CN114369580A - 重组hvt及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及重组HVT及其用途。具体地，本发明涉及包含编码至少两种不同抗原的重组核苷酸序列的重组疱疹病毒。本发明特别适合用于生产疫苗，以免疫接种禽类物种对抗禽类病原体。

Description

重组HVT及其用途
技术领域
本发明涉及编码不同抗原的重组禽疱疹病毒及其用途。本发明适合用于生产疫苗以免疫接种禽类物种对抗禽类病原体。
背景技术
家禽的肉和蛋是重要的食物来源，它们的消费量由于人口的增长和它们极高的品质价格比而持续增加。为了确保家禽健康和食品安全，家禽疫苗技术已成为全球关注的问题。
表达病原体蛋白的病毒载体通常被用作家禽疫苗以对抗靶病原体。包括此类病毒载体的疫苗诱导外来病原体蛋白在被感染宿主中表达，这可能导致保护性免疫。
已经调查了许多不同类别的病毒作为用于禽类疫苗接种的候选载体，例如腺病毒、AAV、禽痘病毒、疱疹病毒等。
已经确定了三种类型的疱疹病毒，即MDV1、MDV2和MDV3(也被称为火鸡疱疹病毒(HVT))。在所述病毒之间存在高相似性(参见Kingham等，Journal of General Virology(2001)82,1123-1135)，并且它们都已被用于制备其中整合有源自于病原体的外来基因的重组病毒，以在禽类、特别是家禽例如鸡中用作疫苗。
尽管此类疫苗制剂对于疫苗接种禽类物种以对抗许多疾病提供了高效结果，但在用各自编码不同抗原的两种或更多种重组疱疹病毒注射禽类时，可能发生病原体之间的竞争和免疫抑制。
为了克服这种干扰并且也为了便于疫苗接种以对抗多种疾病，已做出了各种不同尝试来生产编码几种抗原的多价疱疹病毒。
第一批研究将几个基因插入到疱疹病毒基因组中的单一克隆位点中(参见例如EP1026246)。然而，此类构建物或者不提供所需的保护性免疫水平，或者被证明是不稳定的，在培养细胞中重复传代期间失去所有或一部分外来基因。
WO2013/144355和WO2020/127964报道了编码多种外来抗原的稳定的疱疹病毒，其使用位于病毒基因组的非编码区中的克隆位点的组合来获得。
WO2013/057236、WO2013/082327和WO2013/082317报道了设计多价HVT的另一种方法，其包括将至少一个基因克隆到疱疹病毒的US2编码序列内。
考虑到病原体和物种的数量，在本领域中对能够在体内稳定地表达多个基因并且适合于禽类、特别是家禽的疫苗接种的其他重组多价疱疹病毒，存在着需求。
发明内容
本发明提供了新的抗原和重组禽疱疹病毒。
具体来说，本发明提供了有效产生针对禽流感病毒的免疫应答的新的抗原。本发明还提供了编码所述抗原的核酸分子、含有所述核酸的载体、以及含有此类抗原和/或核酸和/或载体的疫苗。
本发明还提供了重组火鸡疱疹病毒(HVT)，其包含编码具有选自SEQ ID NO：1-6中的任一者的氨基酸序列的血凝素(HA)蛋白或其免疫原性片段或变体的核苷酸序列。优选地，所述核苷酸序列被插入到所述病毒基因组的非编码区中，所述非编码区更优选地选自UL45与UL46之间的非编码区和SORF3与US2之间的非编码区。
本发明还提供了重组火鸡疱疹病毒(HVT)，其包含：(i)插入到所述病毒基因组的第一插入位点中，编码具有选自SEQ ID NO：1-6中的任一者的氨基酸序列的血凝素(HA)蛋白或其免疫原性片段或变体的核苷酸序列；和(ii)插入到所述病毒基因组的第二插入位点中，编码新城疫病毒的F蛋白或其免疫原性片段或变体的核苷酸序列，所述第一和第二插入位点位于所述病毒基因组的选自以下的不同非编码区中：在UL45与UL46之间的非编码区、以及在SORF3与US2之间的非编码区。
本发明还涉及一种核酸，其包含如上所定义的重组HVT的基因组，并且还涉及含有这种核酸的载体(例如质粒)。
本发明还涉及一种细胞，其含有如上所定义的重组HVT或核酸或载体。
本发明的另一个目的是一种组合物，其包含如上所定义的重组HVT和适合的赋形剂或稀释剂。
本发明的另一个目的是一种组合物，其包含如上所定义的核酸或细胞和适合的赋形剂或稀释剂。
本发明的另一个目的在于一种疫苗，其包含免疫有效量的如上所定义的重组HVT、核酸和/或细胞。
本发明的另一个目的在于如上所定义的重组HVT、核酸或细胞，其用于免疫接种禽类例如家禽以对抗新城疫病毒(NDV)和禽流感病毒(AIV)和/或相关疾病。
本发明的另一个目的在于如上所定义的重组HVT、核酸或细胞，其用于保护禽类例如家禽以对抗由NDV和AIV引起的疾病。
本发明的另一个目的在于如上所定义的疫苗，其用于疫苗接种禽类例如家禽以对抗NDV和AIV。
本发明的另一个目的在于一种疫苗接种禽类的方法，所述方法包括向所述禽类给药如上所定义的组合物或疫苗或病毒。
本发明的另一个目的在于一种在禽类中诱导针对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向所述禽类给药如上所定义的组合物或疫苗或病毒。
本发明还提供了一种用于免疫接种禽类的疫苗接种试剂盒，其包含下述组分：
a.有效量的如上所定义的组合物或疫苗，和
b.用于将所述组合物或疫苗给药到所述禽类的工具。
本发明可以在任何禽类中用于疫苗接种以对抗NDV和/或AIV和/或相关障碍或病症。它特别适合于疫苗接种家禽例如鸡。
附图说明
图1示出了根据本发明的具有NDV F基因和AIV HA-H9基因的重组二价HVT构建物(FW206、FW209、FW247、FW248、FW249、FW250、FW251、FW252)和具有NDV F基因(FW168)或AIVHA-H9基因(FW202)的重组单价HVT构建物的示意图。
图2示出了免疫荧光测定法的结果，证实了rHVT/ND-H9构建物的(A)NDV F蛋白(绿色荧光)、(B)AIV HA-H9蛋白(红色荧光)和(C)合并的(黄色)表达。
图3示出了检测构建物FW168、FW206和FW209的NDV F蛋白表达的western印迹分析的结果。
图4示出了检测构建物FW206和FW209的AIV HA-H9蛋白表达的western印迹分析的结果。
图5示出了检测构建物FW247、FW248、FW249、FW250、FW251、FW252、FW168和FW206的NDV F蛋白表达的western印迹分析的结果。
图6示出了检测构建物FW247、FW248、FW249、FW250、FW251、FW252和FW206的AIVHA-H9蛋白表达的western印迹分析的结果。
图7示出了在用构建物FW206疫苗接种的鸡中使用商品化NDV ELISA试剂盒获得的NDV ELISA滴度。
图8示出了在用构建物FW206疫苗接种的鸡中的AIV H9 HI滴度。
图9示出了在用H9亚型的AIV激惹后，用构建物FW206疫苗接种的鸡的气管拭子中的AIV载量。
