JP2023545524A - 組換えｈｖｔ及びその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、少なくとも２つの異なる抗原をコードする組換えヌクレオチド配列を含む、組換えヘルペスウイルスに関する。本発明は、鳥類病原体（複数可）に対して鳥類種を免疫化するためのワクチンを生成するのに特に好適である。【選択図】なし
Description
本発明は、異なる抗原をコードする組換えトリヘルペスウイルス、及びその使用に関する。本発明は、鳥類病原体（複数可）に対して鳥類種を免疫化するためのワクチンを生成するのに好適である。
家禽の肉及び卵は重要な食物源であり、その消費は、ヒト集団の成長、及びそれらの大きな品質－価格比に起因して絶えず増加する。家禽の健康並びに食品の安全性及び保障を確保するために、家禽ワクチン技術が世界的な関心事になっている。
病原体タンパク質を発現するウイルスベクターは、標的病原体に対する家禽ワクチンとして一般的に使用されている。そのようなウイルスベクターを含むワクチンは、感染宿主内で外来性病原体タンパク質の発現を誘導し、これは、防御免疫をもたらし得る。
多くの異なるクラスのウイルスが、アデノウイルス、ＡＡＶ、鶏痘ウイルス、ヘルペスウイルスなどの、鳥類のワクチン接種のための候補ベクターとして調査されている。
３種類のヘルペスウイルス、ＭＤＶ１、ＭＤＶ２、及びＭＤＶ３（また、シチメンチョウのヘルペスウイルス（herpes virus of turkey：ＨＶＴ）としても知られている）が決定されている。当該ウイルス間には高い類似性が存在し（Ｋｉｎｇｈａｍら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００１年）第８２巻第１１２３～１１３５頁を参照）、これらは全て、鳥類、特にニワトリなどの家禽においてワクチンとして使用するために、病原体に由来する外来遺伝子が組み込まれた組換えウイルスを調製するために使用されてきた。
そのようなワクチン調製物は、多くの疾患に対して鳥類種にワクチン接種するための効率的な結果を提供するが、異なる抗原を各々コードする２つ以上の組換えヘルペスウイルスを鳥類に注射する場合、病原体間の競合及び免疫抑制が起こり得る。
そのような干渉を克服し、また複数の疾患に対するワクチン接種を容易にするために、いくつかの抗原をコードする多価ヘルペスウイルスを生成するための様々な試みがなされている。
最初の研究では、ヘルペスウイルスのゲノムにおける単一のクローニング部位にいくつかの遺伝子を挿入した（例えば、欧州特許第ＥＰ１０２６２４６号を参照のこと）。しかしながら、そのような構築物は、必要なレベルの防御免疫を提供しなかったか、又は不安定であることが判明したかのいずれかであり、外来遺伝子の全部又は一部は、培養細胞における反復継代中に欠失している。
国際公開第２０１３／１４４３５５号及び同第２０２０／１２７９６４号は、ウイルスゲノムの非コード領域に位置するクローニング部位の組合せを用いて得られた複数の外来抗原をコードする安定なヘルペスウイルスについて報告している。
国際公開第２０１３／０５７２３６号、同第２０１３／０８２３２７号、及び同第２０１３／０８２３１７号は、ヘルペスウイルスのＵＳ２コード配列内の少なくとも１つの遺伝子をクローニングすることによる、多価ＨＶＴの設計における別のアプローチについて報告している。
病原体及び種の数を考慮すると、インビボで複数の遺伝子を安定に発現することができ、かつ鳥類、特に家禽のワクチン接種に好適である、更なる組換え多価ヘルペスウイルスが当技術分野で必要とされている。
本発明は、ウイルスゲノムの少なくとも２つの別々の位置において少なくとも２つの組換えヌクレオチド配列を含む、組換えトリヘルペスウイルスを提供する。
より具体的には、本発明は、（ｉ）ウイルスゲノムの第１の挿入部位へと挿入された、ニューカッスル病ウイルスのＦタンパク質、又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ウイルスゲノムの第２の挿入部位へと挿入された、サブタイプＨ９トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（Hemagglutinin：ＨＡ）タンパク質、又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列と、を含む、シチメンチョウの組換えヘルペスウイルス（Herpes Virus of Turkeys：ＨＶＴ）であって、第１の挿入部位及び第２の挿入部位が、ＵＬ４５とＵＬ４６との間の非コード領域から、及びＳＯＲＦ３とＵＳ２との間の非コード領域から選択されるウイルスゲノムの異なる非コード領域に位置する、シチメンチョウの組換えヘルペスウイルス（ＨＶＴ）を提供する。
本発明はまた、上記で定義された組換えＨＶＴのゲノムを含む核酸、及びそのような核酸を含有するベクター（プラスミドなど）に関する。
本発明はまた、新規な抗原、及びそれをコードする核酸分子に関する。
本発明は更に、組換えＨＶＴ又は上記で定義した核酸若しくはベクターを含有する細胞に関する。
本発明の更なる目的は、上記で定義した組換えＨＶＴ、及び好適な賦形剤又は希釈剤を含む組成物である。
本発明の更なる目的は、上記で定義した核酸又は細胞、及び好適な賦形剤又は希釈剤を含む組成物である。
本発明の別の目的は、上記で定義した組換えＨＶＴ、核酸、及び／又は細胞の有効な免疫量を含むワクチンにある。
本発明の更なる目的は、ニューカッスル病ウイルス（Newcastle Disease Virus：ＮＤＶ）及びトリインフルエンザウイルス（Avian Influenza Virus：ＡＩＶ）、並びに／又は関連疾患に対して、家禽などの鳥類を免疫化するために使用するための、上記で定義した組換えＨＶＴ、核酸、又は細胞にある。
本発明の更なる目的は、ＮＤＶ及びＡＩＶによって引き起こされる疾患に対して、家禽などの鳥類を保護するために使用するための、上記で定義した組換えＨＶＴ、核酸、又は細胞にある。
本発明の更なる目的は、ＮＤＶ及びＡＩＶに対して、家禽などの鳥類にワクチン接種するために使用するための、上記で定義されるワクチンにある。
本発明の更なる目的は、上記で定義される組成物又はワクチン若しくはウイルスを鳥類に投与することを含む、鳥類にワクチン接種する方法にある。
本発明の更なる目的は、上記で定義した組成物又はワクチン若しくはウイルスを鳥類に投与することを含む、鳥類において抗原に対する免疫応答を誘導する方法にある。
本発明はまた、以下の成分を含む鳥類を免疫化するためのワクチン接種キットを提供する：
ａ．上記で定義したような、有効量の組成物又はワクチン、及び
ｂ．当該組成物又はワクチンを当該鳥類に投与するための手段。
ａ．上記で定義したような、有効量の組成物又はワクチン、及び
ｂ．当該組成物又はワクチンを当該鳥類に投与するための手段。
本発明は、ＮＤＶ及び／若しくはＡＩＶ、並びに／又は関連する障害若しくは状態に対するワクチン接種のために、任意の鳥類において使用され得る。本発明は、ニワトリなどの家禽にワクチン接種するのに特に好適である。
本発明は、一般に、複数の組換えヌクレオチド配列を含有する組換えトリヘルペスウイルス、それらの製造、それらを含む組成物、及びそれらの使用に関する。本発明はまた、ＡＩＶに対する強力な免疫応答を産生するのに好適な新規抗原を提供する。
定義
本開示は、以下の定義を参照することによって最もよく理解されるであろう：
ヘルペスウイルスに関連して、「組換え」という用語は、ヘルペスウイルスのゲノムにおいては天然に見られないか、又は当該ゲノムにおいては天然に見られるが異なる形態若しくは異なる位置にはある、少なくとも１つのヌクレオチド配列（例えば、遺伝子などのＤＮＡ）の挿入によってゲノムが改変されている、ヘルペスウイルスを指す。組換えヘルペスウイルスは、そこに記載されている組換えＤＮＡ技術などの様々な方法によって製造することができ、一旦製造されると、組換えＤＮＡ技術を更に使用せずに複製することができることが理解されよう。
本開示は、以下の定義を参照することによって最もよく理解されるであろう：
ヘルペスウイルスに関連して、「組換え」という用語は、ヘルペスウイルスのゲノムにおいては天然に見られないか、又は当該ゲノムにおいては天然に見られるが異なる形態若しくは異なる位置にはある、少なくとも１つのヌクレオチド配列（例えば、遺伝子などのＤＮＡ）の挿入によってゲノムが改変されている、ヘルペスウイルスを指す。組換えヘルペスウイルスは、そこに記載されている組換えＤＮＡ技術などの様々な方法によって製造することができ、一旦製造されると、組換えＤＮＡ技術を更に使用せずに複製することができることが理解されよう。
本明細書では、「核酸」、「核酸配列」、及び「ヌクレオチド配列」という用語は、互換的に使用され、かつデオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドであり得る決定された配列を有する核酸分子を指す。ヌクレオチド配列は、例えば、組換え、酵素的、及び／又は化学的技術によって最初に調製され、その後、宿主細胞又はインビトロ系で複製され得る。ヌクレオチド配列は、分子（例えば、ペプチド又はタンパク質）をコードするオープン・リーディング・フレームを優先的に含む。ヌクレオチド配列は、例えば、プロモータ、転写ターミネータ、シグナルペプチド、ＩＲＥＳなどの追加の配列を含有し得る。
本明細書では、「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、互換的に使用され、かつ少なくとも２個の連続するアミノ酸のポリマーを含む任意の分子を指す。
「非コード領域」という用語は、当技術分野で周知であり、かつタンパク質をコードしないウイルスゲノムの任意の領域を指す。ＵＬ４５（ＨＶＴ０５３）とＵＬ４６（ＨＶＴ０５４）との間の非コード領域は、典型的には、ＵＬ４５の終止コドンのすぐ３’で始まり、かつＵＬ４６の終止コドンのすぐ５’で終わる領域を示す（両方のＯＲＦが反対の向きにあるため）。ＳＯＲＦ３（ＨＶＴ０８７）とＵＳ２（ＨＶＴ０８８）との間の非コード領域は、典型的には、ＳＯＲＦ３の開始コドンのすぐ３’で始まり、かつＵＳ２の終止コドンのすぐ５’で終わる領域を示す。
抗原の「免疫原性フラグメント」は、免疫応答を誘発することができる任意のフラグメント、好ましくはエピトープを含有する任意のフラグメント、好ましくは抗原特異的エピトープを示す。免疫原性フラグメントは、一般に、５～４０、又は１０～４０、又は１０～３０、１０～２５、若しくは１０～２０などの抗原の５～５０個の連続アミノ酸残基を含有する。天然Ｆタンパク質のフラグメントの例には、配列番号１の１０～４０の連続するアミノ酸の任意のフラグメントが含まれる。
本明細書で使用される場合、「バリアント」という用語は、その免疫原性特性を保持する参照抗原又はフラグメントの改変形態を指す。一般に、バリアントは全体的に類似しており、多くの領域において、参照抗原又はフラグメントと同一である。例としては、バリアントは、参照抗原又はフラグメントと比較して、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を呈し得る。バリアントは、特に、参照配列と比較して、１、２、３、４、又は５個の改変アミノ酸残基を有する抗原を示す。改変としては、アミノ酸欠失（複数可）、置換（複数可）、及び／又は付加（複数可）が挙げられる。バリアントは、参照配列又は病原体に対する免疫応答を誘導する能力など、参照配列の免疫原性特性を保持するものとする。天然Ｆタンパク質のバリアントの例としては、１、２、又は３個のアミノ酸置換を有する配列番号１を含むか、又はそれからなる、任意のタンパク質が挙げられる。フラグメントのバリアントの例としては、１、２、又は３個のアミノ酸置換を有する配列番号１の１０～４０個の連続アミノ酸からなるタンパク質が挙げられる。
「鳥類種」という用語は、鳥類のクラスの鳥、すなわち、羽毛を持つ、翼を持つ、二足歩行の、吸熱の、及び産卵する脊椎動物などのあらゆる種類の鳥類を包含することを意図している。本発明の文脈において、鳥類又は鳥類種は、より具体的には、経済的及び／又は農学的利益を有する鳥、例えば家禽（ニワトリ及びシチメンチョウなど）、水鳥の家禽（アヒル及びガチョウなど）、及び観賞用鳥類（ハクチョウ及びオウムなど）を指す。
本明細書で使用される「ワクチン」という用語は、生物において免疫応答を引き起こす、刺激する、又は増幅するために使用され得る薬剤を示す。
組換えＨＶＴ
本発明は、特定の位置に複数の外来遺伝子を含有する組換えＨＶＴに関する。より具体的には、本発明は、
（ｉ）ウイルスゲノムの第１の挿入部位へと挿入された、ニューカッスル病ウイルスのＦタンパク質、又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードする、ヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）ウイルスゲノムの第２の挿入部位へと挿入された、サブタイプＨ９トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質、又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードする、ヌクレオチド配列と、
を含む、組換えＨＶＴ（ｒＨＶＴ）に関し、
第１の挿入部位及び第２の挿入部位は、ＵＬ４５とＵＬ４６との間の非コード領域、及びＳＯＲＦ３とＵＳ２との間の非コード領域から選択される、ウイルスゲノムの異なる非コード領域に位置する。
本発明は、特定の位置に複数の外来遺伝子を含有する組換えＨＶＴに関する。より具体的には、本発明は、
（ｉ）ウイルスゲノムの第１の挿入部位へと挿入された、ニューカッスル病ウイルスのＦタンパク質、又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードする、ヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）ウイルスゲノムの第２の挿入部位へと挿入された、サブタイプＨ９トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質、又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードする、ヌクレオチド配列と、
を含む、組換えＨＶＴ（ｒＨＶＴ）に関し、
第１の挿入部位及び第２の挿入部位は、ＵＬ４５とＵＬ４６との間の非コード領域、及びＳＯＲＦ３とＵＳ２との間の非コード領域から選択される、ウイルスゲノムの異なる非コード領域に位置する。
特定の実施形態では、本発明は、
（ｉ）ＵＬ４５とＵＬ４６との間に位置するウイルスゲノムの非コード領域へと挿入された、ニューカッスル病ウイルスのＦタンパク質、又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードする、ヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）ＳＯＲＦ３とＵＳ２との間に位置するウイルスゲノムの非コード領域へと挿入された、サブタイプＨ９トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質、又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードする、ヌクレオチド配列と、
を含む、ｒＨＶＴに関する。
（ｉ）ＵＬ４５とＵＬ４６との間に位置するウイルスゲノムの非コード領域へと挿入された、ニューカッスル病ウイルスのＦタンパク質、又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードする、ヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）ＳＯＲＦ３とＵＳ２との間に位置するウイルスゲノムの非コード領域へと挿入された、サブタイプＨ９トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質、又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードする、ヌクレオチド配列と、
を含む、ｒＨＶＴに関する。
更なる特定の実施形態では、本発明は、
（ｉ）ＳＯＲＦ３とＵＳ２との間に位置するウイルスゲノムの非コード領域へと挿入された、ニューカッスル病ウイルスのＦタンパク質、又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードする、ヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）ＵＬ４５とＵＬ４６との間に位置するウイルスゲノムの非コード領域へと挿入された、サブタイプＨ９トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質、又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードする、ヌクレオチド配列と、
を含む、ｒＨＶＴに関する。
（ｉ）ＳＯＲＦ３とＵＳ２との間に位置するウイルスゲノムの非コード領域へと挿入された、ニューカッスル病ウイルスのＦタンパク質、又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードする、ヌクレオチド配列と、
（ｉｉ）ＵＬ４５とＵＬ４６との間に位置するウイルスゲノムの非コード領域へと挿入された、サブタイプＨ９トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質、又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードする、ヌクレオチド配列と、
