白质外壳，通常包围其遗传物质。
“衣壳前体蛋白”是结构蛋白，其参与病毒衣壳或其构建单元的形成。FMDV衣壳前体蛋白通常包含结构蛋白P1。由于蛋白P1被FMDV 3C蛋白酶(3Cpro)加工成成熟的VP0、VP3和VP1蛋白，P1蛋白也可称为多蛋白或前蛋白。在本发明的上下文中，FMDV衣壳前体蛋白通常包含至少P1，其包括蛋白VP1、VP2、VP3和VP4。可替代地，FMDV衣壳前体蛋白可包含蛋白VP1、VP2、VP3和VP4中的一种或多种。FMDV衣壳前体蛋白还可以包含蛋白VP0，其包含蛋白VP2和VP4。最优选地，FMDV衣壳前体蛋白至少包含P1和2A蛋白(本文也称为P1-2A衣壳前体)。
“病毒样颗粒”(VLP)在本领域中也可称为“空衣壳”，它是包含病毒的蛋白质外壳但缺少RNA或DNA基因组的实体。VLP应该以与野生型病毒相同的方式具有抗原性和免疫原性，因为它保留相同的结构表位，但由于缺少病毒基因组，它应该不产生感染。FMDV VLP通常由P1-2A衣壳前体形成。如上所述，2A蛋白酶在其C末端裂解自身以从P2释放P1-2A。P1-2A衣壳前体的加工受3C蛋白酶影响，产生2A和衣壳蛋白VP0、VP3和VP1。VLP是由这些衣壳蛋白自组装形成的。
VLP也可在本发明的杆状病毒表达系统中使用对昆虫细胞毒性较小的经修饰的3C蛋白酶来产生(Porta et al.(2013)J Virol Methods)。P1-2A-3C表达盒中的3C酶的中等和无毒活性允许P1-2A前体重组表达和加工成结构蛋白VP0、VP1和VP3，其组装成VLP。可以使用本领域已知的技术如蔗糖密度离心或电子显微镜来研究或验证VLP的产生。对野生型病毒上的构象表位具有特异性的单克隆抗体可用于研究空衣壳的结构和抗原性是否被保留。
本文所用的术语“疫苗”是指当施用给受试者时，诱导或刺激保护性免疫应答的制剂。疫苗可使生物体对特定疾病免疫。
“针对FMDV感染保护动物”是指帮助预防、改善或治愈FMDV的病原性感染，或帮助预防、改善或治愈由该感染引起的病症，例如，预防或减轻由FMDV感染的治疗后(即疫苗接种后)引起的一种或多种临床征象。
术语“预防(prevention)”或“进行预防(preventing)”是指通过预防性治疗来避免、延迟、阻止或阻碍FMDV感染。例如，所述疫苗可预防或降低感染性FMDV进入宿主细胞的可能性。
术语“核酸序列”包括RNA或DNA序列。它可以是单链或双链的。例如，它可以是基因组、重组体、mRNA或cDNA。
“表达载体”(同义词，“表达构建体”)通常是设计用于在细胞中重组基因表达的质粒或病毒。所述载体用于将特定基因引入靶细胞中，且可控制细胞的蛋白质合成机制以产生由所述基因编码的目标蛋白(POI)。为了表达重组基因以产生POI，表达载体通常包含至少启动子以驱动目的基因(GOI)的表达，并且可以进一步包含一种或多种翻译增强子以增加POI的产率。
“杆状病毒表达载体”是基于杆状病毒的表达载体，其用于宿主细胞例如昆虫细胞中的重组基因表达。杆状病毒表达系统在本领域已建立并且是可商购的，例如Bac-to-Bac表达系统(Thermo Fisher Scientific,德国)。在这些杆状病毒表达系统中，野生型杆状病毒基因组中天然存在的多角体蛋白基因通常被重组基因或cDNA替换。这些基因通常受多角体蛋白或p10杆状病毒启动子的控制。
用于基因表达的最常见的杆状病毒是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographacalifornica nucleopolyhedrovirus(AcNPV))。AcNPV具有大型(130kb)环状双链DNA基因组。GOI被克隆到含有杆状病毒启动子的转移载体中，该启动子两侧是来自非必需基因座(例如多角体基因)的杆状病毒DNA。含有GOI的重组杆状病毒是通过昆虫细胞中转移载体与亲本病毒(例如AcNPV)基因组之间的同源重组产生的。
“翻译增强子”是形成元件的核苷酸序列，其可以促进翻译并由此增加蛋白质产量。通常，翻译增强子可见于mRNA的5′和3′非翻译区(UTR)中。特别地，紧邻GOI的起始ATG密码子上游的5′-UTR中的核苷酸可能对翻译起始水平具有深远的影响。
杆状病毒表达系统
在本发明的方法中，FMDV VLP是在杆状病毒表达载体系统(BEVS)中使用杆状病毒表达载体产生的。
杆状病毒表达载体可以是能够在启动子控制下重组表达FMDV衣壳前体蛋白的任何杆状病毒表达载体。启动子没有特别限制，但可以是能够在杆状病毒表达系统中重组表达FMDV衣壳前体蛋白的任何启动子。用于本发明杆状病毒表达系统的优选启动子是AcNPV的多角体蛋白(polh)启动子(描述于：Ayres M.D.et al.(1994)Virology,Vol.2020,p.586-605)以及p10启动子(描述于：Knebel D.et al.(1985)EMBO J.Vol.4(5),1301–1306)。另一个优选的启动子是甜菜夜蛾核多角体病毒(S.exigua nucleopolyhedrovirus(SeNPV))的orf46病毒基因的启动子(描述于：M.Martínez-Solís et al.(2016)PeerJ,DOI10.7717/peerj.2183)。
