KR20240049581A - 구제역 바이러스 바이러스-유사 입자의 생성 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 바큘로바이러스 발현 시스템에서 구제역 바이러스 (FMDV) 바이러스-유사 입자 (VLP)를 생성하는 방법으로서, (i) 곤충 세포를 바큘로바이러스 발현 벡터로 감염시키는 단계, (ii) 감염후 5일 이상 동안 세포 배양 배지에서 곤충 세포를 배양하는 단계, 및 (iii) 세포 배양 배지로부터 FMDV VLP를 수확하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 FMDV에 의한 감염에 대해 대상체를 보호하는데 사용하기 위한 백신으로서, 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 백신에 관한 것이다.
Description
본 발명은 수의학 및 바이러스학 분야에 관한 것이다. 본 발명은 특히 바큘로바이러스 발현 시스템에서 Asia1 및 SAT2 균주의 구제역 바이러스 (FMDV) 바이러스-유사 입자 (VLP)를 생성하는 방법으로서, (i) 곤충 세포를 바큘로바이러스 발현 벡터로 감염시키는 단계, (ii) 감염후 5일 이상 동안 세포 배양 배지에서 곤충 세포를 배양하는 단계, 및 (iii) 배양 배지로부터 FMDV VLP를 수확하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 FMDV에 의한 감염에 대해 대상체를 보호하는데 사용하기 위한 백신으로서, 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 백신에 관한 것이다.
구제역 (FMD)은 발굽이 갈라진 동물, 가축 및 야생 동물의 고도로 전염성인 급성 바이러스 질환이다. 이는 유엔 식량 농업 기구 (Food and Agriculture Organisation of the United Nations, FAO)에 의해 국경을 넘는 동물 질환으로 분류된다. 이는 또한 신고 대상 질환이다. 구제역은 아프리카, 남아메리카, 중동 및 아시아의 넓은 지역에서 풍토병이고, 전세계적으로 소, 돼지, 양, 염소 및 다른 우제류, 예컨대 버팔로 및 사슴에 영향을 미치는 가축의 가장 경제적으로 중요한 감염성 질환이다. FMD는 한때 전세계적으로 확산되었지만, 북아메리카 및 서유럽을 비롯한 일부 지역에서는 근절되었다. 풍토병인 국가에서는, FMD가 국제 가축 거래에서 경제적 제약을 가하고, 엄격한 예방 조치가 취해지지 않는다면 질환이 없는 지역으로 쉽게 재유입될 수 있다. FMD는 지역 농민들의 소득을 손실시키면서 전세계 가축 산업에 영향을 미치고 있다.
현재의 백신은 불활성화된 바이러스로 제조된다. 바이러스가 불활성화되기 전에, 살아있는 FMD 바이러스가 높은 격리 시설에서 생성되며, 이는 FMD 백신 생성을 제한한다. 이러한 시설의 건설 비용 및 유지 비용은 통상적인 시설에 비해 높으며, 또한 격리가 운영 비용을 유발한다는 제약으로 인해 더 높다.
FMD에 대한 효과적인 백신접종은 면역원성이 불충분한 것으로 입증된 캡시드 빌딩 블록보다는 온전한 FMDV 캡시드 (146S 입자로도 공지됨)를 필요로 한다 (Doel and Chong, 1982, Archives of Virology). 불활성화된 FMD 바이러스는 산성 pH에서 또는 승온에서 캡시드 빌딩 블록으로 쉽께 허물어지는 취약한 구조이다. 따라서, FMD 백신을 가축 사육자에게 효과적으로 전달하기 위해서는 저온 유통 체계가 필요하다. 결과적으로, 전세계에서, 특히 아프리카에서 백신 공급이 매우 부족하다. 따라서, 현재의 전통적인 불활성화된 바이러스 백신의 여러 단점을 극복할 수 있는 상업적인 FMD 백신에 대한 새로운 백신 기술이 필요하다.
현재의 불활성화된 바이러스 백신의 여러 단점을 극복할 수 있는 상업적인 FMD 백신의 새로운 백신 기술이 필요하다.
바이러스-유사 입자 (VLP) 기술은 현재 통상적인 불활성화된 백신에 대한 실행가능한 대안이 될 수 있는 잠재성을 가진 몇 안되는 기술 중 하나로 고려된다. 현재의 기술과 비교하여 VLP 기술의 이점은 예를 들어 더 높은 생성물 안정성, 생성 위치의 더 큰 융통성 (낮은 격리 생성), 및 새로운 균주의 발발에 대한 더 빠른 반응이다. VLP-기반 백신은 비-구조적 단백질을 제거하기 위한 생성 단계 구현의 필요성을 완화시키는 마커 백신으로서 설계된다.
FMDV 게놈은 12종의 성숙 바이러스 단백질로 가공되는 전구체 폴리단백질을 생성하는 단일 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 코딩한다 (도 1, [Balinda et al. Virology Journal 2010, 7:199]로부터). P1 폴리단백질 중간체는 4종의 캡시드 구조적 단백질, VP1-VP4로 구성되고, 2A 단백질의 바로 상류에 위치하며, 번역 동안에 P1 및 P2 폴리단백질의 비-단백질분해성 분리를 유발하여, P2로부터 P1-2A를 방출시킨다. 후속적으로, P1-2A 폴리단백질은 FMDV 3C 프로테아제에 의해 2A, VP0 (1AB로도 공지됨), VP3 (1C), 및 VP1 (1D)로 가공된다. VP0 단백질이 캡슐화 동안에 VP4 및 VP2로 분리되는 것으로 믿어진다. FMDV 비리온은 가공된 바이러스 구조적 단백질로부터 자가-조립에 의해 형성된다.
VLP-기반 백신에서 사용하기 위한 VLP는 FMDV 비리온의 자가-조립과 유사하게 적합한 숙주 세포에서 FMDV 전구체 단백질을 재조합적으로 발현함으로써 생성될 수 있다. 바큘로바이러스 발현 벡터 플랫폼은 현재 VLP의 생성을 위한 바람직한 플랫폼 중 하나로서 사용된다. 예를 들어, 재조합적 발현은 곤충 세포에 대해 덜 독성인 변형된 3C 프로테아제를 사용하여 바큘로바이러스 발현 시스템에서 수행될 수 있다 (Porta et al (2013) J Virol Methods). VLP는 바이러스-코딩된 3C 프로테아제의 작용에 의해 구조적 단백질 전구체 P1-2A로부터 방출되는 가공된 바이러스 구조적 단백질, VP0, VP3 및 VP1로부터 자가-조립된다. P1-2A-3C 카세트에서 3C 효소의 중간 및 비-독성 활성은 빈 캡시드로 조립되는 구조적 단백질로 P1-2A 전구체의 발현 및 가공을 가능하게 한다. VLP의 열안정성 및 낮은 pH에 대한 내성은 캡시드 단백질 사이의 공유 연결, 예컨대 시스테인 브릿지의 도입에 의해 (WO2002/000251), 또는 다른 합리적으로 설계된 돌연변이의 도입에 의해 (Porta et al. (2013) PLoS Pathog) 개선될 수 있다.
그러나, 바큘로바이러스 발현 플랫폼에 의해 제공되는 FMDV VLP의 비교적 낮은 발현 수준은 VLP-기반 FMD 백신의 개발을 제한한다. 또한, 본 발명자들은 곤충 세포 배양물로부터 수확된 FMDV VLP가 특히 특정 혈청형에 대해 단지 중간 정도의 열안정성을 나타낸다는 것을 발견하였다.
바큘로바이러스 발현 시스템에서 생성된 단백질이 세포외 환경에 대해 표적화시키는 신호 서열을 함유하지 않는다면 상기 단백질은 일반적으로 곤충 세포 내부에서 종결된다. 곤충 세포 내부에 갇혀 있는 재조합 단백질은 관련 기술분야에 공지된 세포 파괴 기술에 의해 방출될 수 있다. 수득된 세포 용해물은 모든 세포 성분 및 잔해를 함유하며, 재조합 단백질을 순수한 형태로 수득하기 위해서는 종종 힘들게 정제해야 한다. 추가로, 세포 파괴 기술은 또한 수많은 원치않는 세포 단백질, 예컨대 프로테아제를 방출하며, 이는 원하는 단백질을 분해시켜, 이로써 단백질 수율 및 품질을 감소시킬 수 있다. 따라서, 관심 단백질이 용이하게 수확될 수 있는 상청액에 대해 표적되어야 한다면, 표적화 서열은 종종 단백질 서열로 의도적으로 조작된다. 또한, 본 발명자들은 용해된 곤충 세포로부터 정제된 FMDV VLP만이 특히 특정 혈청형에 대해 단지 중간 정도의 열안정성을 갖는다는 것을 발견하였다.
