KR102365045B1

KR102365045B1 - 부유세포 배양에 적응된 O/ME-SA/Ind-2001 유전형 구제역 바이러스 백신주 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102365045B1
Application number: KR1020210060187A
Authority: KR
Inventors: 김수미; 박종현; 이민자; 이경민; 황지현; 김병한
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2019-07-26
Filing date: 2021-05-10
Publication date: 2022-02-18
Also published as: KR102320272B1; KR20210055668A; KR20210012696A

Abstract

본 발명은 부유세포 배양에 적응된 O/ME-SA/Ind-2001 유전형 구제역 바이러스 백신주, 이를 포함하는 구제역 바이러스 백신 조성물, 및 이들의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 O/ME-SA/Ind-2001 유전형 구제역 바이러스를 부착세포 및 부유세포에서 교대연속계대배양하여 세포 적응성을 확립한 구제역 바이러스 백신주, 이의 불활화된 바이러스 백신주를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물, 및 이들의 제조방법에 관한 것이다.

Description

부유세포 배양에 적응된 O/ME-SA/Ind-2001 유전형 구제역 바이러스 백신주 및 이의 제조방법{Suspension Cell Culture Adapted Vaccine Strain Derived from Foot-and-mouth disease virus of O/ME-SA/Ind-2001 Lineage and Method of Preparing the Same}

본 발명은 O 혈청형 유래 야생형 구제역 바이러스를 LFBK 부착세포, BHK-21 부착세포, 및 BHK-21 부유세포에서 순차적으로 교대연속계대배양하여 세포 적응성이 획득된 것을 특징으로 하는 구제역 바이러스 백신주의 제조방법에 관한 것이다.

더 구체적으로, 본 발명의 구제역 바이러스 백신주의 제조방법은 하기 단계를 포함한다:

(a) LFBK 부착세포에 O 혈청형 유래 야생형 구제역 바이러스를 접종한 후 5회 이상 연속계대배양하여 세포 적응된 바이러스를 포함하는 바이러스 배양물을 얻는 단계;

(b) 상기 (a) 단계에서 얻은 세포 적응된 바이러스를 포함하는 바이러스 배양물을 BHK-21 부착세포에 접종한 후 4회 이상 연속계대배양하여 세포 적응된 바이러스를 포함하는 바이러스 배양물을 얻는 단계;

(c) 상기 (b) 단계에서 얻은 세포 적응된 바이러스를 포함하는 바이러스 배양물을 BHK-21 부유세포에 접종한 후 6회 이상 연속계대배양하여 세포 적응된 바이러스를 포함하는 바이러스 배양물을 얻는 단계;

(d) 상기 (c) 단계에서 얻은 세포 적응된 바이러스를 포함하는 바이러스 배양물로부터 바이러스 생산성 및 항원생산성 중 적어도 하나를 평가하여 후보 백신주 바이러스를 선별 및 분리하는 단계; 및

(e) 상기 선별 및 분리된 후보 백신주 바이러스에 대해 헤파란 설페이트 수용체 및 JMJD6 수용체 중 적어도 하나의 인식여부를 확인하여 최종 백신주 바이러스를 선정하는 단계.

또, 본 발명은 부유세포 배양에 적응된 O/ME-SA/Ind-2001 유전형 구제역 바이러스 백신주 및 이를 포함하는 구제역 바이러스 백신 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 O/ME-SA(Middle East-South America)/Ind-2001 유전형 구제역 바이러스를 부착세포 및 부유세포에서 교대연속계대배양하여 확립한 구제역 바이러스 백신주 및 이의 불활화된 바이러스 백신주를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

구제역(Foot-and-mouth disease; FMD)은 발굽이 둘로 갈라진 동물에 감염되는 바이러스 수포성 질병으로 빠른 복제와 빠른 전파력이 특징이다. 이 질병은 그 경제적 중요성으로 인하여 세계동물보건기구(OIE)에 의하여 중요 질병으로 분류되어 있으며, 축산물의 국가간 교역에 있어 매우 중요한 요소로 작용하고 있다. 구제역 바이러스(Foot-and-mouth disease virus; FMDV)는 단일 가닥의 양극성 RNA 바이러스로 피코나비리데(Picornaviridae)과, 아프소바이러스(Aphthovirus) 속에 속하며 7개의 다른 혈청형(serotype: A, O, C, Asia-1, SAT-1, SAT-2, SAT-3)으로 분류되고 있다. 구제역의 전파를 억제하기 위해 동물의 살처분 이외에는 불활화 백신을 사용하는 방법이 유일하게 사용되고 있다. 그러나 구제역 백신은 다른 혈청형에 대한 방어가 되지 않으며, 지역형(topotype) 및 유전형(lineage)에 따라 적합한 백신을 사용해야 하므로 주변국의 발생상황 등을 고려한 백신주의 개발이 매우 중요하다.

구제역 바이러스 O 혈청형의 경우 약 8가지 이상의 유전형이 있으나, 최근 우리나라와 중국, 베트남, 미얀마 등 아시아지역에서는 O/SEA/Mya-98, Cathay, ME-SA/PanAsia, ME-SA-Ind-2001 유전형의 구제역 바이러스가 발생하고 있다. 이 중 O/ME-SA/Ind-2001(예컨대, O/ME-SA/Ind-2001e) 유전형은 2015년부터 동아시아와 동남아시아지역에서 가장 유행하는 바이러스이다. 특히, 우리나라에서는 2017년(해당 유전형 최초 발생)과 2019년에 O/ME-SA/Ind 2001 유전형의 구제역 바이러스가 발생한 바 있으며, 주변국의 발생도 지속적으로 보고되고 있어 앞으로의 발생 위험이 지속되고 있다. 따라서 O/ME-SA/Ind 2001 유전형 유래 백신주의 개발 필요성도 커지고 있는 상황이다.

구제역 백신은 구제역 바이러스를 대량 배양하여 불활화시킨 후 그 항원을 아쥬반트와 섞어 백신을 제작하는 것이 일반적이다. 구제역 바이러스의 대량 배양에는 주로 BHK-21 부유세포(Baby hamster kidney-21 suspension cell)가 사용된다. 야외에서 분리된 구제역 바이러스(야생형 구제역 바이러스)는 인테그린 수용체를 사용하여 세포와 동물에 감염되지만, BHK-21 부유세포는 인테그린 수용체(integrin receptor; 특히, 인테그린 alpha 5와 인테그린 alpha V)의 발현이 매우 저조하기 때문에 바이러스가 잘 증식하지 못하는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 1). 따라서, 구제역 바이러스의 대량 백신 생산에 이용하기 위해서는 완전한 세포 적응을 통해 인테그린 수용체가 아닌 헤파란 설페이트(Heparan sulfate) 또는 JMJD6(Jumonji domain-containing protein 6)와 같은 부유세포(또는, 기타 숙주세포)의 수용체를 인식하는 바이러스(또는, 백신주)를 확보해야 하며, 부유세포에서의 구제역 바이러스의 증식성과 항원 생산성을 확인해야 한다. 또한, 해당 구제역 바이러스 항원이 포함된 백신이 방어수준의 중화항체가(Neutralizing antibody titer)를 유도할 수 있는 면역원성을 가지고 있어야 한다.

종래 기술에 따르면, 소, 돼지 등의 상피 조직(epithelial tissue)으로부터 분리한 해외 유행주, 특히 아시아 지역에서 유행하는 구제역 바이러스의 혈청형 및 유전형을 규명한 바 있고(비특허문헌 2), 구제역 바이러스로부터 유래되는 특정 구조단백질의 아미노산을 포함하는 항원을 백신 제조에 이용하거나(특허문헌 1), 구제역 바이러스의 특정 유전자를 결실시킨 재조합 바이러스를 백신 제조에 사용하는 내용이 개시되어 있기는 하나(특허문헌 2), 구제역 바이러스는 숙주동물 및 각 혈청형에 따라 서로 교차방어가 되지 않는 특징으로 인하여 현재까지 규명된 모든 혈청형에 대한 감염을 효과적으로 방어하기 위한 백신 개발은 매우 어려운 실정이다(비특허문헌 3-4).