表达载体可以进一步包含一种或多种翻译增强子，其增强FMDV衣壳前体蛋白的重组表达。例如，杆状病毒表达载体可以包含两个翻译增强子Syn21和p10UTR，如EP20203373中所述，其全部内容通过引用并入本文。
用于在重组表达蛋白的杆状病毒表达系统中使用的杆状病毒表达载体是可商购的，并且在本领域中广泛用于产生蛋白质和病毒样颗粒。该系统可以包括，例如一种或多种用于转化细胞(例如大肠杆菌细胞或昆虫细胞，杆状病毒表达载体在其中繁殖)的转移质粒。市售杆状病毒表达载体包括但不限于载体(ALGENEX,Spain)，/>载体(Thermo Fisher Scientific,德国)、/>载体(Oxford ExpressionTechnologies Ltd,UK)以及/>载体(EXPRESSION SYSTEMS,CA)。
因此，本发明方法中使用的杆状病毒表达载体可以含有表达盒，所述表达盒包含编码FMDV衣壳前体蛋白的核酸序列，其在功能性启动子的控制下在昆虫细胞中表达，并且优选地包括一种或多种翻译增强子和/或其他顺式作用元件。
编码FMDV衣壳前体蛋白的核酸序列不具体限于特定的株，并且可以是属于血清型Asia1或SAT2的任何FMDV株。
在本发明的方法中，FMDV衣壳前体蛋白可以包含加工和装配VLP所必需的所有元件。因此，FMDV衣壳前体蛋白通常至少包含衣壳前体P1并且优选还包含2A肽。2A肽能够从其C末端下游的任何蛋白质序列释放P1-2A。
在另一个优选的实施方案中，杆状病毒表达载体还包含编码能够裂解FMDV衣壳前体蛋白的蛋白酶的核酸序列。蛋白酶可以是能够裂解FMDV衣壳前体蛋白作为FMDV VLP的产生和组装步骤的任何蛋白酶。如上所述，对于FMDV，前体P1蛋白水解加工成VP0(VP2加VP4)、VP3和VP1通过病毒3C蛋白酶或其前体3CD而发生。因此，蛋白酶优选是FMDV的3C蛋白酶。来自FMDV株(A型，但在不同FMDV株之间保守)的FMDV野生型3C蛋白酶的序列记载于本领域中以及公开于WO2011/048353中，其通过引用整体并入本文。3C蛋白酶也可以是包括一个或多个降低其蛋白水解活性的突变(例如在半胱氨酸142处的突变)的功能性衍生物。
衣壳前体蛋白可以是P1，其被3C蛋白酶裂解成VP0、VP3和VP1。最优选地，杆状病毒表达系统表达P1-2A-3C盒，即它同时表达蛋白P1、2A和3C的编码区。P1-2A-3C盒中3C酶的表达允许P1-2A前体表达和加工成结构蛋白，其组装成VLP。衣壳前体蛋白和蛋白酶可以在单个启动子的控制下或在相同启动子的控制下表达。进一步可替代地，FMDV VLP组装所需的衣壳前体蛋白可被分成多个表达单位并单独表达，例如通过重组产生VP1、VP2、VP3和VP4，或重组产生VP0、VP1和VP3。在该替代实施方案中，衣壳前体蛋白通过3C蛋白酶的蛋白水解裂解可能不是必需的。
衣壳前体蛋白或VLP的裂解可以使用本领域已知的技术进行分析。例如，可以通过凝胶电泳分析来自杆状病毒感染的宿主细胞的提取物，并将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上用于蛋白质印迹。使用蛋白质特异性抗体进行的蛋白质印迹应揭示蛋白酶介导的裂解的程度。例如，对于FMDV，未加工的衣壳前体蛋白(P1-2A)将显示为约81kDa的条带，裂解可以产生VP3-VP1(～47kDa)、VP0(～33kDa)、VP2(～22kDa)、VP3(～24kDa)和/或VP1(～24kDa)。
产生病毒样颗粒的方法
本发明的方法包括在适合细胞从杆状病毒表达载体表达衣壳前体蛋白以产生VLP的条件下培养宿主细胞，在本发明中宿主细胞是昆虫细胞。因此，术语“昆虫细胞能够重组产生FMDV VLP”是指昆虫细胞可以用作产生重组衣壳前体蛋白的宿主细胞，所述重组衣壳前体蛋白组装成VLP。
本发明方法的第一步包括用杆状病毒表达载体感染昆虫细胞(本发明方法的步骤(i))。昆虫细胞可以是能够在细胞培养物中产生FMDV VLP的任何昆虫细胞。特别地，昆虫细胞可以是Sf9细胞(草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf21细胞的克隆分离物)、Sf21细胞、(BTI-TN-5B1-4)细胞或Tni细胞(从粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)分离的卵巢细胞)。最优选地，宿主细胞是Tni细胞或源自Tni的细胞系，例如Tnao38细胞。