图10示出了在用H9亚型的AIV激惹后，用构建物FW206疫苗接种的鸡的气囊病变评分。
图11示出了在用构建物FW247、FW248、FW249、FW250、FW251和FW252疫苗接种的鸡中使用商品化NDV ELISA试剂盒获得的NDV ELISA滴度。
图12示出了在用构建物FW247、FW248、FW249、FW250、FW251和FW252疫苗接种的鸡中使用商品化NDV ELISA试剂盒获得的AIV H9 HI滴度。
发明详述
本发明提供了适合于产生针对AIV的强力免疫应答的新抗原。本发明还涉及重组禽疱疹病毒、它们的制造、包含它们的组合物及其用途。
定义
通过参考下面的定义，本公开将被最好地理解。
对于疱疹病毒来说，术语“重组的”是指其基因组已通过插入至少一个核苷酸序列(例如DNA，例如基因)而被修饰的疱疹病毒，所述插入的核苷酸序列不是天然存在于疱疹病毒的基因组中的，或者虽然天然存在于所述基因组中，但采取不同的形式或在不同的位置处。应该理解，所述重组疱疹病毒可以通过各种不同的方法例如本文中所描述的重组DNA技术来制造，并且一旦制造后可以在不继续使用重组DNA技术的情况下繁殖。
在本说明书中，术语“核酸”、“核酸序列”和“核苷酸序列”可互换使用，并且是指具有确定序列的核酸分子，可以是脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸。所述核苷酸序列可以首先通过例如重组、酶和/或化学技术来制备，随后在宿主细胞或体外系统中复制。核苷酸序列优选地包含编码分子(例如肽或蛋白质)的开放阅读框。所述核苷酸序列可以含有另外的序列例如启动子、转录终止子、信号肽、IRES等。
在本说明书中，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指包含至少两个连续氨基酸的聚合物的任何分子。
术语“非编码区”在本领域中是公知的，并且是指病毒基因组的不编码蛋白质的任何区域。所述在UL45(HVT053)与UL46(HVT054)之间的非编码区通常是指直接起始于UL45的终止密码子的3’并直接终止于UL46的终止密码子的5’的区域(因为两个ORF采取相反取向)。所述在SORF3(HVT087)与US2(HVT088)之间的非编码区通常是指直接起始于SORF3的起始密码子的3’并直接终止于US2的终止密码子的5’的区域。
抗原的“免疫原性片段”是指可以引发免疫应答的任何片段，优选为含有表位、优选抗原特异性表位的任何片段。免疫原性片段通常含有抗原的5至50个，例如5至40个或10至40个或10-30、10-25或10-20个连续氨基酸残基。本源F蛋白的片段的实例包括SEQ IDNO：7的10至40个连续氨基酸的任何片段。
当在本文中使用时，术语“变体”是指参比抗原或片段的保留其免疫原性性质的修饰形式。通常，变体与所述参比抗原或片段总体上相似并在许多区域中一致。例如，与所述参比抗原或片段相比，变体可以表现出至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性。变体特别是指与所述参比序列相比具有1、2、3、4或5个修饰的氨基酸残基的抗原。修饰包括氨基酸缺失、替换和/或添加。变体应当保留所述参比序列的免疫原性性质，例如诱导针对所述参比序列或病原体的免疫应答的能力。本源F蛋白的变体的实例包括包含SEQ ID NO：7或由SEQ ID NO：7构成并具有1、2或3个氨基酸替换的任何蛋白质。片段的变体的实例包括由SEQ ID NO：7的10至40个连续氨基酸构成并具有1、2、或3个氨基酸替换的蛋白质。
术语“禽类物种”打算涵盖所有种类的禽类，例如鸟纲的鸟类，即有羽毛、有翅、两足、温血和产卵的脊椎动物。在本发明的情形中，禽类或禽类物种更具体来说是指具有经济和/或农业利益的鸟类，例如家禽(例如鸡和火鸡)、水生家禽(例如鸭和鹅)和观赏鸟类(例如天鹅和鹦鹉)。
当在本文中使用时，术语“疫苗”是指可用于在生物体中引起、刺激或放大免疫应答的药剂。
AIV HA抗原
甲型流感病毒基于HA表面蛋白的血清学反应分成亚型。通过血凝素抑制试验来进行HA的血清亚型确定。对于AIV来说识别了十六个HA亚型，即HA1至HA16(David E.Swayne,David L.Suarez和Leslie D.Simes.(2013).Influenza.，在David E.Swayne主编的《家禽疾病》(Diseases of Poultry)第13版(pp.181-218)中)。任何AIV可以按照上述技术和通用知识容易地分类为任何这些亚型。亚型H9进一步包括被称为H9N2的特定亚类。亚型H9 AIV病毒株的实例包括A/turkey/Wisconsin/1/1966(H9N2)、A/Quail/Hong Kong/G1/1997(H9N2)和A/duck/Hong Kong/Y439/1997(H9N2)。
本发明人已设计并合成了具有强力免疫原性和交叉反应性的优化的H9 HA抗原。这些抗原被公开为H9-CNn1(SEQ ID NO：2)、H9-CNn2(SEQ ID NO：3)、H9-CNn3(SEQ ID NO：4)、H9-CNn4(SEQ ID NO：5)和H9-CNn5(SEQ ID NO：6)。所述优化的抗原具有广泛的交叉免疫原性，并且可以诱导针对AIV的强力免疫应答。因此，这些抗原代表了用于生产针对AIV感染和相关疾病的疫苗的强力药剂。
就此而言，本发明涉及一种包含选自SEQ ID NO：2-6的氨基酸序列、基本上由所述序列构成或由所述序列构成的多肽，以及在整个长度上与SEQ ID NO：2-6中的任一者具有至少97％、优选地至少98％、甚至更优选地至少99％的氨基酸序列同一性的任何多肽。氨基酸序列同一性可以使用任何已知的技术或计算机程序例如BLAST来确定。引用序列的变体优选是指与所述参比序列相比具有1、2、3、4或5个修饰的氨基酸残基的抗原。修饰包括氨基酸缺失、替换和/或添加。变体应当保留所述参比序列的免疫原性性质，例如诱导针对所述参比序列或病原体的免疫应答的能力。
本发明的一个具体目的是一种多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：2、基本上由所述序列构成或由所述序列构成。
本发明的另一个具体目的是一种多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：3、基本上由所述序列构成或由所述序列构成。
本发明的另一个具体目的是一种多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：4、基本上由所述序列构成或由所述序列构成。
本发明的另一个具体目的是一种多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：5、基本上由所述序列构成或由所述序列构成。