따라서, 생성된 VLP의 높은 수율 및 양호한 열안정성을 초래하는, 곤충 세포에서 FMDV VLP를 생성하는 개선된 방법이 관련 기술분야에서 요구된다.
본 발명에서, 놀랍게도 Asia1 또는 SAT2 균주의 FMDV VLP가 적어도 5일 동안 배양되는 경우, 즉, 가장 빠르게는 감염후 5일 (dpi)에 VLP를 수확함으로써 증가된 안정성을 갖는다는 것이 발견되었다. 신호 서열에 의해 조작되지 않더라도, VLP의 상당한 부분이 세포 배양 배지로 수송된다는 것이 발견되었으며, 바큘로바이러스 감염의 결과로서 세포가 터지기 전에 VLP가 세포 배양 배지에서 풍부해지는 것으로 관찰되었기 때문에, 이는 능동적인 과정인 것으로 보인다. VLP가 세포외 매트릭스로 이동하는 동안에 성숙하는 것으로 믿어진다. VLP의 상당한 부분이 궁극적으로 세포외 매트릭스로 수송되기 때문에, 이를 통해 적어도 감염 5일 후에 세포 배양 배지로부터 유래된 VLP (즉, 원하는 경우, 세포로부터의, 예를 들어 세포를 용해시킨 후 주변 배지로 방출된 VLP 포함)가 더 이른 시점에 (4 dpi 또는 더 일찍) 수확된 것에 비해 전반적으로 더 안정하다는 본 발명의 놀라운 관찰이 설명된다.
따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 바큘로바이러스 발현 시스템에서 Asia1 또는 SAT2 균주의 구제역 바이러스 (FMDV) 바이러스-유사 입자 (VLP)를 생성하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법을 제공한다:
(i) 곤충 세포를 바큘로바이러스 발현 벡터로 감염시키며, 여기서 곤충 세포는 FMDV VLP를 재조합적으로 생성할 수 있는 것인 단계,
(ii) 곤충 세포가 FMDV VLP를 생성하는 조건 하에 세포 배양 배지에서 곤충 세포를 배양하며, 여기서 배양은 감염후 5일 이상 동안 수행되는 것인 단계,
(iii) 세포 배양 배지 (예를 들어 상청액, 및 임의적으로 이들 세포를 용해시킨 후 세포의 내용물을 포함함)로부터 곤충 세포에 의해 생성된 FMDV VLP를 수확하는 단계.
제2 측면에서, 본 발명은 FMDV에 의한 감염에 대해 대상체를 보호하는데 사용하기 위한 백신으로서, 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 백신을 제공한다.
제3 측면에서, 본 발명은 FMDV에 의한 감염에 대해 대상체를 보호하는 방법으로서, 본 발명의 방법에 의해 FMDV VLP를 생성하는 단계, 제약상 허용가능한 담체의 첨가에 의해 VLP를 백신에 혼입시키는 단계, 및 백신을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
용어의 정의
바이러스 "캡시드"는 전형적으로 그의 유전 물질을 둘러싸는 바이러스의 단백질 쉘로서 관련 기술분야에서 일반적으로 이해된다.
"캡시드 전구체 단백질"은 바이러스 캡시드 또는 그의 빌딩 블록의 형성에 참여하는 구조적 단백질이다. FMDV 캡시드 전구체 단백질은 전형적으로 구조적 단백질 P1을 포함한다. 단백질 P1이 FMDV 3C 프로테아제 (3Cpro)에 의해 성숙 VP0, VP3, 및 VP1 단백질로 가공되기 때문에, P1 단백질은 폴리단백질 또는 프로단백질로도 지칭될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, FMDV 캡시드 전구체 단백질은 전형적으로 단백질 VP1, VP2, VP3 및 VP4를 비롯하여 적어도 P1을 포함한다. 대안적으로, FMDV 캡시드 전구체 단백질은 단백질 VP1, VP2, VP3 및 VP4 중 하나 이상을 포함할 수 있다. FMDV 캡시드 전구체 단백질은 또한 단백질 VP2 및 VP4를 포함하는 단백질 VP0을 포함할 수 있다. 가장 바람직하게는, FMDV 캡시드 전구체 단백질은 적어도 P1 및 2A 단백질 (본원에서 P1-2A 캡시드 전구체로도 지칭됨)을 포함한다.
관련 기술분야에서 "빈 캡시드"로도 지칭될 수 있는 "바이러스-유사 입자" (VLP)는 바이러스의 단백질 쉘을 포함하지만 RNA 또는 DNA 게놈이 결여되어 있는 개체이다. VLP는 야생형 바이러스와 동일한 방식으로 항원성 및 면역원성이어야 하며, 이는 동일한 구조적 에피토프를 유지하지만, 바이러스 게놈의 결여로 인해 감염을 일으키지 않아야 하기 때문이다.
FMDV VLP는 전형적으로 P1-2A 캡시드 전구체로부터 형성된다. 상기 기재된 바와 같이, 2A 프로테아제는 그의 C 말단에서 스스로 절단되어 P2로부터 P1-2A를 방출한다. P1-2A 캡시드 전구체의 가공은 3C 프로테아제의 영향을 받아서, 2A 및 캡시드 단백질 VP0, VP3 및 VP1을 생성한다. VLP는 이들 캡시드 단백질로부터 자가-조립에 의해 형성된다.
VLP는 또한 곤충 세포에 대해 덜 독성인 변형된 3C 프로테아제를 이용하여 본 발명의 바큘로바이러스 발현 시스템에서 생성될 수 있다 (Porta et al. (2013) J Virol Methods). P1-2A-3C 발현 카세트에서 3C 효소의 중간 및 비-독성 활성은 VLP로 조립되는 구조적 단백질인 VP0, VP1 및 VP3으로 P1-2A 전구체의 재조합적 발현 및 가공을 가능하게 한다. VLP의 생성은 관련 기술분야에 공지된 기술, 예컨대 수크로스 밀도 원심분리 또는 전자 현미경법을 이용하여 조사되거나 또는 검증될 수 있다. 야생형 바이러스 상의 형태적 에피토프에 특이적인 모노클로날 항체를 이용하여, 빈 캡시드의 구조 및 항원성이 유지되는지 여부를 조사할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "백신"은 대상체에게 투여될 때 보호성 면역 반응을 유도하거나 또는 자극하는 제제를 지칭한다. 백신은 특정한 질환에 대한 유기체 면역을 생성할 수 있다.
"FMDV에 의한 감염에 대해 동물을 보호한다"는 것은 FMDV에 의한 병원성 감염을 예방하거나, 개선시키거나 또는 치유하는데 도움이 되거나, 또는 해당 감염으로부터 발생하는 장애를 예방하거나, 개선시키거나 또는 치유하는데 도움이 되는, 예를 들어 치료후 (즉, 백신접종후) FMDV 감염으로 인한 하나 이상의 임상 징후를 예방하거나 또는 감소시키는데 도움이 되는 것을 의미한다.
용어 "예방" 또는 "예방하는"은 예방적 치료에 의해 FMDV 감염을 방지하거나, 지연시키거나, 방해하거나 또는 저해하는 것을 지칭하기 위해 의도된다. 백신은 예를 들어 감염성 FMDV가 숙주 세포에 들어갈 가능성을 예방하거나 또는 감소시킬 수 있다.
용어 "핵산 서열"에는 RNA 또는 DNA 서열이 포함된다. 이는 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 이는 예를 들어 게놈, 재조합, mRNA 또는 cDNA일 수 있다.
"발현 벡터" (동의어 "발현 구축물")는 세포에서 재조합 유전자 발현을 위해 설계된 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스이다. 벡터는 특이적 유전자를 표적 세포에 도입시키기 위해 사용되고, 유전자에 의해 코딩되는 관심 단백질 (POI)을 생성하도록 단백질 합성을 위한 세포 메카니즘을 지휘할 수 있다. 재조합 유전자를 발현하여 POI를 생성하기 위해, 발현 벡터는 전형적으로 관심 유전자 (GOI)의 발현을 유도하기 위해 적어도 프로모터를 포함하고, POI의 수율을 증가시키기 위해 하나 이상의 번역 인핸서를 추가로 포함할 수 있다.