用杆状病毒表达载体感染昆虫细胞以重组表达蛋白质的方法是本领域技术人员熟知的。
在本发明的方法中，昆虫细胞的培养在细胞培养基中进行(本发明方法的步骤(ii))，例如在无血清培养基中的悬浮细胞培养物。
在昆虫细胞产生FMDV VLP的条件下，受感染的昆虫细胞的细胞培养在本领域已建立的并且可以，例如，如(Porta et al.,2013,J.Virol.Methods,vol.187,p.406；A.C.Mignaqui et al.,2019,Critical Reviews in Biotechnology,vol.39(3),p.306-320)中所述进行。在昆虫细胞培养物中使用BEVS用于重组蛋白表达的一般程序是本领域众所周知的，并且描述于，例如，“Guide to Baculovirus Expression Vector Systems(BEVS)and Insect Cell Culture Techniques”,Instruction Manual；L.King,The Baculovirus Expression System,A laboratory guide；Springer,1992；Baculovirus and Insect Cell Expression Protocols,Humana Press,D.W.Murhammer(ed.)2007；Baculovirus Expression Vectors:A Laboratory Manual,OxfordUniversity Press,D.R.O'Reilly,1993。
传统上，Grace's补充(TNM-FH)培养基已成为昆虫细胞培养的首选培养基。然而，自从Grace's培养基问世以来，其他依赖于血清/血淋巴和无血清的配方已经出现。大多数培养的昆虫细胞的生长和感染的最佳范围通常为25℃至30℃，pH范围为6.0至6.4。
在本发明的方法中，受感染的细胞的培养在感染后(dpi)进行5天或更长。在本发明中可以令人惊讶地观察到，在杆状病毒感染后第4天和第5天，VP0蛋白存在于细胞培养基中，而在感染后第6天和第7天不存在。伴随着VP0的消失，VP2蛋白出现在细胞培养物中，最明显的是在5dpi时。因此，可以表明培养基中的VP0蛋白被裂解成VP2和VP4蛋白。认为VP0裂解成VP2和VP4发生在病毒颗粒成熟的最后阶段(Curry et al.,1997,J.Virol.71:9743-9752)。因此，我们的结果表明成熟的VLP从5dpi开始出现。
因此，即使由昆虫细胞产生的重组衣壳前体蛋白可能缺乏信号序列，由重组衣壳前体蛋白形成的VLP被细胞释放到细胞培养基中。因此，当使用上清液作为疫苗抗原的来源(任选地除了细胞作为抗原的来源之外)时，与仅使用来自细胞的VLP相比，成熟VLP的量增加，因此观察到稳定性。
因此，培养在感染后进行五天或更长，例如五天、六天或七天，优选五天或六天，最优选五天。尽管当培养超过五天时获得了更高的产率，但是从成本的观点来看，所需的额外培养时间在大规模疫苗生产中是不利的。因此，发现培养五天是最佳的。
培养后，如果希望避免从细胞中收获，可以将昆虫细胞从细胞培养物中分离出来，得到无细胞的细胞培养基(也称为上清液；本发明方法的步骤(iii))。尽管在这种情况下，VLP收获的总体稳定性更高，但总体产量更低，这当然取决于收获时细胞中仍然存在的VLP量。术语“上清液”涉及已除去昆虫细胞的细胞培养物。
在一个实施方案中，VLP仅从上清液中获得。因此，从细胞培养物中去除细胞以获得基本上不含昆虫细胞的无细胞培养基，在本文中也称为上清液。“基本上不含”昆虫细胞是指可能仅存在残余细胞，其对于产生本发明的VLP而言是微不足道的。最优选地，上清液不含任何残留细胞。
用于从小规模或大规模细胞培养物中分离细胞的常规技术是本领域众所周知的，并且包括膜过滤中的一种或多种，例如超滤、离心和沉降。
上清液中的VLP可通过透析、膜过滤或沉淀然后离心来浓缩。
在本发明方法的步骤(iii)中，从细胞培养基中收获由昆虫细胞产生的FMDV VLP，通常包括如本领域公知的从上清液以及细胞(通过引入裂解步骤)进行收获。收获通常包括从培养基中分离VLP，并且如果需要的话，进一步纯化VLP。收获可以通过沉淀VLP来进行，例如用聚乙二醇(PEG)沉淀。色谱技术例如亲和色谱或离子交换色谱也可用于纯化和浓缩VLP。收获还可以包括超滤以浓缩细胞培养基中的VLP或渗滤以浓缩VLP并用选择的液体或缓冲液替换细胞培养基。如果细胞培养基中VLP的浓度和纯度足够高以用于疫苗生产，则本发明的步骤(iii)可以不涉及任何纯化步骤。
在收获、浓缩和/或纯化过程中，蛋白酶抑制剂的存在可以减少不需要的蛋白水解活性。