본 발명자들은 최근 국내에서 유행하는 구제역 바이러스 유행주들의 혈청형/지역형/유전형에 맞는 효과적인 방어 항체의 생성을 위해 최근 5년간 우리나라를 비롯한 아시아 지역에서 가장 빈번히 발생하고 있는 바이러스 중 하나인 O/ME-SA/Ind-2001 유전형 구제역 바이러스인 O/Boeun/SKR/2017 구제역 바이러스를 이용하여 구제역 백신주를 대량 생산하고, 이에 의한 구제역 바이러스에 대한 방어력이 높은 예방 백신을 개발하고자 예의 노력해 왔다. 그 결과, 다수의 선별 과정을 거쳐 최종 선정된 O/ME-SA/Ind-2001 유전형 구제역 바이러스를 LFBK 부착세포(adherent porcine kidney cells), BHK-21 부착세포(adherent baby hamster kidney-21 cells) 및 BHK-21 부유세포(suspension baby hamster kidney-21 cells)에 순차적으로 접종시켜 특정 계대수로 교대연속계대배양하여 최적화된 바이러스 역가(Viral titer)로 구제역 백신주를 수확할 수 있었고, 상기 구제역 백신주를 불활화한 다음, 아쥬반트와 혼합하여 제조한 구제역 바이러스 백신을 돼지 또는 대체동물인 마우스에 접종하였을 때 접종된 동물의 혈청/혈액 내 중화항체가가 현저하게 상승하고 장기간 동안 유지되어 구제역 바이러스에 대한 방어 효과가 탁월함을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

한국 공개특허 제10-2018-0133678호(2018년 12월 17일) 한국 공개특허 제10-2014-0083129호(2014년 7월 4일)

Brown F., Dev Biol Stand.,　93:85-8, 1998 Mahapatra M. et al., Vaccine, 35(51):7147-7153, 2017 Beck E. et al., EMBO J., 2(4): 555-9, 1983 Grubman MJ et al., Virology, 158(1):133-40, 1987

본 발명의 목적은 기존의 백신주로는 효과적인 방어가 어려운, 현재 우리나라 전역에서 빈번하게 유행하는 야생형/야외형 구제역 바이러스, 보다 구체적으로 O/ME-SA/Ind-2001 유전형 구제역 바이러스에 대한 효과적인 신규 구제역 백신주를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 신규 구제역 바이러스 백신주를 포함하는 구제역 바이러스 예방용 또는 치료용 백신 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 야생형 구제역 바이러스인 O/ME-SA/Ind-2001 유전형 구제역 바이러스를 LFBK 부착세포, BHK-21 부착세포, 및 BHK-21 부유세포에서 순차적으로 연속계대배양하여 세포 적응성이 획득된 구제역 백신주를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 구제역 백신주의 불활화된 바이러스를 유효성분으로 포함하는 구제역 바이러스의 감염 예방을 위한 백신 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 구제역 백신주는 구제역 바이러스 항원을 대량으로 생산 가능하여, 구제역 백신 생산에 산업적으로 이용이 가능하고, 아시아 지역에서 대 유행중인 O 혈청형의 구제역 바이러스, 특히 O/ME-SA/Ind-2001 유전형 구제역 바이러스를 포함한 ME-SA 지역형 바이러스의 방어를 위한 백신 제작에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 야생형 구제역 바이러스인 O/ME-SA/Ind-2001 유전형 구제역 바이러스인 O/Boeun/SKR/2017 구제역 바이러스를 접종한 다음, LFBK 부착세포, BHK-21 부착세포, 및 BHK-21 부유세포에서 순차적으로 연속계대배양하여 수확한 바이러스를 BHK-21 부착세포 또는 CHO-K1 부착세포에 감염시켜 바이러스 역가의 측정을 통해 구제역 바이러스의 부유세포에서의 세포 적응도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 구제역 바이러스 백신주(L5B6S9-O 바이러스)의 증식성(A)과 항원 생산성(B)을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 구제역 바이러스 백신주(L5B6S9-O 바이러스)로 생산된 불활화된 항원을 투과전자현미경(Transmission Electron Microscope, TEM)으로 확인한 사진을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 구제역 바이러스 백신주(L5B6S9-O 바이러스)로 생산된 항원을 포함하는 시험백신을 돼지에 접종하여 면역원성의 정도를 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 구제역 바이러스 백신주(L5B6S9-O 바이러스)로 생산된 항원을 포함하는 시험백신을 접종한 돼지의 혈청에 대해 동일한 지역형 바이러스(도 5A) 및 상이한 지역형 바이러스(도 5B)로 중화시험한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 구제역 바이러스 백신주(L5B6S9-O 바이러스)로 생산된 항원을 포함하는 시험백신의 다른 야외형/야생형 구제역 바이러스(heterologous FMDV) 공격에 대한 방어 여부를 마우스에서 실험한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 명세서에서 길이, 면적, 부피, 시간(기간), 농도, 함량 등을 표현하는데 사용된 용어 "약"은 해당 수치 또는 수치 범위에서 최대 10%의 허용오차가 존재한다는 것을 의미한다.

일 관점에서, 본 발명은 신규한 구제역 백신주, 더 구체적으로 야생형/야외형 구제역 바이러스인 O/ME-SA/Ind-2001 유전형 구제역 바이러스인 O/Boeun/SKR/2017 구제역 바이러스를 세포간 교대연속계대배양(alternately and continuously passage cultivation)한 다음, 선별 및 분리하여 얻은 구제역 백신주에 관한 것으로, 상기 세포간 교대연속계대배양은 LFBK(bovine calf kidney cell)의 부착세포, BHK-21(baby hamster kidney cell)의 부착세포, 및 BHK-21(baby hamster kidney cell)의 부유세포에서 순차적으로 연속계대배양하는 것임을 특징으로 할 수 있으나, 반드시 상기 순서로만 한정되는 것은 아니다.

구체적으로, 본 발명에 따른 구제역 바이러스 백신주는, 계대배양 순서 및/또는 계대배양 횟수에 국한됨이 없이, LFBK 부착세포, BHK-21 부착세포, 및 BHK-21 부유세포에서 연속계대배양을 통해 완전 세포 적응되어, 헤파란 설페이트 수용체(heparan sulfate receptor; HSR)를 인식하는 바이러스로서, 정상적인 기능 및 활성을 갖는 HSR을 인식하고, 또 특정 세포에서 목표하는 바이러스 역가를 나타내는 모든 바이러스를 포함한다. 상기 특정 세포는 CHO-K1 세포일 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 구제역 바이러스 백신주는, 계대배양 순서 및/또는 계대배양 횟수에 국한됨이 없이, LFBK 부착세포, BHK-21 부착세포, 및 BHK-21 부유세포에서 연속계대배양을 통해 완전 세포 적응되어, JMJD6 수용체(Jumonji domain-containing protein 6 receptor; JMJD6R)를 인식하는 바이러스로서, 정상적인 기능 및 활성을 갖는 JMJD6R을 인식하고, 또 특정 세포에서 목표하는 바이러스 역가를 나타내는 모든 바이러스를 포함한다. 상기 특정 세포는 CHO-677 세포일 수 있다.

본 발명에 따른 구제역 바이러스 백신주를 획득하기 위한 상기 연속계대배양은 정상적인 기능 및 활성을 갖는 HSR 및/또는 JMJD6R을 인식하는 구제역 바이러스 백신주가 획득되는 한, 계대배양 순서 및/또는 계대배양 횟수에 관계없이 이루어질 수 있으나, 본 발명에 따른 구제역 바이러스 백신주는 LFBK 부착세포에서 적어도 5회, BHK-21 부착세포에서 적어도 4회, 및 BHK-21 부유세포에서 적어도 6회 교대연속계대배양을 거쳐 획득될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 구제역 바이러스 백신주는 LFBK 부착세포에서 5회, BHK-21 부착세포에서 4회, BHK-21 부유세포에서 7회의 교대연속계대배양을 거쳐 획득된 것일 수 있다. 더 바람직하게는, 본 발명에 따른 구제역 바이러스 백신주는 LFBK 부착세포에서 5회, BHK-21 부착세포에서 6회, BHK-21 부유세포에서 9회의 교대연속계대배양을 거쳐 획득된 것일 수 있다.