本发明的另一个具体目的是一种多肽，其包含氨基酸序列SEQ ID NO：6、基本上由所述序列构成或由所述序列构成。
本发明还涉及包含与组成部分(其可以是多肽)偶联的上述多肽的嵌合分子。
本发明还涉及编码如上所定义的多肽的核酸，以及含有此类核酸的任何载体或细胞。本发明的优选核酸分子包含选自SEQ ID NO：9-13中的任一者的序列、基本上由所述序列构成或由所述序列构成。
所述核酸可以被偶联到调控序列(例如启动子和/或终止子)和/或被包括在任何克隆或表达载体(例如质粒、病毒、BAC等)中。在优选实施方式中，所述载体是重组病毒，例如HVT。
重组HVT
本发明涉及一种重组HVT，其含有如上所定义的编码HA蛋白的核酸序列。
本发明还涉及一种重组HVT，其在特定位置中包含多个外来基因。更具体来说，本发明涉及一种重组HVT(rHVT)，其包含：
(i)插入到所述病毒基因组的第一插入位点中，编码具有选自SEQ ID NO：1-6中的任一者的氨基酸序列的血凝素(HA)蛋白或其免疫原性片段或变体的核苷酸序列；和
(ii)插入到所述病毒基因组的第二插入位点中，编码新城疫病毒的F蛋白或其免疫原性片段或变体的核苷酸序列；
所述第一和第二插入位点位于所述病毒基因组的选自以下的不同非编码区中：在UL45与UL46之间的非编码区、以及在SORF3与US2之间的非编码区。
在特定实施方式中，本发明涉及一种rHVT，其包含：
(i)插入到所述病毒基因组的位于UL45与UL46之间的非编码区中，编码具有选自SEQ ID NO：1-6中的任一者的氨基酸序列的血凝素(HA)蛋白或其免疫原性片段或变体的核苷酸序列；和
(ii)插入到所述病毒基因组的位于SORF3与US2之间的非编码区中，编码新城疫病毒的F蛋白或其免疫原性片段或变体的核苷酸序列。
在另一个特定实施方式中，本发明涉及一种rHVT，其包含：
(i)插入到所述病毒基因组的位于SORF3与US2之间的非编码区中，编码具有选自SEQ ID NO：1-6中的任一者的氨基酸序列的血凝素(HA)蛋白或其免疫原性片段或变体的核苷酸序列；和
(ii)插入到所述病毒基因组的位于UL45与UL46之间的非编码区中，编码新城疫病毒的F蛋白或其免疫原性片段或变体的核苷酸序列。
正如在实施例中所示，此类构建物在CEF细胞中经过至少10次、优选地至少15次、更优选地至少20次传代后遗传稳定。此类构建物在CEF细胞中经过至少10次、优选地至少15次、更优选地至少20次传代后也提供抗原的稳定共表达。它们可以在体内提供所述基因的强烈且长期持续的表达，足以产生高的保护性免疫。
更具体来说，本发明人证实了请求保护的rHVT正确地表达NDV F和AIV HA-H9抗原两者(图2-6)。本发明人也已证实，请求保护的rHVT以高的HI滴度高效诱导针对NDV F和AIVHA-H9的抗体(图7、8、11和12)。本申请中的数据还显示，用本发明的二价构建物进行疫苗接种的SPF鸡在激惹后受到非常高效的保护(例如高达96％)以对抗新城疫(ND)和AIV，并且与对照组相比，所有疫苗接种组均具有更低的AIV病毒载量。
因此，请求保护的rHVT提供了非常高效的临床保护以对抗NDV和AIV的激惹。因此，本发明提供了可用于保护禽类以对抗高度相关病原体和相关障碍的新的有效构建物。
本发明的重组HVT可以从任何HVT、优选非致病性HVT制备。适合用于本发明的HVT(MDV3)的非致病性病毒株的实例是FC126病毒株。FC126病毒株的基因组序列在本领域中可用(Afonso等，同上；Kingham等，同上)。另一种适合的HVT病毒株是例如PB1病毒株。任何其他非致病性病毒株也是适合的。
所述靶非编码区在病毒基因组中的位置可以由专业技术人员使用本申请的教导、公知常识、以及文献中可用的序列信息容易地鉴定。例如，Kingham等，同上，报道了FC126参比病毒株的核苷酸序列以及大多数ORF在所述基因组中的位置。
通过参考FC126完整基因组(GenBank：AF291866.1)，在UL45与UL46之间的非编码区对应于HVT基因组的第95323-95443位核苷酸，在SORF3与US2之间的非编码区对应于HVT基因组的第139867-140064位核苷酸。在所述区域内的任何位置处的克隆均适合于本发明。
NDV F蛋白
NDV F蛋白是新城疫病毒(也被称为1型禽副黏病毒)的F蛋白，其是一种I类病毒膜融合(F)糖蛋白，在病毒进入细胞期间介导细胞膜的穿透。NDV F是NDV的已知抗原。本源NDVF蛋白的氨基酸序列是公知的并公布在例如No.AAU89279、ABA39232和AAA46643下，其任何天然存在的变体(多态型、剪接变体等)也是公知的。示例性序列被提供为SEQ ID NO：7(蛋白质)和SEQ ID NO：14(核酸)。
由请求保护的rHVT编码的蛋白质可以是任何本源NDV F蛋白或其能够诱导抗NDV免疫应答的任何免疫原性片段或变体。
本源F蛋白的变体的实例包括包含SEQ ID NO：7或由SEQ ID NO：7构成，并具有1、2、或3个氨基酸替换的任何蛋白质。片段的变体的实例包括由SEQ ID NO：7的10至40个连续氨基酸构成，并具有1、2、或3个氨基酸替换的蛋白质。
其他重组序列
根据本发明所述的重组HVT还可以包含一个或多个另外的序列，其编码例如一种或多种抗原、细胞因子、激素、共刺激因子、佐剂等。
所述插入到基因组中的重组核苷酸序列可以采取任何取向。
启动子
所述插入的核酸序列可以含有(或可操作连接到)调控序列例如启动子和/或终止子。使用的启动子可以是合成或天然的、内源或异源的启动子。原则上可以使用任何启动子，只要它在靶细胞或宿主中能够有效发挥作用即可。就此而言，启动子可以是能够在多价载体的情形中在禽类细胞中指导基因转录的真核、原核、病毒或合成启动子。此外，每个插入的核酸序列可以含有启动子，它们可以是彼此相同或不同的。在特定实施方式中，每个插入的核酸序列含有不同的启动子。
优选地，用于每个插入的核酸序列的启动子选自Pec启动子、巨细胞病毒(CMV)立即早期1(ie1)启动子、特别是鼠类巨细胞病毒(Mcmv)ie1启动子或人类巨细胞病毒(Hcmv)启动子、鸡β-肌动蛋白(Bac)启动子、猴病毒40(SV40)启动子和劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子，或其保留启动子活性的任何片段。
优选地，所述NDV F编码序列和AIV HA编码序列在不同启动子的控制之下。
在优选实施方式中，本发明的rHVT中的一个编码序列被连接到Pec启动子。
在另一个优选实施方式中，本发明的rHVT中的一个编码序列被连接到CMV ie1启动子，特别是鼠类巨细胞病毒(Mcmv)ie1启动子或人类巨细胞病毒(Hcmv)启动子。
Pec启动子的核酸序列示出在SEQ ID NO：15中，Mcmv ie1启动子的序列示出在SEQID NO：16中。应该指出，这些编码功能性启动子的序列的变体是已知的和/或可以由专业技术人员设计/测试，以用于本发明。