疫苗及其生产
如上所述，本发明实施方案的优选用途是兽医医疗用途，特别是用于针对FMD的疫苗接种。因此，本发明还涉及FMDV VLP的产生，其用于生产疫苗。
具体地，在根据本发明的方法的步骤(iii)中从细胞培养基中收获的VLP可用作接种受试者的抗原。优选地，将VLP掺入包含VLP和一种或多种药学上可接受的载体的组合物中。
因此，本发明还提供了生产疫苗的方法，其包括通过上述方法产生FMDV VLP并将FMDV VLP掺入疫苗中的步骤，例如通过加入药学上可接受的载体。
药学上可接受的载体是本领域公知的。仅作为示例；这种载体可以是简单如无菌水或缓冲溶液如PBS。疫苗可包括单一载体或两种或更多种载体的组合。疫苗还可包括一种或多种药学上可接受的稀释剂、佐剂和/或赋形剂。疫苗还可以包括(或能够表达)另一种活性试剂，例如可以在VLP诱导的适应性免疫应答之前刺激早期保护的一种活性试剂。所述试剂可以是抗病毒试剂，例如I型干扰素。替代性地，或附加性地，试剂可以是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
疫苗可以治疗性地使用，以治疗现有的FMDV感染(尤其是在病毒流行的畜群或地区)，但优选预防性地使用，以阻断或降低FMDV感染的可能性和/或预防或降低疾病传播的可能性。
许多可商购的FMD疫苗是多价的，以提供针对不同FMD血清型的保护。同样，本发明的疫苗可包括多种不同的VLP，每种针对不同血清型和/或给定血清型内的不同亚型。
因此，在另一个优选的实施方案中，本发明的方法还包括步骤(iv)：通过加入药学上可接受的载体将FMDV VLP掺入疫苗中。
通过上述方法获得的疫苗可用于针对FMDV感染保护受试者。
本发明还提供了通过施用有效量的本发明疫苗来针对FMDV感染保护受试者的方法。一种针对FMDV感染保护受试者的方法，其包括通过上述方法产生FMDV VLP、通过加入药学上可接受的载体将所述VLP掺入疫苗中和将所述疫苗施用于所述受试者的步骤。
对于FMD，受试者可以是偶蹄类动物。FMD易感动物包括农场牲畜中的牛、绵羊、猪和山羊，以及骆驼科动物(骆驼、美洲驼、羊驼、原驼和小羊驼)。一些野生动物(如刺猬、海狸鼠)以及任何野生偶蹄类动物(如鹿)和动物园动物(包括大象)也是FMD易感的。
施用
本发明考虑至少一次向动物施用有效量的根据本发明的疫苗。疫苗可以以任何本领域已知的方法施用，包括任何局部或全身性施用方法。施用可以通过，例如，通过将抗原施用至肌肉组织中(肌内，IM)、真皮中(皮内，ID)、皮肤之下(皮下，SC)、粘膜之下(粘膜下，SM)、静脉中(静脉内，IV)、体腔中(腹膜内，IP)、经口、经肛门等来进行。对于目前的疫苗，IM、ID和SC施用是优选的。
实施例
通过以下非限制性实施例进一步描述本发明，这些实施例旨在帮助本领域普通技术人员实施本发明。
附图说明
图1：编码产生被加工成12种成熟病毒蛋白的前体多蛋白的单个开放阅读框(ORF)的FMDV基因组的示意图。
图2：使用在4、5、6或7dpi收获的O/TUR/5/2009VLP的时程实验的结果。通过蛋白质印迹法可视化细胞(C)或细胞培养物上清液(S)中的FMD蛋白。
图3：通过ELISA对感染后不同时间点收获的细胞培养物上清液中的O/TUR/5/2009蛋白进行定量。
图4：通过ELISA对不同样品中的O/TUR/5/2009蛋白进行定量。
图5：对来源于20-40％蔗糖梯度的级分进行蛋白质印迹分析。使用抗VP0和抗VP2抗体使条带可视化。每个级分的蔗糖百分比显示在印迹下方。
图6：对来源于在4或7dpi收获的培养物的样品进行蛋白质印迹分析。使用多克隆牛血清使条带可视化。
图7：于56℃孵育20min的Asia1/Shamir/89VLP的解离百分比。
图8：用来源于昆虫细胞或细胞培养物上清液的O/TUR/5/2009VLP对牛进行疫苗接种后诱导的病毒中和滴度。
图9：通过ELISA对在杆状病毒感染后不同时间点收获的超声处理的昆虫细胞培养物中的SAT2/SAU/6/2000VLP浓度进行定量(实施例8)。
图10：于46℃孵育20min后的SAT2/SAU/6/2000VLP的热稳定性(实施例8)。
图11：通过ELISA对在杆状病毒感染后不同时间点收获的澄清的昆虫细胞培养物液体中的A/SAU/1/2015VLP浓度进行定量(实施例9)。
图12：于56℃孵育20min后的A/SAU/1/2015VLP的热稳定性(实施例9)。
杆状病毒构建体的制备