を含む、ｒＨＶＴに関する。
実施例に示されるように、そのような構築物は、ＣＥＦ細胞において、少なくとも１０回、好ましくは少なくとも１５回、より好ましくは少なくとも２０回の継代にわたって遺伝的に安定である。そのような構築物はまた、ＣＥＦ細胞において、少なくとも１０回、好ましくは少なくとも１５回、より好ましくは少なくとも２０回の継代にわたって抗原の安定な共発現を提供する。これらは、高い防御免疫を獲得するのに充分な、インビボでの遺伝子の強力かつ持続的な発現を付与することができる。
より詳細には、本発明者らは、特許請求されたｒＨＶＴが、ＮＤＶ Ｆ抗原及びＡＩＶ ＨＡ－Ｈ９抗原の両方を正確に発現することを実証した（図２～図６）。本発明者らはまた、特許請求されたｒＨＶＴが、ＮＤＶ Ｆ及びＡＩＶ ＨＡ－Ｈ９（図７、図８、図１１、及び図１２）に対する抗体を高いＨＩ力価で効率的に誘導することを実証した。本出願のデータは更に、本発明の二価構築物をワクチン接種したＳＰＦニワトリが、チャレンジ後にニューカッスル病（Newcastle Disease：ＮＤ）及びＡＩＶから非常に効率的に（例えば、最大１００％）保護されること、及び全てのワクチン接種グループが対照グループと比較してＡＩＶウイルス負荷が低いことを示す。
したがって、特許請求されたｒＨＶＴは、ＮＤＶ及びＡＩＶによるチャレンジに対する極めて効率的な臨床的保護を付与する。したがって、本発明は、極めて関連性の高い病原体及び関連障害から鳥類を保護するために使用することができる、新規の有効な構築物を提供する。
本発明の組換えＨＶＴは、任意のＨＶＴ、好ましくは非病原性ＨＶＴから調製することができる。本発明での使用に好適なＨＶＴの非病原性株（ＭＤＶ３）の例は、ＦＣ１２６株である。ＦＣ１２６株のゲノム配列は当技術分野で利用可能である（Ａｆｏｎｓｏら、上述；Ｋｉｎｇｈａｍら、上述）。別の好適なＨＶＴ株は、例としては、ＰＢ１株である。任意の他の非病原性株もまた好適である。
ウイルスゲノム中の標的非コード領域の位置は、本出願の教示、一般知識、及び文献で利用可能な配列情報を用いて、当業者によって容易に特定することができる。例としては、Ｋｉｎｇｈａｍら（上述）は、ＦＣ１２６参照株のヌクレオチド配列と、当該ゲノム内のほとんどのＯＲＦの位置とについて報告している。
ＦＣ１２６完全ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ２９１８６６．１）を参照すると、ＵＬ４５とＵＬ４６との間の非コード領域は、ＨＶＴゲノムのヌクレオチド９５３２３～９５４４３に対応し、ＳＯＲＦ３とＵＳ２との間の非コード領域は、ＨＶＴゲノムのヌクレオチド１３９８６７～１４００６４に対応する。当該領域内の任意の位置でのクローニングが本発明に好適である。
ＮＤＶ Ｆタンパク質
示されるように、特許請求されたｒＨＶＴは、ＮＤＶのＦタンパク質、又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードする、組換えヌクレオチド配列を含有する。
示されるように、特許請求されたｒＨＶＴは、ＮＤＶのＦタンパク質、又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードする、組換えヌクレオチド配列を含有する。
ＮＤＶ Ｆタンパク質は、ニューカッスル病ウイルス（また、トリパラミクソウイルス１型ウイルスとも称される）のＦタンパク質であって、細胞へのウイルス侵入中に細胞膜の透過を媒介するクラスＩウイルス膜融合（Ｆ）糖タンパク質である。ＮＤＶ Ｆは、ＮＤＶの公知の抗原である。天然ＮＤＶ Ｆタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、ＡＡＵ８９２７９号、ＡＢＡ３９２３２号、及びＡＡＡ４６６４３号などの番号の下で、並びにその任意の天然バリアント（多型、スプライシングバリアントなど）で、周知でありかつ公開されている。例示的な配列は、配列番号１（タンパク質）及び配列番号１４（核酸）として提供される。
特許請求されたｒＨＶＴによってコードされるタンパク質は、抗ＮＤＶ免疫応答を誘導することができる、任意の天然ＮＤＶ Ｆタンパク質、又はその任意の免疫原性フラグメント若しくはバリアントであり得る。
天然Ｆタンパク質のフラグメントの例には、配列番号１の１０～４０の連続するアミノ酸の任意のフラグメントが含まれる。天然Ｆタンパク質のバリアントの例としては、１、２、又は３個のアミノ酸置換を有する配列番号１を含むか、又はそれからなる、任意のタンパク質が挙げられる。フラグメントのバリアントの例としては、１、２、又は３個のアミノ酸置換を有する配列番号１の１０～４０個の連続アミノ酸からなるタンパク質が挙げられる。
ＡＩＶ ＨＡタンパク質
示されるように、特許請求されたｒＨＶＴは、サブタイプＨ９トリインフルエンザウイルスの表面タンパク質ヘマグルチニン（ＨＡ）、又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードする、組換えヌクレオチド配列を含有する。
示されるように、特許請求されたｒＨＶＴは、サブタイプＨ９トリインフルエンザウイルスの表面タンパク質ヘマグルチニン（ＨＡ）、又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードする、組換えヌクレオチド配列を含有する。
インフルエンザウイルスＡは、ＨＡ表面タンパク質の血清学的反応に基づいてサブタイプに分類される。ＨＡの血清学的サブタイピングをヘマグルチニン阻害試験によって行う。ＨＡの１６のサブタイプであるＨＡ１～ＨＡ１６がＡＩＶについて認識されている（Ｄａｖｉｄ Ｅ．Ｓｗａｙｎｅ、Ｄａｖｉｄ Ｌ．Ｓｕａｒｅｚ、及びＬｅｓｌｉｅ Ｄ．Ｓｉｍｅｓ。（２０１３年）。Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ．Ｄａｖｉｄ Ｅ．Ｓｗａｙｎｅ（編）中。Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ Ｐｏｕｌｔｒｙ、第１３版（第１８１～２１８頁））。任意のＡＩＶは、上記の技術及び常識に従って、任意のそのようなサブタイプに容易に分類することができる。サブタイプＨ９は、Ｈ９Ｎ２と称される特定のサブクラスを更に含む。サブタイプＨ９ ＡＩＶ株の例としては、Ａ／シチメンチョウ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１／１９６６（Ｈ９Ｎ２）、Ａ／ウズラ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／Ｇ１／１９９７（Ｈ９Ｎ２）、及びＡ／アヒル／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／Ｙ４３９／１９９７（Ｈ９Ｎ２）が挙げられる。好ましくは、ＨＡタンパク質は、Ｈ９Ｎ２サブタイプＡＩＶに由来する。
ＨＡタンパク質は、サブタイプＨ９ ＡＩＶ、好ましくはＨ９Ｎ２サブタイプＡＩＶの任意の天然ＨＡタンパク質であり得る。
あるいは、特許請求された構築物は、抗ＡＩＶ免疫応答を誘導することができるＨ９サブタイプＡＩＶ、好ましくはＨ９Ｎ２サブタイプＡＩＶの表面タンパク質ヘマグルチニン（ＨＡ）の免疫原性フラグメント又はバリアント（上記で定義）をコードし得る。これに関して、実験部分に詳述されているように、本発明者らは、強力な免疫原性及び交差反応性を有する、最適化されたＨ９ ＨＡ抗原を設計及び合成した。そのような抗原は、Ｈ９－ＣＳ（配列番号２）、Ｈ９－ＣＮｎ１（配列番号３）、Ｈ９－ＣＮｎ２（配列番号４）、Ｈ９－ＣＮｎ３（配列番号５）、Ｈ９－ＣＮｎ４（配列番号６）、及びＨ９－ＣＮｎ５（配列番号７）として開示されている。当該配列及び抗原は、本発明の特定の目的、並びにそれを含有する任意のベクター及びその使用を表す。
これに関して、本発明は、配列番号２～７から選択されるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなるポリペプチド、及びその全長にわたって配列番号２～７のいずれか１つと少なくとも９７％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも９８％、更により好ましくは少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する任意のポリペプチドに関する。アミノ酸配列同一性は、任意の公知の技術又は例えばＢＬＡＳＴなどのコンピュータプログラムを用いて決定され得る。
本発明の具体的な目的は、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、配列番号２のアミノ酸配列から本質的になるか、又は配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
本発明の別の具体的な目的は、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、配列番号３のアミノ酸配列から本質的になるか、又は配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
本発明の別の具体的な目的は、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、配列番号４のアミノ酸配列から本質的になるか、又は配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
本発明の別の具体的な目的は、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、配列番号５のアミノ酸配列から本質的になるか、又は配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
本発明の別の具体的な目的は、配列番号６のアミノ酸配列を含むか、配列番号６のアミノ酸配列から本質的になるか、又は配列番号６のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
本発明の別の具体的な目的は、配列番号７のアミノ酸配列を含むか、配列番号７のアミノ酸配列から本質的になるか、又は配列番号７のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
本発明の別の具体的な目的は、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、配列番号３のアミノ酸配列から本質的になるか、又は配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
本発明の別の具体的な目的は、配列番号４のアミノ酸配列を含むか、配列番号４のアミノ酸配列から本質的になるか、又は配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
本発明の別の具体的な目的は、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、配列番号５のアミノ酸配列から本質的になるか、又は配列番号５のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
本発明の別の具体的な目的は、配列番号６のアミノ酸配列を含むか、配列番号６のアミノ酸配列から本質的になるか、又は配列番号６のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
本発明の別の具体的な目的は、配列番号７のアミノ酸配列を含むか、配列番号７のアミノ酸配列から本質的になるか、又は配列番号７のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
本発明はまた、構造部分（ポリペプチドであり得る）にコンジュゲートした上記のポリペプチドを含むキメラ分子に関する。
本発明はまた、上記で定義したポリペプチドをコードする核酸、並びにそのような核酸を含有する任意のベクター又は細胞に関する。本発明の好ましい核酸分子は、配列番号８～１３のいずれか１つから選択される配列を含むか、配列番号８～１３のいずれか１つから選択される配列から本質的になるか、又は配列番号８～１３のいずれか１つから選択される配列からなる。核酸は、調節配列（プロモータ及び／又はターミネータなど）にコンジュゲートされ得る、及び／又は任意のクローニング若しくは発現ベクター（例えば、プラスミド、ウイルス、ＢＡＣなど）に含まれ得る。
他の組換え配列
本発明にかかる組換えＨＶＴは、例えば、１つ以上の抗原、サイトカイン、ホルモン、共刺激因子、アジュバントなどをコードする、１つ以上の追加の配列を更に含み得る。
本発明にかかる組換えＨＶＴは、例えば、１つ以上の抗原、サイトカイン、ホルモン、共刺激因子、アジュバントなどをコードする、１つ以上の追加の配列を更に含み得る。
ゲノムに挿入される組換えヌクレオチド配列は任意の配向であり得る。
プロモータ
挿入された核酸配列は、プロモータ及び／又はターミネータなどの調節配列を含有し得る（又は、それに作動可能に連結され得る）。使用されるプロモータは、合成プロモータ又は天然プロモータ、内因性プロモータ、又は異種性プロモータのいずれかであり得る。標的細胞又は宿主において有効に機能することができる限り、原則として任意のプロモータを使用することができる。これに関して、プロモータは、多価ベクターに関連して鳥類細胞における遺伝子転写を指令することができる、真核生物、原核生物、ウイルス、又は合成プロモータであり得る。また、挿入された各核酸配列は、互いに同じであっても異なっていてもよいプロモータを含有し得る。特定の実施形態では、各挿入された核酸配列は、異なるプロモータを含有する。
挿入された核酸配列は、プロモータ及び／又はターミネータなどの調節配列を含有し得る（又は、それに作動可能に連結され得る）。使用されるプロモータは、合成プロモータ又は天然プロモータ、内因性プロモータ、又は異種性プロモータのいずれかであり得る。標的細胞又は宿主において有効に機能することができる限り、原則として任意のプロモータを使用することができる。これに関して、プロモータは、多価ベクターに関連して鳥類細胞における遺伝子転写を指令することができる、真核生物、原核生物、ウイルス、又は合成プロモータであり得る。また、挿入された各核酸配列は、互いに同じであっても異なっていてもよいプロモータを含有し得る。特定の実施形態では、各挿入された核酸配列は、異なるプロモータを含有する。
優先的には、各挿入された核酸配列に使用されるプロモータは、Ｐｅｃプロモータ、サイトメガロウイルス（Cytomegalovirus：ＣＭＶ）最初期１（ｉｅ１）プロモータ、特にマウスサイトメガロウイルス（Murine Cytomegalovirus：Ｍｃｍｖ）ｉｅ１プロモータ若しくはヒトサイトメガロウイルス（Human Cytomegalovirus：Ｈｃｍｖ）プロモータ、ニワトリベータ－アクチン（beta-actin：Ｂａｃ）プロモータ、シミアンウイルス４０（Simian virus 40：ＳＶ４０）プロモータ、及びラウス肉腫ウイルス（Rous Sarcoma virus：ＲＳＶ）プロモータ、又はプロモータ活性を保持するそれらの任意のフラグメントから選択される。
優先的には、ＮＤＶ Ｆコード配列及びＡＩＶ ＨＡコード配列は、異なるプロモータの制御下にある。
好ましい実施形態では、本発明のｒＨＶＴ中の１つのコード配列は、Ｐｅｃプロモータに連結されている。
別の好ましい実施形態では、本発明のｒＨＶＴ中の１つのコード配列は、ＣＭＶ ｉｅ１プロモータ、特にマウスサイトメガロウイルス（Ｍｃｍｖ）ｉｅ１プロモータ、又はヒトサイトメガロウイルス（Ｈｃｍｖ）プロモータに連結されている。
Ｐｅｃプロモータの核酸配列を配列番号１５に示し、Ｍｃｍｖ ｉｅ１プロモータの配列を配列番号１６に示す。機能的プロモータをコードするそのような配列のバリアントは公知であり、及び／又は本発明で使用するために当業者によって設計／試験され得ることに留意すべきである。
好ましい実施形態では、ＵＬ４５とＵＬ４６との間に位置する非コード領域へと挿入された組換えヌクレオチド配列は、Ｐｅｃプロモータを含有し、ＳＯＲＦ３とＵＳ２との間に位置する非コード領域へと挿入された組換えヌクレオチド配列は、ＣＭＶ ＩＥ１プロモータ、特にＭｃｍｖ ｉｅ１プロモータを含有する。本発明者らによって得られた結果は、そのようなプロモータが、本発明の多価ベクターの状況において、当該クローニング部位に配置された場合に特に効率的であることを示す。
別の好ましい実施形態では、ＵＬ４５とＵＬ４６との間に位置する非コード領域へと挿入された外来遺伝子は、ＣＭＶ ＩＥ１プロモータ、特にＭｃｍｖ ｉｅ１プロモータを含有し、ＳＯＲＦ３とＵＳ２との間に位置する非コード領域へと挿入された組換えヌクレオチド配列は、Ｐｅｃプロモータを含有する。本発明者らによって得られた結果は、そのようなプロモータがまた、本発明の多価ベクターの状況において、当該クローニング部位に配置された場合に特に効率的であることを示す。
好ましくは、本発明の組換えＨＶＴは、（ｉ）Ｐｅｃプロモータの制御下においてＵＬ４５とＵＬ４６との間の非コード領域へと挿入された、ニューカッスル病ウイルスのＦタンパク質又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ＣＭＶ ＩＥ１プロモータ、好ましくはＭｃｍｖ ｉｅ１プロモータの制御下においてＳＯＲＦ３とＵＳ２との間の非コード領域へと挿入された、サブタイプＨ９トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列と、を含む。