본 발명에 따른 구제역 바이러스 백신주는, 야생형 구제역 바이러스인 O/ME-SA/Ind-2001 유전형 구제역 바이러스가 LFBK 부착세포, BHK-21 부착세포, 및 BHK-21 부유세포에서 순차적으로 연속계대배양을 거침으로서 백신주로서 적합한 세포 적응성, 엄밀하게는 완전한 세포 적응성을 획득할 수 있다. 여기서 용어 '백신주로서 적합한 세포 적응성을 획득하다' 또는 '완전한 세포 적응성을 획득하다'는 야생형 바이러스가 LFBK 부착세포, BHK-21 부착세포, 및 BHK-21 부유세포에서 순차적으로 연속계대배양을 거쳐 BHK-21 부유세포에 적응이 완료되었음을 의미한다. 다른 의미로, 상기 용어는 본 발명의 구제역 백신주 바이러스가 다양한 숙주 세포, 예를 들어, LFBK 부착세포, BHK-21 부착세포, BHK-21 부유세포, CHO 부착세포(예컨대, CHO-K1 부착세포 및/또는 CHO-677 부착세포), 바람직하게는 BHK-21 부유세포에서 인테그린 수용체 이외의 수용체, 예컨대, 헤파란 설페이트 수용체, JMJD6 수용체를 인식하여 정상적으로 생존 내지 증식하여 소정의 바이러스 역가를 나타낼 수 있음을 의미한다.

본 발명에 따른 구제역 바이러스 백신주는 헤파란 설페이트 수용체를 인식하기 때문에, CHO-K1 부착세포에서 1x10^2.0 TCID₅₀/mL 이상, 바람직하게는 1x10^2.3 TCID₅₀/mL 이상, 더 바람직하게는 1x10^2.5 TCID₅₀/mL 이상의 바이러스 역가를 나타낼 수 있다.

본 발명에 따른 구제역 바이러스 백신주는 JMJD6 수용체를 인식하기 때문에, CHO-677 부착세포에서 1x10^2.0 TCID₅₀/mL 이상, 바람직하게는 1x10^2.5 TCID₅₀/mL 이상, 더 바람직하게는 1x10^2.7 TCID₅₀/mL 이상의 바이러스 역가를 나타낼 수 있다.

본 발명의 구체역 바이러스는 LFBK 부착세포, BHK-21 부착세포, 및 BHK-21 부유세포에서 연속계대배양을 통해 얻은 바이러스 배양물(culture)에서 선별 및 분리과정을 거쳐 얻은 바이러스로서 BHK-21 부착세포에서 1x10^5.5 TCID₅₀/mL 이상, 바람직하게는 1x10^6.0 TCID₅₀/mL 이상, 가장 바람직하게는 1x10^7.0 TCID₅₀/mL 이상의 바이러스 역가를 나타내고, CHO-K1 부착세포에서 1x10^2.0 TCID₅₀/mL 이상, 바람직하게는 1x10^2.5 TCID₅₀/mL 이상의 바이러스 역가를 나타내며, CHO-677 부착세포에서 1x10^2.0 TCID₅₀/mL 이상, 바람직하게는 1x10^2.5 TCID₅₀/mL 이상의 바이러스 역가를 나타내는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 구제역 바이러스 백신주는 LFBK 부착세포, BHK-21 부착세포, 및 BHK-21 부유세포에서 교대연속계대배양을 통해 완전한 세포적응성을 획득한 바이러스로서, 서열번호 1로 표기되는 핵산(뉴클레오타이드) 염기서열을 갖거나, 이와 실질적 상동성을 갖는 핵산 염기서열 및 상기 핵산 염기서열로 생성되는 폴리펩티드를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 구제역 백신주의 핵산 및 폴리펩티드의 경우, 용어 "실질적 상동성"은 2종의 핵산 및 2종의 폴리펩티드 또는 이것들의 지정된 서열이 최적으로 정렬 및 비교되는 경우에 뉴클레오티드 및 아미노산의 적어도 약 80％, 통상적으로는 뉴클레오티드 및 아미노산의 적어도 약 85％, 바람직하게는 약 90％, 91％, 92％, 93％, 94％ 또는 95％, 더욱 바람직하게는 적어도 약 96％, 97％, 98％, 99％, 99.1％, 99.2％, 99.3％, 99.4％ 또는 99.5％에서 동일한 것을 의미한다. 본 발명은 본원에서 언급된 특정 핵산 염기서열 및 아미노산 서열에 대해 실질적 상동성을 갖는 핵산 염기서열 및 폴리펩티드 서열을 포함한다.

본 발명의 구제역 바이러스를 획득하기 위해 출발물질로 사용되는 상기 야생형 또는 야외형 구제역 바이러스는 O/ME-SA/Ind-2001 유전형의 구체적 바이러스로 분류되는 바이러스라면 모두 사용할 수 있다. 상기 유전형 구제역 바이러스로서, 예를 들어, 농림축산검역본부의 KVCC(Korea Veterinary Culture Collection, 한국수의유전자원은행[http://kvcc.kahis.go.kr])에 수탁번호 KVCC-VR1700004로 수탁된 구제역 바이러스를 사용할 수 있다.

다른 관점에서, 본 발명은 상기 구제역 백신주의 불활화된 바이러스를 유효성분으로 포함하는 구제역 바이러스의 감염 예방을 위한 백신 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 불활화된 구제역 바이러스 백신주는 구제역 바이러스 백신주를 공지의 방법으로 불활화 처리하여 얻을 수 있다.

공지의 불활화 처리 방법으로는, 예를 들어 바이러스 불활화에 사용되는 BEI(Binary Ethylenimine)로 처리하거나, 포르말린, 글루타알데하이드, 가열, 조사, BPL 또는 당 분야에 공지된 다른 불활화제(불활성화제)를 사용하여 불활화(불활성화)될 수 있다.

본 발명의 불활화된 구제역 바이러스 백신주의 불활화 반응은 바람직하게는 26~37℃에서 48시간 동안 이루어질 수 있으며, 가장 바람직하게는 37℃의 온도에서 24시간 동안 1차 불활화시킨 후 26℃의 온도에서 24시간 동안 2차 불활화시켜 이루어질 수 있다.

상기 백신 조성물은 불활성화된 구제역 바이러스 백신주 이외에도, 1종 이상의 통상적으로 사용되는 약제학적 및/또는 수의학적으로 허용되는 담체, 희석제, 항생제, 면역조절제 등을 더 포함할 수 있다.

본원 명세서에서 사용된 바와 같이, "담체"라는 용어는 목적동물(숙주동물)에게 투여하는 것에 대해 제약상 허용되는 임의의 용매(용액), 분산 매질, 코팅제, 완충제, 등장성 작용제, 현탁액, 콜로이드, 안정화제, 방부제, 항생제(항균제, 항진균제 등), 흡착 지연제, 보조제(아쥬반트, Adjuvant), 삽입물 등을 의미한다. 일반적으로는 화학 화합물, 특히 면역원에 대한 1종 이상의 전달 비히클(Vehicle)의 사용은 제약 업계의 당업자에게 주지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 성분과 상용성이지 않는 한, 진단, 예방 및 치료용 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 1종 이상의 보충 활성 성분(들)이 또한 개시된 면역원성 조성물 및 백신 제제 중 1종 이상 이내로 혼입될 수 있거나 또는 이와 함께 투여될 수 있다.