通过本领域熟知的标准克隆方法进行杆状病毒表达构建体的克隆。使用来自ABVector的ProEasyTM系统生成重组杆状病毒。它们配备有P1-2A-3Cpro表达盒，如Porta etal.,2013,J Virol Methods所述。为了提高表达水平，将所谓的Syn21翻译增强子放置在P1-2A-3Cpro开放阅读框前面，在P1-2A-3Cpro编码区的下游插入来自苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)p10基因的3’-UTR(P10UTR)(Liu et al.,2015,Biotechnol Lett)。使用被置于用于产生重组杆状病毒的转移载体中的合成的cDNA引入氨基酸修饰。以下杆状病毒表达构建体在以下实施例中用于在昆虫细胞中重组产生VLP：
i)表达构建体O/TUR/5/2009，其包含未用任何突变进行稳定的FMDV株O/TUR/5/2009的P1-2A-3Cpro表达盒；
ii)表达构建体O/TUR/5/2009-VP2-S93F，其包含用VP2-S93F突变进行稳定的FMDV株O/TUR/5/2009的P1-2A-3Cpro表达盒，如WO2014/154655A1中所述；
iii)表达构建体A/IRN/7/2013-VP2-H93F，其包含用VP2-H93F突变进行稳定的FMDV株A/IRN/7/2013的P1-2A-3Cpro表达盒，如WO2014/154655A1中所述；
iv)表达构建体SAT2/SAU/6/2000-VP1-T12N-VP4-D53G，其包含用VP1(T12N)和VP4(D53G)中的突变进行稳定的FMDV株SAT2/SAU/6/2000的P1-2A-3Cpro表达盒；VP1-T12N突变是指VP1中在位置12处的苏氨酸(T)至天冬酰胺(N)的氨基酸突变。VP4-D53G突变是指VP4中在位置53处的天冬氨酸(D)至甘氨酸(G)的氨基酸突变。
v)表达构建体Asia1/Shamir-VP2-S93C，其包含基于用VP2-S93C突变进行稳定的FMDV株Asia1/Shamir/89的P1-2A-3Cpro表达盒，如WO2014/154655A1中所述。
vi)表达构建体A/SAU/1/2015-VP2-H93C，其包含基于FMDV株A/SAU/1/2015的P1-2A-3Cpro表达盒。VP2-H93C突变是指VP2中在位置093处的组氨酸(H)至半胱氨酸(C)的氨基酸突变，并且如WO 2002/000251中所描述。
采用杆状病毒表达系统重组表达VLP。
实施例1
用含有表达盒O/TUR/5/2009的重组杆状病毒以MOI＝1感染浓度为3.2×105个细胞/ml的Tni细胞的100ml细胞培养物。于27℃孵育后，在感染后4、5、6或7天(dpi)通过离心收集细胞，并重悬于10％的原始细胞培养物体积中，得到10x浓度系数。不使用细胞裂解方法。细胞培养物上清液，即已经通过离心从中除去昆虫细胞的无细胞培养基，不进行处理。使用抗VP0单克隆抗体(Loureiro et al.,2018,https://wellcomeopenresearch.org/articles/3-88)和多克隆牛血清FMD13.70.445(MSD Animal Health)两者通过蛋白质印迹分析上清液和细胞样品。
图2中的结果显示，早在4dpi时，就可以在细胞培养物上清液中检测到FMDV蛋白。随着时间的推移，在VP0蛋白质印迹上最清楚地观察到，细胞中FMDV蛋白的量减少，而细胞培养物上清液中FMDV蛋白的量增加，表明FMDV重组蛋白有效地从细胞释放到培养基中。
多克隆血清印迹揭示了另一个有趣的观察结果，其可能与衣壳成熟有关。在第4天和第5天，VP0蛋白存在于细胞培养基中，在感染后第6天和第7天不存在。伴随着VP0条带的消失，多克隆血清印迹上出现可能代表VP2蛋白的条带。如果是这样，蛋白质印迹表明培养基中的VP0蛋白被裂解成VP2和VP4蛋白。认为VP0裂解成VP2和VP4发生在病毒颗粒成熟的最后阶段(Curry et al.,1997,J.Virol.71:9743-9752)。这是令人惊讶的发现，因为空衣壳不包含RNA基因组并且通常不包含裂解的VP0。然而，这表明培养基是疫苗抗原的良好来源，因为与细胞相比，它含有成熟的VLP。
为了定量细胞培养物上清液中FMDV蛋白浓度的差异，使用INT-FMA-01-08单克隆抗体(MSD Animal Health)进行ELISA，其检测完整衣壳(75S/146S)和衣壳的五聚体构建单元(12S)。为此，将连续稀释的样品在用抗体于4℃包被过夜的微量滴定板上于37℃孵育1h。除去样品并用PBS-Tween洗涤三次后，将固定量的生物素化的INT-FMA-01-08加入到板中并于37℃孵育1h。除去生物素化的抗体，用PBS-Tween洗涤板三次，然后将过氧化物酶缀合的链霉亲和素添加到板中，然后进行发色检测。