別の好ましい実施形態では、本発明の組換えＨＶＴは、（ｉ）ＣＭＶ ＩＥ１プロモータ、好ましくはＭｃｍｖ ｉｅ１プロモータの制御下においてＵＬ４５とＵＬ４６との間の非コード領域へと挿入された、サブタイプＨ９トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）Ｐｅｃプロモータの制御下においてＳＯＲＦ３とＵＳ２との間の非コード領域へと挿入された、ニューカッスル病ウイルスのＦタンパク質又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列と、を含む。
別の実施形態では、本発明にかかる組換えＨＶＴは、（ｉ）Ｐｅｃプロモータの制御下においてＵＬ４５とＵＬ４６との間の非コード領域へと挿入された、ニューカッスル病ウイルスのＦタンパク質又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ＣＭＶ ＩＥ１プロモータ、好ましくはＨｃｍｖプロモータの制御下においてＳＯＲＦ３とＵＳ２との間の非コード領域へと挿入された、サブタイプＨ９トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列と、を含む。
構築方法
本発明の組換えＨＶＴは、例えば、組換え技術、相同組換え、部位特異的挿入、突然変異誘発などの、当技術分野でそれ自体公知の技術を用いて調製することができる。
本発明の組換えＨＶＴは、例えば、組換え技術、相同組換え、部位特異的挿入、突然変異誘発などの、当技術分野でそれ自体公知の技術を用いて調製することができる。
遺伝子クローニング及びプラスミド構築は当業者に周知であり、標準的な分子生物学技術によって本質的に実行され得る（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｗｏｏｄｂｕｒｙ、Ｎ．Ｙ．（２０１２年））。
ヘルペスウイルスは、任意の好適な宿主細胞及び培地中で増殖させることができる。ヘルペスウイルスの宿主及び増殖条件としては、例としては、例えばＣＥＦ（ニワトリ胚線維芽細胞）、ニワトリ腎臓細胞などのニワトリ由来の細胞が挙げられる。そのような細胞は、イーグルＭＥＭ、Ｌｅｉｂｏｗｉｔｚ－Ｌ－１５／ＭｃＣｏｙ ５Ａ（１：１混合物）培養培地などの培養培地中において、約３７℃で３～４日間培養され得る。
ゲノムＤＮＡは、任意の従来の方法に従ってウイルス感染細胞から抽出され得る。特に、溶解緩衝液中でタンパク質を変性させて除去した後、フェノール及びエタノールでＤＮＡを抽出してもよい。
典型的には、組換えウイルスは、ウイルスゲノムと、組換えヌクレオチド配列又は挿入される核酸を含み、組換えを可能にする挿入部位からのヌクレオチドが隣接する構築物（例えば、プラスミド）との間の相同組換えによって調製され得る。手短に言えば、標的領域を含有する配列を、最初に、プラスミド又は他の好適なベクターへとクローニングする。プラスミドの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２７、ｐＢＲ３２８、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ７、ｐＵＣ８、及びｐＵＣ９が挙げられ、ファージの例としてはラムダファージ及びＭ１３ファージが挙げられ、コスミドの例としてはｐＨＣ７９が挙げられる。クローニング領域は、好ましくは、外来遺伝子の挿入の際に、外来遺伝子に隣接する配列がウイルスゲノムとのインビトロ相同組換えを可能にするのに適切な長さであるように、充分な長さでなければならない。好ましくは、各隣接配列は、少なくともおよそ５０ヌクレオチド長を有するものとする。
１つ以上の組換えヌクレオチド配列を標的領域へと挿入するために、領域の特定の部位で突然変異を実行して、制限酵素の切断部位を作製することができる。突然変異を実施する方法は従来の方法であればよく、インビトロでの突然変異誘発及びＰＣＲなどの、当業者が通常使用する方法を用いることができる。そこで、ＰＣＲ法では、ＰＣＲプライマにおいて１～２ヌクレオチドの欠失、置換、付加などの突然変異を行い、次いで、そのプライマを用いて突然変異を作製する。あるいは、天然に存在する制限部位を使用してもよい。次いで、外来遺伝子（及びプロモータ）をプラスミド中のウイルスゲノムの挿入部位へと挿入する。
得られたプラスミドを、任意の好適な技術（例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム、リポフェクチンベースの方法など）を用いて、ＨＶＴ感染細胞又はＨＶＴゲノムトランスフェクト細胞へと導入することができる。導入されるプラスミドの量が０．１μｇ～１０００μｇの範囲内である場合、ＨＶＴゲノムの相同領域とプラスミドとの間の組換えによる組換えウイルスの産生効率が細胞内において高くなる。これは、プラスミドとウイルスゲノムとの間の組換え事象をもたらすことで、組換えヌクレオチド配列のウイルスへの挿入を引き起こす。
得られた組換えウイルスは、例えば、ハイブリダイゼーション、組換え核酸配列と同時統合された遺伝子によってコードされる酵素活性の検出、又は免疫学的な組換えヘルペスウイルスによって発現される抗原ペプチドの検出による選択の既知の技術を用いて、遺伝子型的又は表現型的に選択され得る。選択された組換えヘルペスウイルスは、細胞培養において大規模に培養することができる。作製されると、ウイルスは好適な細胞内で増殖され得る。
好ましい実施形態
以下の組換えＨＶＴは、本発明の好ましい特定の実施形態である。実施例に示すように、これらは、各組換えヌクレオチド配列によってコードされる抗原に対するインビボでの強い免疫応答を可能にする。
以下の組換えＨＶＴは、本発明の好ましい特定の実施形態である。実施例に示すように、これらは、各組換えヌクレオチド配列によってコードされる抗原に対するインビボでの強い免疫応答を可能にする。
本発明の特に好ましい組換えＨＶＴ（ｒＨＶＴ）は、（ｉ）Ｐｅｃプロモータの制御下においてＵＬ４５とＵＬ４６との間の非コード領域へと挿入された、ニューカッスル病ウイルスのＦタンパク質又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）Ｍｃｍｖ ｉｅ１プロモータの制御下においてＳＯＲＦ３とＵＳ２との間の非コード領域へと挿入された、サブタイプＨ９トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列と、を含む。好ましくは、そのような組換えｒＨＶＴは、実験データに記載されているように、以下の二価構築物から選択される：
・ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＳ（ＦＷ２０５）、
・ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮ（ＦＷ２０６）、
・ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ１（ＦＷ２４７）、
・ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ２（ＦＷ２４８）、
・ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ３（ＦＷ２４９）、
・ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ４（ＦＷ２５０）、及び
・ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ５（ＦＷ２５１）。
・ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＳ（ＦＷ２０５）、
・ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮ（ＦＷ２０６）、
・ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ１（ＦＷ２４７）、
・ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ２（ＦＷ２４８）、
・ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ３（ＦＷ２４９）、
・ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ４（ＦＷ２５０）、及び
・ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ５（ＦＷ２５１）。
好ましい実施形態では、本発明にかかるｒＨＶＴは、配列番号２～７のいずれか１つから選択される配列を含むか、配列番号２～７のいずれか１つから選択される配列から本質的になるか、又は配列番号２～７のいずれか１つから選択される配列からなる、ＨＡ抗原をコードする。
好ましい実施形態では、本発明にかかるｒＨＶＴは、配列番号１又はその天然に存在するバリアントを含むか、又は配列番号１又はその天然に存在するバリアントから本質的になるか、又は配列番号１又はその天然に存在するバリアントからなる、Ｆ抗原をコードする。
好ましい実施形態では、本発明にかかるｒＨＶＴは、配列番号１４を含むか、又は配列番号１４から本質的になるか、又は配列番号１４からなる、Ｆ抗原をコードする核酸を含有する。
好ましい実施形態では、本発明にかかるｒＨＶＴは、配列番号８のトリインフルエンザウイルスＨ９サブタイプ（Ｈ９－ＣＳ）のヘマグルチニン遺伝子のコンセンサス配列を含む、ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＳ（ＦＷ２０５）である。
別の好ましい実施形態では、本発明にかかるｒＨＶＴは、配列番号１１のトリインフルエンザウイルスＨ９サブタイプ（Ｈ９－ＣＮｎ３）の人工的に設計されたヘマグルチニン遺伝子を含む、ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ３（ＦＷ２４９）である。
他の好ましい実施形態では、本発明にかかるｒＨＶＴは、以下の二価構築物から選択される：
・配列番号９のトリインフルエンザウイルスＨ９サブタイプ（Ｈ９－Ｃｎｎ１）の人工的に設計されたヘマグルチニン遺伝子を含む、ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ１（ＦＷ２４７）、
・配列番号１０のトリインフルエンザウイルスＨ９サブタイプ（Ｈ９－ＣＮｎ２）の人工的に設計されたヘマグルチニン遺伝子を含む、ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ２（ＦＷ２４８）、
・配列番号１２のトリインフルエンザウイルスＨ９サブタイプ（Ｈ９－ＣＮｎ４）の人工的に設計されたヘマグルチニン遺伝子を含む、ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ４（ＦＷ２５０）、
・配列番号１３のトリインフルエンザウイルスＨ９サブタイプ（Ｈ９－ＣＮｎ５）の人工的に設計されたヘマグルチニン遺伝子を含む、ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ５（ＦＷ２５１）。
・配列番号９のトリインフルエンザウイルスＨ９サブタイプ（Ｈ９－Ｃｎｎ１）の人工的に設計されたヘマグルチニン遺伝子を含む、ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ１（ＦＷ２４７）、
・配列番号１０のトリインフルエンザウイルスＨ９サブタイプ（Ｈ９－ＣＮｎ２）の人工的に設計されたヘマグルチニン遺伝子を含む、ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ２（ＦＷ２４８）、
・配列番号１２のトリインフルエンザウイルスＨ９サブタイプ（Ｈ９－ＣＮｎ４）の人工的に設計されたヘマグルチニン遺伝子を含む、ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ４（ＦＷ２５０）、
・配列番号１３のトリインフルエンザウイルスＨ９サブタイプ（Ｈ９－ＣＮｎ５）の人工的に設計されたヘマグルチニン遺伝子を含む、ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ５（ＦＷ２５１）。
本発明の別の好ましい組換えｒＨＶＴは、（ｉ）Ｍｃｍｖ ｉｅ１プロモータの制御下においてＵＬ４５とＵＬ４６との間の非コード領域へと挿入された、サブタイプＨ９トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）Ｐｅｃプロモータの制御下においてＳＯＲＦ３とＵＳ２との間の非コード領域へと挿入された、ニューカッスル病ウイルスのＦタンパク質又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列と、を含む。好ましくは、そのようなｒＨＶＴは、実験データに記載されているように、以下の二価構築物から選択される：
・ＨＶＴ／４５－４６ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＳ／８７－８８ ＰｅｃＦ（ＦＷ２０８）、及び
・ＨＶＴ／４５－４６ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮ／８７－８８ ＰｅｃＦ（ＦＷ２０９）。
・ＨＶＴ／４５－４６ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＳ／８７－８８ ＰｅｃＦ（ＦＷ２０８）、及び
・ＨＶＴ／４５－４６ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮ／８７－８８ ＰｅｃＦ（ＦＷ２０９）。
別の実施形態では、本発明にかかるｒＨＶＴは、（ｉ）Ｐｅｃプロモータの制御下においてＵＬ４５とＵＬ４６との間の非コード領域へと挿入された、ニューカッスル病ウイルスのＦタンパク質又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）Ｈｃｍｖプロモータの制御下においてＳＯＲＦ３とＵＳ２との間の非コード領域へと挿入された、サブタイプＨ９トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列と、を含む。好ましくは、そのようなｒＨＶＴは、実験データに記載されるような、二価構築物ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｈｃｍｖ Ｈ９－ＣＮｎ１（ＦＷ２５２）である。
本発明の特に好ましいｒＨＶＴは、ＦＣ１２６又はＰＢ１株を用いて調製される。
本発明の組換えＨＶＴは細胞培養物中で増殖させることができる。好ましい実施形態では、ＣＥＦ、発育鶏卵、ニワトリ腎臓細胞などが、組換えＨＶＴの増殖のための宿主細胞として使用される。本発明の多価組換えＨＶＴは、イーグルＭＥＭ、Ｌｅｉｂｏｗｉｔｚ－Ｌ－１５／ＭｃＣｏｙ ５Ａ（１：１混合物）培地などの培地中において、約３７℃で３～４日間培養することができる。次いで、得られた感染細胞を、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する培地中に懸濁し、液体窒素下において凍結保存する。
有利には、本発明の組換えＨＶＴは、高レベルの安定性を示す。これらは遺伝的に安定であり、これは、鳥類種の細胞、好ましくはＣＥＦ細胞において、１０回以上の継代後、好ましくは１５回の継代後、より好ましくは２０回の継代後でさえ、挿入された遺伝子を維持することを意味する。これらはまた抗原の安定な発現を提供し、これは、１０回以上の継代、好ましくは１５回の継代、更により好ましくは２０回の継代の後でさえ、抗原を鳥類種の細胞、好ましくはＣＥＦ細胞において共発現することを意味する。本発明の文脈において、「継代」又は「細胞継代」は、細胞の増殖を可能にし、かつ９０％～１００％コンフルエントになるまでそれらを生存させるのに好適な条件における、細胞の培養を意味する。継代工程は、以前のコンフルエント培養の少数の細胞を新しい培養培地へと移すことからなる。少数の細胞を含有する以前のコンフルエント培養のアリコートを、大量の新鮮な培地で希釈することができる。
ウイルスは従来の技術を用いて収集又は精製することができる。これらは、任意の好適な培地に保存され、凍結、及び／又は凍結乾燥され得る。
核酸及び細胞
本発明の更なる目的は、上記で定義したウイルスに含有される任意の核酸に関する。核酸は、一本鎖若しくは二本鎖、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はそれらのバリアントであり得る。
本発明の更なる目的は、上記で定義したウイルスに含有される任意の核酸に関する。核酸は、一本鎖若しくは二本鎖、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はそれらのバリアントであり得る。
本発明はまた、本発明の核酸を含むベクター（例えば、プラスミド、コスミド、人工染色体など）に関する。
本発明はまた、本発明の組換えＨＶＴ、核酸、又はベクターを含有する細胞に関する。細胞は、典型的には、鳥類細胞などの真核生物細胞、又は原核生物細胞（ベクターがそのような細胞型における複製又は維持に好適である場合）である。
ワクチン組成物
本発明はまた、本発明の多価組換えＨＶＴ、本発明の核酸、又は本発明の細胞を含む、ワクチンなどの組成物に関する。