在优选实施方式中，所述插入到位于UL45与UL46之间的非编码区中的重组核苷酸序列含有Pec启动子，并且所述插入到位于SORF3与US2之间的非编码区中的重组核苷酸序列含有CMV IE1启动子，特别是Mcmv ie1启动子。由本发明人获得的结果显示，在本发明的多价载体的情形中，这些启动子在位于所述克隆位点中时特别高效。
在另一个优选实施方式中，所述插入到位于UL45与UL46之间的非编码区中的外来基因含有CMV IE1启动子，特别是Mcmv ie1启动子，并且所述插入到位于SORF3与US2之间的非编码区中的重组核苷酸序列含有Pec启动子。由本发明人获得的结果显示，在本发明的多价载体的情形中，这些启动子在位于所述克隆位点中时特别高效。
优选地，本发明的重组HVT包含：(i)插入到UL45与UL46之间的非编码区中，在Pec启动子控制之下的编码新城疫病毒的F蛋白或其免疫原性片段或变体的核苷酸序列；和(ii)插入到SORF3与US2之间的非编码区中，在CMV IE1启动子、优选为Mcmv ie1启动子控制之下的编码具有选自SEQ ID NO：1-6中的任一者的氨基酸序列的血凝素(HA)蛋白的核苷酸序列。
在另一个优选实施方式中，本发明的重组HVT包含：(i)插入到UL45与UL46之间的非编码区中，在CMV IE1启动子、优选为Mcmv ie1启动子控制之下的编码具有选自SEQ IDNO：1-6中的任一者的氨基酸序列的血凝素(HA)蛋白的核苷酸序列；和(ii)插入到SORF3与US2之间的非编码区中，在Pec启动子控制之下的编码新城疫病毒的F蛋白或其免疫原性片段或变体的核苷酸序列。
在另一个实施方式中，根据本发明所述的重组HVT包含：(i)插入到UL45与UL46之间的非编码区中，在Pec启动子控制之下的编码新城疫病毒的F蛋白或其免疫原性片段或变体的核苷酸序列；和(ii)插入到SORF3与US2之间的非编码区中，在CMV IE1启动子、优选为Hcmv启动子控制之下的编码具有选自SEQ ID NO：1-6中的任一者的氨基酸序列的血凝素(HA)蛋白的核苷酸序列。
构建方法
本发明的重组HVT可以使用本身在本领域中已知的技术例如重组技术、同源重组、位点特异性插入、诱变等来制备。
基因克隆和质粒构建对于本领域普通技术人员来说是公知的，并且可以基本上通过标准的分子生物学技术来进行(《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)，第4版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Woodbury,N.Y.2012)。
疱疹病毒可以在任何适合的宿主细胞和培养基中繁殖。用于繁殖疱疹病毒的宿主和条件包括例如源自于鸡的细胞例如CEF(鸡胚成纤维细胞)、鸡肾细胞等。这些细胞可以在培养基例如Eagle's MEM、Leibowitz-L-15/McCoy 5A(1:1混合物)培养基中，在约37℃下培养3至4天。
基因组DNA可以按照任何常规方法从病毒感染的细胞提取。具体来说，在将蛋白质在裂解缓冲液中变性并移除后，可以使用苯酚和乙醇提取DNA。
通常，重组病毒可以通过病毒基因组与构建物(例如质粒)之间的同源重组来制备，所述构建物包含要插入的重组核苷酸序列或核酸，在其两侧具有来自于所述插入位点的核苷酸以允许重组。简单来说，首先将含有靶区域的序列克隆到质粒或其他适合的载体中。质粒的实例包括pBR322、pBR325、pBR327、pBR328、pUC18、pUC19、pUC7、pUC8和pUC9，噬菌体的实例包括λ噬菌体和M13噬菌体，粘粒的实例包括pHC79。被克隆的区域应该优选地具有足够的长度，以便在插入外来基因后，在所述外来基因两侧的序列具有适合的长度以允许与病毒基因组进行体外同源重组。优选地，每个侧翼序列应该具有至少大约50个核苷酸的长度。
为了将一个或多个重组核苷酸序列插入到所述靶区域中，可以在所述区域的特定位点处进行突变，以产生限制性酶的切割位点。进行突变的方法可以是常规方法，并且可以使用本领域技术人员常用的方法例如体外诱变和PCR。因此，在PCR方法中，可以在PCR引物中进行突变例如缺失、替换或添加1至2个核苷酸，然后使用所述引物来产生突变。或者，可以使用天然存在的限制性位点。然后将所述外来基因(和启动子)插入到所述质粒中所述病毒基因组的插入位点中。
可以使用任何适合的技术(例如电穿孔、磷酸钙、基于脂转染的方法等)将所得到的质粒引入到HVT感染的细胞或HVT基因组转染的细胞中。当待引入的质粒的量在0.1至1000μg的范围内时，在细胞中通过HVT基因组和所述质粒的同源区之间的重组产生重组病毒的效率变高。这引起所述质粒与病毒基因组之间的重组事件，导致所述重组核苷酸序列插入到所述病毒中。
所得到的重组病毒可以使用已知的选择技术通过基因型或表型进行选择，例如通过杂交、检测由与所述重组核酸序列一起共同整合的基因编码的酶活性、或者免疫学检测由所述重组疱疹病毒表达的抗原性肽。所选出的重组疱疹病毒可以在细胞培养中进行大规模培养。一旦产生后，所述病毒可以在适合的细胞中繁殖。
优选实施方式
下述重组HVT是本发明的优选特定实施方式。正如在实施例中所示，它们允许在体内产生针对由每个重组核苷酸序列编码的抗原的强烈免疫应答。
本发明的特别优选的重组HVT(rHVT)包含：(i)插入到UL45与UL46之间的非编码区中，在Pec启动子控制之下的编码新城疫病毒的F蛋白或其免疫原性片段或变体的核苷酸序列；和(ii)插入到SORF3与US2之间的非编码区中，在Mcmv ie1启动子控制之下的编码具有选自SEQ ID NO：1-6中的任一者的氨基酸序列的血凝素(HA)蛋白的核苷酸序列。优选地，正如在实验数据中所描述的，这种重组rHVT选自下述二价构建物：
·HVT/45-46PecF/87-88Mcmv ie1 H9-CN(FW206)，
·HVT/45-46PecF/87-88Mcmv ie1 H9-CNn1(FW247)，
·HVT/45-46PecF/87-88Mcmv ie1 H9-CNn2(FW248)，
·HVT/45-46PecF/87-88Mcmv ie1 H9-CNn3(FW249)，
·HVT/45-46PecF/87-88Mcmv ie1 H9-CNn4(FW250)，和
·HVT/45-46PecF/87-88Mcmv ie1 H9-CNn5(FW251)。
在优选实施方式中，根据本发明所述的rHVT含有编码F抗原或其天然存在的变体的核酸，所述F抗原包含氨基酸序列SEQ ID NO：7或基本上由氨基酸序列SEQ ID NO：7构成或由氨基酸序列SEQ ID NO：7构成。
在优选实施方式中，根据本发明所述的rHVT含有编码F抗原的核酸，所述核酸包含核酸序列SEQ ID NO：14或基本上由核酸序列SEQ ID NO：14构成或由核酸序列SEQ ID NO：14构成。