图3中的图是ELISA结果的可视表示，并表明细胞培养基中VLP的量在7dpi时比4dpi时增加至3.4倍。通过将未处理样品的ELISA数据与在56℃热处理50分钟以将75S衣壳转化成12S五聚体的样品的ELISA数据进行比较，估计不稳定的野生型O/Tur/5/2009上清液中的VLP完整性(即75S的量)为54％，表明确实完整的衣壳被释放到细胞培养基中。
在该实施例中，显示FMDV重组蛋白有效地从细胞释放到培养基中，细胞培养基中VLP的量随时间增加，形成成熟的VLP。
实施例2
用含有表达盒O/TUR/5/2009-VP2-S93F的重组杆状病毒以MOI＝2感染两个含有3.2×105个细胞/ml的Tni细胞的100ml细胞培养物。于27℃孵育后，在4dpi时通过离心收集来自一个培养物的细胞，随后将细胞沉淀在50mM Tris pH 8.0-100mM KCl缓冲液中以感染培养物体积的10％进行超声处理。通过在7dpi时离心获得来自第二培养物的细胞培养物上清液。
每个级分的不同收获时间基于实施例1中提供的数据，其表明细胞中重组蛋白的量在4dpi时最高，而细胞培养基中的重组蛋白的量在7dpi时最高。为了验证是否可以通过简单的方法浓缩细胞培养物上清液，使用具有100kDa分子量截留膜的系统应用超滤(UF)步骤来浓缩材料。为了定量样品中FMDV重组蛋白的量，如实施例1所述，使用INT-FMA-01-08单克隆抗体进行ELISA。在ELISA中包括具有已知浓度(以ELISA单位/ml或EU/ml计)的参照，以估计样品的浓度。
图4显示了单个ELISA图，而获得的值显示在表1中。从该数据可以得出结论，与细胞相比，从杆状病毒表达系统的细胞培养物上清液可以收获明显更多的FMDV VLP(约6x)，并且上清液可以通过一步法进行浓缩，一步法易于应用于大规模生产。
表1.不同样品中O/TUR/5/2009蛋白的ELISA定量
在本实施例中，表明从细胞培养物上清液中可以比从细胞中收集更多的O株VLP。
实施例3
用含有表达盒O/TUR/5/2009-VP2-S93F的重组杆状病毒以MOI＝1感染两个含有3.2×105个细胞/ml的Tni细胞的100ml细胞培养物。于27℃孵育后，在4dpi时通过离心收集来自一个培养物的细胞，随后将细胞沉淀在50mM Tris pH 8.0-100mM KCl缓冲液中以感染培养物体积的10％进行超声处理。通过在7dpi时离心获得来自第二培养物的细胞培养物上清液。对含有裂解的细胞和上清液的样品进行区带梯度离心。梯度由20％至40％蔗糖组成，样品加载到梯度顶部，然后于20℃以50,000xg离心50min。使用抗VP2单克隆抗体F1412SA通过蛋白质印迹分析梯度的级分(Yang et al.,2007,Vet Immunol Immunopathol)。
蛋白质印迹分析显示，在35％的蔗糖浓度附近的梯度中检测到VP0和/或VP2蛋白，其中预计有75S颗粒，表明在细胞和上清液两者中都存在完整的VLP(图5)。蛋白质印迹分析还表明，上清液中的VLP使得其VP0部分地被加工成VP4和VP2，如通过与VP0前体条带相比，VP2条带相对较强的存在所表明的。该结果证实了在实施例1中的我们的更早的观察结果。
在该实施例中，可以显示细胞培养物上清液含有FMDV O株的完整VLP。
实施例4
用含有表达盒A/IRN/7/2013-VP2-H93F的重组杆状病毒以MOI＝1感染两个具有3.2×105个细胞/ml的Tni细胞的100ml细胞培养物，且随后于27℃孵育。在4dpi时收获两个培养物中的一个，在7dpi时收获第二个。通过离心分离细胞和细胞培养物上清液级分。将获得的细胞沉淀在50mM Tris pH8.0-100mM KCl缓冲液中以感染培养物体积的10％进行超声处理。细胞培养物上清液不处理。
使用多克隆牛血清FMD 13.70.445通过蛋白质印迹分析细胞和上清液样品(图6)。蛋白质印迹的可视检测表明，上清液样品的VP2条带强度强于细胞裂解物样品。由于细胞裂解物被浓缩10倍，可以得出结论，在感染后4和7天，细胞外环境中存在至少10倍的VP2蛋白。蛋白质印迹还显示细胞培养物上清液含有少得多的P1多蛋白加工中间体，并且大部分VP0蛋白裂解成VP2(和VP4)。这再次表明成熟的衣壳主要存在于细胞培养物上清液中，如实施例1和3中已经讨论的。
在该实施例中，可以显示在4和7dpi时，FMDV A株的VLP在细胞培养物上清液中比在细胞中的更多。
实施例5
用含有表达构建体SAT2/SAU/6/2000-VP1-T12N-VP4-D53G的重组杆状病毒以MOI＝1感染2升生物反应器中浓度为2.2×106个细胞/ml的Tnao38昆虫细胞。于28℃孵育后，在5dpi时，通过离心收集细胞，并将细胞沉淀物在50mM pH8.0-100mM缓冲液中以感染培养物体积的5％进行超声处理。通过使用30千道尔顿(kDa)分子量截留膜进行超滤，将来自离心步骤的培养物上清液进一步浓缩18.6倍。