상기 희석제로는 물, 식염수, 덱스트로스, 에탄올, 글라이세롤 등이 포함될 수 있고, 상기 등장성 작용제로는 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 솔비톨, 락토스 등이 포함될 수 있으며, 상기 안정화제로는 알부민이 포함될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

상기 보조제(아쥬반트)로는 광물성 겔, 예를 들어 알루미늄 하이드록사이드 겔; 표면 활성 물질, 예를 들어 라이소레시틴; 글리코사이드, 예를 들어 사포닌 유도체, 예를 들어, 퀼 A(Quil A) 또는 GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals, Inc., 알라바마주 버밍햄); 플루론 폴리올; 다가음이온(다중음이온); 비-이온성 블록 중합체, 예를 들어 플루론 F-127(B.A.S.F., 미국); 펩타이드; 광유, 예를 들어 몬타나이드(Montanide) ISA-206(셉픽(Seppic), 프랑스), 몬타나이드 ISA-50(셉픽, 프랑스), 카보폴(Cabopol), 암피겐, 암피겐 마크 II(하이드로닉스(Hydronic), 미국), 알하이드로겔, 오일 에멀젼(예컨대, 베이올F(BayolF)/아르라셀 A(Arlacel A)와 같은 광유와 물의 유화액), 또는 식물성 오일, 물 및 레시틴과 같은 유화제의 유화액; 명반(alum); 콜레스테롤; 프로인트(Freund) 완전 및 불완전 보조제; 블록 공중합체(CytRx, 죠지아주 아틀란타); SAF-M(카이론(Chiron), 캘리포니아주 에머리빌); 암피겐(AMPHIGEN, 등록상표) 보조제; 모노포스포릴 지질 A, 애브리딘(Avridine) 지질-아민 보조제; 대장균(E. coli) 유래 열-불안정성 장 독소(재조합 등); 콜레라 독소; 뮤라밀 다이펩타이드; IMS1313(셉픽(Seppic사), 프랑스); ISA206; 몬타나이드 01 겔(Montanide 01 gel)(셉픽, 프랑스); 및 이들 보조제의 혼합물이 포함되나, 이에 한정되지 아니하고, 바람직하게는 IMS1313, 카보폴 및 몬타나이드 01 겔로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 아쥬반트이다. 상기 아쥬반트는 면역반응의 향상 및/또는 접종 후 흡수 속도를 촉진하는 화합물 또는 혼합물을 칭하는 것으로 임의의 흡수-촉진제를 포함한다.

본원 명세서에서 사용된 바와 같이, "백신"이라는 용어는 척추동물, 바람직하게는 소, 돼지, 염소, 양, 사슴, 낙타, 기린 등의 포유동물과 같은 우제류(偶蹄類, Artiodactyla) 동물에 투여될 수 있는 형태의 면역원성 조성물을 포함하는 조성물 또는 제제를 지칭한다.

본 발명에 따른 백신 조성물은 목적동물(숙주동물)에 투여하기 위해 제제화된, 본원 명세서에 개시된 면역원성 조성물인 구제역 바이러스 백신주를 포함하는 조성물에 기타 면역원성 조성물들을 포함할 수 있다.

상기 구제역 바이러스 백신주를 포함하는 면역원성 조성물의 "면역원성"은 구제역 바이러스의 서로 다른 혈청형, 특히 O 혈청형의 구제역 바이러스에 대해 목적동물(숙주동물)에서 면역 반응을 유발하는 구제역 바이러스의 능력(항원으로서의 작용력)을 의미한다. 면역반응은 주로 세포독성 T-세포에 의해 매개되는 세포성 면역반응, 또는 B-세포를 활성화시켜 항체 생성을 유도하는 보조 T-세포에 의해 주로 매개되는 체액성 면역반응일 수 있다.

특히, "면역원성"이라는 용어는 목적동물(숙주동물)에서 면역반응을 유발하는 구제역 바이러스를 구성하는 핵산, 폴리펩티드 등의 물질을 지칭하는 것으로 체액성 유형(B 세포) 및/또는 세포성 유형(T 세포)의 면역반응을 유도할 수 있는 물질들이 이러한 특성을 갖는다.

상기 면역원성 조성물, 및 이를 포함하는 백신 조성물은 목적동물(숙주동물)에 도입 시 면역반응, 바람직하게는 도입된 항원(들)에 대해 특이적인 면역반응을 일으킬 수 있는데, 이와 같은 면역반응은 백신 접종된 목적동물(숙주동물)의 세포 및 조직 내에서의 특이적 항체의 생산, 사이토카인, 및/또는 세포독성 T 세포, 항원 제시 세포, 헬퍼 T 세포, 수지상 세포 및/또는 기타 세포성 반응의 활성화 여부로 검출하되, 면역학 업계의 당업자에게 공지된 통상적인 검정법을 사용하여 쉽게 검출 가능하다.

상기 백신 조성물에 포함되는 상기 불활화된 바이러스와 아쥬반트의 혼합비율은 부피 기준으로, 1~10 : 1~10, 바람직하게는 1~5 : 1~5, 가장 바람직하게는 1 : 1일 수 있다.

상기 백신 조성물에 포함되는 항생제로는 겐타마이신(Gentamicin) 및 메티올레이트(Merthiolate)가 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 백신 조성물은 사이토카인(예컨대, 인터류킨, 인터페론 등)과 같은 1종 이상의 면역조절제를 더 포함할 수 있다.

상기 백신 조성물은 목적동물(숙주동물)로서, 인간을 제외한 포유동물에서 구제역 바이러스 감염에 따른 증상을 예방, 방어, 관리 또는 치료하기 위한 백신 조성물로서 본원 명세서에 개시된 백신 접종 방법으로 사용할 수 있는 단일-용량 분취량 또는 다중-용량 분취량으로 제조될 수 있고, 백신 접종은 단일 접종 또는 다회 접종을 통해 달성될 수 있다.

상기 백신 조성물은 바람직하게는 근육내 또는 피하 경로에 의해 목적동물에게 투여하지만, 다른 투여 경로, 예를 들면, 경구 투여, 비강 투여(예컨대, 에어로졸 또는 다른 무침 투여), 경피 투여 및 비경구 투여(예컨대, 정맥주사, 복강 투여, 림프절내 투여, 피내 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 직장 투여, 질 투여 또는 근육내 투여), 또는 이들 투여 경로를 조합한 경로를 포함하는 공지된 경로를 통해 수행될 수 있다. 바람직한 투여 경로는 근육, 피하, 복강, 정맥, 경구, 진피, 안구 및 뇌로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상이고, 더욱 바람직한 투여 경로는 피하 투여 또는 근육내 투여이며, 가장 바람직한 투여 경로는 목적동물의 목 부분의 근육내 투여이다.

상기 백신 조성물은 일반적인 주사 제형으로 투여하는 경우, 투여대상동물(목적동물: 소, 돼지, 염소, 양, 사슴, 낙타, 기린 등)의 근육, 또는 이와 인접한 부위에 투여하되, 투여대상동물의 체중 및 건강 상태를 고려하여 지정된 투여 기간 동안 1회 이상 투여하는 것이 바람직하다.

상기 백신 조성물은 O, A, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 및 Asia-1의 구제역 바이러스 혈청형으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상에 대해 면역반응, 감염 예방 및/또는 구제역 바이러스 감염증의 치료 효능을 갖는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또 다른 관점에서, LFBK 부착세포, BHK-21 부착세포, 및 BHK-21 부유세포에서 연속계대배양을 통해 완전 세포 적응되어, 헤파란 설페이트 수용체(HSR) 및/또는 JMJD6 수용체, 더 정확하게는 정상적인 기능 및 활성을 갖는 HSR 및/또는 JMJD6 수용체을 인식하는, 구제역 바이러스 백신주의 제조방법에 관한 것이다.

상기 연속계대배양은 정상적인 활성을 갖는 HSR을 인식하고, 또 특정 세포에서 목표하는 바이러스 역가를 나타내는 구제역 바이러스 백신주가 획득되는 한, 순서 및/또는 횟수에 관계없이 이루어질 수 있으나, LFBK 부착세포, BHK-21 부착세포, BHK-21 부유세포 순으로 진행되는 것이 바람직하다. 상기 연속계대배양은 LFBK 부착세포에서 적어도 5회, BHK-21 부착세포에서 적어도 4회, 및 BHK-21 부유세포에서 적어도 6회 이루어지는 것이 더 바람직하다.