"바큘로바이러스 발현 벡터"는 숙주 세포, 예컨대 곤충 세포에서 재조합 유전자 발현을 위해 사용되는 바큘로바이러스를 기반으로 하는 발현 벡터이다. 바큘로바이러스 발현 시스템은 관련 기술분야에 확립되어 있고, Bac-to-Bac 발현 시스템 (써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific), 독일)과 같이 상업적으로 입수가능하다. 이들 바큘로바이러스 발현 시스템에서, 야생형 바큘로바이러스 게놈 내의 천연 발생 폴리헤드린 유전자는 전형적으로 재조합 유전자 또는 cDNA로 대체된다. 이들 유전자는 일반적으로 폴리헤드린 또는 p10 바큘로바이러스 프로모터의 제어 하에 있다.
유전자 발현에 사용되는 가장 일반적인 바큘로바이러스는 오토그라파 칼리포르니카 뉴클레오폴리헤드로바이러스(Autographa californica nucleopolyhedrovirus) (AcNPV)이다. AcNPV는 크고 (130kb) 원형인 이중-가닥 DNA 게놈이다. GOI는 폴리헤드린 유전자와 같이 비필수 유전자좌로부터 유래된 바큘로바이러스 DNA에 의해 플랭킹된 바큘로바이러스 프로모터를 함유하는 전달 벡터에 클로닝된다. GOI를 함유하는 재조합 바큘로바이러스는 곤충 세포에서 전달 벡터와 모 바이러스 (예컨대 AcNPV) 게놈 사이의 상동성 재조합에 의해 생성된다.
"번역 인핸서"는 번역을 촉진하여, 이로써 단백질 생성을 증가시킬 수 있는 요소를 형성하는 뉴클레오티드 서열이다. 전형적으로, 번역 인핸서는 mRNA의 5' 및 3' 비번역 영역 (UTR)에서 발견될 수 있다. 특히, GOI의 개시 ATG 코돈의 바로 상류에 있는 5'-UTR의 뉴클레오티드는 번역 개시 수준에 현저한 영향을 미칠 수 있다.
바큘로바이러스 발현 시스템
본 발명의 방법에서, FMDV VLP는 바큘로바이러스 발현 벡터를 이용하여 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템 (BEVS)에서 생성된다.
바큘로바이러스 발현 벡터는 프로모터의 제어 하에 FMDV 캡시드 전구체 단백질을 재조합적으로 발현할 수 있는 임의의 바큘로바이러스 발현 벡터일 수 있다. 프로모터는 특별히 제한되지 않지만, 바큘로바이러스 발현 시스템에서 FMDV 캡시드 전구체 단백질을 재조합적으로 발현할 수 있는 임의의 프로모터일 수 있다. 본 발명의 바큘로바이러스 발현 시스템에서 사용하기 위한 바람직한 프로모터는 AcNPV의 폴리헤드린 (polh) 프로모터 ([Ayres M.D. et al. (1994) Virology, Vol. 2020, p. 586-605]에 기재됨) 및 p10 프로모터 ([Knebel D. et al. (1985) EMBO J. Vol. 4(5), 1301-1306]에 기재됨)이다. 또 다른 바람직한 프로모터는 에스. 엑시구아(S. exigua) 뉴클레오폴리헤드로바이러스 (SeNPV)의 orf46 바이러스 유전자의 프로모터이다 ([M. Martinez-Solis et al. (2016) PeerJ, DOI 10.7717/peerj.2183]에 기재됨).
발현 벡터는 FMDV 캡시드 전구체 단백질의 재조합적 발현을 증강시키는 하나 이상의 번역 인핸서를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 바큘로바이러스 발현 벡터는 EP 20 203 373 (그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 2종의 번역 인핸서 Syn21 및 p10UTR을 포함할 수 있다.
단백질의 재조합적 발현을 위해 바큘로바이러스 발현 시스템에서 사용하기 위한 바큘로바이러스 발현 벡터는 상업적으로 입수가능하고, 단백질 및 바이러스-유사 입자의 생성을 위해 관련 기술분야에서 광범위하게 사용된다. 시스템은 예를 들어 바큘로바이러스 발현 벡터가 전파되는 이. 콜라이(E. coli) 세포 또는 곤충 세포와 같은 세포를 형질전환시키기 위해 사용되는 하나 이상의 전달 플라스미드를 포함할 수 있다. 상업적으로 입수가능한 바큘로바이러스 발현 벡터에는 Top-Bac® 벡터 (알제넥스(ALGENEX), 스페인), pFastBac® 벡터 (써모 피셔 사이언티픽, 독일), flashBAC® 벡터 (옥스포드 익스프레션 테크놀로지즈 리미티드(Oxford Expression Technologies Ltd), 영국) 및 BestBac® 벡터 (익스프레션 시스템즈(EXPRESSION SYSTEMS), 캘리포니아주)가 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
따라서, 본 발명의 방법에서 사용되는 바큘로바이러스 발현 벡터는 기능성 프로모터의 제어 하에 곤충 세포에서 발현되는 FMDV 캡시드 전구체 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 바람직하게는 하나 이상의 번역 인핸서 및/또는 다른 시스-작용 요소를 포함하는 발현 카세트를 함유할 수 있다.
FMDV 캡시드 전구체 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 특정 균주로 특별히 제한되지 않으며, 혈청형 Asia1 또는 SAT2에 속하는 임의의 FMDV 균주일 수 있다.
본 발명의 방법에서, FMDV 캡시드 전구체 단백질은 VLP를 가공하고 조립하는데 필요한 모든 요소를 포함할 수 있다. 따라서, FMDV 캡시드 전구체 단백질은 전형적으로 적어도 캡시드 전구체 P1을 포함하고, 바람직하게는 2A 펩티드를 추가로 포함한다. 2A 펩티드는 그의 C 말단의 하류에 있는 임의의 단백질 서열로부터 P1-2A를 방출시킬 수 있다.
추가로 바람직한 실시양태에서, 바큘로바이러스 발현 벡터는 FMDV 캡시드 전구체 단백질을 절단할 수 있는 프로테아제를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 프로테아제는 FMDV VLP의 생성 및 조립의 단계로서 FMDV 캡시드 전구체 단백질을 절단할 수 있는 임의의 프로테아제일 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, FMDV의 경우, 전구체 P1에서 VP0 (VP2 플러스 VP4), VP3 및 VP1로의 단백질분해성 가공은 바이러스 3C 프로테아제 또는 그의 전구체 3CD에 의해 발생한다. 따라서, 프로테아제는 바람직하게는 FMDV의 3C 프로테아제이다. FMDV 균주 (유형 A, 그러나 상이한 FMDV 균주 사이에서 보존됨)로부터의 FMDV 야생형 3C 프로테아제의 서열은 관련 기술분야에 기재되어 있고, WO 2011/048353 (그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 개시되어 있다. 3C 프로테아제는 또한 그의 단백질분해 활성을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어 시스테인 142에서의 돌연변이를 포함하는 기능적 유도체일 수 있다.
캡시드 전구체 단백질은 P1일 수 있으며, 이는 3C 프로테아제에 의해 VP0, VP3 및 VP1로 절단된다. 가장 바람직하게는, 바큘로바이러스 발현 시스템은 P1-2A-3C 카세트를 발현하며, 즉, 이는 단백질 P1, 2A 및 3C에 대한 코딩 영역을 동시에 발현한다. P1-2A-3C 카세트에서 3C 효소의 발현은 VLP로 조립되는 구조적 단백질로 P1-2A 전구체의 발현 및 가공을 가능하게 한다. 캡시드 전구체 단백질 및 프로테아제는 개별 프로모터의 제어 하에 또는 동일한 프로모터의 제어 하에 발현될 수 있다. 추가로 대안적으로, FMDV VLP의 조립에 필요한 캡시드 전구체 단백질은 다중 발현 단위로 분할되어, 예를 들어 VP1, VP2, VP3 및 VP4를 재조합적으로 생성하거나 또는 VP0, VP1 및 VP3을 재조합적으로 생성함으로써 별도로 발현될 수 있다. 이 대안적인 실시양태에서, 3C 프로테아제에 의한 캡시드 전구체 단백질의 단백질분해성 절단은 필요하지 않을 수 있다.
캡시드 전구체 단백질 또는 VLP의 절단은 관련 기술분야에 공지된 기술을 이용하여 분석될 수 있다. 예를 들어, 바큘로바이러스-감염된 숙주 세포로부터의 추출물은 겔-전기영동에 의해 분석될 수 있고, 분리된 단백질은 웨스턴 블롯팅을 위해 니트로셀룰로스 막 상에 전달될 수 있다. 단백질-특이적 항체에 의한 웨스턴 블롯팅은 프로테아제-매개된 절단 정도를 밝혀내어야 한다. 예를 들어, FMDV의 경우, 가공되지 않은 캡시드 전구체 단백질 (P1-2A)은 대략 81 kDa의 밴드로서 나타나고, 절단에 의해 VP3-VP1 (~47kDa), VP0 (~33kDa), VP2 (~22 kDa), VP3 (~24kDa) 및/또는 VP1 (~24 kDa)이 생성될 수 있다.