在另一个优选实施方式中，根据本发明所述的rHVT是HVT/45-46PecF/87-88Mcmvie1 H9-CNn3(FW249)，其包含SEQ ID NO：11的禽流感病毒H9亚型的人工设计的血凝素基因(H9-CNn3)。
在其他优选实施方式中，根据本发明所述的rHVT选自下述二价构建物：
·HVT/45-46PecF/87-88Mcmv ie1 H9-CNn1(FW247)，其包含SEQ ID NO：9的禽流感病毒H9亚型的人工设计的血凝素基因(H9-CNn1)，
·HVT/45-46PecF/87-88Mcmv ie1 H9-CNn2(FW248)，其包含SEQ ID NO：10的禽流感病毒H9亚型的人工设计的血凝素基因(H9-CNn2)，
·HVT/45-46PecF/87-88Mcmv ie1 H9-CNn4(FW250)，其包含SEQ ID NO：12的禽流感病毒H9亚型的人工设计的血凝素基因(H9-CNn4)，和
·HVT/45-46PecF/87-88Mcmv ie1 H9-CNn5(FW251)，其包含SEQ ID NO：13的禽流感病毒H9亚型的人工设计的血凝素基因(H9-CNn5)。
本发明的另一个优选rHVT包含：(i)插入到UL45与UL46之间的非编码区中，在Mcmvie1启动子控制之下的编码具有SEQ ID NO：1-6中的任一者的氨基酸序列的血凝素(HA)蛋白的核苷酸序列；和(ii)插入到SORF3与US2之间的非编码区中，在Pec启动子控制之下的编码新城疫病毒的F蛋白或其免疫原性片段或变体的核苷酸序列。优选地，正如在实验数据中所描述的，这种rHVT选自下述二价构建物：
·HVT/45-46Mcmv ie1 H9-CN/87-88PecF(FW209)。
在另一个实施方式中，根据本发明所述的rHVT包含：(i)插入到UL45与UL46之间的非编码区中，在Pec启动子控制之下的编码新城疫病毒的F蛋白或其免疫原性片段或变体的核苷酸序列；和(ii)插入到SORF3与US2之间的非编码区中，在Hcmv启动子控制之下的编码具有SEQ ID NO：1-6中的任一者的氨基酸序列的血凝素(HA)蛋白的核苷酸序列。优选地，正如在实验数据中所描述的，这种rHVT是二价构建物HVT/45-46PecF/87-88Hcmv H9-CNn1(FW252)。
本发明的特别优选的rHVT使用FC126或PB1病毒株来制备。
本发明的重组HVT可以在细胞培养物中繁殖。在优选实施方式中，CEF、含胚卵、鸡肾细胞等被用作繁殖重组HVT的宿主细胞。本发明的多价重组HVT可以在培养基例如Eagle's MEM、Leibowitz-L-15/McCoy 5A(1:1混合物)培养基中，在约37℃下培养3至4天。将由此获得的被感染细胞悬浮在含有10％二甲基亚砜(DMSO)的培养基中，并在液氮下冷冻储存。
有利的是，本发明的重组HVT呈现出高水平的稳定性。它们是遗传稳定的，这意味着它们在禽类物种的细胞、优选CEF细胞中，即使在10次或更多次传代后，优选地15次传代后，更优选地20次传代后，仍维持所插入的基因。它们也提供抗原的稳定表达，这意味着它们在禽类物种的细胞、优选CEF细胞中，即使在10次或更多次传代后，优选地15次传代后，甚至更优选地20次传代后，仍共表达所述抗原。在本发明的情形中，“传代”或“细胞传代”意味着将细胞在适合的条件下培养以允许它们生长并保持它们存活直至它们达到90％至100％合生。所述传代步骤包括将前一次汇合培养物的少量细胞转移到新的培养基中。可以将含有少量细胞的前一次汇合培养物的等分试样在大体积的新鲜培养基中稀释。
所述病毒可以使用常规技术来收集或纯化。可以将它们储存在任何适合的介质中，冷冻和/或冷冻干燥。
核酸和细胞
本发明的另一个目的涉及在如上所定义的病毒中含有的任何核酸。所述核酸可以是单链或双链的DNA或RNA或其变体。核酸的具体实例包括本发明的HVT的整个基因组。其他具体核酸是包含SEQ ID NO：9-13或由SEQ ID NO：9-13构成的基因。
本发明还涉及包含本发明的核酸的载体(例如质粒、粘粒、人工染色体等)。
本发明还涉及含有本发明的重组HVT、核酸或载体的细胞。所述细胞通常是真核细胞例如禽类细胞，或者是原核细胞(如果所述载体适合于在这些细胞类型中复制或维持的话)。
疫苗组合物
本发明还涉及组合物例如疫苗，其包含本发明的多价重组HVT、本发明的核酸或本发明的细胞。
本发明的疫苗通常在可药用介质中包含免疫有效量的如上所述的重组HVT。
根据本发明所述的组合物和疫苗通常包含适合的溶剂或稀释剂或赋形剂，例如水性缓冲液或磷酸盐缓冲液。所述组合物还可以含有添加剂，例如源自于动物的蛋白质或肽(例如激素、细胞因子、共刺激因子)、源自于病毒和其他来源的核酸(例如双链RNA、CpG)等，它们与所述疫苗一起以足以增强免疫应答的量给药。另外，上述物质的任何组合可能提供免疫增强效果，并因此可以形成本发明的免疫增强剂。
本发明的疫苗还可以与一种或多种其他添加剂一起配制以维持等渗性、生理pH和稳定性，例如缓冲剂如生理盐水(0.85％)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、柠檬酸盐缓冲剂、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、Tris缓冲的盐水等，或抗生素例如新霉素或链霉素等。
给药途径可以是任何途径，包括口服、眼部(例如通过滴眼液)、使用气溶胶的眼鼻给药、鼻内、泄殖腔、在饲料中、在水中、或通过喷雾、卵内、局部或通过注射(例如静脉内、皮下、肌肉内、眶内、眼内、真皮内和/或腹膜内)疫苗接种。专业技术人员将会容易地改造疫苗组合物的制剂以适应于每种类型的给药途径。
每剂疫苗可以含有足以在禽类物种中引发保护性免疫应答的适合的剂量。这种剂量的优化在本领域中是公知的。每剂的抗原量可以通过已知方法，使用抗原/抗体反应例如通过ELISA方法来确定。
取决于疫苗接种方案，本发明的疫苗可以作为单次药剂或重复药剂给药。
本发明的疫苗的另一个优点在于它们在疫苗接种3周后，为鸟类物种提供针对靶禽类病原体的高达100％的保护。
本发明还涉及如上所述的疫苗的用途，其用于免疫接种禽类物种例如家禽以对抗病原体。
本发明还涉及一种通过给药免疫有效量的根据本发明所述的疫苗对禽类物种进行免疫接种的方法。有利的是，所述疫苗可以真皮内、皮下、肌肉内、口服、卵内、通过粘膜给药或通过眼鼻给药来给药。
本发明还涉及用于对禽类物种进行免疫接种的疫苗接种试剂盒，其包含有效量的如上所述的多价疫苗和用于将所述组分给药到所述物种的工具。例如，此类试剂盒包含装填有根据本发明所述的多价疫苗的注射装置，以及用于真皮内、皮下、肌肉内或卵内注射的使用说明。可选地，所述试剂盒包含装填有根据本发明所述的多价疫苗的喷雾/气溶胶或滴眼装置，以及用于眼鼻给药、口服或粘膜给药的使用说明。