예를 들어, 본 발명의 구제역 바이러스 백신주의 제조방법은 하기 (a)~(e)의 단계를 포함할 수 있다:

(a) LFBK 부착세포에 야생형 구제역 바이러스, 바람직하게는 O/ME-SA/Ind-2001 유전형 구제역 바이러스, 더 바람직하게는 O/Boeun/SKR/2017 구제역 바이러스를 접종한 후 5회 이상 연속계대배양하여 세포 적응된 바이러스를 포함하는 바이러스 배양물을 얻는 단계;

(b) 상기 (a) 단계에서 얻은 세포 적응된 바이러스를 포함하는 바이러스 배양물을 BHK-21 부착세포에 접종한 후 4회 이상, 바람직하게는 4~6회 연속계대배양하여 세포 적응된 바이러스를 포함하는 바이러스 배양물을 얻는 단계;

(c) 상기 (b) 단계에서 얻은 세포 적응된 바이러스를 포함하는 바이러스 배양물을 BHK-21 부유세포에 접종한 후 6회 이상, 바람직하게는 7~9회 연속계대배양하여 세포 적응된 바이러스를 포함하는 바이러스 배양물을 얻는 단계;

(d) 상기 (c) 단계에서 얻은 세포 적응된 바이러스를 포함하는 바이러스 배양물로부터 바이러스 생산성 및 항원생산성을 평가하여 후보 백신주 바이러스를 선별 및 분리하는 단계; 및

본 발명에 따른 상기 구제역 바이러스 백신주의 제조방법의 상기 단계 (d)에서, 바이러스 생산성은 BHK-21 부착세포에서 바이러스의 역가를 측정하여 평가하고, 바이러스 항원생산성은 적절한 바이러스 역가가 나타나는 시점(예컨대, 바이러스 역가가 최고점인 시점)에 수확한 바이러스 항원(146S 불활화 구제역 바이러스 입자)의 농도를 평가하여 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 상기 구제역 바이러스 백신주의 제조방법의 상기 단계 (e)에서, 후보 백신주 바이러스의 헤파란 설페이트 수용체의 인식여부는 CHO-K1 부착세포에서 바이러스 역가를 측정함으로써 이루어질 수 있다. CHO-K1 부착세포에서 접종된 바이러스가 1x10^2.0 TCID₅₀/mL 이상, 바람직하게는 1x10^2.3 TCID₅₀/mL 이상, 더 바람직하게는 1x10^2.5 TCID₅₀/mL 이상의 바이러스 역가를 나타내는 경우, 정상적인 기능 및 활성을 갖는 헤파란 설페이트 수용체를 인식하는 것으로 판정할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 구제역 바이러스 백신주의 제조방법의 상기 단계 (e)에서, 후보 백신주 바이러스의 JMJD6 수용체의 인식여부는 CHO-677 부착세포에서 바이러스 역가를 측정함으로써 이루어질 수 있다. CHO-677 부착세포에서 접종된 바이러스가 1x10^2.0 TCID₅₀/mL 이상, 바람직하게는 1x10^2.5 TCID₅₀/mL 이상, 더 바람직하게는 1x10^2.7 TCID₅₀/mL 이상의 바이러스 역가를 나타내는 경우, 정상적인 기능 및 활성을 갖는 JMJD6 수용체를 인식하는 것으로 판정할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 구제역 바이러스 백신주의 제조방법은 상기 (e) 단계 이후에, 최종 선정된 백신주 바이러스에 대한 BHK-21 세포, CHO-K1, 및 CHO-677 중 적어도 어느 하나의 세포에서의 바이러스 역가 측정, 바이러스 유전자의 일부 또는 전체에 대한 시퀀싱(예컨대, 바이러스의 구조 단백질을 구성하는 아미노산 또는 이를 코딩하는 핵산 서열의 변화를 확인하기 위한 시퀀싱), 목적동물에서의 면역원성 확인을 위한 시험, 및 이종 바이러스에 대한 방어력을 확인하기 위한 시험으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나를 추가로 실시할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

[시험예 1] 야생형 구제역 바이러스의 교대연속세포계대배양을 통한 후보 백신주 바이러스의 제조 및 완전 세포 적응된 백신주 바이러스의 선별

(1) 야생형 구제역 바이러스의 교대연속세포계대배양을 통한 후보 백신주 바이러스의 제조

2017년에 충북 보은의 구제역 양성으로 판정된 소의 수포로부터 분리한 O 혈청형 구제역 바이러스에 속하는 O/ME-SA/Ind-2001 유전형 구제역 바이러스인 O/Boeun/SKR/2017 구제역 바이러스를 접종시킨 돼지 신장세포인 LFBK 부착세포(LFBK adherent cell; Swaney LM, Vet. Microbiol., 18:1-14, 1988, 및 LaRocco M. et al., J Clin Microbiol., 51(6):1714-20, 2013 참조)에서 일정 횟수로 계대배양(passaging, subculture)하여 증식시킨 후, 햄스터 신장세포인 BHK-21 부유세포에서의 적응(adaptation)을 위하여, 먼저 BHK-21 부착세포(BHK-21 adherent cell; 세포배양용 용기[플레이트]에 부착된 상태로 배양한 BHK-21 세포; ATCC^® CCL-10^™)에서 계대배양한 다음, BHK-21 부유세포(BHK-21 suspension cell; 세포배양용 용기[플레이트]에 부유된 상태로 배양한 BHK-21 세포; KCTC 12945BP 세포주[한국 등록특허 제10-1812223호 참조])에서 계대배양하는 교대연속계대배양을 수행하였다.

구체적으로, 아래 표 1에 나타낸 바와 같이, O/Boeun/SKR/2017 구제역 바이러스를 LFBK 부착세포에 접종한 후, 일정 횟수로 계대배양한 다음 LFBK 부착세포로부터 바이러스 배양물을 수확하였다. 이 수확한 바이러스 배양물을 사용하여 BHK-21 부착세포에 접종하고 일정 횟수로 계대배양한 다음, BHK-21 부착세포로부터 바이러스 배양물을 수확하였다. 이 수확한 바이러스 배양물을 사용하여 BHK-21 부유세포에 접종하여 일정 횟수로 계대배양하여 최종 바이러스(백신주 후보) 배양물을 수확하였다.

LFBK 부착세포, BHK-21 부착세포 및 BHK-21 부유세포 각각의 세포 당 바이러스 접종량은 0.01 MOI(Multiplicity of infection)이었고, 접종 후 약 16시간이 경과된 시점에서 바이러스 배양물을 수확하여 바이러스 역가를 BHK-21 부착세포에서 측정하였다.

LFBK 부착세포와 BHK-21 부착세포는 10%(v/v) Fetal Bovine Serum(FBS)를 포함하는 Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM)을 이용하고 5% CO₂/37℃ 조건하에서 세포를 배양하고 바이러스 접종시에는 2%(v/v) FBS를 넣은 DMEM으로 배지를 교체하고 동일한 조건하에서 계대배양하였다. BHK-21 부유세포는 dextran sulfate(Sigma-Aldrich, USA), L-glutamine(Thermo Fisher Scientific, USA), pluronic F-68 non-ionic surfactant(Thermo Fisher Scientific, USA) 및 HyClone cell boost 5 supplement(Fisher Scientific, Hampton, USA)를 포함한 ProVERO-1 무혈청 배지(Lonza, Switzerland)를 사용하여 5% CO₂/37℃/110rpm 조건하에서 세포를 부유 배양하고, 바이러스 접종 시에는 첨가물 없는 무혈청 CD-BHK-21 production media(Thermofisher, USA)로 배지를 교체하여 동일한 조건으로 계대배양하였다.

또, 교대연속계대배양 시 LFBK 부착세포, BHK-21 부착세포 및 BHK-21 부유세포의 순으로 세포 유형을 전환할 때, 수확한 바이러스 배양물을 약 3,000rpm으로 원심분리하여 얻은 상층액(supernatant)을 사용하였다. 상기 상층액은 0.45μm의 주사필터(Syringe Filter, Merck)에 배양물을 통과시켜 세포 파쇄물 등의 불순물을 제거한 상태로 준비하였다.