使用VHH M377F通过ELISA测定完整病毒样颗粒的浓度(Harmsen et al.,2017,Front.Immunol.8:960,doi:10.3389/fimmu.2017.00960)。为此，连续稀释的样品在用M377F于4℃包被过夜的微量滴定板上于室温(RT)孵育1h。除去样品并用PBS-tween洗涤三次后，将固定量的生物素化的M377F加入到板中并于RT孵育1h。除去生物素化的抗体，用PBS-Tween洗涤板三次，然后向板中加入过氧化物酶缀合的链霉抗生物素蛋白，随后进行发色检测。根据ELISA，20x细胞裂解物含有117EU/ml的完整VLP，而浓缩的培养物上清液含有92EU/ml。因此，在5dpi时，所有SAT2/SAU/6/2000VLP的46％存在于细胞培养物上清液中。
结果表明，FMDV SAT2 VLP在细胞培养物上清液中积累。
实施例6
用3ml含有表达构建体Asia1/shamir-VP2-S93C的重组杆状病毒的P1原液接种含有40ml的1×106个Tnao38昆虫细胞/ml的锥形瓶。于27.5℃孵育4或6dpi后，通过以3000rpm将细胞旋转5min来收集细胞。将得到的细胞沉淀重悬于50mM HEPES pH8.0-100mM KCl中，体积为原始培养物体积的1/10，并通过超声处理来裂解细胞。离心后也收集细胞培养物上清液。
将获得的材料于56℃热处理20分钟，根据实施例5中描述的方法，使用M332F抗体(Harmsen et al.,2017,Front.Immunol.8:960)通过同源ELISA测定热处理之前和之后完整VLP的量，但于37℃而不是RT进行孵育。
于56℃孵育而存活的衣壳的百分比如图7中所示。结果证明，上清液来源的VLP比细胞来源的VLP更耐热，并且更长的培养时间(即6天而不是4天)似乎可以提高热稳定性。这一观察结果不被认为是昆虫细胞培养基对这些VLP的稳定作用的结果，因为在旨在测量细胞培养基对VLP热稳定性的影响的其他实验中，无法检测到稳定作用。一个合理的解释是，细胞培养物上清液中的VLP更加成熟，因为它们已被主动转运到细胞外环境，就像自然感染细胞中的FMDV衣壳一样。与VLP成熟理论(如实施例1中提到的)一致的是，发现VLP随着时间的推移变得更加耐热：在6dpi时收获的VLP的热稳定性高于在4dpi时收获的VLP。
在本实施例中，可以证明来源于细胞培养物上清液的Asia1/Shamir/89株的FMDVVLP的热稳定性比来源于细胞的VLP更高。
实施例7
进行动物试验以证明来源于细胞培养物上清液的VLP与源于细胞的VLP至少具有相同的免疫原性。将10只4-6月龄的小牛分成2组，每组5只小牛。在第0天，小牛用O/TUR/5/2009株的8μg的FMDV VLP和专有SVEA-E佐剂配制的2ml疫苗进行肌内(IM)疫苗接种。一组接受来源于昆虫细胞的VLP，而另一组接受来源于细胞培养物上清液的VLP。在疫苗接种后0、7、14和21天(dpv)采集血样。血清来源于凝血，随后使用O/TUR/5/2009通过病毒中和测定法(VNT)进行测试。
O/TUR/5/2009VP2-S93CVLP于30℃在2升生物反应器中产生，所述生物反应器含有2×106个Tnao38昆虫细胞/ml，以MOI＝1感染。在5dpi以200xg离心收获细胞培养物上清液和细胞。通过超声处理释放VLP。根据实施例5中描述的方法，使用VHHC1(Wang et al.,2015,BMC Veterinary Research 11:120,DOI 10.1186/s12917-015-0437-2)通过ELISA测定完整VLP的浓度，但于37℃而不是RT进行孵育。
在两组的所有动物中，可在7dpv检测到高水平的FMDV病毒中和抗体，导致细胞组的组平均值为2.26log10，细胞培养物上清液组为2.39log10(图8)。在疫苗接种后第21天，滴度分别略微攀升至2.30log10和2.53log10。结果表明，细胞和细胞培养物上清液这两种来源均产生免疫原性VLP。
结果表明，来源于细胞或细胞培养物上清液的VLP均具有免疫原性。
实施例8
在此实施例中，评估了在稍后时间点收获SAT2/SAU/6/2000VLP是否可以改善产率和衣壳稳定性二者。
为了研究杆状病毒感染后的收获时间对VLP产率和热稳定性的影响，用包含SAT2/SAU/6/2000-VP1-T12N+VP4-D53G表达盒的重组杆状病毒以MOI＝0.1接种含有Tnao38昆虫细胞的2升生物反应器。将受杆状病毒感染的昆虫细胞培养物于30℃孵育，并在感染后4、5和6天收获一部分培养物。对收获物进行超声处理以裂解昆虫细胞并释放细胞内VLP。随后通过以3000xg离心10min澄清所得材料(即细胞培养物液体中的裂解的细胞)。
如实施例5中所述，使用VHH M377F通过ELISA测定材料中完整VLP的量。