本発明はまた、本発明の多価組換えＨＶＴ、本発明の核酸、又は本発明の細胞を含む、ワクチンなどの組成物に関する。
本発明のワクチンは、典型的には、薬学的に許容されるビヒクル中に、免疫学的有効量である上記の組換えＨＶＴを含む。
本発明にかかる組成物及びワクチンは、典型的には、例えば水性緩衝液又はリン酸緩衝液などの好適な溶媒又は希釈剤又は賦形剤を含む。組成物はまた、免疫応答を増強するのに充分な量でワクチンと共に投与される、添加物、例えば、動物（例えば、ホルモン、サイトカイン、共刺激因子）に由来するタンパク質又はペプチド、ウイルス及び他の供給源（例えば、二本鎖ＲＮＡ、ＣｐＧ）に由来する核酸などを含み得る。加えて、前述の物質の任意の数の組合せが免疫賦活化効果を提供してもよく、したがって、本発明の免疫賦活薬を形成し得る。
本発明のワクチンは、等張性、生理学的ｐＨ、及び安定性を維持するための１つ以上の更なる添加物、例えば、生理食塩水（０．８５％）、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、クエン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン（ＴＲＩＳ）、トリス緩衝食塩水などの緩衝液、又は抗生物質、例えばネオマイシン又はストレプトマイシンなどと共に更に製剤化され得る。
投与経路は、経口、眼（例えば、点眼）、エアロゾルを用いる眼鼻投与、鼻腔内、飼料中、水中、又はスプレーによる総排泄腔（Cloacal）、胚内、局所、又は注射（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、眼窩内、眼内、皮内、及び／又は腹腔内）によるワクチン接種を含む、任意の経路であり得る。当業者は、投与経路の各タイプに対してワクチン組成物の製剤を容易に適合させるであろう。
各ワクチン用量は、鳥類種において防御免疫応答を誘発するのに充分な好適な用量を含有し得る。そのような用量の最適化は当技術分野で周知である。用量当たりの抗原の量は、抗原／抗体反応を用いる公知の方法、例えばＥＬＩＳＡ法によって決定することができる。
本発明のワクチンは、ワクチン接種プロトコルに応じて、単回用量又は反復用量として投与することができる。
本発明のワクチンは、３週間のワクチン接種後に、標的鳥類病原体に対する最大１００％の防御を鳥種に付与するという点で更に有利である。
本発明は更に、家禽などの鳥類種を病原体に対して免疫化するための上記のワクチンの使用に関する。
本発明は更に、本発明にかかるワクチンの免疫学的有効量を投与することによって鳥類種を免疫化する方法に関する。ワクチンは、好都合には、皮内、皮下、筋肉内、経口、胚内、粘膜投与、又は眼鼻投与によって投与され得る。
本発明は更に、有効量である上記の多価ワクチン、及び当該成分を当該種に投与するための手段を含む、鳥類種を免疫化するためのワクチン接種キットに関する。例えば、そのようなキットは、本発明にかかる多価ワクチンが充填された注射装置、及び皮内、皮下、筋肉内、又は胚内注射のための説明書を備える。あるいは、キットは、本発明にかかる多価ワクチンが充填されたスプレー／エアロゾル又は点眼装置、及び眼鼻投与、経口、又は粘膜投与のための説明書を備える。
本出願の更なる態様及び利点は、ここで、本発明を例示する以下の実施例に開示される。
以下の実施例では、組換えＨＶＴ（ｒＨＶＴ）を調製し、使用した。これらは以下の命名法に従って指定される：
－ ＨＶＴ／挿入部位、プロモータ、挿入抗原（一価構築物）；
－ ＨＶＴ／第１の挿入部位、第１のプロモータ、第１の挿入抗原／第２の挿入部位、第２のプロモータ、第２の挿入抗原（二価構築物）。
－ ＨＶＴ／挿入部位、プロモータ、挿入抗原（一価構築物）；
－ ＨＶＴ／第１の挿入部位、第１のプロモータ、第１の挿入抗原／第２の挿入部位、第２のプロモータ、第２の挿入抗原（二価構築物）。
実施例で調製及び使用されたｒＨＶＴのリスト：
ＦＷ１６８：ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ（一価）
ＦＷ２０２：ＨＶＴ／４５－４６ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮ（一価）
ＦＷ２０４：ＨＶＴ／４５－４６ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＳ（一価）
ＦＷ２０５：ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＳ（二価）
ＦＷ２０６：ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮ（二価）
ＦＷ２０８：ＨＶＴ／４５－４６ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＳ／８７－８８ ＰｅｃＦ（二価）
ＦＷ２０９：ＨＶＴ／４５－４６ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮ／８７－８８ ＰｅｃＦ（二価）
ＦＷ２４７：ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ１（二価）
ＦＷ２４８：ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ２（二価）
ＦＷ２４９：ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ３（二価）
ＦＷ２５０：ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ４（二価）
ＦＷ２５１：ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ５（二価）
ＦＷ２５２：ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｈｃｍｖ Ｈ９－ＣＮｎ１（二価）
ＦＷ１６８：ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ（一価）
ＦＷ２０２：ＨＶＴ／４５－４６ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮ（一価）
ＦＷ２０４：ＨＶＴ／４５－４６ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＳ（一価）
ＦＷ２０５：ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＳ（二価）
ＦＷ２０６：ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮ（二価）
ＦＷ２０８：ＨＶＴ／４５－４６ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＳ／８７－８８ ＰｅｃＦ（二価）
ＦＷ２０９：ＨＶＴ／４５－４６ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮ／８７－８８ ＰｅｃＦ（二価）
ＦＷ２４７：ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ１（二価）
ＦＷ２４８：ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ２（二価）
ＦＷ２４９：ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ３（二価）
ＦＷ２５０：ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ４（二価）
ＦＷ２５１：ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ５（二価）
ＦＷ２５２：ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｈｃｍｖ Ｈ９－ＣＮｎ１（二価）
実施例１：トリインフルエンザウイルスＨ９サブタイプのヘマグルチニン遺伝子のコンセンサス配列の設計及び合成
Ｈ９－ＣＳと呼ばれるコンセンサス配列の設計及び合成
トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）Ｈ９サブタイプのヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子のコンセンサス配列を系統発生分析に基づいて設計し、Ｈ９Ｎ２ ＡＩＶ単離株間の保護の幅を最大化するために以下のように合成した。
Ｈ９－ＣＳと呼ばれるコンセンサス配列の設計及び合成
トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）Ｈ９サブタイプのヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子のコンセンサス配列を系統発生分析に基づいて設計し、Ｈ９Ｎ２ ＡＩＶ単離株間の保護の幅を最大化するために以下のように合成した。
最初に、最近のＨ９Ｎ２株からの８０を超えるＨＡ遺伝子配列を公開データベースから収集した。次いで、系統樹を構築し、樹の中心（center of tree：ＣＯＴ）配列及び最も近い共通祖先（most recent common ancestor：ＭＲＣＡ）配列を特定した。ＣＯＴ分析及びＭＲＣＡ分析は、ワクチン免疫原性に対する抗原多様性の負の影響を最小限に抑えるために開発された計算方法である（Ｋｅｓｔｕｒｕ他、２００６年）。本発明者らはまた、代表的な配列の選択を確実にするために、特に予測される抗原性領域及びＮ－グリコシル化部位における配列のアラインメントを詳しく調べた。これらの分析により、本発明者らは、様々なＨ９株へと広い交差反応性を提供する、Ｈ９－ＣＳと呼ばれる１つの配列の設計に至った。
Ｈ９－ＣＳ遺伝子配列を人工的に合成した。Ｈ９－ＣＳのアミノ及び核酸配列は、それぞれ、配列番号２及び配列番号８として提供される。
配列Ｈ９－ＣＮｎ１～Ｈ９－ＣＮｎ５の設計及び合成
Ｈ９Ｎ２ ＡＩＶ単離株間の保護の幅を最大にするために、５つのＡＩＶ Ｈ９サブタイプ抗原を以下のように設計及び合成した。抗原は、本明細書ではＨ９－ＣＮと呼ばれるＡＩＶ Ｈ９サブタイプ由来の既知のＨＡ遺伝子配列に基づいてより詳細に設計された。（Ａ／ニワトリ／Ｈｅｎａｎ／Ｈ２４／２０１１；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＮ８０４２９７）。
Ｈ９Ｎ２ ＡＩＶ単離株間の保護の幅を最大にするために、５つのＡＩＶ Ｈ９サブタイプ抗原を以下のように設計及び合成した。抗原は、本明細書ではＨ９－ＣＮと呼ばれるＡＩＶ Ｈ９サブタイプ由来の既知のＨＡ遺伝子配列に基づいてより詳細に設計された。（Ａ／ニワトリ／Ｈｅｎａｎ／Ｈ２４／２０１１；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＮ８０４２９７）。
２０１６年の７つの中国株単離株を含む、Ｈ９株のいくつかの配列を収集した。計算タンパク質モデリング分析をそれらのＨ９配列に基づいて実施し、本発明者らは、Ｈ９－ＣＮｎ１－４（配列番号４）、Ｈ９－ＣＮｎ２（配列番号５）、Ｈ９－ＣＮｎ３（配列番号６）、Ｈ９－ＣＮｎ４（配列番号７）と呼ばれる４つの抗原の選択にたどり着いた。Ｈ９－ＣＮｎ５は、分子安定性及び交差反応性を更に高めるために、Ｈ９－ＣＮｎ１の膜貫通ドメイン（Transmembrane domain：ＴＭ）をＡＩＶのＨ３サブタイプの膜貫通ドメインで置き換えることによって設計した。
Ｈ９－ＣＮｎ１－５のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３～７として提供される。
Ｈ９－ＣＮｎ１－５をコードする核酸配列は、それぞれ、配列番号９～１３として提供される。
Ｈ９－ＣＮｎ１－５をコードする核酸配列は、それぞれ、配列番号９～１３として提供される。
実施例２：組換えＨＶＴの構築
２．１．相同ベクターの構築
プラスミド構築は、本質的に、標準的な分子生物学技術によって実行される（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ、２０１２年）。
２．１．相同ベクターの構築
プラスミド構築は、本質的に、標準的な分子生物学技術によって実行される（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ、２０１２年）。
ｐ４５／４６Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＳ及びｐ４５／４６Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮの構築
マウスサイトメガロウイルス（Ｍｃｍｖ）ｉｅ１プロモータ（配列番号１６）をｐＵＣ１８ベースのベクター中で合成し、これによりｐＧＩ Ｍｃｍｖ ｉｅ１を得た。
マウスサイトメガロウイルス（Ｍｃｍｖ）ｉｅ１プロモータ（配列番号１６）をｐＵＣ１８ベースのベクター中で合成し、これによりｐＧＩ Ｍｃｍｖ ｉｅ１を得た。
ポリＡシグナル（ＳＰＡ：配列番号１７）もまた合成し、ＳａｌＩ及びＳｆｉＩで切断されたｐＧＩ Ｍｃｍｖ ｉｅ１へと挿入し、これによりｐＧＩ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ ＳＰＡを得た。Ｍｃｍｖ ｉｅ１プロモータ－ＳＰＡカセットを、ＢｇｌＩ消化によってｐＧＩ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ ＳＰＡから切り出し、ｐ４５／４６ＳｆｉのＳｆｉＩ部位へと挿入し（国際公開第０３／０６４５９５号）、これによりｐ４５／４６ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ ＳＰＡを得た。
実施例１で合成したコンセンサス配列Ｈ９－ＣＳ（配列番号８）を使用した。実施例１で参照した、遺伝子配列Ｈ９－ＣＮ（Ａ／ニワトリ／Ｈｅｎａｎ／Ｈ２４／２０１１；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＮ８０４２９７）を合成して、使用した。これらのＨＡ配列をＸｂａＩ及びＳａｌＩで消化し、次いでＸｂａＩ及びＳａｌＩ切断ｐ４５／４６ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ ＳＰＡへと挿入し、これにより、それぞれｐ４５／４６ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＳ ＳＰＡ及びｐ４５／４６ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮ ＳＰＡを得た。
ｐＨＶＴ８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＳ及びｐＨＶＴ８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮの構築
Ｍｃｍｖ ｉｅ１プロモータ－ＳＰＡカセットを、ＢｇｌＩ消化によってｐＧＩ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ ＳＰＡから切り出し、ｐＨＶＴ８７－８８（国際公開第２０１３／１４４３５５号）のＳｆｉＩ部位へと挿入し、これによりｐＨＶＴ８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ ＳＰＡを得た。次いで、ＸｂａＩ及びＳａｌＩで消化したＨ９－ＣＳ遺伝子又はＨ９－ＣＮ遺伝子を、ＸｂａＩ及びＳａｌＩ切断ｐＨＶＴ８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ ＳＰＡへと挿入し、これにより、それぞれｐＨＶＴ８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＳ ＳＰＡ及びｐＨＶＴ８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮ ＳＰＡを得た。
Ｍｃｍｖ ｉｅ１プロモータ－ＳＰＡカセットを、ＢｇｌＩ消化によってｐＧＩ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ ＳＰＡから切り出し、ｐＨＶＴ８７－８８（国際公開第２０１３／１４４３５５号）のＳｆｉＩ部位へと挿入し、これによりｐＨＶＴ８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ ＳＰＡを得た。次いで、ＸｂａＩ及びＳａｌＩで消化したＨ９－ＣＳ遺伝子又はＨ９－ＣＮ遺伝子を、ＸｂａＩ及びＳａｌＩ切断ｐＨＶＴ８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ ＳＰＡへと挿入し、これにより、それぞれｐＨＶＴ８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＳ ＳＰＡ及びｐＨＶＴ８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮ ＳＰＡを得た。
ｐＨＶＴ８７－８８ ＰｅｃＦの構築
Ｐｅｃプロモータ－ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）Ｆ遺伝子－ＳＶ４０ポリＡカセットを、ＢｇｌＩ消化によってｐ４５／４６ＰｅｃＦ（国際公開第０３／０６４５９５号）から取り出し、ＳｆｉＩ消化ｐＨＶＴ８７－８８へとクローニングし、これによりｐＨＶＴ８７－８８ ＰｅｃＦを得た。使用されるＮＤＶ Ｆ遺伝子は配列番号１４を含む。