바이러스 유사 입자의 생성 방법
본 발명의 방법은 세포가 바큘로바이러스 발현 벡터로부터 캡시드 전구체 단백질을 발현하여 VLP를 생성하는데 적합한 조건 하에 본 발명에서는 곤충 세포인 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다. 따라서, 용어 "곤충 세포는 FMDV VLP를 재조합적으로 생성할 수 있다"는 곤충 세포가 VLP로 조립되는 재조합 캡시드 전구체 단백질의 생성을 위한 숙주 세포로서 사용될 수 있음을 의미한다.
본 발명의 방법의 제1 단계는 곤충 세포를 바큘로바이러스 발현 벡터로 감염시키는 것을 포함한다 (본 발명의 방법의 단계 (i)). 곤충 세포는 세포 배양물에서 FMDV VLP를 생성할 수 있는 임의의 곤충 세포일 수 있다. 특히, 곤충 세포는 Sf9 세포 (스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) Sf21 세포의 클로날 단리물), Sf21 세포, 하이-파이브(High-Five)® (BTI-TN-5B1-4) 세포 또는 Tni 세포 (트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)로부터 단리된 난소 세포)일 수 있다. 가장 바람직하게는, 숙주 세포는 Tni 세포, 또는 Tni-유래된 세포주, 예컨대 Tnao38 세포이다.
단백질의 재조합적 발현을 위해 곤충 세포를 바큘로바이러스 발현 벡터로 감염시키는 방법은 숙련된 기술자에게 널리 공지되어 있다.
본 발명의 방법에서, 곤충 세포의 배양은 세포 배양 배지에서, 예컨대 무혈청 배지에서 현탁액 세포 배양으로 수행된다 (본 발명의 방법의 단계 (ii)).
곤충 세포가 FMDV VLP를 생성하는 조건 하에 감염된 곤충 세포의 세포 배양은 관련 기술분야에 확립되어 있으며, 예를 들어 [Porta et al., 2013, J. Virol. Methods, vol. 187, p. 406; A.C. Mignaqui et al., 2019, Critical Reviews in Biotechnology, vol. 39(3), p. 306-320]에 기재되어 있다. 곤충 세포 배양에서 BEVS를 사용하는 재조합 단백질 발현을 위한 일반적인 절차는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 ["Guide to Baculovirus Expression Vector Systems (BEVS) and Insect Cell Culture Techniques", Invitrogen®, Instruction Manual; L. King, The Baculovirus Expression System, A laboratory guide; Springer, 1992; Baculovirus and Insect Cell Expression Protocols, Humana Press, D.W. Murhammer (ed.) 2007; Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Oxford University Press, D.R. O'Reilly, 1993]에 기재되어 있다.
전통적으로, 그레이스(Grace) 보충 (TNM-FH) 배지는 곤충 세포 배양을 위해 선택된 배지였다. 그러나, 그레이스 배지가 도입된 이래로 다른 혈청/혈림프-의존성 및 무혈청 제형이 발전하였다. 대부분의 배양된 곤충 세포의 성장 및 감염을 위한 최적의 범위는 전형적으로 6.0 내지 6.4의 pH 범위에서 25℃ 내지 30℃이다.
본 발명의 방법에서, 감염된 세포의 배양은 감염후 5일 (dpi) 이상 동안 수행된다. 놀랍게도 본 발명에서 바큘로바이러스 감염후 4 및 5일차에는 VP0 단백질이 세포 배양 배지에 존재하였고, 감염후 6 및 7일차에는 부재하는 것으로 관찰될 수 있었다. VP0의 소멸과 동시에, 가장 현저하게는 5 dpi에 VP2 단백질이 세포 배양물에서 나타났다. 따라서, 배양 배지의 VP0 단백질이 VP2 및 VP4 단백질로 절단되었음을 알 수 있다. VP0에서 VP2 및 VP4로의 절단은 바이러스 입자 성숙의 마지막 단계에서 발생하는 것으로 생각된다 (Curry et al., 1997, J. Virol. 71:9743-9752). 따라서, 본 발명자들의 결과는 성숙 VLP가 5 dpi부터 발생함을 나타낸다.
따라서, 곤충 세포에 의해 생성된 재조합 캡시드 전구체 단백질에 신호 서열이 결여될 수 있더라도, 재조합 캡시드 전구체 단백질로부터 형성된 VLP는 세포에 의해 세포 배양 배지로 방출된다. 따라서, (임의적으로 항원의 공급원으로서 세포 외에도) 백신 항원의 공급원으로서 상청액을 사용할 때, 성숙된 VLP의 양은 세포로부터의 VLP만을 사용하는 것과 비교할 때 증가되며, 따라서 안정성이 관찰된다.
따라서, 배양은 감염후 5일 이상 동안, 예컨대 5, 6 또는 7일 동안, 바람직하게는 5 또는 6일 동안, 가장 바람직하게는 5일 동안 수행된다. 5일 초과 동안 배양할 때 더 높은 수율이 수득되지만, 소요되는 추가 배양 시간은 비용의 관점에서 대규모 백신 생성에 불리하다. 따라서, 5일의 배양이 최적인 것으로 확인된다.
배양 후, 세포로부터의 수확을 피하고자 하는 경우에는, 세포 배양물로부터 곤충 세포를 분리하여 무세포 세포 배양 배지 (상청액으로도 지칭됨; 본 발명의 방법의 단계 (iii))를 수득할 수 있다. 해당 경우에 VLP 수확의 전체 안정성은 더 높지만, 수확 시 세포에 여전히 존재하는 VLP의 양에 따라 전체 수율은 더 낮다. 용어 "상청액"은 곤충 세포가 제거된 세포 배양물을 지칭한다.
한 실시양태에서, VLP가 상청액으로부터만 수득된다. 따라서, 세포 배양물로부터 세포를 제거하여 본원에서 상청액으로도 지칭되는 무세포 배양 배지를 수득하고, 여기에는 곤충 세포가 실질적으로 없다. 곤충 세포가 "실질적으로 없다"는 것은 본 발명에서 VLP를 생성하는데 무의미한 잔여 세포만이 존재할 수 있음을 의미하다. 가장 바람직하게는, 상청액은 임의의 잔여 세포를 함유하지 않는다.
소규모 또는 대규모 세포 배양물로부터 세포를 분리하는 통상적인 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 막 여과, 예컨대 한외여과, 원심분리 및 침강 중 하나 이상이 포함된다.
상청액 중 VLP는 투석, 막 여과, 또는 침전 후 원심분리에 의해 농축될 수 있다.
본 발명의 방법의 단계 (iii)에서, 곤충 세포에 의해 생성된 FMDV VLP는 세포 배양 배지로부터 수확되며, 전형적으로 관련 기술분야에 일반적으로 공지된 바와 같이 (용해 단계를 도입함으로써) 상청액 뿐만 아니라 세포로부터의 수확을 포함한다. 수확은 전형적으로 배양 배지로부터 VLP를 분리하고, 필요에 따라 추가로 VLP를 정제하는 것을 포함한다. 수확은 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 사용하여 VLP를 침전시킴으로써 수행될 수 있다. VLP를 정제하고 농축시키기 위해 크로마토그래피 기술, 예컨대 친화도 크로마토그래피 또는 이온 교환 크로마토그래피 또한 이용될 수 있다. 수확은 또한 세포 배양 배지 중 VLP를 농축시키는 한외여과 또는 VLP를 농축시키고 세포 배양 배지를 선택된 액체 또는 완충제로 대체하는 정용여과를 포함할 수 있다. 세포 배양 배지 중 VLP의 농축 및 정제가 백신 생성에 충분히 높은 경우, 본 발명의 단계 (iii)은 임의의 정제 단계를 수반하지 않을 수 있다.
수확, 농축 및/또는 정제 절차 동안에, 프로테아제 억제제의 존재는 바람직하지 않은 단백질분해 활성을 감소시킬 수 있다.
백신 및 그의 생성
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 실시양태의 바람직한 유용성은 특히 FMD에 대한 백신접종을 위한 수의학적 용도에 있다. 따라서, 본 발명은 추가로 백신 생성에 사용되는 FMDV VLP의 생성에 관한 것이다.
특히, 본 발명에 따른 방법의 단계 (iii)에서 세포 배양 배지로부터 수확된 VLP는 대상체의 백신접종을 위한 항원으로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, VLP는 VLP 및 하나 이상의 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 조성물에 혼입된다.