现在将在下面的实施例中公开本申请的其他方面和优点，所述实施例用于说明本发明。
实施例
在下面的实施例中制备并使用重组HVT(rHVT)。它们按照下述命名法来命名：
-HVT/插入位点，启动子，插入的抗原(单价构建物)；
-HVT/第一插入位点，第一启动子，第一插入的抗原/第二插入位点，第二启动子，第二插入的抗原(二价构建物)。
在实施例中制备和使用的rHVT的名单：
FW168：HVT/45-46PecF(单价)
FW202：HVT/45-46Mcmv ie1 H9-CN(单价)
FW206：HVT/45-46PecF/87-88Mcmv ie1 H9-CN(二价)
FW209：HVT/45-46Mcmv ie1 H9-CN/87-88PecF(二价)
FW247：HVT/45-46PecF/87-88Mcmv ie1 H9-CNn1(二价)
FW248：HVT/45-46PecF/87-88Mcmv ie1 H9-CNn2(二价)
FW249：HVT/45-46PecF/87-88Mcmv ie1 H9-CNn3(二价)
FW250：HVT/45-46PecF/87-88Mcmv ie1 H9-CNn4(二价)
FW251：HVT/45-46PecF/87-88Mcmv ie1 H9-CNn5(二价)
FW252：HVT/45-46PecF/87-88Hcmv H9-CNn1(二价)
实施例1：禽流感病毒H9亚型的血凝素的优化的抗原蛋白的设计和合成
设计并合成了如下几种AIV H9亚型抗原，以使H9N2 AIV分离株中的保护范围最大化。收集了几种H9病毒株的序列，包括7株2016年的中国分离株。在这些H9序列的基础上进行了计算机蛋白质建模分析。更具体来说，优化的抗原是在本文中命名为H9-CN的来自于A/chicken/Henan/H24/2011的HA基因序列(GenBank登记号JN804297)(SEQ ID NO：1)的基础上设计的。
设计并选出了5种优化的抗原，被称为H9-CNn1-4(SEQ ID NO：2)、H9-CNn2(SEQ IDNO：3)、H9-CNn3(SEQ ID NO：4)、H9-CNn4(SEQ ID NO：5)。H9-CNn5(SEQ ID NO：6)通过将H9-CNn1的跨膜结构域(TM)用H3亚型的AIV的TM代替来设计，以便进一步提高分子稳定性和交叉反应性。
H9-CNn1-5的氨基酸序列分别被提供为SEQ ID NO：2-6。
编码H9-CNn1-5的核酸序列分别被提供为SEQ ID NO：9-13。
实施例2：重组HVT的构建
2.1.同源载体的构建
质粒构建基本上通过标准分子生物学技术来进行(《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第4版，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,USA,2012)。
p45/46Mcmv ie1 H9-CN的构建
鼠类巨细胞病毒(Mcmv)ie1启动子(SEQ ID NO：16)被合成在基于pUC18的载体中，产生pGI Mcmv ie1。
polyA信号(SPA：SEQ ID NO：17)也被合成，并插入到用SalI和SfiI切开的pGIMcmv ie1中，产生pGI Mcmv ie1 SPA。通过BglI消化从pGI Mcmv ie1 SPA切下所述Mcmvie1启动子–SPA盒，并将其插入到p45/46Sfi(WO03/064595)的SfiI位点中，产生p45/46Mcmvie1SPA。
合成并使用实施例1中提到的基因序列H9-CN(SEQ ID NO：8)。将这个HA序列用XbaI和SalI消化，然后插入到XbaI和SalI切开的p45/46Mcmv ie1 SPA中，产生p45/46Mcmvie1 H9-CN SPA。
pHVT87-88 Mcmv ie1 H9-CN的构建
通过BglI消化将所述Mcmv ie1启动子–SPA盒从pGI Mcmv ie1SPA切下，并插入到pHVT87-88(WO2013/144355)的SfiI位点中，产生pHVT87-88 Mcmv ie1 SPA。然后，将用XbaI和SalI消化的H9-CN基因插入到XbaI和SalI切开的pHVT87-88 Mcmv ie1 SPA中，产生pHVT87-88 Mcmv ie1 H9-CN SPA。
pHVT87-88 PecF的构建
通过BglI消化从p45/46PecF(WO03/064595)获取Pec启动子–新城疫病毒(NDV)F基因–SV40 polyA盒，并将其克隆到SfiI消化的pHVT87-88中，产生pHVT87-88 PecF。使用的NDV F基因包含SEQ ID NO：14。
pHVT87-88 Mcmv ie1 H9-CNn1至CNn5的构建
使用实施例1中合成的H9-CNn1(SEQ ID NO：9)、H9-CNn2(SEQ ID NO：10)、H9-CNn3(SEQ ID NO：11)、H9-CNn4(SEQ ID NO：12)和H9-CNn5(SEQ ID NO：13)基因。将这些基因克隆到XbaI和SalI切开的pHVT87-88 Mcmv ie1 SPA中，产生pHVT87-88 Mcmv ie1H9-CNn1SPA、pHVT87-88 Mcmv ie1 H9-CNn2 SPA、pHVT87-88 Mcmv ie1 H9-CNn3 SPA、pHVT87-88Mcmv ie1 H9-CNn4 SPA和pHVT87-88Mcmv ie1 H9-CNn5 SPA。
pHVT87-88 cmv H9-CNn1的构建
通过BglI和XbaI消化从pGICMVpA(WO2008/121329)获取人类巨细胞病毒(Hcmv)启动子，并将其插入到BglI和XbaI切开的pHVT87-88 Mcmv ie1 H9-CNn1 SPA中，产生pHVT87-88 Hcmv H9-CNn1 SPA。
2.2重组HVT的构建