Ｐｅｃプロモータ－ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）Ｆ遺伝子－ＳＶ４０ポリＡカセットを、ＢｇｌＩ消化によってｐ４５／４６ＰｅｃＦ（国際公開第０３／０６４５９５号）から取り出し、ＳｆｉＩ消化ｐＨＶＴ８７－８８へとクローニングし、これによりｐＨＶＴ８７－８８ ＰｅｃＦを得た。使用されるＮＤＶ Ｆ遺伝子は配列番号１４を含む。
ｐＨＶＴ８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ１～ＣＮｎ５の構築
実施例１で合成したＨ９－ＣＮｎ１（配列番号９）、Ｈ９－ＣＮｎ２（配列番号１０）、Ｈ９－ＣＮｎ３（配列番号１１）、Ｈ９－ＣＮｎ４（配列番号１２）、及びＨ９－ＣＮｎ５（配列番号１３）遺伝子を使用した。これらの遺伝子を、ＸｂａＩ及びＳａｌＩ切断ｐＨＶＴ８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ ＳＰＡにクローニングし、これにより、ｐＨＶＴ８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ１ ＳＰＡ、ｐＨＶＴ８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ２ ＳＰＡ、ｐＨＶＴ８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ３ ＳＰＡ、ｐＨＶＴ８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ４ ＳＰＡ、及びｐＨＶＴ８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ５ ＳＰＡが得られた。
実施例１で合成したＨ９－ＣＮｎ１（配列番号９）、Ｈ９－ＣＮｎ２（配列番号１０）、Ｈ９－ＣＮｎ３（配列番号１１）、Ｈ９－ＣＮｎ４（配列番号１２）、及びＨ９－ＣＮｎ５（配列番号１３）遺伝子を使用した。これらの遺伝子を、ＸｂａＩ及びＳａｌＩ切断ｐＨＶＴ８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ ＳＰＡにクローニングし、これにより、ｐＨＶＴ８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ１ ＳＰＡ、ｐＨＶＴ８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ２ ＳＰＡ、ｐＨＶＴ８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ３ ＳＰＡ、ｐＨＶＴ８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ４ ＳＰＡ、及びｐＨＶＴ８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ５ ＳＰＡが得られた。
ｐＨＶＴ８７－８８ｃｍｖ Ｈ９－ＣＮｎ１の構築
ヒトサイトメガロウイルス（Ｈｃｍｖ）プロモータを、ＢｇｌＩ及びＸｂａＩ消化によってｐＧＩＣＭＶｐＡ（国際公開第２００８／１２１３２９号）から取り出し、ＢｇｌＩ及びＸｂａＩ切断ｐＨＶＴ８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ１ ＳＰＡへと挿入し、これにより、ｐＨＶＴ８７－８８ Ｈｃｍｖ Ｈ９－ＣＮｎ１ ＳＰＡを得た。
ヒトサイトメガロウイルス（Ｈｃｍｖ）プロモータを、ＢｇｌＩ及びＸｂａＩ消化によってｐＧＩＣＭＶｐＡ（国際公開第２００８／１２１３２９号）から取り出し、ＢｇｌＩ及びＸｂａＩ切断ｐＨＶＴ８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮｎ１ ＳＰＡへと挿入し、これにより、ｐＨＶＴ８７－８８ Ｈｃｍｖ Ｈ９－ＣＮｎ１ ＳＰＡを得た。
２．２ 組換えＨＶＴの構築
組換えＨＶＴ（ｒＨＶＴ）の構築は培養細胞における相同組換えによって行った。ＨＶＴ ＤＮＡは、Ｍｏｒｇａｎら（Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、第３４巻：第３４５～３５１頁、１９９０年）によって記載されているように、親ＨＶＴに感染したニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）から調製した。およそ２μｇのＨＶＴ ＤＮＡ及び１μｇの相同ベクターの１つを、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いたエレクトロポレーションによって、およそ１０７個のＣＥＦ細胞へとトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、ライボビッツＬ－１５（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、カタログ番号４１３００－３９）、マッコイ５Ａ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、カタログ番号２１５００－０６１）（１：１）、及び４％ウシ胎仔血清（ＬＭ（＋）培地）へと加え、９６ウェル組織培養プレートにプレーティングし、ＨＶＴプラークが見えるようになるまで、３７℃で４～５％ＣＯ２中にて５～７日間インキュベートした。次いで、細胞を、トリプシン処理によってプレートから剥離し、ＣＥＦを有する２つの９６ウェルプレートへと等しく移し、プラークが観察されるまで３～５日間インキュベートした。スクリーニングは、抗原タンパク質、ＮＤＶ Ｆタンパク質、又はＡＩＶ ＨＡタンパク質を発現するプラークのみを染色する黒色プラークアッセイによって行った。簡単に説明すると、２つのプレートのうち１つをメタノール：アセトン混合物（１：２）で固定し、ウサギ抗ＮＤＶ Ｆタンパク質血清又はニワトリ抗ＨＡ（Ｈ９）血清とインキュベートした。次いで、プレートを、ビオチン化抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＢＡ－１０００）又はビオチン化抗ニワトリＩｇＹ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＢＡ－９０１０）とインキュベートし、最後にＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ ＡＢＣ－ＡＰキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＡＫ－５０００）とインキュベートした。抗原を発現するプラークを、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１６８１４５１）の添加によって染色した。染色された組換えプラークを含有するウェルを特定し、他の９６ウェルプレート上の対応するウェル中の細胞をトリプシン処理した。次いで、細胞を新鮮な二次ＣＥＦ細胞で希釈し、新しい９６ウェルプレートに移して、最初の精製を完了した。全てのプラークが黒色プラークアッセイで陽性に染色されるまで、精製手順を繰り返した。複数のクローンを各構築物について単離した。
組換えＨＶＴ（ｒＨＶＴ）の構築は培養細胞における相同組換えによって行った。ＨＶＴ ＤＮＡは、Ｍｏｒｇａｎら（Ａｖｉａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、第３４巻：第３４５～３５１頁、１９９０年）によって記載されているように、親ＨＶＴに感染したニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）から調製した。およそ２μｇのＨＶＴ ＤＮＡ及び１μｇの相同ベクターの１つを、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いたエレクトロポレーションによって、およそ１０７個のＣＥＦ細胞へとトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、ライボビッツＬ－１５（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、カタログ番号４１３００－３９）、マッコイ５Ａ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．、カタログ番号２１５００－０６１）（１：１）、及び４％ウシ胎仔血清（ＬＭ（＋）培地）へと加え、９６ウェル組織培養プレートにプレーティングし、ＨＶＴプラークが見えるようになるまで、３７℃で４～５％ＣＯ２中にて５～７日間インキュベートした。次いで、細胞を、トリプシン処理によってプレートから剥離し、ＣＥＦを有する２つの９６ウェルプレートへと等しく移し、プラークが観察されるまで３～５日間インキュベートした。スクリーニングは、抗原タンパク質、ＮＤＶ Ｆタンパク質、又はＡＩＶ ＨＡタンパク質を発現するプラークのみを染色する黒色プラークアッセイによって行った。簡単に説明すると、２つのプレートのうち１つをメタノール：アセトン混合物（１：２）で固定し、ウサギ抗ＮＤＶ Ｆタンパク質血清又はニワトリ抗ＨＡ（Ｈ９）血清とインキュベートした。次いで、プレートを、ビオチン化抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＢＡ－１０００）又はビオチン化抗ニワトリＩｇＹ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＢＡ－９０１０）とインキュベートし、最後にＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ ＡＢＣ－ＡＰキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＡＫ－５０００）とインキュベートした。抗原を発現するプラークを、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１６８１４５１）の添加によって染色した。染色された組換えプラークを含有するウェルを特定し、他の９６ウェルプレート上の対応するウェル中の細胞をトリプシン処理した。次いで、細胞を新鮮な二次ＣＥＦ細胞で希釈し、新しい９６ウェルプレートに移して、最初の精製を完了した。全てのプラークが黒色プラークアッセイで陽性に染色されるまで、精製手順を繰り返した。複数のクローンを各構築物について単離した。
構築されたｒＨＶＴ、それらの親ウイルス、及び使用される相同ベクターのリストを、以下の表１に提供する。ｒＨＶＴのゲノム構造を示す図を図１に提供する。ＮＤＶ Ｆ遺伝子及びＡＩＶ ＨＡ－Ｈ９遺伝子の両方を発現する二価ｒＨＶＴ（ｒＨＶＴ／ＮＤ－Ｈ９）の構築のために、１つの抗原遺伝子を含有するｒＨＶＴから抽出したウイルスＤＮＡを用いて前述した構築プロセスを繰り返した。
実施例３：組換えＨＶＴによる挿入された抗原の発現
実施例２で調製したｒＨＶＴ構築物によるＮＤＶ Ｆタンパク質及び／又はＡＩＶ ＨＡ－Ｈ９タンパク質の発現を、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）及びウエスタン・ブロット・アッセイによって確認した。ＩＦＡのために、ｒＨＶＴプラークを有するＣＥＦ単層をメタノール：アセトン混合物（１：２）で固定し、ウサギ抗ＮＤＶ Ｆタンパク質血清及びニワトリ抗ＨＡ（Ｈ９）血清の混合物とインキュベートした。次いで、プレートを、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ－１１００８）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６抗ニワトリＩｇＹ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ－１１０４０）の混合物とインキュベートし、蛍光顕微鏡下において観察した。特異的な緑色（Ｆタンパク質）又は赤色（ＨＡ－Ｈ９タンパク質）の蛍光が各ｒＨＶＴで観察され、これにより、これらのｒＨＶＴが抗原タンパク質を発現することを実証した。また、二価ｒＨＶＴ／ＮＤ－Ｈ９構築物の各プラークは、Ｆ抗原及びＨＡ－Ｈ９抗原の両方を発現することが実証された（図２）。
実施例２で調製したｒＨＶＴ構築物によるＮＤＶ Ｆタンパク質及び／又はＡＩＶ ＨＡ－Ｈ９タンパク質の発現を、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）及びウエスタン・ブロット・アッセイによって確認した。ＩＦＡのために、ｒＨＶＴプラークを有するＣＥＦ単層をメタノール：アセトン混合物（１：２）で固定し、ウサギ抗ＮＤＶ Ｆタンパク質血清及びニワトリ抗ＨＡ（Ｈ９）血清の混合物とインキュベートした。次いで、プレートを、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ－１１００８）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６抗ニワトリＩｇＹ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ－１１０４０）の混合物とインキュベートし、蛍光顕微鏡下において観察した。特異的な緑色（Ｆタンパク質）又は赤色（ＨＡ－Ｈ９タンパク質）の蛍光が各ｒＨＶＴで観察され、これにより、これらのｒＨＶＴが抗原タンパク質を発現することを実証した。また、二価ｒＨＶＴ／ＮＤ－Ｈ９構築物の各プラークは、Ｆ抗原及びＨＡ－Ｈ９抗原の両方を発現することが実証された（図２）。
ウエスタンブロットは、組換えウイルスに感染したＣＥＦ細胞、及びウサギ抗ＮＤＶ Ｆタンパク質血清又はニワトリ抗ＨＡ（Ｈ９）血清を用いて行った。簡潔には、６ウェルプレート中のＣＥＦ細胞を、およそ０．１の感染の多重度で組換えウイルス又は親ＨＶＴ株の１つに感染させた。接種の３日後、細胞をトリプシンで収穫し、９１３×ｇで５分間遠心分離した。ペレットをＰＢＳで洗浄し、１００μＬのＰＢＳで再懸濁した。同じ体積の２×ＳＤＳ試料緩衝液（１３０ｍＭトリス－Ｃｌ（ｐＨ６．８）、６％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％２－メルカプトエタノール、及び０．０１％ブロモフェノールブルー）を加えた後、細胞懸濁液を５分間沸騰させた。試料を、１０％ポリアクリルアミドゲルを用いるＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）へと移した。膜を完全に乾燥させ、次いで、ウサギ抗ＮＤＶ Ｆタンパク質血清又はニワトリ抗ＨＡ（Ｈ９）血清とインキュベートした。抗体を洗い流した後、膜を、ビオチン化抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＢＡ－１０００）又はビオチン化抗ニワトリＩｇＹ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＢＡ－９０１０）のいずれかとインキュベートし、その後、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ ＡＢＣ－ＡＰキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＡＫ－５０００）とインキュベートした。抗体と結合したタンパク質を、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液を添加することによって可視化した。図３～図６に示すように、ＮＤＶ Ｆタンパク質については６０キロダルトン（ｋＤａ）のタンパク質バンド又はＡＩＶ ＨＡ－Ｈ９タンパク質については７０ｋＤａのタンパク質バンドは、組換えウイルス感染細胞のレーンでのみ観察され、実施例２で調製したｒＨＶＴ構築物が予想されたサイズの抗原タンパク質を発現することが確認された。
実施例４：組換えＨＶＴのゲノム構造の検証
実施例２で調製したｒＨＶＴ構築物のゲノム構造を、２つの挿入領域（ＵＬ４５／ＵＬ４６及びＳＯＲＦ３／ＵＳ２）を増幅する２つのＰＣＲ反応によって検証した。ＰＣＲ反応で使用されるプライマ対は、ＵＬ４５／ＵＬ４６については配列番号１８（５’－ＧＧＧＧＡＡＧＴＣＴＴＣＣＧＧＴＴＡＡＧＧＧＡＣ－３’）及び配列番号１９（５’－ＧＧＴＧＣＡＡＴＴＣＧＴＡＡＧＡＣＣＧＡＴＧＧＧ－３’）であり、（ＳＯＲＦ３／ＵＳ２）については配列番号２０（５’－ＧＣＧＣＧＡＣＴＣＣＡＴＡＣＡＴＴＧＡ－３’）及び配列番号２１（５’－ＡＧＴＣＣＡＣＡＴＧＣＡＣＣＣＣＡＣＣＴＡＡＡＣ－３’）である。挿入された遺伝子を含有するＰＣＲ産物の予想されるサイズは、ｒＨＶＴの全てで観察され、これらの組換えＨＶＴが予想されるゲノム構造を有することが確認された。
実施例２で調製したｒＨＶＴ構築物のゲノム構造を、２つの挿入領域（ＵＬ４５／ＵＬ４６及びＳＯＲＦ３／ＵＳ２）を増幅する２つのＰＣＲ反応によって検証した。ＰＣＲ反応で使用されるプライマ対は、ＵＬ４５／ＵＬ４６については配列番号１８（５’－ＧＧＧＧＡＡＧＴＣＴＴＣＣＧＧＴＴＡＡＧＧＧＡＣ－３’）及び配列番号１９（５’－ＧＧＴＧＣＡＡＴＴＣＧＴＡＡＧＡＣＣＧＡＴＧＧＧ－３’）であり、（ＳＯＲＦ３／ＵＳ２）については配列番号２０（５’－ＧＣＧＣＧＡＣＴＣＣＡＴＡＣＡＴＴＧＡ－３’）及び配列番号２１（５’－ＡＧＴＣＣＡＣＡＴＧＣＡＣＣＣＣＡＣＣＴＡＡＡＣ－３’）である。挿入された遺伝子を含有するＰＣＲ産物の予想されるサイズは、ｒＨＶＴの全てで観察され、これらの組換えＨＶＴが予想されるゲノム構造を有することが確認された。