따라서, 본 발명은 또한 백신의 생성 방법으로서, 상기 기재된 방법에 의해 FMDV VLP를 생성하는 단계, 및 예컨대 제약상 허용가능한 담체의 첨가에 의해 FMDV VLP를 백신에 혼입시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
제약상 허용가능한 담체는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 단지 예로서; 이러한 담체는 간단하게는 멸균수 또는 완충제 용액, 예컨대 PBS일 수 있다. 백신은 단일 담체 또는 2종 이상의 담체의 조합을 포함할 수 있다. 백신은 또한 하나 이상의 제약상 허용가능한 희석제, 아주반트 및/또는 부형제를 포함할 수 있다. 백신은 또한 또 다른 활성 작용제, 예를 들어 VLP-유도된 적응성 면역 반응 이전에 조기 보호를 자극할 수 있는 작용제를 포함할 수 있거나 또는 그를 발현할 수 있다. 작용제는 항바이러스제, 예컨대 제I형 인터페론일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 작용제는 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF)일 수 있다.
백신은 기존 FMDV 감염을 치료하기 위해 치료적으로 사용될 수 있지만 (특히 바이러스가 풍토병인 무리 또는 지역에서), 바람직하게는 FMDV 감염 가능성을 차단하거나 또는 감소시키기 위해 및/또는 질환 확산 가능성을 예방하거나 또는 감소시키기 위해 예방적으로 사용된다.
여러 상업적으로 입수가능한 FMD 백신은 상이한 FMD 혈청형에 대한 보호를 제공하기 위해 다가이다. 마찬가지로, 본 발명의 백신은 상이한 혈청형 및/또는 주어진 혈청형 내의 상이한 아형을 각각 겨냥하는 복수개의 상이한 VLP를 포함할 수 있다.
따라서, 추가로 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 제약상 허용가능한 담체의 첨가에 의해 FMDV VLP를 백신에 혼입시키는 단계 (iv)를 추가로 포함한다.
상기 기재된 방법에 의해 수득된 백신은 FMDV에 의한 감염에 대해 대상체를 보호하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 백신의 유효량을 투여함으로써 FMDV에 의한 감염에 대해 대상체를 보호하는 방법을 제공한다. FMDV에 의한 감염에 대해 대상체를 보호하는 방법은 상기 기재된 방법에 의해 FMDV VLP를 생성하는 단계, 제약상 허용가능한 담체의 첨가에 의해 VLP를 백신에 혼입시키는 단계, 및 백신을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
FMD의 경우 대상체는 발굽이 갈라진 동물일 수 있다. FMD에 걸리기 쉬운 동물에는 농장 가축 중에서 소, 양, 돼지 및 염소, 뿐만 아니라 낙타류 (낙타, 라마, 알파카, 과나코 및 비쿠나)가 포함된다. 일부 야생 동물, 예컨대 고슴도치, 뉴트리아, 및 발굽이 갈라진 임의의 야생 동물, 예컨대 사슴 및 동물원 동물, 예컨대 코끼리 또한 FMD에 걸리기 쉽다.
투여
본 발명은 본 발명에 따른 백신의 유효량을 동물에게 적어도 1회 투여하는 것을 고려한다. 백신은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법, 예컨대 임의의 국소 또는 전신 투여 방법으로 투여될 수 있다. 투여는 예를 들어 항원을 근육 조직으로 (근육내, IM), 진피로 (피내, ID), 피부 아래로 (피하, SC), 점막 아래로 (점막하, SM), 정맥으로 (정맥내, IV), 체강으로 (복강내, IP), 경구로, 항문 등으로 투여함으로써 수행될 수 있다. 현재의 백신의 경우 IM, ID 및 SC 투여가 바람직하다.
실시예
본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 의해 추가로 기재될 것이며, 이는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 본 발명을 수행하는데 도움을 주기 위해 의도된다.
도면의 간단한설명
도 1: 12종의 성숙 바이러스 단백질로 가공되는 전구체 폴리단백질을 생성하는 단일 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 코딩하는 FMDV 게놈의 개략적 표현.
도 2: 4, 5, 6, 또는 7 dpi에 수확한 O/TUR/5/2009 VLP를 사용하는 시간 경과 실험의 결과. 세포 (C) 또는 세포 배양 상청액 (S)에 있는 FMD 단백질을 웨스턴 블롯팅에 의해 시각화하였다.
도 3: 감염 후 상이한 시점에서 수확한 세포 배양 상청액에서 O/TUR/5/2009 단백질의 ELISA에 의한 정량화.
도 4: 상이한 샘플에서 O/TUR/5/2009 단백질의 ELISA에 의한 정량화.
도 5: 20-40% 수크로스 구배로부터 유래된 분획의 웨스턴 블롯 분석. 밴드는 항-VP0 및 항-VP2 항체 둘 다에 의해 시각화되었다. 분획당 퍼센트 수크로스는 블롯 아래에 표시된다.
도 6: 4 또는 7 dpi에 수확한 배양물로부터 유래된 샘플의 웨스턴 블롯 분석. 밴드는 폴리클로날 소 혈청에 의해 시각화되었다.
도 7: 56℃에서 20분 동안 인큐베이션한 Asia1/Shamir/89 VLP의 퍼센트 해리.
도 8: 곤충 세포 또는 세포 배양 상청액으로부터 유래된 O/TUR/5/2009 VLP로 소를 백신접종한 후 유도된 바이러스 중화 역가.
도 9: 바큘로바이러스 감염 후 상이한 시점에서 수확한 초음파처리된 곤충 세포 배양물에서 SAT2/SAU/6/2000 VLP 농도의 ELISA에 의한 정량화 (실시예 8).
도 10: 46℃에서 20분 동안 인큐베이션 시 SAT2/SAU/6/2000 VLP의 열 안정성 (실시예 8).
도 11: 바큘로바이러스 감염 후 상이한 시점에서 수확한 정화된 곤충 세포 배양액에서 A/SAU/1/2015 VLP 농도의 ELISA에 의한 정량화 (실시예 9).
도 12: 56℃에서 20분 동안 인큐베이션 시 A/SAU/1/2015 VLP의 열 안정성 (실시예 9).
바큘로바이러스 구축물의 제조
바큘로바이러스 발현 구축물의 클로닝은 관련 기술분야에 널리 공지된 표준 클로닝 절차에 의해 수행되었다. 재조합 바큘로바이러스는 에이비 벡터(AB Vector)로부터의 프로이지(ProEasy)TM 시스템을 이용하여 생성되었다. 이들은 [Porta et al., 2013, J Virol Methods]에 기재된 P1-2A-3Cpro 발현 카세트를 구비하였다. 발현 수준을 증가시키기 위해, 소위 Syn21 번역 인핸서를 P1-2A-3Cpro 오픈 리딩 프레임 앞에 배치하고, P1-2A-3Cpro 코딩 영역의 하류에 오토그라파 칼리포르니카 뉴클레오폴리헤드로바이러스 (AcNPV) p10 유전자 (P10UTR)로부터의 3'-UTR을 삽입하였다 (Liu et al., 2015, Biotechnol Lett). 재조합 바큘로바이러스를 생성하기 위해 사용되는 전달 벡터에 배치된 합성 cDNA를 사용하여 아미노산 변형을 도입하였다. 곤충 세포에서 VLP의 재조합적 생성을 위해 하기 실시예에서 하기 바큘로바이러스 발현 구축물을 사용하였다:
i) 임의의 돌연변이에 의해 안정화되지 않은 FMDV 균주 O/TUR/5/2009의 P1-2A-3Cpro 발현 카세트를 함유하는 발현 구축물 O/TUR/5/2009;
ii) WO 2014/154655 A1에 기재된 바와 같이 VP2-S93F 돌연변이에 의해 안정화된 FMDV 균주 O/TUR/5/2009의 P1-2A-3Cpro 발현 카세트를 함유하는 발현 구축물 O/TUR/5/2009-VP2-S93F;
iii) WO 2014/154655 A1에 기재된 바와 같이 VP2-H93F 돌연변이에 의해 안정화된 FMDV 균주 A/IRN/7/2013의 P1-2A-3Cpro 발현 카세트를 함유하는 발현 구축물 A/IRN/7/2013-VP2-H93F;
iv) VP1 (T12N) 및 VP4 (D53G)에서 돌연변이에 의해 안정화된 FMDV 균주 SAT2/SAU/6/2000의 P1-2A-3Cpro 발현 카세트를 함유하는 발현 구축물 SAT2/SAU/6/2000-VP1-T12N-VP4-D53G; VP1-T12N 돌연변이는 VP1의 위치 12에서 트레오닌 (T)에서 아스파라긴 (N)으로의 아미노산 돌연변이를 지칭한다. VP4-D53G 돌연변이는 VP4의 위치 53에서 아스파르테이트 (D)에서 글리신 (G)으로의 아미노산 돌연변이를 지칭한다.
v) WO 2014/154655 A1에 기재된 바와 같이 VP2-S93C 돌연변이에 의해 안정화된 FMDV 균주 Asia1/Shamir/89를 기반으로 하는 P1-2A-3Cpro 발현 카세트를 함유하는 발현 구축물 Asia1/Shamir-VP2-S93C.
vi) FMDV 균주 A/SAU/1/2015를 기반으로 하는 P1-2A-3Cpro 발현 카세트를 함유하는 발현 구축물 A/SAU/1/2015-VP2-H93C. VP2-H93C 돌연변이는 VP2의 위치 093에서 히스티딘 (H)에서 시스테인 (C)으로의 아미노산 돌연변이를 지칭하며, WO 2002/000251에 기재된 바와 같다.