在培养的细胞中通过同源重组来进行重组HVT(rHVT)的构建。如Morgan等(AvianDiseases,34:345-351,1990)所描述的，从用亲代HVT感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)制备HVTDNA。使用Nucleofector II(Lonza,Basel,Switzerland)，通过电穿孔将大约2μg所述HVTDNA和1μg同源载体之一转染到大约107个CEF细胞中。将转染的细胞添加到Leibovitz’s L-15(Life Technologies Corp.，目录号41300-39)、McCoy’s 5A培养基(Life TechnologiesCorp.，目录号21500-061)(1:1)和4％小牛血清(LM(+)培养基)中，在96孔组织培养板中铺板，并在37℃和4-5％CO2中温育5-7天，直至HVT噬斑变得可见。然后通过胰蛋白酶处理将细胞从板上脱离，等量转移到两块含有CEF的96孔板，并温育3至5天，直至观察到噬斑。通过只染色表达抗原蛋白NDV F蛋白或AIV HA蛋白的噬斑的黑色噬斑测定法进行筛选。简单来说，将两块板之一用甲醇：丙酮混合物(1:2)固定，并与兔抗NDV F蛋白血清或鸡抗HA(H9)血清温育。然后将所述板与生物素标记的抗兔IgG抗体(Vector Laboratories，目录号BA-1000)或生物素标记的抗鸡IgY抗体(Vector Laboratories，目录号BA-9010)温育，最后与VECTASTAIN ABC-AP试剂盒(Vector Laboratories，目录号AK-5000)温育。表达所述抗原的噬斑通过添加NBT/BCIP溶液(Roche Applied Science，目录号1681451)进行染色。鉴定含有染色的重组噬斑的孔，并将另一块96孔板上相应的孔中的细胞用胰蛋白酶处理。然后将所述细胞在新鲜的次生CEF细胞中稀释并转移到新的96孔板，以完成第一轮纯化。重复所述纯化程序，直至在黑色噬斑测定法中所有噬斑均被阳性染色。为每种构建物分离多个克隆。
所构建的rHVT、它们的亲代病毒和使用的同源载体的名单提供在下面的表1中。使用HVT病毒株FC126。示出了所述rHVT的基因组结构的图示被提供在图1中。对于表达NDV F基因和AIV HA-H9基因两者的二价rHVT(rHVT/ND-H9)的构建来说，使用从含有一个抗原基因的rHVT提取的病毒DNA重复上述构建过程。
表1：构建的rHVT、亲代病毒和同源载体
构建物编码 亲代病毒 同源载体
FW168(单价) HVT FC-126病毒株 p45/46PecF
FW202(单价) HVT FC-126病毒株 p45/46Mcmv ie1 H9-CN SPA
FW206(二价) FW168 pHVT87-88 Mcmv ie1 H9-CN SPA
FW209(二价) FW202 pHVT87-88 PecF
FW247(二价) FW168 pHVT87-88 Mcmv ie1 H9-CNn1 SPA
FW248(二价) FW168 pHVT87-88 Mcmv ie1 H9-CNn2 SPA
FW249(二价) FW168 pHVT87-88 Mcmv ie1 H9-CNn3 SPA
FW250(二价) FW168 pHVT87-88 Mcmv ie1 H9-CNn4 SPA
FW251(二价) FW168 pHVT87-88 Mcmv ie1 H9-CNn5 SPA
FW252(二价) FW168 pHVT87-88 Hcmv H9-CNn1 SPA
实施例3：插入的抗原被重组HVT的表达
在实施例2中制备的rHVT构建物的NDV F蛋白和/或AIV HA-H9蛋白的表达通过免疫荧光测定法(IFA)和Western印迹分析来确认。对于IFA来说，将具有rHVT噬斑的CEF单层用甲醇：丙酮混合物(1:2)固定，并与兔抗NDV F蛋白血清和鸡抗HA(H9)血清的混合物温育。然后将所述板与Alexa Fluor 488抗兔IgG抗体(Invitrogen，目录号A-11008)和AlexaFluor 546抗鸡IgY抗体(Invitrogen，目录号A-11040)的混合物温育，并在荧光显微镜下观察。使用每种rHVT观察到特异性绿色(F蛋白)或红色(HA-H9蛋白)荧光，证实了这些rHVT表达所述抗原蛋白。此外，还证实了二价rHVT/ND-H9构建物的每个噬斑表达F和HA-H9抗原两者(图2)。
使用被所述重组病毒感染的CEF细胞和兔抗NDV F蛋白血清或鸡抗HA(H9)血清来进行Western印迹。简单来说，将6孔板中的CEF细胞用所述重组病毒之一或亲代HVT病毒株以约0.1的感染复数感染。在接种后三天，用胰蛋白酶收获细胞并将其以913x g离心5分钟。将沉积物用PBS清洗并用100μl PBS重悬浮。在添加相同体积的2x SDS样品缓冲液(130mMTris-Cl(pH6.8)，6％SDS，20％甘油，10％2-巯基乙醇和0.01％溴酚蓝)后，将细胞悬液煮沸5分钟。使用10％聚丙烯酰胺凝胶将所述样品通过SDS-PAGE进行分离，并转移到PVDF膜(Immobilon-P,Millipore)。将所述膜完全干燥，然后与兔抗NDV F蛋白血清或鸡抗HA(H9)血清温育。在洗掉抗体后，将所述膜与生物素标记的抗兔IgG抗体(Vector Laboratories，目录号BA-1000)或生物素标记的抗鸡IgY抗体(Vector Laboratories，目录号BA-9010)温育，然后与VECTASTAIN ABC-AP试剂盒(Vector Laboratories，目录号AK-5000)温育。通过添加NBT/BCIP溶液将与抗体结合的蛋白可视化。如图3至6中所示，只在使用重组病毒感染的细胞的道中观察到对应于NDV F蛋白的60千道尔顿(kDa)的蛋白条带或对应于AIV HA-H9蛋白的70kDa的蛋白条带，确认了实施例2中制备的rHVT构建物表达预期尺寸的抗原蛋白。
实施例4：重组HVT的基因组结构的验证
通过扩增两个被插入的区域(UL45/UL46和SORF3/US2)的两个PCR反应，验证了在实施例2中制备的rHVT构建物的基因组结构。在所述PCR反应中使用的引物对，对于UL45/UL46来说是SEQ ID NO：18(5’-GGGGAAGTCTTCCGGTTAAGGGAC-3’)和SEQ ID NO：19(5’-GGTGCAATTCGTAAGACCGATGGG-3’)，对于SORF3/US2来说是SEQ ID NO：20(5’-GCGCGACTCCATACATTGA-3’)和SEQ ID NO：21(5’-AGTCCACATGCACCCCACCTAAAC-3’)。使用所有所述rHVT时均观察到含有插入基因的PCR产物的预期尺寸，证实了这些重组HVT具有预期的基因组结构。
实施例5：重组HVT的遗传稳定性
将实施例2中制备的rHVT构建物在CEF中传代20次并测试遗传稳定性。在20x传代后，将所有rHVT如实施例4中所述通过PCR测试基因组结构，并且如实施例3中所述通过IFA和western印迹测试抗原蛋白的表达。所有rHVT构建物通过PCR显示出维持所插入的基因，并通过IFA和western印迹显示出表达所述抗原蛋白，证实了这些rHVT是遗传稳定的并提供稳定的抗原表达。
实施例6：用FW206进行疫苗接种的鸡中的抗体滴度