実施例５：組換えＨＶＴの遺伝的安定性
実施例２で調製したｒＨＶＴ構築物をＣＥＦに２０回通し、遺伝的安定性について試験した。２０回の継代後のｒＨＶＴの全てを、ゲノム構造について実施例４に記載されるようなＰＣＲによって、及び実施例３に記載されるような抗原タンパク質の発現についてＩＦＡ及びウエスタンブロットによって試験した。全てのｒＨＶＴ構築物は、ＰＣＲによって挿入された遺伝子を維持し、ＩＦＡ及びウエスタンブロットによって抗原タンパク質を発現したことが示され、これにより、これらのｒＨＶＴが遺伝的に安定であり、かつ抗原の安定な発現を提供することが実証された。
実施例２で調製したｒＨＶＴ構築物をＣＥＦに２０回通し、遺伝的安定性について試験した。２０回の継代後のｒＨＶＴの全てを、ゲノム構造について実施例４に記載されるようなＰＣＲによって、及び実施例３に記載されるような抗原タンパク質の発現についてＩＦＡ及びウエスタンブロットによって試験した。全てのｒＨＶＴ構築物は、ＰＣＲによって挿入された遺伝子を維持し、ＩＦＡ及びウエスタンブロットによって抗原タンパク質を発現したことが示され、これにより、これらのｒＨＶＴが遺伝的に安定であり、かつ抗原の安定な発現を提供することが実証された。
実施例６：ＦＷ２０５、ＦＷ２０６、又はＦＷ２０８をワクチン接種したニワトリにおける抗体力価
構築物ＦＷ２０５、ＦＷ２０６、及びＦＷ２０８を、ＮＤＶ Ｆ及びＡＩＶ ＨＡ－Ｈ９に対する抗体を誘導するそれらの能力について調査した。ｒＨＶＴ構築物のおよそ１，０００プラーク形成単位（plaque forming unit：ＰＦＵ）を、１日齢の特定病原体除去（specific pathogen free：ＳＰＦ）ニワトリの皮下へと投与した。血清を２～５週齢の間で毎週収集し、抗原に対する特異的抗体について試験した。ＮＤＶ Ｆに対する抗体を、ＩＤ Ｓｃｒｅｅｎ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡキット（ＩＤＶｅｔ）を用いて試験した。試験した構築物は全て、ＮＤＶ Ｆタンパク質に対する抗体を誘導した（図７）。ＦＷ２０５は他の構築物よりも非常に高い力価を誘導した。ＡＩＶ ＨＡ－Ｈ９に対する抗体を、Ｈ９サブタイプの不活性化ＡＩＶを用いて、ＯＩＥ Ｔｅｒｒｅｓｔｒｉａｌ Ｍａｎｕａｌ ２０１８の３．３．４章（トリインフルエンザ）に記載されるようなヘマグルチン（hemagglutin）阻害（ＨＩ）試験によって試験した。試験した構築物は全て、２～５週齢の間でＨＩ力価を呈することが示された（図８Ａ及び図８Ｂ）。
構築物ＦＷ２０５、ＦＷ２０６、及びＦＷ２０８を、ＮＤＶ Ｆ及びＡＩＶ ＨＡ－Ｈ９に対する抗体を誘導するそれらの能力について調査した。ｒＨＶＴ構築物のおよそ１，０００プラーク形成単位（plaque forming unit：ＰＦＵ）を、１日齢の特定病原体除去（specific pathogen free：ＳＰＦ）ニワトリの皮下へと投与した。血清を２～５週齢の間で毎週収集し、抗原に対する特異的抗体について試験した。ＮＤＶ Ｆに対する抗体を、ＩＤ Ｓｃｒｅｅｎ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡキット（ＩＤＶｅｔ）を用いて試験した。試験した構築物は全て、ＮＤＶ Ｆタンパク質に対する抗体を誘導した（図７）。ＦＷ２０５は他の構築物よりも非常に高い力価を誘導した。ＡＩＶ ＨＡ－Ｈ９に対する抗体を、Ｈ９サブタイプの不活性化ＡＩＶを用いて、ＯＩＥ Ｔｅｒｒｅｓｔｒｉａｌ Ｍａｎｕａｌ ２０１８の３．３．４章（トリインフルエンザ）に記載されるようなヘマグルチン（hemagglutin）阻害（ＨＩ）試験によって試験した。試験した構築物は全て、２～５週齢の間でＨＩ力価を呈することが示された（図８Ａ及び図８Ｂ）。
実施例７：１７日齢でのチャレンジ後のＦＷ２０５、ＦＷ２０６、又はＦＷ２０８をワクチン接種したニワトリにおけるＮＤに対する保護
構築物ＦＷ２０５（ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＳ）、ＦＷ２０６（ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮ）、及びＦＷ２０８（ＨＶＴ／４５－４６ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＳ／８７－８８ ＰｅｃＦ）の有効性を、病原性ＮＤＶ株によるチャレンジに対して調査した。１日齢のＳＰＦニワトリに、およそ１，０００ＰＦＵのｒＨＶＴ／ＮＤ－Ｈ９構築物のうち１つを皮下ワクチン接種した。１７日齢のニワトリに、筋肉内注射を介して１０５ ＥＬＤ５０の病原性ＮＤＶ Ｈｅｒｔｓ ３３／５６株をチャレンジし、ニューカッスル病（ＮＤ）の臨床徴候について１４日間観察した。全ての構築物は非常に早い年齢でのチャレンジに対して７０％以上の保護を提供した。
構築物ＦＷ２０５（ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＳ）、ＦＷ２０６（ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ／８７－８８ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＮ）、及びＦＷ２０８（ＨＶＴ／４５－４６ Ｍｃｍｖ ｉｅ１ Ｈ９－ＣＳ／８７－８８ ＰｅｃＦ）の有効性を、病原性ＮＤＶ株によるチャレンジに対して調査した。１日齢のＳＰＦニワトリに、およそ１，０００ＰＦＵのｒＨＶＴ／ＮＤ－Ｈ９構築物のうち１つを皮下ワクチン接種した。１７日齢のニワトリに、筋肉内注射を介して１０５ ＥＬＤ５０の病原性ＮＤＶ Ｈｅｒｔｓ ３３／５６株をチャレンジし、ニューカッスル病（ＮＤ）の臨床徴候について１４日間観察した。全ての構築物は非常に早い年齢でのチャレンジに対して７０％以上の保護を提供した。
ＮＩＣＣ＝非免疫化チャレンジ陽性対照
実施例８：２１日齢でのチャレンジ後のＦＷ２０５、ＦＷ２０６、又はＦＷ２０８をワクチン接種したニワトリにおけるＮＤに対する保護
ＦＷ２０５、ＦＷ２０６、及びＦＷ２０８の有効性を、病原性ＮＤＶ株によるチャレンジに対して調査した。ＦＷ１６８（ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ）もまた試験した。１日齢のＳＰＦニワトリに、およそ４００ＰＦＵのｒＨＶＴ構築物の１つを皮下ワクチン接種した。２１日齢のニワトリに、筋肉内注射を介して１０５ ＥＬＤ５０の病原性ＮＤＶ Ｈｅｒｔｓ ３３／５６株をチャレンジし、ニューカッスル病（ＮＤ）の臨床徴候について１４日間観察した。構築物ＦＷ２０５及びＦＷ１６８は、それぞれ１００％及び９６％という優れた保護を提供し、他の構築物もまた７０％を超える良好な保護を提供した。結果を以下の表３に示す。
ＦＷ２０５、ＦＷ２０６、及びＦＷ２０８の有効性を、病原性ＮＤＶ株によるチャレンジに対して調査した。ＦＷ１６８（ＨＶＴ／４５－４６ ＰｅｃＦ）もまた試験した。１日齢のＳＰＦニワトリに、およそ４００ＰＦＵのｒＨＶＴ構築物の１つを皮下ワクチン接種した。２１日齢のニワトリに、筋肉内注射を介して１０５ ＥＬＤ５０の病原性ＮＤＶ Ｈｅｒｔｓ ３３／５６株をチャレンジし、ニューカッスル病（ＮＤ）の臨床徴候について１４日間観察した。構築物ＦＷ２０５及びＦＷ１６８は、それぞれ１００％及び９６％という優れた保護を提供し、他の構築物もまた７０％を超える良好な保護を提供した。結果を以下の表３に示す。
ＮＩＣＣ＝非免疫化チャレンジ陽性対照
実施例９：２５日齢でのチャレンジ後のＦＷ２０５、ＦＷ２０６、又はＦＷ２０８をワクチン接種したニワトリにおけるＡＩに対する保護
ＡＩＶ Ｈ９サブタイプによるチャレンジに対するＦＷ２０５、ＦＷ２０６、及びＦＷ２０８の有効性を、市販のブロイラー鶏において調査した。１日齢の市販のブロイラー鶏に、およそ１，０００ＰＦＵのＦＷ２０５、ＦＷ２０６、又はＦＷ２０８を皮下ワクチン接種した。ニワトリに、２５日齢で気管内及び鼻腔内経路を介して１０７ ＥＩＤ５０のＡＩＶ Ａ／ニワトリ／Ｓａｕｄｉ Ａｒａｂｉａ／Ｄ１８１６／１／１／２０１１（Ｈ９Ｎ２）株をチャレンジした。チャレンジの５日後に気管試料を収集し、ｑＰＣＲ分析によるＡＩＶの定量化に使用した。チャレンジの１１日後、ニワトリを剖検し、気嚢の病変を評価した。図９に示すように、全てのワクチン接種グループは、対照グループと比較してウイルス量負荷が低かった。ＦＷ２０５は、チャレンジ対照グループと比較して、気管スワブにおけるＡＩＶ負荷を１ｌｏｇ減少させ（図９）、ＦＷ２０６又はＦＷ２０８のいずれかをワクチン接種した他の２つのグループにおけるＡＩＶ負荷は、チャレンジ対照におけるＡＩＶ負荷よりも０．５ｌｏｇ低かった（図９）。全てのワクチン接種グループの気嚢病変スコアもまた、チャレンジ対照グループよりも実質的に低かった（図１０）。これらの結果は、全ての試験した構築物が、ＡＩＶ Ｈ９サブタイプによるチャレンジに対する臨床的保護を提供することを実証した。
ＡＩＶ Ｈ９サブタイプによるチャレンジに対するＦＷ２０５、ＦＷ２０６、及びＦＷ２０８の有効性を、市販のブロイラー鶏において調査した。１日齢の市販のブロイラー鶏に、およそ１，０００ＰＦＵのＦＷ２０５、ＦＷ２０６、又はＦＷ２０８を皮下ワクチン接種した。ニワトリに、２５日齢で気管内及び鼻腔内経路を介して１０７ ＥＩＤ５０のＡＩＶ Ａ／ニワトリ／Ｓａｕｄｉ Ａｒａｂｉａ／Ｄ１８１６／１／１／２０１１（Ｈ９Ｎ２）株をチャレンジした。チャレンジの５日後に気管試料を収集し、ｑＰＣＲ分析によるＡＩＶの定量化に使用した。チャレンジの１１日後、ニワトリを剖検し、気嚢の病変を評価した。図９に示すように、全てのワクチン接種グループは、対照グループと比較してウイルス量負荷が低かった。ＦＷ２０５は、チャレンジ対照グループと比較して、気管スワブにおけるＡＩＶ負荷を１ｌｏｇ減少させ（図９）、ＦＷ２０６又はＦＷ２０８のいずれかをワクチン接種した他の２つのグループにおけるＡＩＶ負荷は、チャレンジ対照におけるＡＩＶ負荷よりも０．５ｌｏｇ低かった（図９）。全てのワクチン接種グループの気嚢病変スコアもまた、チャレンジ対照グループよりも実質的に低かった（図１０）。これらの結果は、全ての試験した構築物が、ＡＩＶ Ｈ９サブタイプによるチャレンジに対する臨床的保護を提供することを実証した。
実施例１０：ＦＷ２４７、ＦＷ２４８、ＦＷ２４９、ＦＷ２５０、ＦＷ２５１、又はＦＷ２５２をワクチン接種したニワトリにおける抗体力価
構築物ＦＷ２４７、ＦＷ２４８、ＦＷ２４９、ＦＷ２５０、ＦＷ２５１、及びＦＷ２５２を、ＮＤＶ Ｆ及びＡＩＶ ＨＡ－Ｈ９に対する抗体を誘導するそれらの能力について調査した。およそ３，０００ＰＦＵのｒＨＶＴ構築物を１日齢のＳＰＦニワトリへと皮下投与した。血清を２週齢及び３週齢で収集し、抗原に対する特異的抗体について試験した。ＮＤＶ Ｆに対する抗体を、ＩＤ Ｓｃｒｅｅｎ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡキット（ＩＤＶｅｔ）を用いて試験した。ＡＩＶ ＨＡ－Ｈ９に対する抗体を、Ｈ９サブタイプの不活性化ＡＩＶを用いるＨＩ試験によって試験した。試験した構築物は全て、ＮＤＶ Ｆタンパク質（図１１）及びＡＩＶ ＨＡ－Ｈ９（図１２）の両方に対する抗体を誘導した。構築物ＦＷ２４９は高Ｆ抗体及びＨＡ－Ｈ９抗体を誘導するようであった。
構築物ＦＷ２４７、ＦＷ２４８、ＦＷ２４９、ＦＷ２５０、ＦＷ２５１、及びＦＷ２５２を、ＮＤＶ Ｆ及びＡＩＶ ＨＡ－Ｈ９に対する抗体を誘導するそれらの能力について調査した。およそ３，０００ＰＦＵのｒＨＶＴ構築物を１日齢のＳＰＦニワトリへと皮下投与した。血清を２週齢及び３週齢で収集し、抗原に対する特異的抗体について試験した。ＮＤＶ Ｆに対する抗体を、ＩＤ Ｓｃｒｅｅｎ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｉｎｄｉｒｅｃｔ ＥＬＩＳＡキット（ＩＤＶｅｔ）を用いて試験した。ＡＩＶ ＨＡ－Ｈ９に対する抗体を、Ｈ９サブタイプの不活性化ＡＩＶを用いるＨＩ試験によって試験した。試験した構築物は全て、ＮＤＶ Ｆタンパク質（図１１）及びＡＩＶ ＨＡ－Ｈ９（図１２）の両方に対する抗体を誘導した。構築物ＦＷ２４９は高Ｆ抗体及びＨＡ－Ｈ９抗体を誘導するようであった。
実施例１１：２１日齢でのチャレンジ後のＦＷ２４９をワクチン接種したニワトリにおけるＮＤに対する保護
構築物ＦＷ２４９の有効性を病原性ＮＤＶ株によるチャレンジに対して調査した。１日齢のＳＰＦニワトリに、およそ２，５００ＰＦＵのｒＨＶＴ／ＮＤ－Ｈ９構築物のうち１つを皮下ワクチン接種した。２１日齢のニワトリに、筋肉内注射を介して１０５ ＥＬＤ５０の病原性ＮＤＶ Ｈｅｒｔｓ ３３／５６株をチャレンジし、ニューカッスル病（ＮＤ）の臨床徴候について１４日間観察した。結果を表４に提示する。
構築物ＦＷ２４９の有効性を病原性ＮＤＶ株によるチャレンジに対して調査した。１日齢のＳＰＦニワトリに、およそ２，５００ＰＦＵのｒＨＶＴ／ＮＤ－Ｈ９構築物のうち１つを皮下ワクチン接種した。２１日齢のニワトリに、筋肉内注射を介して１０５ ＥＬＤ５０の病原性ＮＤＶ Ｈｅｒｔｓ ３３／５６株をチャレンジし、ニューカッスル病（ＮＤ）の臨床徴候について１４日間観察した。結果を表４に提示する。
ＮＩＣＣ＝非免疫化チャレンジ陽性対照
配列表
配列番号１
名称：Ｆタンパク質
タイプ：アミノ酸
長さ：５５３
ＭＧＳＲＳＳＴＲＩＰＶＰＬＭＬＴＶＲＩＭＬＡＬＳＣＶＣＰＴＳＳＬＤＧＲＰＬＡＡＡＧＩＶＶＴＧＤＫＡＶＮＩＹＴＳＳＱＴＧＳＩＩＩＫＬＬＰＮＭＰＫＤＫＥＡＣＡＫＡＰＬＥＡＹＮＲＴＬＴＴＬＬＴＰＬＧＤＳＩＲＲＩＱＥＳＶＴＴＳＧＧＧＫＱＧＲＬＩＧＡＩＩＧＧＶＡＬＧＶＡＴＡＡＱＩＴＡＡＳＡＬＩＱＡＮＱＮＡＡＮＩＬＲＬＫＥＳＩＡＡＴＮＥＡＶＨＥＶＴＤＧＬＳＱＬＡＶＡＶＧＫＭＱＱＦＶＮＤＱＦＮＫＴＡＱＥＬＤＣＩＫＩＴＱＱＶＧＶＥＬＮＬＹＬＴＥＬＴＴＶＦＧＰＱＩＴＳＰＡＬＴＱＬＴＩＱＡＬＹＮＬＡＧＧＮＭＤＹＬＬＴＫＬＧＶＧＮＮＱＬＳＳＬＩＧＳＧＬＩＴＧＮＰＩＬＹＤＳＱＴＱＬＬＧＩＱＶＴＬＰＳＶＧＮＬＮＮＭＲＡＴＹＬＥＴＬＳＶＳＴＴＫＧＦＡＳＡＬＶＰＫＶＶＴＱＶＧＳＶＩＥＥＬＤＴＳＹＣＩＥＴＤＬＤＬＹＣＴＲＩＶＴＦＰＭＳＰＧＩＹＳＣＬＳＧＮＴＳＡＣＭＹＳＫＴＥＧＡＬＴＴＰＹＭＴＬＫＧＳＶＩＡＮＣＫＭＴＴＣＲＣＡＤＰＰＧＩＩＳＱＮＹＧＥＡＶＳＬＩＤＲＱＳＣＮＩＬＳＬＤＧＩＴＬＲＬＳＧＥＦＤＡＴＹＱＫＮＩＳＩＱＤＳＱＶＩＶＴＧＮＬＤＩＳＴＥＬＧＮＶＮＮＳＩＳＮＡＬＤＫＬＥＥＳＮＳＫＬＤＫＶＮＶＫＬＴＳＴＳＡＬＩＴＹＩＶＬＴＶＩＳＬＶＣＧＩＬＳＬＶＬＡＣＹＬＭＹＫＱＫＡＱＱＫＴＬＬＷＬＧＮＮＴＬＤＱＭＲＡＴＴＫＭ
配列番号２
名称：（Ｈ９－ＣＳ）
タイプ：アミノ酸
長さ：５６０
ＭＥＴＩＳＬＭＴＩＬＬＶＶＴＴＳＮＡＤＫＩＣＩＧＨＱＳＴＮＳＴＥＴＶＤＴＬＴＥＴＮＶＰＶＴＨＡＫＥＬＬＨＴＥＨＮＧＭＬＣＡＴＮＬＧＨＰＬＩＬＤＴＣＴＩＥＧＬＶＹＧＮＰＳＣＤＬＬＬＧＧＲＥＷＳＹＩＶＥＲＰＳＡＶＮＧＴＣＹＰＧＮＶＥＮＬＥＥＬＲＴＬＦＳＳＳＳＳＹＱＲＩＱＩＦＰＤＴＩＷＮＶＴＹＴＧＴＳＫＳＣＳＤＳＦＹＲＮＭＲＷＬＴＱＫＮＧＶＹＰＶＱＤＡＱＹＴＮＮＲＧＫＤＩＬＦＶＷＧＩＨＨＰＰＴＤＴＡＱＴＮＬＹＴＲＴＤＴＴＴＳＶＴＴＥＮＬＤＲＴＦＫＰＬＩＧＰＲＰＬＶＮＧＬＩＧＲＩＮＹＹＷＳＶＬＫＰＧＱＴＬＲＶＲＳＮＧＮＬＩＡＰＷＦＧＨＶＬＳＧＥＳＨＧＲＩＬＫＴＤＬＮＳＧＮＣＶＶＱＣＱＴＥＫＧＧＬＮＳＴＬＰＦＨＮＩＳＫＹＡＦＧＴＣＰＫＹＩＧＶＫＳＬＫＬＡＩＧＬＲＮＶＰＡＲＳＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＰＧＬＶＡＧＷＹＧＦＱＨＳＮＤＱＧＶＧＭＡＡＤＲＤＳＴＱＫＡＶＤＫＩＴＳＫＶＮＮＩＶＤＫＭＮＫＱＹＥＩＩＤＨＥＦＳＥＶＥＴＲＬＮＭＩＮＮＫＩＤＤＱＩＱＤＶＷＡＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＱＫＴＬＤＥＨＤＡＮＶＮＮＬＹＮＫＶＫＲＡＬＧＳＮＡＩＥＤＧＫＧＣＦＥＬＹＨＫＣＤＮＱＣＭＥＴＩＲＮＧＴＹＮＲＲＫＹＫＥＥＳＲＬＥＲＱＫＩＥＧＶＫＬＥＳＥＧＴＹＫＩＬＴＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＡＭＶＦＡＡＦＬＦＷＡＭＳＮＧＳＣＲＣＮＩＣＩ
配列番号３
名称：Ｈ９－ＣＮｎ１
タイプ：アミノ酸
長さ：５６０
ＭＥＶＶＳＬＩＴＩＬＬＶＶＴＶＳＮＡＤＫＩＣＩＧＹＱＳＴＮＳＴＥＴＶＤＴＬＴＥＮＮＶＰＶＴＨＡＫＥＬＬＨＴＥＨＮＧＭＬＣＡＴＳＬＧＱＰＬＩＬＤＴＣＴＩＥＧＬＩＹＧＮＰＳＣＤＬＳＬＥＧＲＥＷＳＹＩＶＥＲＰＳＡＶＮＧＬＣＹＰＧＮＶＥＮＬＥＥＬＲＳＬＦＳＳＡＲＳＹＱＲＩＱＩＦＰＤＴＩＷＮＶＳＹＤＧＴＳＴＡＣＳＧＳＦＹＲＳＭＲＷＬＴＲＫＮＧＤＹＰＩＱＤＡＱＹＴＮＮＱＧＫＮＩＬＦＭＷＧＩＮＨＰＰＴＤＤＴＱＲＮＬＹＴＲＴＤＴＴＴＳＶＡＴＥＥＩＮＲＩＦＫＰＬＩＧＰＲＰＬＶＮＧＬＭＧＲＩＤＹＹＷＳＶＬＫＰＧＱＴＬＲＩＫＳＤＧＮＬＩＡＰＷＹＧＨＩＬＳＧＥＳＨＧＲＩＬＫＴＤＬＫＲＧＳＣＴＶＱＣＱＴＥＫＧＧＬＮＴＴＬＰＦＱＮＶＳＫＹＡＦＧＮＣＳＫＹＩＧＩＫＳＬＫＬＡＶＧＬＲＮＶＰＳＲＳＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＳＧＬＶＡＧＷＹＧＦＱＨＳＮＤＱＧＶＧＭＡＡＤＲＤＳＴＱＫＡＩＤＫＩＴＳＫＶＮＮＩＶＤＫＭＮＫＱＹＥＩＩＤＨＥＦＳＥＶＥＴＲＬＮＭＩＮＮＫＩＤＤＱＩＱＤＩＷＡＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＱＫＴＬＤＥＨＤＡＮＶＮＮＬＹＮＫＶＫＲＡＬＧＴＮＡＶＥＤＧＫＧＣＦＥＬＹＨＫＣＤＤＱＣＭＥＴＩＲＮＧＴＹＮＲＲＫＹＱＥＥＳＫＬＥＲＱＫＩＥＧＶＫＬＥＳＥＧＴＹＫＩＬＴＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＩＡＭＧＦＡＡＦＬＦＷＡＭＳＮＧＳＣＲＣＮＩＣＩ