바큘로바이러스 발현 시스템을 이용하여 VLP를 재조합적으로 발현하였다.
실시예 1
3.2x105개 세포/ml 농도의 Tni 세포의 100 ml 세포 배양물을 발현 카세트 O/TUR/5/2009를 함유하는 재조합 바큘로바이러스로 MOI=1로 감염시켰다. 27℃에서 인큐베이션 후, 감염후 4, 5, 6 또는 7일 (dpi)에 세포를 원심분리에 의해 수집하고, 원래 세포 배양물 부피의 10%에서 재현탁시켜, 10x 농도 인자를 생성하였다. 세포 용해 방법은 적용되지 않았다. 세포 배양 상청액, 즉, 곤충 세포가 원심분리에 의해 제거된 무세포 배양 배지는 비처리로 두었다. 항-VP0 모노클로날 항체 (Loureiro et al., 2018, https://wellcomeopenresearch.org/articles/3-88) 및 폴리클로날 소 혈청 FMD13.70.445 (엠에스디 애니멀 헬스(MSD Animal Health)) 둘 다를 사용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 상청액 및 세포 샘플을 분석하였다.
도 2의 결과는 빠르게는 4 dpi에 FMDV 단백질이 세포 배양 상청액에서 검출됨을 나타낸다. 시간 경과에 따라 VP0 웨스턴 블롯에서 가장 명확하게 관찰되었고, 세포 중 FMDV 단백질의 양은 감소한 반면에, 세포 배양 상청액 중 FMDV 단백질의 양은 증가하였으며, 이는 FMDV 재조합 단백질이 세포로부터 배양 배지로 효율적으로 방출되었음을 나타낸다.
폴리클로날 혈청 블롯은 캡시드 성숙과 관련 가능성이 있는 또 다른 흥미로은 관찰을 밝혀내었다. 4 및 5일차에는 VP0 단백질이 세포 배양 배지에 존재하였고, 감염후 6 및 7일차에는 부재하였다. VP0 밴드가 소멸됨에 따라, 폴리클로날 혈청 블롯 상에서 VP2 단백질을 나타낼 수 있는 밴드가 나타난다. 그렇다면, 웨스턴 블롯은 배양 배지 중의 VP0 단백질이 VP2 및 VP4 단백질로 절단되었음을 나타낸다. VP0에서 VP2 및 VP4로의 절단은 바이러스 입자 성숙의 마지막 단계에서 발생하는 것으로 생각된다 (Curry et al., 1997, J. Virol. 71:9743-9752). 빈 캡시드가 RNA 게놈을 함유하지 않고, 일반적으로 절단된 VP0을 함유하지 않기 때문에, 이는 놀라운 발견이다. 그러나, 이는 배양 배지가 세포와는 대조적으로 성숙된 VLP를 함유하기 때문에 백신 항원의 양호한 공급원임을 나타낼 수 있다.
세포 배양 상청액에서 FMDV 단백질 농도의 차이를 정량화하기 위해, 온전한 캡시드 (75S/146S) 및 캡시드의 오량체성 빌딩 블록 (12S) 둘 다를 검출하는 INT-FMA-01-08 모노클로날 항체 (엠에스디 애니멀 헬스)를 사용하여 ELISA를 수행하였다. 이를 위해, 계열 희석된 샘플을 4℃에서 밤새 항체로 코팅된 미세역가 플레이트 상에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 제거하고, PBS-Tween으로 3회 세척한 후, 고정량의 비오티닐화 INT-FMA-01-08을 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 비오티닐화 항체를 제거하고, 플레이트를 PBS-Tween으로 3회 세척한 후, 플레이트에 퍼옥시다제-접합된 스트렙타비딘을 첨가한 다음, 발색단을 검출하였다.
도 3의 그래프는 ELISA 결과의 시각적 표현이며, 세포 배양 배지 중 VLP의 양이 4 dpi에서의 양과 비교하여 7 dpi에서 3.4배까지 증가되었음을 입증한다. 비처리 샘플의 ELISA 데이터와 56℃에서 50분 동안 열 처리하여 75S 캡시드를 12S 오량체로 전환시킨 샘플의 데이터를 비교함으로써, 불안정화된 야생형 O/Tur/5/2009에 대한 상청액 중 VLP 온전성 (즉, 75S의 양)이 54%로 추정되었으며, 이는 실제로 온전한 캡시드가 세포 배양 배지로 방출되었음을 나타낸다.
이 실시예에서는, FMDV 재조합 단백질이 세포에서 배양 배지로 효율적으로 방출되어, 시간 경과에 따라 세포 배양 배지 중 VLP의 양이 증가되며, 성숙된 VLP가 형성됨을 나타낸다.
실시예 2
3.2x105개 세포/ml의 Tni 세포를 갖는 2개의 100 ml 세포 배양물을 발현 카세트 O/TUR/5/2009-VP2-S93F를 함유하는 재조합 바큘로바이러스로 MOI=2로 감염시켰다. 27℃에서 인큐베이션 후, 4 dpi에 한 배양물로부터 세포를 원심분리에 의해 수집하고, 후속적으로 세포 펠렛을 감염 배양물 부피의 10%에서 50 mM Tris pH 8.0 - 100 mM KCl 완충제 중에서 초음파처리하였다. 7 dpi에 두번째 배양물로부터의 세포 배양 상청액을 원심분리에 의해 수득하였다.
각각의 분획에 대한 상이한 수확 시간은 세포 중 재조합 단백질의 양이 4 dpi에 가장 높은 반면에, 세포 배양 배지 중에서는 7 dpi에 가장 높았음을 나타내는 실시예 1에 제시된 데이터를 기반으로 하였다. 세포 배양 상청액이 간단한 방법에 의해 농축될 수 있는지를 검증하기 위해, 100 kDa 분자량 컷오프 막을 갖는 시스템을 사용하여 한외여과 (UF) 단계를 적용함으로써 물질을 농축시켰다. 샘플 중 FMDV 재조합 단백질의 양을 정량화하기 위해, 실시예 1에 기재된 바와 같이 INT-FMA-01-08 모노클로날 항체를 사용하여 ELISA를 수행하였다. 샘플의 농도를 추정하기 위해 공지된 농도를 갖는 참조 (ELISA 단위/ml 또는 EU/ml)를 ELISA에 포함시켰다.
도 4는 개별 ELISA 그래프를 제시하며, 수득된 값은 표 1에 나타내었다. 이 데이터로부터, 세포와 비교하여 유의하게 더 많은 FMDV VLP가 바큘로바이러스 발현 시스템의 세포 배양 상청액으로부터 수확될 수 있고 (약 6x), 상청액이 대규모 생성에 용이하게 적용될 수 있는 1-단계 방법에 의해 농축될 수 있는 것으로 결론내릴 수 있다.
표 1. 상이한 샘플 중 O/TUR/5/2009 단백질의 ELISA에 의한 정량화
이 실시예에서는, O 균주의 더 많은 VLP가 세포에 비해 세포 배양 상청액으로부터 수확될 수 있는 것으로 나타났다.
실시예 3
3.2x105개 세포/ml의 Tni 세포를 갖는 2개의 100 ml 세포 배양물을 발현 카세트 O/TUR/5/2009-VP2-S93F를 함유하는 재조합 바큘로바이러스로 MOI=1로 감염시켰다. 27℃에서 인큐베이션 후, 4 dpi에 한 배양물로부터 세포를 원심분리에 의해 수집하고, 세포 펠렛을 감염 배양물 부피의 10%에서 50 mM Tris pH 8.0 - 100 mM KCl 완충제 중에서 초음파처리하였다. 7 dpi에 두번째 배양물로부터 세포 배양 상청액을 원심분리에 의해 수득하였다. 용해된 세포 및 상청액을 함유하는 샘플을 구역 구배 원심분리에 적용하였다. 구배는 20% 내지 40% 수크로스로 구성되었고, 샘플을 구배 상부에 로딩한 후, 50,000xg 하에 20℃에서 50분 동안 원심분리하였다. 항-VP2 모노클로날 항체 F1412SA를 사용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 구배 분획을 분석하였다 (Yang et al., 2007, Vet Immunol Immunopathol).