观察到，在杆状病毒感染后5或6天(dpi)收获导致了比在4dpi收获显著更高的VLP产率(见图9)。
将澄清的材料于46℃热处理20分钟，并在热处理之前和之后通过ELISA测定完整VLP的量。根据该ELISA数据，可以计算出于46℃孵育而存活的衣壳的百分比(图10)。在5或6dpi收获的SAT2 VLP的热稳定性似乎高于在4dpi收获的。
总体而言，本实施例中提供的数据表明，如果从5dpi或更晚收获VLP，则SAT2/SAU/6/2000VP1-T12N+VP4-D53G VLP的产率和热稳定性都是最佳的。
实施例9
在此实施例中，评估了在感染后的哪个时间点A/SAU/1/2015VLP的产率和热稳定性是最佳的。
为了研究收获时间是否也会影响属于另一种FMDV血清型的株的VLP产率和热稳定性，按照上述方法生成了新的一组重组杆状病毒，其具有基于株A/SAU/1/2015的P1-2A-3Cpro表达盒。A/SAU/1/2015VLP用VP2-H93C突变进行稳定。
VLP在含有Tnao38昆虫细胞的2升生物反应器中产生，并以MOI＝0.1接种包含A/SAU/1/2015-VP2-H93C表达盒的重组杆状病毒。将受杆状病毒感染的昆虫细胞培养物于28℃孵育，并在感染后3、4、5、6和7天收获一部分培养物。将收获物以3000xg离心10min以获得澄清的细胞培养物液体。
按照实施例5中描述的方法，使用VHH M702F(Li et al.,2021,Vaccines:9,620,doi.org/10.3390/vaccines9060620)通过ELISA测定材料中完整VLP的量，不同之处在于在37℃进行孵育。
观察到细胞培养物液体中的VLP浓度随着时间的推移而增加，并且在7dpi时最高(参见图11)。
将澄清的材料于56℃热处理20分钟，并在热处理之前和之后通过ELISA测定完整VLP的量。根据该ELISA数据，可以计算出于46℃孵育而存活的衣壳的百分比(图12)。A VLP的热稳定性从3dpi至5dpi得到改善，但此后没有改善，表明在5dpi时已达到最佳热稳定性。
总之，使用A/SAU/1/2015VLP获得的数据表明，为了获得最佳热稳定性，VLP的收获不应早于5dpi。
结论
本发明可以显示，当在5dpi或更晚收获时，来自Asia1和SAT2株的FMDV重组蛋白可以在杆状病毒/昆虫细胞表达系统中高效产生。据信，从细胞释放到培养物上清液中会导致更成熟的VLP。与仅来源于细胞的VLP相比，这些VLP具有更高的热稳定性。根据本发明的来源于细胞培养物的VLP是免疫原性的并且可以用于对受试者进行疫苗接种以提供针对FMDV感染的保护。

Claims (8)

1.一种在杆状病毒表达系统中产生Asia1或SAT2株的口蹄疫病毒(FMDV)病毒样颗粒(VLP)的方法，所述方法包括：
(i)用杆状病毒表达载体感染昆虫细胞，其中所述昆虫细胞能够重组产生FMDV VLP，
(ii)在所述昆虫细胞产生FMDV VLP的条件下在细胞培养基中培养所述昆虫细胞，其中培养在感染后进行5天或更长，
(iii)从所述细胞培养基收获所述昆虫细胞产生的FMDV VLP。
2.根据权利要求1所述的方法，其中培养在感染后进行5天。
3.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中所述杆状病毒表达载体包含编码FMDV衣壳前体蛋白的核酸序列。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述杆状病毒表达载体还包含编码能将FMDV衣壳前体蛋白裂解成一种或多种衣壳蛋白的蛋白酶的核酸序列。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述衣壳前体蛋白包含FMDV衣壳前体P1和2A肽并且所述蛋白酶是3C。
6.根据前述任一项权利要求所述的方法，所述方法进一步包括：
(iv)通过添加药学上可接受的载体将FMDV VLP掺入疫苗中。
7.一种用于针对FMDV感染保护受试者的疫苗，所述疫苗通过权利要求6所述的方法可获得。
8.一种针对FMDV感染保护受试者的方法，其包括通过根据权利要求1-5中任一项所述的方法产生FMDV VLP，通过添加药学上可接受的载体将VLP掺入疫苗中，和将所述疫苗施用于所述受试者的步骤。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CA2962225A1 (en) * 2014-09-23 2016-03-31 Merial, Inc. Fmdv recombinant vaccines and uses thereof

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