(2) 완전한 세포 적응성을 획득한 백신주 바이러스의 선별

세포 적응력이 우수한 후보백신주 바이러스를 선정하기 위하여, 상술한 바와 같이 LFBK 부착세포, BHK-21 부착세포 및 BHK-21 부유세포의 조합 및 계대배양 횟수를 달리하여 교대연속계대배양을 수행하였고 그에 따른 바이러스 역가를 BHK-21 부착세포 및 CHO-K1 부착세포에서 확인하였다.

구체적으로, 상기 (1)의 교대연속계대배양 후 여과과정을 거쳐 얻은 바이러스가 숙주세포, 즉 BHK-21 부유세포에 적응이 완료된 구제역 바이러스인지 확인하기 위하여, 인테그린 수용체를 가지고 있지 않은 햄스터 신장세포인 CHO-K1 세포(헤파란 설페이트 수용체 보유, 인테그린 수용체 미보유; ATCC^® CCL-61^™)에 바이러스를 0.01 MOI의 접종량으로 접종한 후, 바이러스 역가 측정을 통해 세포 적응이 완료된 바이러스인지 확인하였다. 여기서, 상기 CHO-K1 부착세포는 10%(v/v) FBS를 포함한 RPMI 1640 배지를 이용하여 5% CO₂/37℃ 조건하에서 배양한 것을 사용하였다.

표 1은 야생형 구제역 바이러스의 백신주 확립을 위해 바이러스를 서로 다른 조합의 세포로 교대연속계대배양하여 수확한 바이러스의 바이러스 역가(TCID₅₀/ml)를 BHK-21 부착세포 및 CHO-K1 부착세포에서 확인하여 나타낸 것이다(참고: Reed LJ, Muench H. A simple method of estimating fifty percent endpoint. Am J Hyg. 27:493~497, 1938). BHK-21 부착세포 계대 전 구제역 바이러스 이외의 미입 바이러스 활성 제거를 위해 Chloroform을 사용하였다.

바이러스	교대연속계대배양: 세포주(계대수)	접종 MOI (Multiplicity of infection)	BHK-21 부착세포에서의 바이러스 역가 (TCID₅₀/ml)	CHO-K1 부착세포에서 헤파란 설페이트 수용체 인식여부
O/Boeun/SKR/2017	LFBK(5), Chloroform treatment	NA[not assayed]	NA	NA
	LFBK(5), Adherent BHK-21(3)	0.01	1x10^5.95	X
	LFBK(5), Adherent BHK-21(4)	0.01	1x10^6.63	X
	LFBK(5), Adherent BHK-21(4), Suspension BHK-21(1)	0.01	1x10^6.50	X
	LFBK(5), Adherent BHK-21(4), Suspension BHK-21(2)	0.01	1x10^6.50	X
	LFBK(5), Adherent BHK-21(4), Suspension BHK-21(3)	0.01	1x10^6.50	X
	LFBK(5), Adherent BHK-21(4), Suspension BHK-21(4)	0.01	1x10^7.50	X
	LFBK(5), Adherent BHK-21(4), Suspension BHK-21(5)	0.01	1x10^6.83	X
	LFBK(5), Adherent BHK-21(4), Suspension BHK-21(6)	0.01	1x10^6.30	O^*
	LFBK(5), Adherent BHK-21(4), Suspension BHK-21(7)	0.01	1x10^6.50	O^**
	LFBK(5), Adherent BHK-21(4), Suspension BHK-21(8)	0.01	1x10^6.50	O^***

*; **; *** : CHO-K1 부착세포에서1x10^2.5O TCID₅₀/ml이었음. 상기 표 1로부터 확인되는 바와 같이, LFBK 부착세포, BHK-21 부착세포 및 BHK-21 부유세포의 조합 및 계대배양 횟수를 달리하여 교대연속계대배양을 수행하여 수확한 바이러스들 중 일부는 BHK-21 부착세포에서의 양호한 바이러스 역가를 나타낸다고 할지라도, 헤파란 설페이트 수용체를 인식하지 못하는 것으로 나타났다. 헤파란 설페이트 수용체를 인식하지 못하는 바이러스는 완전한 세포 적응성을 획득하지 못한 것이므로, 구제역 바이러스 백신주 후보에서 배제되었다.

또, 도 1에 나타낸 그래프의 CHO-K1부착세포에서의 바이러스 역가 데이터를 참조할 때, LFBK 부착세포에서 5회 계대배양 후(L5), BHK-21 부착세포에서 4회 계대배양한 다음(B4), BHK-21 부유세포에서 6회 계대배양(S6)한 바이러스(L5B4S6)부터는 헤파란 설페이트 수용체를 인식하는 것으로 나타났기 때문에, BHK-21 부착세포에서 적어도 4회, LFBK 부착세포에서 적어도 5회, 및 BHK-21 부유세포에서 적어도 6회의 교대연속계대배양을 거치면 완전한 세포 적응성을 획득하게 된다는 결론을 도출할 수 있었다(여기서, L은 LFBK 부착세포를 나타내고, B는 BHK-21 부착세포를 나타내며, S는 BHK-21 부유세포를 나타낸 것이고, 숫자는 계대수를 나타낸 것임).

[시험예 2] 선별된 백신주 바이러스의 특성 규명

LFBK 세포에서 5회, 부착 BHK-21세포에서 4회, BHK-21 부유세포에서 7회 계대하여 얻은 바이러스 배양물(L5B4S7-O 바이러스 포함)을 단일 특성의 바이러스를 얻기 위하여 BHK-21 부착세포에서 플라크 정제법(Polatnick J. et al., Appl Microbiol., 12:368-73, 1964 참조)을 이용하여 바이러스 플라크를 얻었다. 구체적으로, BHK-21 부착세포에서 플라크 정제과정을 거치고(1회 배양), 역가측정이 가능한 수준의 바이러스를 얻기 위해 BHK-21 부착세포에서 추가로 1회의 계대배양한 바이러스를 'L5B6S7-O 플라크 바이러스'라고 명명하였다.

(1) L5B6S7-O 플라크 바이러스의 세포 적응 여부 확인

상기의 플라크 정제 및 계대배양하여 수득한 바이러스(L5B6S7-O 바이러스)의 역가를 BHK-21 부착세포 및 CHO-K1 부착세포에서 접종 72시간 후에 확인하였다.

표 2는 L5B6S7-O 플라크 바이러스의 역가를 BHK-21 부착세포 및 CHO-K1 부착세포에서 측정한 결과를 나타낸 것이다.

	BHK-21 부착세포에서의 바이러스 역가 (TCID₅₀/ml)	CHO-K1 부착세포에서의 바이러스 역가 (TCID₅₀/ml)
L5B6S7-O플라크 바이러스	1x10^7.10	1x10^2.50

상기 표 2로부터 확인되는 바와 같이, L5B6S7-O 플라크 유래 바이러스는 CHO-K1 부착세포에서 양호한 바이러스 역가를 나타냈고, 그에 따라 헤파란 설페이트 수용체를 정상적으로 인식하는 것으로 판정하였다.
(2) L5B6S9-O 바이러스의 세포 적응성과 역가 확인

L5B6S7-O 플라크 바이러스를 백신 제조용 종자 바이러스화 하기 위하여 BHK-21 부유세포에서 2회 계대 배양하여 바이러스를 생산하였고, 최종적으로 'L5B6S9-O 바이러스'로 명명하였다.

상기 상층액(L5B6S9-O 바이러스)을 BHK-21 부착세포, CHO-K1 부착세포, CHO-677(pgsD-677) 부착세포에서 바이러스 역가를 세포 적응성을 획득한 백신주 바이러스의 선별을 위해 사용된 바이러스 역가 측정법으로 측정하였다. 측정 결과는 아래 표 3에 나타내었다.