웨스턴 블롯 분석은 VP0 및/또는 VP2 단백질이 75S 입자가 예상되는 35%의 수크로스 농도 주변의 구배에서 검출되었음을 나타내며, 이는 세포 및 상청액 둘 다에서 온전한 VLP가 존재함을 나타낸다 (도 5). 웨스턴 블롯 분석은 또한 상청액 중 VLP가 VP4 및 VP2로 부분적으로 가공되는 VP0를 가짐을 나타내며, 이는 VP0 전구체 밴드와 비교하여 VP2 밴드의 비교적 강한 존재에 의해 나타난다. 이 결과는 실시예 1에서 본 발명자들의 이전 관찰을 확인시켜 준다.
이 실시예에서는, 세포 배양 상청액이 FMDV O 균주의 온전한 VLP를 함유한다는 것을 알 수 있다.
실시예 4
3.2x105개 세포/ml의 Tni 세포를 갖는 2개의 100 ml 세포 배양물을 발현 카세트 A/IRN/7/2013-VP2-H93F를 함유하는 재조합 바큘로바이러스로 MOI=1로 감염시키고, 후속적으로 27℃에서 인큐베이션하였다. 2개의 배양물 중 하나를 4 dpi에 수확하고, 두번째는 7 dpi에 수확하였다. 세포 및 세포 배양 상청액 분획을 원심분리에 의해 분리하였다. 수득된 세포 펠렛을 감염 배양물 부피의 10%에서 50 mM Tris pH 8.0 - 100 mM KCl 완충제 중에서 초음파처리하였다. 세포 배양 상청액은 비처리로 두었다.
폴리클로날 소 혈청 FMD13.70.445를 사용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 세포 및 상청액 샘플을 분석하였다 (도 6). 웨스턴 블롯의 시각적 검사를 통해 상청액 샘플의 VP2 밴드의 강도가 세포 용해물 샘플의 것보다 강한 것으로 나타났다. 세포 용해물이 10배 농축되었기 때문에, 감염후 4 및 7일 둘 다에서 세포외 환경에 적어도 10배 더 많은 VP2 단백질이 존재한다고 결론 내릴 수 있다. 웨스턴 블롯은 또한 세포 배양 상청액이 훨씬 적은 P1 폴리단백질 가공 중간체를 함유하였고, 대부분의 VP0 단백질이 VP2 (및 VP4)로 절단됨을 나타낸다. 이는 다시 실시예 1 및 3에서 이미 논의된 바와 같이 성숙 캡시드가 세포 배양 상청액에 우세하게 존재한다는 것을 시사한다.
이 실시예에서는, 4 및 7 dpi 둘 다에서 세포에 비해 세포 배양 상청액에 FMDV A 균주의 더 많은 VLP가 존재한다는 것을 알 수 있다.
실시예 5
2-리터 생물반응기에서 2.2x106개 세포/ml 농도의 Tnao38 곤충 세포를 발현 구축물 SAT2/SAU/6/2000-VP1-T12N-VP4-D53G를 함유하는 재조합 바큘로바이러스로 MOI=1로 감염시켰다. 5 dpi에 28℃에서 인큐베이션한 후, 세포를 원심분리에 의해 수집하고, 세포 펠렛을 감염 배양물 부피의 5%에서 50 mM pH 8.0 - 100 mM 완충제 중에서 초음파처리하였다. 30 킬로달톤 (kDa) 분자량 컷오프 막을 사용하여 한외여과에 의해 원심분리 단계로부터의 배양 상청액을 추가로 18.6배 농축시켰다.
온전한 바이러스-유사 입자의 농도는 VHH M377F를 사용하여 ELISA에 의해 결정되었다 (Harmsen et al., 2017, Front. Immunol. 8:960, doi: 10.3389/fimmu.2017.00960). 이를 위해, 계열 희석된 샘플을 4℃에서 밤새 M377F로 코팅된 미세역가 플레이트 상에서 실온에서 (RT) 1시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 제거하고, PBS-Tween으로 3회 세척한 후, 고정량의 비오티닐화 M377F를 플레이트에 첨가하고, RT에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 비오티닐화 항체를 제거하고, 플레이트를 PBS-Tween으로 3회 세척한 후, 퍼옥시다제-접합된 스트렙타비딘을 플레이트에 첨가한 다음, 발색단을 검출하였다. ELISA에 따라, 20x 세포 용해물은 117 EU/ml의 온전한 VLP를 함유한 반면에, 농축된 배양 상청액은 92 EU/ml를 함유하였다. 따라서, 5 dpi에 모든 SAT2/SAU/6/2000 VLP의 46%가 세포 배양 상청액에 존재한다.
결과적으로, FMDV SAT2 VLP가 세포 배양 상청액에서 축적되는 것을 알 수 있다.
실시예 6
ml당 40 ml의 1ㆍ106개 Tnao38 곤충 세포를 함유하는 에를렌마이어 플라스크를 발현 구축물 Asia1/Shamir-VP2-S93C를 함유하는 재조합 바큘로바이러스의 P1 스톡 3 ml로 접종하였다. 4 또는 6 dpi 동안 27.5℃에서 인큐베이션한 후, 세포를 3000 rpm에서 5분 동안 회전시킴으로써 수집하였다. 생성된 세포 펠렛을 원래 배양물 부피의 1/10 부피에서 50 mM HEPES pH 8.0 - 100mM KCl 중에 재현탁시키고, 세포를 초음파처리에 의해 용해시켰다. 원심분리 후에도 세포 배양 상청액을 수집하였다.
수득된 물질을 56℃에서 20분 동안 열 처리하고, 실시예 5에 기재된 방법에 따라 그러나 RT 대신에 37℃에서 인큐베이션하여 M332F 항체를 사용하는 상동성 ELISA에 의해 열 처리 전후에 온전한 VLP의 양을 결정하였다 (Harmsen et al., 2017, Front. Immunol. 8:960).
56℃에서 인큐베이션하여 생존한 캡시드의 백분율은 도 7에 제시된다. 결과는 상청액-유래된 VLP가 세포-유래된 VLP에 비해 더욱 열안정함을 입증하고, 더 긴 배양 시간 (즉, 4일 대신에 6일)은 열안정성을 개선시키는 것으로 보인다. VLP 열안정성에 대한 세포 배양 배지의 효과를 측정하는 것을 목적으로 하는 추가의 실험에서, 안정화 효과를 검출할 수 없었기 때문에, 이러한 관찰이 이들 VLP에 대한 곤충 세포 배양 배지의 안정화 효과의 결과인 것으로 믿어지지 않는다. 타당한 설명은 자연적으로 감염된 세포에서 FMDV 캡시드가 하는 것과 같이, 세포 배양 상청액 중 VLP가 세포외 환경으로 능동적으로 수송되었기 때문에 더 성숙된다는 것이다. VLP 성숙 이론 (실시예 1에서 언급됨)에 따라 VLP는 시간 경과에 따라 더욱 내열성이 된다는 것이 발견되었고: 6 dpi에서 수확된 VLP의 열안정성은 4 dpi에 비해 높다.
이 실시예에서는, 세포 배양 상청액으로부터 유래된 Asia1/Shamir/89 균주의 FMDV VLP의 열안정성이 세포로부터 유래된 VLP와 비교하여 더 높다는 것이 입증될 수 있다.
실시예 7
세포 배양 상청액으로부터 유래된 VLP가 세포로부터 유래된 VLP만큼 면역원성이 있음을 입증하기 위해 동물 실험을 수행하였다. 4-6개월령의 10마리의 송아지를 각각 5마리씩을 포함하는 2 그룹으로 나누었다. 0일차에, 8 μg의 균주 O/TUR/5/2009의 FMDV VLP 및 독점 SVEA-E 아주반트에 의해 제형화된 2 ml의 백신을 송아지에게 근육내로 (IM) 백신접종하였다. 한 그룹은 곤충 세포로부터 유래된 VLP를 제공받은 반면에, 다른 그룹은 세포 배양 상청액으로부터 유래된 VLP를 제공받았다. 백신접종후 0, 7, 14 및 21일 (dpv)에 혈액 샘플을 취하였다. 응고된 혈액으로부터 혈청이 유래되었고, 후속적으로 O/TUR/5/2009를 사용하여 바이러스 중화 검정 (VNT)에 의해 시험하였다.