配列番号４
名称：Ｈ９－ＣＮｎ２
タイプ：アミノ酸
長さ：５６０
ＭＥＶＶＳＬＩＴＩＬＬＶＶＴＶＳＮＡＤＫＩＣＩＧＹＱＳＴＮＳＴＥＴＶＤＴＬＴＥＮＮＶＰＶＴＨＡＫＥＬＬＨＴＥＨＮＧＭＬＣＡＴＳＬＧＱＰＬＩＬＤＴＣＴＩＥＧＬＩＹＧＮＰＳＣＤＬＳＬＥＧＲＥＷＳＹＩＶＥＲＰＳＡＶＮＧＬＣＹＰＧＮＶＥＮＬＥＥＬＲＳＬＦＳＳＡＲＳＹＱＲＩＱＩＦＰＤＴＩＷＮＶＳＹＤＧＴＳＴＡＣＳＧＳＦＹＲＳＭＲＷＬＴＲＫＮＧＤＹＰＴＱＤＡＱＹＴＮＮＱＧＫＮＩＬＦＭＷＧＩＮＨＰＰＴＤＴＡＱＴＮＬＹＴＲＴＤＴＴＴＳＶＡＴＥＥＩＮＲＩＦＫＰＬＩＧＰＲＰＬＶＮＧＬＭＧＲＩＤＹＹＷＳＶＬＫＰＧＱＴＬＲＩＫＳＤＧＮＬＩＡＰＷＹＧＨＩＬＳＧＥＳＨＧＲＩＬＫＴＤＬＫＲＧＳＣＴＶＱＣＱＴＥＫＧＧＬＮＴＴＬＰＦＱＮＶＳＫＹＡＦＧＮＣＳＫＹＩＧＩＫＳＬＫＬＡＶＧＬＲＮＶＰＳＲＳＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＳＧＬＶＡＧＷＹＧＦＱＨＳＮＤＱＧＶＧＭＡＡＤＲＤＳＴＱＫＡＩＤＫＩＴＳＫＶＮＮＩＶＤＫＭＮＫＱＹＥＩＩＤＨＥＦＳＥＶＥＴＲＬＮＭＩＮＮＫＩＤＤＱＩＱＤＩＷＡＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＱＫＴＬＤＥＨＤＡＮＶＮＮＬＹＮＫＶＫＲＡＬＧＴＮＡＶＥＤＧＫＧＣＦＥＬＹＨＫＣＤＤＱＣＭＥＴＩＲＮＧＴＹＮＲＲＫＹＱＥＥＳＫＬＥＲＱＫＩＥＧＶＫＬＥＳＥＧＴＹＫＩＬＴＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＩＡＭＧＦＡＡＦＬＦＷＡＭＳＮＧＳＣＲＣＮＩＣＩ
配列番号５
名称：Ｈ９－ＣＮｎ３
タイプ：アミノ酸
長さ：５６０
ＭＥＶＶＳＬＩＴＩＬＬＶＶＴＶＳＮＡＤＫＩＣＩＧＹＱＳＴＮＳＴＥＴＶＤＴＬＴＥＮＮＶＰＶＴＨＡＫＥＬＬＨＴＥＨＮＧＭＬＣＡＴＳＬＧＱＰＬＩＬＤＴＣＴＩＥＧＬＩＹＧＮＰＳＣＤＬＳＬＥＧＲＥＷＳＹＩＶＥＲＰＳＡＶＮＧＬＣＹＰＧＮＶＥＮＬＥＥＬＲＳＬＦＳＳＡＲＳＹＱＲＩＱＩＦＰＤＴＩＷＮＶＳＹＤＧＴＳＴＡＣＳＧＳＦＹＲＳＭＲＷＬＴＱＫＮＮＡＹＰＩＱＤＡＱＹＴＮＮＱＧＫＮＩＬＦＭＷＧＩＮＨＰＰＴＤＴＴＱＲＮＬＹＴＲＴＤＴＴＴＳＶＡＴＥＥＩＮＲＩＦＫＰＬＩＧＰＲＰＬＶＮＧＬＭＧＲＩＤＹＹＷＳＶＬＫＰＧＱＴＬＲＩＫＳＤＧＮＬＩＡＰＷＹＧＨＩＬＳＧＥＳＨＧＲＩＬＫＴＤＬＫＲＧＳＣＴＶＱＣＱＴＥＫＧＧＬＮＴＴＬＰＦＱＮＶＳＫＹＡＦＧＮＣＳＫＹＩＧＩＫＳＬＫＬＡＶＧＬＲＮＶＰＳＲＳＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＳＧＬＶＡＧＷＹＧＦＱＨＳＮＤＱＧＶＧＭＡＡＤＲＤＳＴＱＫＡＩＤＫＩＴＳＫＶＮＮＩＶＤＫＭＮＫＱＹＥＩＩＤＨＥＦＳＥＶＥＴＲＬＮＭＩＮＮＫＩＤＤＱＩＱＤＩＷＡＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＱＫＴＬＤＥＨＤＡＮＶＮＮＬＹＮＫＶＫＲＡＬＧＴＮＡＶＥＤＧＫＧＣＦＥＬＹＨＫＣＤＤＱＣＭＥＴＩＲＮＧＴＹＮＲＲＫＹＱＥＥＳＫＬＥＲＱＫＩＥＧＶＫＬＥＳＥＧＴＹＫＩＬＴＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＩＡＭＧＦＡＡＦＬＦＷＡＭＳＮＧＳＣＲＣＮＩＣＩ
配列番号６
名称：Ｈ９－ＣＮｎ４
タイプ：アミノ酸
長さ：５６０
ＭＥＶＶＳＬＩＴＩＬＬＶＶＴＶＳＮＡＤＫＩＣＩＧＹＱＳＴＮＳＴＥＴＶＤＴＬＴＥＮＮＶＰＶＴＨＡＫＥＬＬＨＴＥＨＮＧＭＬＣＡＴＳＬＧＱＰＬＩＬＤＴＣＴＩＥＧＬＩＹＧＮＰＳＣＤＬＬＬＧＧＲＥＷＳＹＩＶＥＲＰＳＡＶＮＧＬＣＹＰＧＮＶＥＮＬＥＥＬＲＳＬＦＳＳＡＲＳＹＱＲＩＱＩＦＰＤＴＩＷＮＶＳＹＤＧＴＳＴＡＣＳＧＳＦＹＲＳＭＲＷＬＴＲＫＮＧＤＹＰＩＱＤＡＱＹＴＮＮＱＧＫＮＩＬＦＭＷＧＩＮＨＰＰＴＤＤＴＱＲＮＬＹＴＲＴＤＴＴＴＳＶＡＴＥＥＩＮＲＩＦＫＰＬＩＧＰＲＰＬＶＮＧＬＭＧＲＩＤＹＹＷＳＶＬＫＰＧＱＴＬＲＩＫＳＤＧＮＬＩＡＰＷＹＧＨＩＬＳＧＥＳＨＧＲＩＬＫＴＤＬＫＲＧＳＣＴＶＱＣＱＴＥＫＧＧＬＮＴＴＬＰＦＱＮＶＳＫＹＡＦＧＮＣＳＫＹＩＧＩＫＳＬＫＬＡＶＧＬＲＮＶＰＳＲＳＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＳＧＬＶＡＧＷＹＧＦＱＨＳＮＤＱＧＶＧＭＡＡＤＲＤＳＴＱＫＡＩＤＫＩＴＳＫＶＮＮＩＶＤＫＭＮＫＱＹＥＩＩＤＨＥＦＳＥＶＥＴＲＬＮＭＩＮＮＫＩＤＤＱＩＱＤＩＷＡＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＱＫＴＬＤＥＨＤＡＮＶＮＮＬＹＮＫＶＫＲＡＬＧＴＮＡＶＥＤＧＫＧＣＦＥＬＹＨＫＣＤＤＱＣＭＥＴＩＲＮＧＴＹＮＲＲＫＹＱＥＥＳＫＬＥＲＱＫＩＥＧＶＫＬＥＳＥＧＴＹＫＩＬＴＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＩＡＭＧＦＡＡＦＬＦＷＡＭＳＮＧＳＣＲＣＮＩＣＩ
配列番号７
名称：Ｈ９－ＣＮｎ５
タイプ：アミノ酸
長さ：５５９
ＭＥＶＶＳＬＩＴＩＬＬＶＶＴＶＳＮＡＤＫＩＣＩＧＹＱＳＴＮＳＴＥＴＶＤＴＬＴＥＮＮＶＰＶＴＨＡＫＥＬＬＨＴＥＨＮＧＭＬＣＡＴＳＬＧＱＰＬＩＬＤＴＣＴＩＥＧＬＩＹＧＮＰＳＣＤＬＳＬＥＧＲＥＷＳＹＩＶＥＲＰＳＡＶＮＧＬＣＹＰＧＮＶＥＮＬＥＥＬＲＳＬＦＳＳＡＲＳＹＱＲＩＱＩＦＰＤＴＩＷＮＶＳＹＤＧＴＳＴＡＣＳＧＳＦＹＲＳＭＲＷＬＴＲＫＮＧＤＹＰＩＱＤＡＱＹＴＮＮＱＧＫＮＩＬＦＭＷＧＩＮＨＰＰＴＤＤＴＱＲＮＬＹＴＲＴＤＴＴＴＳＶＡＴＥＥＩＮＲＩＦＫＰＬＩＧＰＲＰＬＶＮＧＬＭＧＲＩＤＹＹＷＳＶＬＫＰＧＱＴＬＲＩＫＳＤＧＮＬＩＡＰＷＹＧＨＩＬＳＧＥＳＨＧＲＩＬＫＴＤＬＫＲＧＳＣＴＶＱＣＱＴＥＫＧＧＬＮＴＴＬＰＦＱＮＶＳＫＹＡＦＧＮＣＳＫＹＩＧＩＫＳＬＫＬＡＶＧＬＲＮＶＰＳＲＳＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＳＧＬＶＡＧＷＹＧＦＱＨＳＮＤＱＧＶＧＭＡＡＤＲＤＳＴＱＫＡＩＤＫＩＴＳＫＶＮＮＩＶＤＫＭＮＫＱＹＥＩＩＤＨＥＦＳＥＶＥＴＲＬＮＭＩＮＮＫＩＤＤＱＩＱＤＩＷＡＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＱＫＴＬＤＥＨＤＡＮＶＮＮＬＹＮＫＶＫＲＡＬＧＴＮＡＶＥＤＧＫＧＣＦＥＬＹＨＫＣＤＤＱＣＭＥＴＩＲＮＧＴＹＮＲＲＫＹＱＥＥＳＫＬＥＲＱＫＩＥＧＶＫＬＥＳＥＧＴＹＫＩＬＴＩＳＦＡＩＳＣＦＬＬＣＶＶＬＬＧＦＩＭＷＡＣＱＮＧＳＣＲＣＮＩＣＩ
配列番号８
名称：Ｈ９－ＣＳ
タイプ：ヌクレオチド
長さ：１６８３
ａｔｇｇａａａｃａａｔａｔｃａｃｔｇａｔｇａｃｔａｔａｃｔａｃｔａｇｔａｇｔａａｃａａｃａａｇｃａａｔｇｃａｇａｔａａａａｔｃｔｇｃａｔｔｇｇｃｃａｃｃａｇｔｃａａｃａａａｔｔｃｃａｃａｇａａａｃｔｇｔｇｇａｃａｃｇｃｔａａｃａｇａａａｃｔａａｔｇｔｔｃｃｔｇｔｇａｃａｃａｔｇｃｃａａａｇａａｔｔｇｃｔｃｃａｃａｃａｇａｇｃａｃａａｔｇｇａａｔｇｃｔｇｔｇｔｇｃａａｃａａａｔｃｔｇｇｇａｃａｔｃｃｃｃｔｃａｔｃｃｔａｇａｃａｃａｔｇｃａｃｔａｔｃｇａａｇｇａｃｔｔｇｔｃｔａｔｇｇｔａａｃｃｃｔｔｃｔｔｇｔｇａｔｃｔｇｔｔｇｔｔｇｇｇｇｇｇａａｇａｇａａｔｇｇｔｃｃｔａｃａｔｃｇｔｔｇａａａｇａｃｃａｔｃａｇｃｔｇｔａａａｔｇｇａａｃｇｔｇｔｔａｃｃｃｔｇｇｇａａｔｇｔｇｇａａａａｃｔｔａｇａｇｇａａｃｔｃａｇａａｃａｃｔｃｔｔｔａｇｔｔｃｃｔｃｔａｇｔｔｃｃｔａｃｃａａａｇａａｔｃｃａａａｔａｔｔｃｃｃａｇａｃａｃａａｔｃｔｇｇａａｔｇｔｇａｃｔｔａｃａｃｔｇｇａａｃａａｇｃａａａｔｃａｔｇｔｔｃａｇａｔｔｃａｔｔｃｔａｃａｇｇａａｔａｔｇａｇａｔｇｇｃｔｇａｃｔｃａａａａｇａａｃｇｇｇｇｔｔｔａｔｃｃｔｇｔｔｃａａｇａｃｇｃｃｃａａｔａｃａｃａａａｔａａｔｃｇｇｇｇａａａａｇａｃａｔｔｃｔｔｔｔｃｇｔｇｔｇｇｇｇｔａｔａｃａｔｃａｔｃｃａｃｃｃａｃｃｇａｔａｃｔｇｃａｃａｇａｃｇａａｔｔｔｇｔａｃａｃａａｇａａｃｃｇａｃａｃａａｃａａｃａａｇｔｇｔａａｃａａｃａｇａａａａｔｔｔａｇａｔａｇａａｃｃｔｔｃａａａｃｃａｔｔｇａｔａｇｇｇｃｃａａｇｇｃｃｃｃｔｔｇｔｃａａｔｇｇｔｃｔｇａｔｔｇｇａａｇａａｔｔａａｔｔａｔｔａｔｔｇｇｔｃａｇｔａｃｔａａａａｃｃａｇｇｃｃａｇａｃａｔｔｇｃｇａｇｔａａｇａｔｃｃａａｔｇｇｇａａｔｔｔｇａｔｔｇｃｔｃｃａｔｇｇｔｔｔｇｇａｃａｃｇｔｔｃｔｃｔｃａｇｇｇｇａｇａｇｃｃａｔｇｇｔａｇａａｔｃｃｔｇａａａａｃｔｇａｔｔｔａａａｃａｇｔｇｇｔａａｔｔｇｔｇｔａｇｔｇｃａａｔｇｔｃａｇａｃｔｇａａａａａｇｇｔｇｇｃｃｔａａａｃａｇｔａｃａｔｔｇｃｃｔｔｔｃｃａｃａａｔａｔｃａｇｔａａａｔａｔｇｃａｔｔｔｇｇｇａｃｔｔｇｃｃｃｃａａａｔａｔａｔｔｇｇａｇｔｃａａｇａｇｔｃｔｃａａａｃｔｇｇｃａａｔｃｇｇｔｃｔｇａｇａａａｃｇｔｇｃｃｔｇｃｔａｇｇｔｃａａｇｔａｇａｇｇａｃｔａｔｔｔｇｇａｇｃｃａｔａｇｃｔｇｇａｔｔｃａｔａｇａａｇｇａｇｇｔｔｇｇｃｃａｇｇｇｃｔａｇｔｔｇｃｃｇｇｔｔｇｇｔａｔｇｇｔｔｔｃｃａｇｃａｔｔｃａａａｔｇａｔｃａａｇｇｇｇｔｔｇｇｔａｔｇｇｃａｇｃａｇａｔａｇｇｇａｔｔｃａａｃｔｃａａａａｇｇｃａｇｔｔｇａｔａａａａｔａａｃａｔｃｃａａｇｇｔｇａａｔａａｔａｔａｇｔｇｇａｃａａｇａｔｇａａｃａａｇｃａａｔａｔｇａａａｔａａｔｔｇａｔｃａｔｇａａｔｔｃａｇｔｇａｇｇｔｔｇａａａｃｔａｇａｃｔｃａａｔａｔｇａｔｃａａｔａａｔａａｇａｔｔｇａｔｇａｃｃａａａｔａｃａａｇａｔｇｔａｔｇｇｇｃａｔａｔａａｔｇｃａｇａｇｔｔｇｃｔａｇｔａｃｔａｃｔｔｇａｇａａｃｃａｇａａａａｃａｃｔｃｇａｔｇａｇｃａｔｇａｃｇｃａａａｃｇｔｇａａｃａａｃｃｔａｔａｔａａｃａａｇｇｔｇａａａａｇｇｇｃｃｔｔｇｇｇｃｔｃｃａａｔｇｃｇａｔｔｇａａｇａｔｇｇｇａａｇｇｇｃｔｇｔｔｔｃｇａｇｃｔａｔａｃｃａｃａａａｔｇｔｇａｔａａｃｃａａｔｇｃａｔｇｇａａａｃｔａｔｔｃｇｇａａｔｇｇｇａｃｃｔａｔａａｔａｇｇａｇｇａａｇｔａｃａａａｇａｇｇａａｔｃａａｇａｃｔａｇａａａｇａｃａｇａａａａｔａｇａｇｇｇｇｇｔｃａａａｃｔｇｇａａｔｃｔｇａｇｇｇｇａｃｔｔａｃａａａａｔａｃｔｔａｃｃａｔｔｔａｔｔｃｇａｃｔｇｔｃｇｃｃｔｃａｔｃｔｃｔｔｇｔａｃｔｔｇｃａａｔｇｇｔｇｔｔｔｇｃｔｇｃｃｔｔｃｔｔａｔｔｃｔｇｇｇｃｃａｔｇｔｃｃａａｔｇｇａｔｃａｔｇｃａｇｇｔｇｃａａｃａｔｃｔｇｔａｔａｔａａ
配列番号９
名称：Ｈ９－ＣＮｎ１
タイプ：ヌクレオチド
長さ：１６８３
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配列番号１０
名称：Ｈ９－ＣＮｎ２
タイプ：ヌクレオチド
長さ：１６８３
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配列番号１１
名称：Ｈ９－ＣＮｎ３
タイプ：ヌクレオチド
長さ：１６８３
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配列番号：１２
名称：Ｈ９－ＣＮｎ４
タイプ：ヌクレオチド
長さ：１６８３
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配列番号１３
名称：Ｈ９－ＣＮｎ５
タイプ：ヌクレオチド
長さ：１６８０
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配列番号１４
名称：ニューカッスル病ウイルスＦ遺伝子
タイプ：ヌクレオチド
長さ：１６６２
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配列番号１５
名称：Ｐｅｃプロモータ
タイプ：ヌクレオチド
長さ：５７２
配列番号１
名称：Ｆタンパク質
タイプ：アミノ酸
長さ：５５３
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配列番号２
名称：（Ｈ９－ＣＳ）
タイプ：アミノ酸
長さ：５６０
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配列番号３
名称：Ｈ９－ＣＮｎ１
タイプ：アミノ酸
長さ：５６０
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配列番号４
名称：Ｈ９－ＣＮｎ２
タイプ：アミノ酸
長さ：５６０
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配列番号５
名称：Ｈ９－ＣＮｎ３
タイプ：アミノ酸
長さ：５６０
ＭＥＶＶＳＬＩＴＩＬＬＶＶＴＶＳＮＡＤＫＩＣＩＧＹＱＳＴＮＳＴＥＴＶＤＴＬＴＥＮＮＶＰＶＴＨＡＫＥＬＬＨＴＥＨＮＧＭＬＣＡＴＳＬＧＱＰＬＩＬＤＴＣＴＩＥＧＬＩＹＧＮＰＳＣＤＬＳＬＥＧＲＥＷＳＹＩＶＥＲＰＳＡＶＮＧＬＣＹＰＧＮＶＥＮＬＥＥＬＲＳＬＦＳＳＡＲＳＹＱＲＩＱＩＦＰＤＴＩＷＮＶＳＹＤＧＴＳＴＡＣＳＧＳＦＹＲＳＭＲＷＬＴＱＫＮＮＡＹＰＩＱＤＡＱＹＴＮＮＱＧＫＮＩＬＦＭＷＧＩＮＨＰＰＴＤＴＴＱＲＮＬＹＴＲＴＤＴＴＴＳＶＡＴＥＥＩＮＲＩＦＫＰＬＩＧＰＲＰＬＶＮＧＬＭＧＲＩＤＹＹＷＳＶＬＫＰＧＱＴＬＲＩＫＳＤＧＮＬＩＡＰＷＹＧＨＩＬＳＧＥＳＨＧＲＩＬＫＴＤＬＫＲＧＳＣＴＶＱＣＱＴＥＫＧＧＬＮＴＴＬＰＦＱＮＶＳＫＹＡＦＧＮＣＳＫＹＩＧＩＫＳＬＫＬＡＶＧＬＲＮＶＰＳＲＳＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＳＧＬＶＡＧＷＹＧＦＱＨＳＮＤＱＧＶＧＭＡＡＤＲＤＳＴＱＫＡＩＤＫＩＴＳＫＶＮＮＩＶＤＫＭＮＫＱＹＥＩＩＤＨＥＦＳＥＶＥＴＲＬＮＭＩＮＮＫＩＤＤＱＩＱＤＩＷＡＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＱＫＴＬＤＥＨＤＡＮＶＮＮＬＹＮＫＶＫＲＡＬＧＴＮＡＶＥＤＧＫＧＣＦＥＬＹＨＫＣＤＤＱＣＭＥＴＩＲＮＧＴＹＮＲＲＫＹＱＥＥＳＫＬＥＲＱＫＩＥＧＶＫＬＥＳＥＧＴＹＫＩＬＴＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＩＡＭＧＦＡＡＦＬＦＷＡＭＳＮＧＳＣＲＣＮＩＣＩ
配列番号６
名称：Ｈ９－ＣＮｎ４
タイプ：アミノ酸
長さ：５６０
ＭＥＶＶＳＬＩＴＩＬＬＶＶＴＶＳＮＡＤＫＩＣＩＧＹＱＳＴＮＳＴＥＴＶＤＴＬＴＥＮＮＶＰＶＴＨＡＫＥＬＬＨＴＥＨＮＧＭＬＣＡＴＳＬＧＱＰＬＩＬＤＴＣＴＩＥＧＬＩＹＧＮＰＳＣＤＬＬＬＧＧＲＥＷＳＹＩＶＥＲＰＳＡＶＮＧＬＣＹＰＧＮＶＥＮＬＥＥＬＲＳＬＦＳＳＡＲＳＹＱＲＩＱＩＦＰＤＴＩＷＮＶＳＹＤＧＴＳＴＡＣＳＧＳＦＹＲＳＭＲＷＬＴＲＫＮＧＤＹＰＩＱＤＡＱＹＴＮＮＱＧＫＮＩＬＦＭＷＧＩＮＨＰＰＴＤＤＴＱＲＮＬＹＴＲＴＤＴＴＴＳＶＡＴＥＥＩＮＲＩＦＫＰＬＩＧＰＲＰＬＶＮＧＬＭＧＲＩＤＹＹＷＳＶＬＫＰＧＱＴＬＲＩＫＳＤＧＮＬＩＡＰＷＹＧＨＩＬＳＧＥＳＨＧＲＩＬＫＴＤＬＫＲＧＳＣＴＶＱＣＱＴＥＫＧＧＬＮＴＴＬＰＦＱＮＶＳＫＹＡＦＧＮＣＳＫＹＩＧＩＫＳＬＫＬＡＶＧＬＲＮＶＰＳＲＳＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＳＧＬＶＡＧＷＹＧＦＱＨＳＮＤＱＧＶＧＭＡＡＤＲＤＳＴＱＫＡＩＤＫＩＴＳＫＶＮＮＩＶＤＫＭＮＫＱＹＥＩＩＤＨＥＦＳＥＶＥＴＲＬＮＭＩＮＮＫＩＤＤＱＩＱＤＩＷＡＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＱＫＴＬＤＥＨＤＡＮＶＮＮＬＹＮＫＶＫＲＡＬＧＴＮＡＶＥＤＧＫＧＣＦＥＬＹＨＫＣＤＤＱＣＭＥＴＩＲＮＧＴＹＮＲＲＫＹＱＥＥＳＫＬＥＲＱＫＩＥＧＶＫＬＥＳＥＧＴＹＫＩＬＴＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＩＡＭＧＦＡＡＦＬＦＷＡＭＳＮＧＳＣＲＣＮＩＣＩ
配列番号７
名称：Ｈ９－ＣＮｎ５
タイプ：アミノ酸
長さ：５５９
ＭＥＶＶＳＬＩＴＩＬＬＶＶＴＶＳＮＡＤＫＩＣＩＧＹＱＳＴＮＳＴＥＴＶＤＴＬＴＥＮＮＶＰＶＴＨＡＫＥＬＬＨＴＥＨＮＧＭＬＣＡＴＳＬＧＱＰＬＩＬＤＴＣＴＩＥＧＬＩＹＧＮＰＳＣＤＬＳＬＥＧＲＥＷＳＹＩＶＥＲＰＳＡＶＮＧＬＣＹＰＧＮＶＥＮＬＥＥＬＲＳＬＦＳＳＡＲＳＹＱＲＩＱＩＦＰＤＴＩＷＮＶＳＹＤＧＴＳＴＡＣＳＧＳＦＹＲＳＭＲＷＬＴＲＫＮＧＤＹＰＩＱＤＡＱＹＴＮＮＱＧＫＮＩＬＦＭＷＧＩＮＨＰＰＴＤＤＴＱＲＮＬＹＴＲＴＤＴＴＴＳＶＡＴＥＥＩＮＲＩＦＫＰＬＩＧＰＲＰＬＶＮＧＬＭＧＲＩＤＹＹＷＳＶＬＫＰＧＱＴＬＲＩＫＳＤＧＮＬＩＡＰＷＹＧＨＩＬＳＧＥＳＨＧＲＩＬＫＴＤＬＫＲＧＳＣＴＶＱＣＱＴＥＫＧＧＬＮＴＴＬＰＦＱＮＶＳＫＹＡＦＧＮＣＳＫＹＩＧＩＫＳＬＫＬＡＶＧＬＲＮＶＰＳＲＳＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＳＧＬＶＡＧＷＹＧＦＱＨＳＮＤＱＧＶＧＭＡＡＤＲＤＳＴＱＫＡＩＤＫＩＴＳＫＶＮＮＩＶＤＫＭＮＫＱＹＥＩＩＤＨＥＦＳＥＶＥＴＲＬＮＭＩＮＮＫＩＤＤＱＩＱＤＩＷＡＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＱＫＴＬＤＥＨＤＡＮＶＮＮＬＹＮＫＶＫＲＡＬＧＴＮＡＶＥＤＧＫＧＣＦＥＬＹＨＫＣＤＤＱＣＭＥＴＩＲＮＧＴＹＮＲＲＫＹＱＥＥＳＫＬＥＲＱＫＩＥＧＶＫＬＥＳＥＧＴＹＫＩＬＴＩＳＦＡＩＳＣＦＬＬＣＶＶＬＬＧＦＩＭＷＡＣＱＮＧＳＣＲＣＮＩＣＩ
配列番号８
名称：Ｈ９－ＣＳ
タイプ：ヌクレオチド
長さ：１６８３
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配列番号９
名称：Ｈ９－ＣＮｎ１
タイプ：ヌクレオチド
長さ：１６８３