	BHK-21 부착세포 에서의 바이러스 역가 (TCID₅₀/ml)	CHO-K1 부착세포에서의 바이러스 역가 (TCID₅₀/ml)	CHO-677 부착세포에서의 바이러스 역가 (TCID₅₀/ml)
L5B6S9-O 바이러스	1x10^7.00	1x10^2.50	1x10^2.50

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, L5B6S9-O 바이러스는 BHK-21 부착세포에서 1x10^7.00 TCID₅₀/ml의 높은 바이러스 역가를 나타내었고, CHO-K1 부착세포에서 1x10^2.50 TCID₅₀/ml의 바이러스 역가를 나타내었으며, CHO-677(pgsD-677) 부착세포에서 1x10^2.50 TCID₅₀/ml의 바이러스 역가를 나타내어 세포 적응이 완료된 것을 확인하였다.
(3) L5B6S9-O 바이러스의 증식성 확인

L5B6S9-O 백신주 바이러스를 100ml의 BHK-21 부유세포 배양액에 0.01 MOI로 접종하여 증식성을 확인하였다. 배양 조건은 상기의 계대배양시 부유배양과 동일하게 진행하였다. L5B6S9-O 구제역 바이러스 접종 후 8, 12, 16, 24 시간 후 배양 상층액을 수득하여 BHK-21 부착세포에서 역가측정을 실시하였다.

그 결과, 도 2 (A)에 나타낸 바와 같이, L5B6S9-O 바이러스는 접종 후 16시간이 경과된 수확 시점에서 가장 높은 바이러스 역가, 즉 평균 1x10^6.0TCID₅₀/ml를 나타내었다.

(4) L5B6S9-O 바이러스의 항원 생산성 확인

상기의 L5B6S9-O 바이러스를 100ml의 부유세포 배양액에 0.01 MOI로 접종한 뒤 특정 배양 시간 동안(즉, 접종 후 8시간, 12시간, 16시간) 바이러스 배양을 실시하였다. 배양물에 BEI(binary ethylenimine)를 넣어 최종 농도가 3mM이 되도록 한 다음, 진탕배양기(shaking incubator)에서 37℃, 24시간 동안 반응시켰다(1차 불활화 단계). 그런 다음, 1차 불활화 단계를 거친 바이러스 배양액을 새 용기로 옮겨 1차 불활화 단계와 동일한 농도로 BEI를 처리하고 26℃의 온도에서 24시간 동안 반응시켰다(2차 불활화 단계). 1차 불활화 단계 및 2차 불활화 단계를 거친 바이러스 배양액에 1M 티오황산나트륨(sodium thiosulfate)의 농도가 최종 1%(중량%)가 되도록 투입하여 BEI를 중화시켜 불활화를 완료하였다. 바이러스 농축 및 정제를 위하여 7.5% PEG 8000과 혼합하여 4℃에서 밤새 교반하고 약 10,000g의 원심력으로 약 30분 동안 원심한 뒤 Tris-NaCl[pH 7.2] 버퍼에 용해시켰다. 상기와 같이 불활화, 농축 및 정제 과정을 거쳐 얻은 항원을 15~45% 자당 구배 원심분리법(Sucrose gradient ultracentrification method)으로 4℃의 온도에서 약 110,000g의 원심력으로 약 180분 동안 원심분리한 뒤 259nm의 파장대에서 분광 광도계(Spectrophotometer)로 정량하여 항원 획득량(146S antigen의 함량)을 비교하였다. 항원 획득량은 측정된 최종 항원량을 바이러스 배양액 기준으로 계산하여 얻어내었다(바이러스 배양액 1ml 당 생산된 항원량 ㎍).

그 결과, 도 2 (B)에 나타낸 바와 같이, L5B6S9-O 바이러스는 일반적인 항원생산 기준인 배양액 1ml 기준 항원량 2㎍을 초과하는 수준(접종 12시간 후 항원량 약 4.8 ㎍/ml 생산)으로 항원(146S 불활화된 구제역 바이러스 입자) 생산성이 매우 우수한 것으로 나타났다.

(5) L5B6S9-O 바이러스 생산 항원의 입자 확인(전자현미경 관찰)

L5B6S9-O 바이러스 배양물의 상층액에 시험예 1에서 언급한 바와 같이 BEI를 첨가하여 L5B6S9-O 바이러스를 불활화시키고, PEG 8000(Polyethylene glycol 8000) 용액을 최종농도 7.5 중량%가 되도록 처리(약 4℃, 약 8시간 동안 교반)한 후, 약 10,000g, 약 30분 동안 원심분리한 다음, 농축된 바이러스 항원을 Tris-NaCl[pH 7.2] 버퍼에 용해시켜 L5B6S9-O 바이러스 유래 바이러스 항원을 수득하였다.

그 다음, 상기 L5B6S9-O 바이러스 유래 바이러스 항원을 15~45% 자당 구배 초원심분리법(Sucrose gradient ultracentrifugation method)으로 약 4℃의 온도에서 약 110,000g의 원심력으로 180분 동안 원심분리하여 정제된 바이러스 항원을 획득하고, 획득한 바이러스 항원을 투과전자현미경(TEM, Transmission Electron Microscope)을 이용하여 바이러스 항원의 입자구조를 관찰하였다.

그 결과, 아래 도 3에 나타낸 바와 같이, L5B6S9-O으로부터 생산된 불활화 항원은 온전한 형태의 146S 바이러스 항원 입자구조를 가지는 것을 관찰할 수 있었다.

L5B6S9-O 바이러스를 백신 생산을 위한 바이러스 백신주로 최종 결정하였고, 핵산 염기서열 시퀀싱을 진행한 결과 서열번호 1로 표기되는 핵산 염기서열을 갖는 것으로 확인되었다. 이 바이러스 백신주를 농림축산검역본부의 KVCC(Korea Veterinary Culture Collection, 한국수의유전자원은행[http://kvcc.kahis.go.kr])에 수탁하여 수탁번호 KVCC-VR1900044로 등재되었다.

[시험예 3] 목적동물을 대상으로 한 면역원성 평가

구제역 바이러스 백신주의 면역원성을 확인하기 위해 L5B6S9-O 바이러스로부터 생산된 불활화 항원 15㎍(1두 당)을 Montanide ISA 206(Seppic, France) 아쥬반트와 동일한 부피로 섞어 W/O/W 에멀젼(water in oil in water emulsion)의 시험백신을 제조한 다음, 시험백신 2ml을 구제역 바이러스에 대한 항체가 음성인 돼지에 접종하였다.

그다음, 2차 접종 없이 6주의 기간 동안 주 1회 시험백신을 접종한 돼지로부터 획득한 면역혈청에 포함된 항체의 중화항체가를 측정하기 위하여, 구제역 바이러스 혈청형 O, O//ME-SA/Ind-2001 유전형의 O/Boeun/SKR/2017 바이러스(바이러스 분리 후 LFBK 부착세포에 6회 계대배양)를 이용하여 LFBK 세포에서 구제역 바이러스의 중화시험을 통해 시험백신을 접종한 돼지로부터 획득한 면역혈청에 포함된 중화항체의 중화항체가를 측정하여 구제역 바이러스 항원의 면역원성을 확인하였다. 또한, PrioCHECK FMDV type O-SP ELISA(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 시험백신의 항체가를 측정하였다.

그 결과, 아래 도 4 (A)에 나타낸 바와 같이, 백신 접종 후 1주가 경과된 시점부터 모든 돼지 개체에서 45배(1.65Log10) 이상의 중화항체가가 나타나는 것을 확인하였고, 백신 접종 후 4주가 경과된 시점부터 중화항체가가 급격히 증가하여 100배 이상의 중화항체가를 나타내어 방어항체가 충분히 형성되는 것을 확인하였다.

또, 아래 도 4 (B)에 나타낸 바와 같이, O 형 SP ELISA 결과에서도 시험백신 접종 후 4주째부터 모든 돼지 개체가 항체 양성반응(PI[Percentage inhibition, 억제율] value가 50 이상)을 나타내어 시험백신의 1회 접종만으로도 충분한 항체 형성이 돼지 개체들에서 이루어지는 것을 재차 확인하였다. 도 4(A)의 점선은 OIE 육지동물 매뉴얼의 구제역 편(section)의 바이러스 중화시험(virus neutralizing test) 양성 기준값(45 배)을 나타낸 것이며 도 4(B)의 점선은 ELISA의 양성 기준값 PI value 50을 나타낸 것이다.