O/TUR/5/2009 VP2-S93C VLP는 MOI=1로 감염된 ml당 2ㆍ106개 Tnao38 곤충 세포를 함유하는 2-리터 생물반응기에서 30℃에서 생성되었다. 5 dpi에 세포 배양 상청액 및 세포를 200xg에서 원심분리에 의해 수확하였다. VLP는 초음파처리에 의해 방출되었다. 온전한 VLP의 농도는 실시예 5에 기재된 방법에 따라 그러나 RT 대신에 37℃에서 인큐베이션하여 VHH C1을 사용하는 ELISA에 의해 결정되었다 (Wang et al., 2015, BMC Veterinary Research 11:120, DOI 10.1186/s12917-015-0437-2).
그룹 둘 다의 모든 동물에서 높은 수준의 FMDV 바이러스-중화 항체가 7 dpv에 검출될 수 있었고, 그룹 평균은 세포 그룹의 경우 2.26 log10 및 세포 배양 상청액 그룹의 경우 2.39 log10이었다 (도 8). 백신접종후 21일차에 역가가 각각 2.30 log10 및 2.53 log10으로 약간 상승하였다. 결과는 세포 및 세포 배양 상청액의 공급원 둘 다가 면역원성 VLP를 생성하였음을 나타낸다.
결과적으로, 세포 또는 세포 배양 상청액으로부터 유래된 VLP는 둘 다 면역원성임을 알 수 있다.
실시예 8
이 실시예에서는, 이후 시점에 SAT2/SAU/6/2000 VLP를 수확하는 것이 수율 및 캡시드 안정성 둘 다를 개선시키는지 여부를 평가하였다.
VLP 수율 및 열안정성에 대한 바큘로바이러스 감염 후 수확 시간의 효과를 조사하기 위해, Tnao38 곤충 세포를 함유하는 2-리터 생물반응기를 SAT2/SAU/6/2000-VP1-T12N+VP4-D53G 발현 카세트를 함유하는 재조합 바큘로바이러스로 MOI=0.1로 접종하였다. 바큘로바이러스-감염된 곤충 세포 배양물을 30℃에서 인큐베이션하고, 배양물의 일부를 감염후 4, 5 및 6일에 수확하였다. 수확물을 초음파처리하여 곤충 세포를 용해시키고, 세포내 VLP를 방출시켰다. 후속적으로, 생성된 물질 (즉, 세포 배양액 중 용해된 세포)을 3000xg에서 10분 동안 원심분리하여 정화시켰다.
물질 중 온전한 VLP의 양은 실시예 5에 기재된 바와 같이 VHH M377F를 사용하여 ELISA에 의해 결정되었다.
바큘로바이러스 감염후 5 또는 6일 (dpi)에서의 수확이 4 dpi의 수확에 비해 유의하게 더 높은 VLP 수율을 생성하였음이 관찰되었다 (도 9 참조).
정화된 물질을 46℃에서 20분 동안 열 처리하였고, 열 처리 전후에 온전한 VLP의 양을 ELISA에 의해 결정하였다. 이 ELISA 데이터로부터 46℃에서 인큐베이션하여 생존한 캡시드의 백분율을 계산할 수 있다 (도 10). 5 또는 6 dpi에 수확된 SAT2 VLP의 열안정성은 4 dpi에 비해 더 높은 것으로 나타났다.
전반적으로, 이 실시예에서 제시된 데이터는 SAT2/SAU/6/2000 VP1-T12N+VP4-D53G VLP의 수율 및 열안정성 둘 다 VLP가 5 dpi 또는 그 이후에 수확되는 경우에 최적임을 나타낸다.
실시예 9
이 실시예에서는, 감염 후 어느 시점에서 A/SAU/1/2015 VLP의 수율 및 열안정성이 가장 최적인지를 평가하였다.
수확 시점이 또 다른 FMDV 혈청형에 속하는 균주의 VLP의 수율 및 열안정성에도 영향을 미치는지를 조사하기 위해, 균주 A/SAU/1/2015를 기반으로 하는 P1-2A-3Cpro 발현 카세트를 갖는 재조합 바큘로바이러스의 새로운 세트를 상기 기재된 방법에 따라 생성하였다. A/SAU/1/2015 VLP는 VP2-H93C 돌연변이에 의해 안정화되었다.
A/SAU/1/2015-VP2-H93C 발현 카세트를 함유하는 재조합 바큘로바이러스로 MOI=0.1로 접종된 Tnao38 곤충 세포를 함유하는 2-리터 생물반응기에서 VLP를 생성하였다. 바큘로바이러스-감염된 곤충 세포 배양물을 28℃에서 인큐베이션하고, 배양물의 일부를 감염후 3, 4, 5, 6 및 7일에 수확하였다. 수확물을 3000xg에서 10분 동안 원심분리하여, 정화된 세포 배양액을 수득하였다.
물질 중 온전한 VLP의 양은 37℃에서 인큐베이션을 수행한 것을 제외하고는 실시예 5에 기재된 방법에 따라 VHH M702F를 사용하는 ELISA에 의해 결정되었다 (Li et al., 2021, Vaccines: 9, 620, doi.org/10.3390/vaccines9060620).
세포 배양액 중 VLP 농도가 시간 경과에 따라 증가하였고, 7 dpi에 가장 높은 것으로 관찰되었다 (도 11 참조).
정화된 물질을 56℃에서 20분 동안 열 처리하고, 열 처리 전후에 온전한 VLP의 양을 ELISA에 의해 결정하였다. 이 ELISA 데이터로부터 46℃에서 인큐베이션하여 생존한 캡시드의 백분율을 계산할 수 있다 (도 12). VLP의 열안정성이 3 내지 5 dpi에 개선되었지만, 그 이후에는 개선되지 않았으며, 이는 5 dpi에 이미 최상의 열안정성에 도달하였음을 나타낸다.
요약하면, A/SAU/1/2015 VLP에 의해 수득된 데이터는 최상의 열안정성을 위해서는 VLP가 5 dpi보다 일찍 수확되지 않아야 함을 나타낸다.
결론
본 발명에서 Asia1 및 SAT2 균주로부터의 FMDV 재조합 단백질이 5 dpi 또는 그 이후에 수확될 때 바큘로바이러스/곤충 세포 발현 시스템에서 효율적으로 생성될 수 있음을 알 수 있다. 세포에서 배양 상청액으로의 방출이 더 성숙된 VLP를 생성하는 것으로 믿어진다. 이들 VLP는 단지 세포로부터 유래된 VLP와 비교하여 더 높은 열안정성을 갖는다. 본 발명에 따라 세포 배양물로부터 유래된 VLP는 면역원성이고, FMDV에 의한 감염에 대한 보호를 제공하는 대상체의 백신접종을 위해 사용될 수 있다.
Claims (8)
- 바큘로바이러스 발현 시스템에서 Asia1 또는 SAT2 균주의 구제역 바이러스 (FMDV) 바이러스-유사 입자 (VLP)를 생성하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
(i) 곤충 세포를 바큘로바이러스 발현 벡터로 감염시키며, 여기서 곤충 세포는 FMDV VLP를 재조합적으로 생성할 수 있는 것인 단계,
(ii) 곤충 세포가 FMDV VLP를 생성하는 조건 하에 세포 배양 배지에서 곤충 세포를 배양하며, 여기서 배양은 감염후 5일 이상 동안 수행되는 것인 단계,
(iii) 세포 배양 배지로부터 곤충 세포에 의해 생성된 FMDV VLP를 수확하는 단계. - 제1항에 있어서, 배양이 감염후 5일 동안 수행되는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 바큘로바이러스 발현 벡터가 FMDV 캡시드 전구체 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제3항에 있어서, 바큘로바이러스 발현 벡터가 FMDV 캡시드 전구체 단백질을 하나 이상의 캡시드 단백질로 절단할 수 있는 프로테아제를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 것인 방법.
- 제4항에 있어서, 캡시드 전구체 단백질이 FMDV 캡시드 전구체 P1 및 2A 펩티드를 포함하고, 프로테아제가 3C인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
(iv) 제약상 허용가능한 담체의 첨가에 의해 FMDV VLP를 백신에 혼입시키는 단계. - FMDV에 의한 감염에 대해 대상체를 보호하는데 사용하기 위한 백신으로서, 제6항에 따른 방법에 의해 수득가능한 백신.
- FMDV에 의한 감염에 대해 대상체를 보호하는 방법으로서, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 FMDV VLP를 생성하는 단계, 제약상 허용가능한 담체의 첨가에 의해 VLP를 백신에 혼입시키는 단계, 및 백신을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
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