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配列番号１０
名称：Ｈ９－ＣＮｎ２
タイプ：ヌクレオチド
長さ：１６８３
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配列番号１１
名称：Ｈ９－ＣＮｎ３
タイプ：ヌクレオチド
長さ：１６８３
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配列番号：１２
名称：Ｈ９－ＣＮｎ４
タイプ：ヌクレオチド
長さ：１６８３
ａｔｇｇａａｇｔａｇｔａｔｃａｃｔａａｔａａｃｔａｔａｃｔａｃｔａｇｔａｇｔａａｃａｇｔａａｇｃａａｔｇｃａｇａｔａａａａｔｃｔｇｃａｔｃｇｇｃｔａｃｃａａｔｃａａｃａａａｃｔｃｃａｃａｇａａａｃｔｇｔｇｇａｃａｃａｃｔａａｃａｇａａａａｃａａｔｇｔｃｃｃｔｇｔｇａｃａｃａｔｇｃｃａａａｇａａｃｔｇｃｔｃｃａｃａｃａｇａｇｃａｔａａｔｇｇｇａｔｇｃｔｇｔｇｔｇｃａａｃａａｇｃｔｔｇｇｇａｃａａｃｃｔｃｔｔａｔｔｔｔａｇａｃａｃｃｔｇｃａｃｃａｔｔｇａａｇｇｇｃｔａａｔｃｔａｔｇｇｃａａｔｃｃｔｔｃｔｔｇｔｇａｔｃｔａｔｔｇｃｔｇｇｇａｇｇａａｇａｇａａｔｇｇｔｃｃｔａｔａｔｃｇｔｃｇａｇａｇａｃｃａｔｃａｇｃｔｇｔｔａａｃｇｇａｔｔｇｔｇｔｔａｃｃｃｃｇｇｇａａｔｇｔａｇａａａａｃｃｔａｇａａｇａｇｃｔａａｇｇｔｃａｃｔｔｔｔｔａｇｔｔｃｔｇｃｔａｇｇｔｃｔｔａｔｃａａａｇａａｔｃｃａｇａｔｔｔｔｃｃｃａｇａｃａｃａａｔｃｔｇｇａａｔｇｔｇｔｃｔｔａｃｇａｔｇｇａａｃａａｇｃａｃａｇｃａｔｇｃｔｃａｇｇｔｔｃａｔｔｃｔａｃａｇａａｇｃａｔｇａｇａｔｇｇｔｔｇａｃｔｃｇａａａｇａａｃｇｇｃｇａｔｔａｃｃｃｔａｔｃｃａａｇａｃｇｃｃｃａａｔａｃａｃａａａｔａａｔｃａａｇｇｇａａｇａａｃａｔｔｃｔｔｔｔｃａｔｇｔｇｇｇｇｃａｔａａａｔｃａｃｃｃａｃｃｃａｃｃｇａｔｇａｔａｃｇｃａｇａｇａａａｔｃｔｇｔａｃａｃｇａｇａａｃｃｇａｃａｃａａｃａａｃｇａｇｔｇｔｇｇｃａａｃａｇａａｇａａａｔａａａｔａｇｇａｔｃｔｔｃａａａｃｃａｔｔｇａｔａｇｇａｃｃａａｇｇｃｃｔｃｔｔｇｔｃａａｃｇｇｔｔｔｇａｔｇｇｇａａｇａａｔｔｇａｔｔａｔｔａｔｔｇｇｔｃｔｇｔａｔｔｇａａａｃｃｇｇｇｔｃａａａｃａｃｔｇｃｇａａｔａａａａｔｃｔｇａｔｇｇｇａａｔｃｔａａｔａｇｃｔｃｃａｔｇｇｔａｔｇｇａｃａｃａｔｔｃｔｔｔｃａｇｇａｇａｇａｇｃｃａｔｇｇａａｇａａｔｃｃｔｇａａｇａｃｔｇａｔｔｔａａａａａｇｇｇｇｔａｇｃｔｇｃａｃａｇｔｇｃａａｔｇｔｃａｇａｃａｇａｇａａａｇｇｔｇｇｃｔｔａａａｃａｃａａｃａｃｔｇｃｃａｔｔｃｃａａａａｔｇｔａａｇｔａａｇｔａｔｇｃａｔｔｔｇｇａａａｃｔｇｃｔｃａａａａｔａｃａｔｔｇｇｃａｔａａａｇａｇｔｃｔｃａａａｃｔｔｇｃａｇｔｔｇｇｔｃｔｇａｇｇａａｔｇｔｇｃｃｔｔｃｃａｇａｔｃｔａｇｔａｇａｇｇａｃｔａｔｔｃｇｇｇｇｃｃａｔａｇｃａｇｇａｔｔｃａｔａｇａｇｇｇａｇｇｔｔｇｇｔｃａｇｇｇｃｔａｇｔｔｇｃｔｇｇｔｔｇｇｔａｔｇｇａｔｔｃｃａｇｃａｔｔｃａａａｔｇａｃｃａａｇｇｇｇｔｔｇｇｔａｔｇｇｃａｇｃａｇａｔａｇａｇａｃｔｃａａｃｃｃａａａａｇｇｃａａｔｔｇａｔａａａａｔａａｃａｔｃｃａａａｇｔｇａａｔａａｃａｔａｇｔｇｇａｃａａａａｔｇａａｃａａｇｃａｇｔａｔｇａａａｔｔａｔｔｇａｔｃａｔｇａａｔｔｃａｇｔｇａｇｇｔｔｇａａａｃｔａｇａｃｔｔａａｃａｔｇａｔｃａａｔａａｔａａｇａｔｔｇａｔｇａｔｃａａａｔｔｃａａｇａｔａｔａｔｇｇｇｃａｔａｔａａｔｇｃａｇａａｔｔｇｃｔａｇｔｔｃｔｇｃｔｔｇａｇａａｃｃａｇａａａａｃａｃｔｃｇａｔｇａｇｃａｔｇａｔｇｃａａａｔｇｔａａａｔａａｔｃｔａｔａｔａａｔａａａｇｔｇａａｇａｇｇｇｃａｔｔｇｇｇｔａｃｃａａｔｇｃｇｇｔｇｇａａｇａｔｇｇｇａａａｇｇａｔｇｔｔｔｃｇａｇｃｔａｔａｃｃａｃａａａｔｇｔｇａｔｇａｃｃａｇｔｇｃａｔｇｇａｇａｃａａｔｔｃｇｇａａｃｇｇｇａｃｃｔａｃａａｃａｇｇａｇｇａａｇｔａｔｃａａｇａａｇａａｔｃａａａａｔｔａｇａａａｇｇｃａｇａａａａｔａｇａｇｇｇｇｇｔｃａａｇｃｔｇｇａａｔｃｔｇａａｇｇａａｃｔｔａｃａａａａｔｃｃｔｃａｃｃａｔｔｔａｔｔｃｇａｃｔｇｔｃｇｃｃｔｃａｔｃｔｃｔｔｇｔａａｔｔｇｃａａｔｇｇｇｇｔｔｔｇｃｔｇｃｃｔｔｃｔｔｇｔｔｃｔｇｇｇｃｃａｔｇｔｃｃａａｔｇｇｇｔｃｔｔｇｃａｇａｔｇｃａａｃａｔｔｔｇｔａｔａｔａａ
配列番号１３
名称：Ｈ９－ＣＮｎ５
タイプ：ヌクレオチド
長さ：１６８０
ａｔｇｇａａｇｔａｇｔａｔｃａｃｔａａｔａａｃｔａｔａｃｔａｃｔａｇｔａｇｔａａｃａｇｔａａｇｃａａｔｇｃａｇａｔａａａａｔｃｔｇｃａｔｃｇｇｃｔａｃｃａａｔｃａａｃａａａｃｔｃｃａｃａｇａａａｃｔｇｔｇｇａｃａｃａｃｔａａｃａｇａａａａｃａａｔｇｔｃｃｃｔｇｔｇａｃａｃａｔｇｃｃａａａｇａａｃｔｇｃｔｃｃａｃａｃａｇａｇｃａｔａａｔｇｇｇａｔｇｃｔｇｔｇｔｇｃａａｃａａｇｃｔｔｇｇｇａｃａａｃｃｔｃｔｔａｔｔｔｔａｇａｃａｃｃｔｇｃａｃｃａｔｔｇａａｇｇｇｃｔａａｔｃｔａｔｇｇｃａａｔｃｃｔｔｃｔｔｇｔｇａｔｃｔａｔｃｇｃｔｇｇａａｇｇａａｇａｇａａｔｇｇｔｃｃｔａｔａｔｃｇｔｃｇａｇａｇａｃｃａｔｃａｇｃｔｇｔｔａａｃｇｇａｔｔｇｔｇｔｔａｃｃｃｃｇｇｇａａｔｇｔａｇａａａａｃｃｔａｇａａｇａｇｃｔａａｇｇｔｃａｃｔｔｔｔｔａｇｔｔｃｔｇｃｔａｇｇｔｃｔｔａｔｃａａａｇａａｔｃｃａｇａｔｔｔｔｃｃｃａｇａｃａｃａａｔｃｔｇｇａａｔｇｔｇｔｃｔｔａｃｇａｔｇｇａａｃａａｇｃａｃａｇｃａｔｇｃｔｃａｇｇｔｔｃａｔｔｃｔａｃａｇａａｇｃａｔｇａｇａｔｇｇｔｔｇａｃｔｃｇａａａｇａａｃｇｇｃｇａｔｔａｃｃｃｔａｔｃｃａａｇａｃｇｃｃｃａａｔａｃａｃａａａｔａａｔｃａａｇｇｇａａｇａａｃａｔｔｃｔｔｔｔｃａｔｇｔｇｇｇｇｃａｔａａａｔｃａｃｃｃａｃｃｃａｃｃｇａｔｇａｔａｃｇｃａｇａｇａａａｔｃｔｇｔａｃａｃｇａｇａａｃｃｇａｃａｃａａｃａａｃｇａｇｔｇｔｇｇｃａａｃａｇａａｇａａａｔａａａｔａｇｇａｔｃｔｔｃａａａｃｃａｔｔｇａｔａｇｇａｃｃａａｇｇｃｃｔｃｔｔｇｔｃａａｃｇｇｔｔｔｇａｔｇｇｇａａｇａａｔｔｇａｔｔａｔｔａｔｔｇｇｔｃｔｇｔａｔｔｇａａａｃｃｇｇｇｔｃａａａｃａｃｔｇｃｇａａｔａａａａｔｃｔｇａｔｇｇｇａａｔｃｔａａｔａｇｃｔｃｃａｔｇｇｔａｔｇｇａｃａｃａｔｔｃｔｔｔｃａｇｇａｇａｇａｇｃｃａｔｇｇａａｇａａｔｃｃｔｇａａｇａｃｔｇａｔｔｔａａａａａｇｇｇｇｔａｇｃｔｇｃａｃａｇｔｇｃａａｔｇｔｃａｇａｃａｇａｇａａａｇｇｔｇｇｃｔｔａａａｃａｃａａｃａｃｔｇｃｃａｔｔｃｃａａａａｔｇｔａａｇｔａａｇｔａｔｇｃａｔｔｔｇｇａａａｃｔｇｃｔｃａａａａｔａｃａｔｔｇｇｃａｔａａａｇａｇｔｃｔｃａａａｃｔｔｇｃａｇｔｔｇｇｔｃｔｇａｇｇａａｔｇｔｇｃｃｔｔｃｃａｇａｔｃｔａｇｔａｇａｇｇａｃｔａｔｔｃｇｇｇｇｃｃａｔａｇｃａｇｇａｔｔｃａｔａｇａｇｇｇａｇｇｔｔｇｇｔｃａｇｇｇｃｔａｇｔｔｇｃｔｇｇｔｔｇｇｔａｔｇｇａｔｔｃｃａｇｃａｔｔｃａａａｔｇａｃｃａａｇｇｇｇｔｔｇｇｔａｔｇｇｃａｇｃａｇａｔａｇａｇａｃｔｃａａｃｃｃａａａａｇｇｃａａｔｔｇａｔａａａａｔａａｃａｔｃｃａａａｇｔｇａａｔａａｃａｔａｇｔｇｇａｃａａａａｔｇａａｃａａｇｃａｇｔａｔｇａａａｔｔａｔｔｇａｔｃａｔｇａａｔｔｃａｇｔｇａｇｇｔｔｇａａａｃｔａｇａｃｔｔａａｃａｔｇａｔｃａａｔａａｔａａｇａｔｔｇａｔｇａｔｃａａａｔｔｃａａｇａｔａｔａｔｇｇｇｃａｔａｔａａｔｇｃａｇａａｔｔｇｃｔａｇｔｔｃｔｇｃｔｔｇａｇａａｃｃａｇａａａａｃａｃｔｃｇａｔｇａｇｃａｔｇａｔｇｃａａａｔｇｔａａａｔａａｔｃｔａｔａｔａａｔａａａｇｔｇａａｇａｇｇｇｃａｔｔｇｇｇｔａｃｃａａｔｇｃｇｇｔｇｇａａｇａｔｇｇｇａａａｇｇａｔｇｔｔｔｃｇａｇｃｔａｔａｃｃａｃａａａｔｇｔｇａｔｇａｃｃａｇｔｇｃａｔｇｇａｇａｃａａｔｔｃｇｇａａｃｇｇｇａｃｃｔａｃａａｃａｇｇａｇｇａａｇｔａｔｃａａｇａａｇａａｔｃａａａａｔｔａｇａａａｇｇｃａｇａａａａｔａｇａｇｇｇｇｇｔｃａａｇｃｔｇｇａａｔｃｔｇａａｇｇａａｃｔｔａｃａａａａｔｃｃｔｃａｃｃａｔｔｔｃｃｔｔｔｇｃｃａｔａｔｃａｔｇｃｔｔｔｔｔｇｃｔｔｔｇｔｇｔｔｇｔｔｃｔａｔｔｇｇｇｇｔｔｃａｔｔａｔｇｔｇｇｇｃｃｔｇｃｃａｇａａｔｇｇｇｔｃｔｔｇｃａｇａｔｇｃａａｃａｔｔｔｇｔａｔａｔａａ
配列番号１４
名称：ニューカッスル病ウイルスＦ遺伝子
タイプ：ヌクレオチド
長さ：１６６２
ａｔｇｇｇｃｔｃｃａｇａｔｃｔｔｃｔａｃｃａｇｇａｔｃｃｃａｇｔａｃｃｔｃｔｇａｔｇｃｔｇａｃｃｇｔｃｃｇａａｔｃａｔｇｔｔｇｇｃａｃｔｇａｇｔｔｇｃｇｔｃｔｇｔｃｃｇａｃｃａｇｃｔｃｃｃｔｔｇａｔｇｇｃａｇｇｃｃｔｃｔｔｇｃａｇｃｔｇｃａｇｇｇａｔｔｇｔｇｇｔａａｃａｇｇａｇａｃａａａｇｃａｇｔｃａａｃａｔａｔａｃａｃｃｔｃａｔｃｔｃａｇａｃａｇｇｇｔｃａａｔｃａｔａａｔｃａａｇｔｔａｃｔｃｃｃａａａｔａｔｇｃｃｃａａｇｇａｔａａａｇａｇｇｃｇｔｇｔｇｃａａａａｇｃｃｃｃａｔｔｇｇａａｇｃａｔａｃａａｃａｇｇａｃａｔｔｇａｃｔａｃｔｔｔｇｃｔｃａｃｃｃｃｃｃｔｔｇｇｔｇａｔｔｃｔａｔｃｃｇｔａｇｇａｔａｃａａｇａｇｔｃｔｇｔｇａｃｃａｃａｔｃｃｇｇａｇｇａｇｇｇａａａｃａｇｇｇａｃｇｔｃｔｔａｔａｇｇｃｇｃｃａｔｔａｔｃｇｇｔｇｇｔｇｔａｇｃｔｃｔｃｇｇｇｇｔｔｇｃａａｃｃｇｃｔｇｃａｃａｇａｔａａｃａｇｃａｇｃｃｔｃｇｇｃｔｃｔｇａｔａｃａａｇｃｃａａｔｃａａａａｔｇｃｔｇｃｃａａｃａｔｃｃｔｃｃｇｇｃｔｃａａａｇａｇａｇｃａｔｔｇｃｔｇｃａａｃｃａａｔｇａｇｇｃｔｇｔｇｃａｃｇａｇｇｔｃａｃｔｇａｃｇｇａｔｔａｔｃａｃａａｃｔａｇｃａｇｔｇｇｃａｇｔｔｇｇｇａａｇａｔｇｃａｇｃａａｔｔｔｇｔｔａａｔｇａｃｃａｇｔｔｔａａｔａａａａｃａｇｃｔｃａｇｇａａｔｔｇｇａｃｔｇｔａｔａａａａａｔｔａｃａｃａｇｃａｇｇｔｔｇｇｔｇｔａｇａａｃｔｃａａｃｃｔｇｔａｃｃｔａａｃｔｇａａｔｔｇａｃｔａｃａｇｔａｔｔｃｇｇｇｃｃａｃａａａｔｃａｃｔｔｃｃｃｃｔｇｃｃｔｔａａｃｔｃａｇｃｔｇａｃｔａｔｃｃａｇｇｃｇｃｔｔｔａｃａａｔｃｔａｇｃｔｇｇｔｇｇｇａａｔａｔｇｇａｔｔａｃｔｔｇｔｔｇａｃｔａａｇｔｔａｇｇｔｇｔａｇｇａａａｃａａｃｃａａｃｔｃａｇｃｔｃａｔｔａａｔｔｇｇｔａｇｔｇｇｃｃｔｇａｔｔａｃｃｇｇｃａａｃｃｃｔａｔｃｃｔｇｔａｃｇａｃｔｃａｃａｇａｃｔｃａａｃｔｃｔｔｇｇｇｔａｔａｃａｇｇｔｃａｃｃｃｔａｃｃｃｔｃａｇｔｃｇｇｇａａｔｃｔａａａｔａａｔａｔｇｃｇｔｇｃｃａｃｃｔａｃｃｔｇｇａａａｃｃｔｔｇｔｃｔｇｔａａｇｔａｃａａｃｃａａａｇｇａｔｔｔｇｃｃｔｃａｇｃａｃｔｔｇｔｃｃｃａａａａｇｔａｇｔｇａｃａｃａｇｇｔｔｇｇｔｔｃｃｇｔｇａｔａｇａａｇａｇｃｔｔｇａｃａｃｃｔｃｇｔａｃｔｇｔａｔｃｇａｇａｃｃｇａｔｔｔｇｇａｃｃｔａｔａｔｔｇｔａｃａａｇａａｔａｇｔｇａｃａｔｔｃｃｃｔａｔｇｔｃｔｃｃｔｇｇｔａｔｔｔａｔｔｃｃｔｇｔｔｔｇａｇｔｇｇｃａａｔａｃａｔｃｔｇｃｔｔｇｃａｔｇｔａｔｔｃａａａｇａｃｔｇａａｇｇｃｇｃａｃｔｃａｃｔａｃｇｃｃｇｔａｔａｔｇａｃｃｃｔｃａａａｇｇｃｔｃａｇｔｔａｔｔｇｃｃａａｃｔｇｔａａｇａｔｇａｃａａｃａｔｇｔａｇａｔｇｔｇｃａｇａｃｃｃｃｃｃｇｇｇｔａｔｃａｔａｔｃｇｃａｇａａｔｔａｔｇｇａｇａａｇｃｔｇｔｇｔｃｔｃｔａａｔａｇａｔａｇｇｃａａｔｃａｔｇｃａａｔａｔｃｔｔａｔｃｃｔｔａｇａｃｇｇｇａｔａａｃｔｔｔｇａｇｇｃｔｃａｇｔｇｇｇｇａａｔｔｔｇａｔｇｃａａｃｔｔａｔｃａａａａｇａａｔａｔｃｔｃａａｔａｃａａｇａｔｔｃｔｃａａｇｔａａｔａｇｔｔａｃａｇｇｃａａｔｃｔｔｇａｃａｔｃｔｃｇａｃｔｇａｇｃｔｔｇｇｇａａｔｇｔｃａａｃａａｃｔｃｇａｔａａｇｔａａｔｇｃｔｔｔｇｇａｔａａｇｔｔａｇａｇｇａａａｇｃａａｃａｇｃａａａｃｔａｇａｃａａｇｇｔｃａａｔｇｔｔａａａｃｔｇａｃｃａｇｃａｃａｔｃｃｇｃｔｃｔｔａｔｔａｃｃｔａｔａｔｃｇｔｔｔｔａａｃｔｇｔｃａｔａｔｃｔｃｔｔｇｔａｔｇｔｇｇｔａｔａｃｔｔａｇｃｃｔｇｇｔｔｃｔａｇｃａｔｇｃｔａｃｃｔｇａｔｇｔａｃａａｇｃａａａａｇｇｃｇｃａａｃａｇａａｇａｃｃｔｔｇｔｔｇｔｇｇｃｔｔｇｇｇａａｔａａｔａｃｃｃｔａｇａｃｃａｇａｔｇａｇｇｇｃｃａｃｔａｃａａａａａｔｇｔｇａ
配列番号１５
名称：Ｐｅｃプロモータ
タイプ：ヌクレオチド
長さ：５７２
配列番号１６
名称：マウスサイトメガロウイルスｉｅ１プロモータ
タイプ：ヌクレオチド
長さ：５７２
配列番号１７
名称：ポリＡシグナル
タイプ：ヌクレオチド
長さ：８７
配列番号１８
名称：プライマ
タイプ：ヌクレオチド
長さ：２４
ｇｇｇｇａａｇｔｃｔ ｔｃｃｇｇｔｔａａｇ ｇｇａｃ
配列番号１９
名称：プライマ
タイプ：ヌクレオチド
長さ：２４
ｇｇｔｇｃａａｔｔｃ ｇｔａａｇａｃｃｇａ ｔｇｇｇ
配列番号２０
名称：プライマ
タイプ：ヌクレオチド
長さ：１９
ｇｃｇｃｇａｃｔｃｃ ａｔａｃａｔｔｇａ
配列番号２１
名称：プライマ
タイプ：ヌクレオチド
長さ：２４
ａｇｔｃｃａｃａｔｇ ｃａｃｃｃｃａｃｃｔ ａａａｃ
Claims (15)
- （ｉ）ウイルスゲノムの第１の挿入部位へと挿入された、ニューカッスル病ウイルスのＦタンパク質、又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）前記ウイルスゲノムの第２の挿入部位へと挿入された、サブタイプＨ９トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（Hemagglutinin：ＨＡ）タンパク質、又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列と、を含む、シチメンチョウの組換えヘルペスウイルス（recombinant Herpes Virus of Turkeys：ｒＨＶＴ）であって、前記第１の挿入部位及び第２の挿入部位が、ＵＬ４５とＵＬ４６との間の非コード領域から、及びＳＯＲＦ３とＵＳ２との間の非コード領域から選択される前記ウイルスゲノムの異なる非コード領域に位置する、シチメンチョウの組換えヘルペスウイルス（ｒＨＶＴ）。
- （ｉ）ＵＬ４５とＵＬ４６との間に位置する前記ウイルスゲノムの非コード領域へと挿入された、ニューカッスル病ウイルスのＦタンパク質、又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ＳＯＲＦ３とＵＳ２との間に位置する前記ウイルスゲノムの非コード領域へと挿入された、サブタイプＨ９トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質、又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列と、を含む、請求項１に記載のｒＨＶＴ。
- （ｉ）ＳＯＲＦ３とＵＳ２との間に位置する前記ウイルスゲノムの非コード領域へと挿入された、ニューカッスル病ウイルスのＦタンパク質、又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）ＵＬ４５とＵＬ４６との間に位置する前記ウイルスゲノムの非コード領域へと挿入された、サブタイプＨ９トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質、又はその免疫原性フラグメント若しくはバリアントをコードするヌクレオチド配列と、を含む、請求項１に記載のｒＨＶＴ。
- 前記ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質が、サブタイプＨ９Ｎ２トリインフルエンザウイルスのものである、請求項１～３のいずれか一項に記載のｒＨＶＴ。
- 前記ＨＡタンパク質をコードする前記配列が、配列番号８～１３から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載のｒＨＶＴ。
- 前記ＨＡタンパク質をコードする前記配列が、ＣＭＶ最初期プロモータ、好ましくはマウス又はヒトＣＭＶ最初期プロモータの制御下にある、請求項１～５のいずれか一項に記載のｒＨＶＴ。
- 前記ｍＣＭＶ ＩＥ１プロモータが、配列番号１５の配列を含む、請求項６に記載のｒＨＶＴ。
- 前記Ｆタンパク質をコードする前記配列が、Ｐｅｃプロモータの制御下にあり、好ましくは前記Ｐｅｃプロモータが、配列番号１４の配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のｒＨＶＴ。
- 請求項１～８のいずれか一項に記載のｒＨＶＴを含む、ワクチン。
- 家禽、好ましくはニワトリなどの鳥類にワクチン接種するために使用するための、請求項１～８のいずれか一項に記載のｒＨＶＴ。
- 配列番号２～７のいずれか１つから選択される配列を含むか、配列番号２～７のいずれか１つから本質的になるか、又は配列番号２～７のいずれか１つからなる、ポリペプチド。
- 好ましくは、核酸が、配列番号８～１３のいずれか１つから選択される配列を含むか、配列番号８～１３のいずれか１つから選択される配列から本質的になるか、又は配列番号８～１３のいずれか１つから選択される配列からなる、請求項１１に記載のポリペプチドをコードする核酸。
- 好ましくは、ベクターが、組換えウイルスである、請求項１２に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項１２に記載の核酸又は請求項１３に記載のベクターを含む、組換え細胞。
- 請求項１１に記載されるポリペプチド、又は請求項１２に記載される核酸、又は請求項１３若しくは請求項１４に記載されるベクター若しくは細胞を含む、ワクチン。
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