[시험예 4] 돼지 면역혈청의 타지역 야외형 바이러스에 대한 중화항체가 시험

시험예 3에서 획득한 면역혈청, 즉 O, 2, 4, 6주 각각의 돼지 면역혈청을 여러 가지 지역형의 구제역 바이러스에 대한 중화항체가를 측정함으로써 본 발명에 따른 L5B6S9-O 바이러스 백신주의 유효성을 평가하였다. 본 발명의 시험백신의 유효성을 검증하기 위해, 아시아에서 대표적으로 유행하는 O 혈청형의 3가지 지역형(ME-SA, SEA, Cathay)에 속하는 O1 Manisa/Turkey/69 바이러스(ME-SA; LFBK 세포에서 4회 계대배양 후 획득), O/VIT/2013 바이러스(O/ME-SA/PanAsia; ZZ-R 세포(염소 태아 혀 세포)에서 5회 계대배양한 다음, LFBK 세포에서 6회 계대배양 후 획득), O/Andong/SKR/2010 바이러스(O/SEA/Mya-98; LFBK 세포에서 4회 계대배양 후 획득)와, O/Taiwan/97 바이러스(O Cathay; LFBK 부착세포에서 4회 계대배양 후 획득)에 대한 중화 시험을 수행하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 시험예 4에서 획득한 면역혈청 중 돼지의 접종 4주부터 획득한 면역혈청은 O1 Manisa/Turkey/69 바이러스, O/VIT/2013 바이러스, O/Andong/SKR/2010 바이러스 및 O/Taiwan/97 바이러스 모두에 대해 100배 이상의 중화항체가를 나타내었다. 도 5의 점선은 시험예 3에서와 동일하게 OIE 육지동물 매뉴얼의 구제역 편(section)의 바이러스 중화시험(virus neutralizing test) 양성 기준값(45배)을 나타낸 것이다. 이 결과를 볼 때 본 발명의 백신주는 동종 또는 이종 지역형 구제역 바이러스에 대한 방어 범위가 넓어 백신주로서 효용 가치가 매우 높은것으로 확인되었다.

[시험예 5] 구제역 바이러스 백신주의 타지역 야외형 바이러스에 대한 방어 시험(실험동물: 마우스)

7주령의 C57BL6 마우스에 시험백신(본 발명의 L5B6S9-O 바이러스를 접종하여 생산된 항원 1㎍ 및 Montanide ISA 201의 혼합물인 O vaccine(1㎍) 100μl, 및 이를 4배 단계 희석한 시험백신(O vaccine(0.25㎍), O vaccine(0.064㎍), O vaccine(0.016㎍)) 100μl를 접종한 뒤 10일 후 O/ME-SA/PanAsia 유전형의 마우스에 적응된 O/VIT/2013 구제역 바이러스 200 LD₅₀를 공격접종하고 7일간 생존률(percent survival)을 관찰하였다.

그 결과, 도 6 (A)에 나타낸 바와 같이, 마우스 마리 당 1㎍ 항원을 포함하는 시험백신(O vaccine(1㎍))은 100%의 생존률을 나타내었고, 마우스 마리 당 0.016㎍ 항원을 포함한 시험백신(64배 희석; O vaccine(0.016㎍))까지도 80%의 생존률을 유지하는 것으로 나타났다.

다음으로, 7주령의 C57BL6 마우스에 시험백신인 O vaccine(1㎍)과 이를 10배 희석한 시험백신 O vaccine(0.1㎍)을 접종한 뒤 3주후 O/ME-SA/PanAsia 유전형의 마우스에 적응된 O/VIT/2013 구제역 바이러스 200 LD₅₀를 공격접종하고 7일간 생존률을 관찰하였다.

그 결과, 도 6 (B)에 나타낸 바와 같이, 항체 형성이 완전히 이루어진 백신 접종 3주 후에 공격접종(O/VIT/2013 구제역 바이러스 200 LD₅₀)한 경우에는 마우스 마리 당 1㎍과 0.1㎍의 항원을 포함하는 시험백신 모두에서 100% 생존률을 나타내는 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> REPUBLIC OF KOREA (Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Suspension Cell Culture Adapted Vaccine Strain Derived from Foot-and-mouth disease virus of O/ME-SA/Ind-2001 Lineage and the Viral Vaccine Composition Containing the Same <130> TKPA210511-KR-D1 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8193 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> O/Boeun/SKR/2017 <400> 1 ttgaaagggg gcgttagggt ttcaccctag cacaccaccg gcaactcctg cgttgcactc 60 cacacttacg cccgtgtact cgcgggaacc gatggacttt cgtccaccca cctacagctg 120 gactcatggc accgcgaggc catcttagct ggattgtgcg gatgaacacc gcttgcgcac 180 ctcgcgtgac cggttaatac tcttaccact ttccgcctac ttggtcatta gcgctgtcct 240 gggcactcct gttgggggcc gttcgacgct ccacggtctc ccccgcgtaa cggactacgg 300 tgatggggcc gcttcgtgcg ggttggtcgc ttggtctgct tcggttgttg ctcgaagccc 360 acctttcacc cccccccccc ccctaagttt tccgtcgtcc ccgacgttaa aggggtgtaa 420 ccacaagctt ggaaccgtct tgcccgacgt taatgggttg taaccacgcg cttgtaccgc 480 ctttcccggc gttatcggga tgtaaccaaa agatgaacct tcacccggaa 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Claims

하기 단계를 포함하는, 구제역 바이러스 백신주의 제조방법:
(a) LFBK 부착세포에 O 혈청형 유래 야생형 구제역 바이러스를 접종한 후 연속계대배양하여 세포 적응성이 획득된 바이러스를 포함하는 바이러스 배양물을 얻는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 얻은 세포 적응성이 획득된 바이러스를 포함하는 바이러스 배양물을 BHK-21 부착세포에 접종한 후 연속계대배양하여 세포 적응성이 획득된 바이러스를 포함하는 바이러스 배양물을 얻는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 얻은 세포 적응성이 획득된 바이러스를 포함하는 바이러스 배양물을 BHK-21 부유세포에 접종한 후 연속계대배양하여 세포 적응성이 획득된 바이러스를 포함하는 바이러스 배양물을 얻는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 얻은 세포 적응성이 획득된 바이러스를 포함하는 바이러스 배양물로부터 바이러스 생산성 및 항원생산성 중 적어도 하나를 평가하여 후보 백신주 바이러스를 선별 및 분리하는 단계; 및
(e) 상기 선별 및 분리된 후보 백신주 바이러스에 대해 헤파란 설페이트 수용체 및 JMJD6 수용체 중 적어도 하나의 인식여부를 확인하여 최종 백신주 바이러스를 선정하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 상기 야생형 구제역 바이러스는 O/ME-SA/Ind-2001 유전형 구제역 바이러스인, 구제역 바이러스 백신주의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (d)에서 상기 바이러스 생산성 및 항원생산성 중 적어도 하나를 평가하기에 앞서 플라크 정제 단계를 거치는, 구제역 바이러스 백신주의 제조방법.
제3항에 있어서, 상기 플라크 정제가 BHK-21 부착세포를 이용하여 수행되는, 구제역 바이러스 백신주의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (e)에서, 상기 후보 백신주 바이러스의 헤파란 설페이트 수용체의 인식여부는 CHO-K1 세포에서 바이러스 역가를 측정함으로써 결정되고, 후보 백신주 바이러스의 JMJD6 수용체 인식여부는 CHO-677 세포에서 바이러스 역가를 측정함으로써 결정되는, 구제역 바이러스 백신주의 제조방법.
제5항에 있어서, 상기 CHO-K1 세포에서 측정된 바이러스 역가가 1x10^2.0 TCID₅₀/mL 이상이면 헤파란 설페이트 수용체를 인식하는 것으로 결정하고,
상기 CHO-677 세포에서 측정된 바이러스 역가가 1x10^2.0 TCID₅₀/mL 이상이면 JMJD6 수용체를 인식하는 것으로 결정하는, 구제역 바이러스 백신주의 제조방법.