调查了构建物FW206诱导针对NDV F和AIV HA-H9的抗体的能力。将大约1,000个噬斑形成单位(PFU)的rHVT构建物皮下给药到1日龄的无特定病原体的(SPF)鸡。在2至5周龄之间每周收集血清并测试针对抗原的特异性抗体。使用ID Screen新城疫间接ELISA试剂盒(ID Vet)来测试针对NDV F的抗体。如图7中所示，FW206诱导针对NDV F蛋白的抗体。如在OIE Terrestrial Manual 2018的第3.3.4章(禽流感)中所述，使用失活的H9亚型的AIV，通过血凝素抑制(HI)试验来测试针对AIV HA-H9的抗体。据显示，在2至5周龄之间，FW206诱导HI滴度(图8)。
实施例7：在用FW206进行疫苗接种的鸡中在17日龄时激惹后针对ND的保护
调查了构建物FW206(HVT/45-46PecF/87-88Mcmv ie1 H9-CN)对抗使用烈性NDV病毒株的激惹的功效。将1日龄的SPF鸡用大约1,000PFU的rHVT/ND-H9构建物之一进行皮下疫苗接种。在17日龄时将所述鸡用105ELD50的烈性NDV Herts 33/56病毒株通过肌肉内注射进行激惹，并观察新城疫(ND)的临床体征14天。FW206在非常早期就提供了针对所述激惹的接近90％的保护。
表2：在用FW206进行疫苗接种的SPF鸡中在17日龄时激惹后针对ND的保护
组号 组 鸡的数目 具有ND临床体征的数目 保护％
1 FW206 15 2 87％
2 NICC 10 10 0％
NICC＝未免疫接种的激惹的阳性对照
实施例8：在用FW206进行疫苗接种的鸡中在21日龄时激惹后针对ND的保护
调查了FW206对抗使用烈性NDV病毒株的激惹的功效。将1日龄的SPF鸡用大约400PFU的rHVT构建物进行皮下疫苗接种。在21日龄时将所述鸡用105ELD50的烈性NDV Herts33/56病毒株通过肌肉内注射进行激惹，并观察新城疫(ND)的临床体征14天。结果显示在下面的表3中，并证实了超过70％的疫苗接种的鸡受到保护。
表3：在用FW206进行疫苗接种的SPF鸡中在21日龄时激惹后针对ND的保护
组号 组 鸡的数目 具有ND临床体征的数目 保护％
1 FW206 24 7 71％
62 NICC 12 12 0％
NICC＝未免疫接种的激惹的阳性对照
实施例9：在用FW206进行疫苗接种的鸡中在25日龄时激惹后针对AI的保护
在商品化肉鸡中调查了FW206对抗使用AIV H9亚型的激惹的功效。将1日龄的商品化肉鸡用大约1,000PFU的FW206进行皮下疫苗接种。在25日龄时，将所述鸡用107EID50的AIVA/chicken/Saudi Arabia/D1816/1/1/2011(H9N2)病毒株通过气管内和鼻内途径激惹。在激惹后5天收集气管样品，并用于通过qPCR分析进行AIV定量。在激惹后11天，对所述鸡进行尸检并评估气囊中的病变。如图9中所示，与对照组相比，疫苗接种组具有更低的病毒载量。FW206疫苗接种组中的AIV载量比激惹对照中的AIV载量低0.5log(图9)。疫苗接种组中的气囊病变评分也显著低于激惹对照组(图10)。这些结果证实了请求保护的构建物针对使用AIV H9亚型的激惹提供了保护。
实施例10：用FW247、FW248、FW249、FW250、FW251或FW252进行疫苗接种的鸡中的抗体滴度
调查了构建物FW247、FW248、FW249、FW250、FW251和FW252诱导针对NDV F和AIVHA-H9的抗体的能力。将大约3,000个PFU的rHVT构建物皮下给药到1日龄的SPF鸡。在2和3周龄时收集血清并测试针对抗原的特异性抗体。使用ID Screen新城疫间接ELISA试剂盒(IDVet)来测试针对NDV F的抗体。使用失活的H9亚型的AIV，通过HI试验来测试针对AIV HA-H9的抗体。测试的所有构建物均诱导针对NDV F蛋白(图11)和AIV HA-H9(图12)两者的抗体。构建物FW249似乎诱导高的F抗体和HA-H9抗体。
实施例11：在用FW249进行疫苗接种的鸡中在21日龄时激惹后针对ND的保护
调查了构建物FW249对抗使用烈性NDV病毒株的激惹的功效。将1日龄的SPF鸡用大约2,500PFU的rHVT/ND-H9构建物之一进行皮下疫苗接种。在21日龄时将所述鸡用105ELD50的烈性NDV Herts33/56病毒株通过肌肉内注射进行激惹，并观察新城疫(ND)的临床体征14天。结果提供在表4中。
表4：在用FW249进行疫苗接种的SPF鸡中在21日龄时激惹后针对ND的保护
组号 组 鸡的数目 具有ND临床体征的数目 保护％
1 FW249 13 1 92％
2 NICC 13 13 0％
NICC＝未免疫接种的激惹的阳性对照
序列表
<110> 浙江诗华诺倍威生物技术有限公司（ZHEJIANG CEVA EBVAC BIOTECH CO.,LTD）
北京华都诗华生物制品有限公司（Beijing Ceva Huadu Biological Co., Ltd.）
<120> 重组HVT及其用途
<130> B3389
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 560
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H9-CN
<400> 1
Met Glu Val Val Ser Leu Ile Thr Ile Leu Leu Val Val Thr Val Ser
1 5 10 15
Asn Ala Asp Lys Ile Cys Ile Gly Tyr Gln Ser Thr Asn Ser Thr Glu
20 25 30
Thr Val Asp Thr Leu Thr Glu Asn Asn Val Pro Val Thr His Ala Lys
35 40 45
Glu Leu Leu His Thr Glu His Asn Gly Met Leu Cys Ala Thr Ser Leu
50 55 60
Gly His Pro Leu Ile Leu Asp Thr Cys Thr Ile Glu Gly Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Gly Asn Pro Ser Cys Asp Leu Leu Leu Gly Gly Arg Glu Trp Ser Tyr
85 90 95
Ile Val Glu Arg Pro Ser Ala Val Asn Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Asn
100 105 110
Val Glu Asn Leu Glu Glu Leu Arg Ser Leu Phe Ser Ser Ala Arg Ser
115 120 125
Tyr Gln Arg Ile Gln Ile Phe Pro Asp Thr Ile Trp Asn Val Ser Tyr
130 135 140
Ser Gly Thr Ser Lys Ala Cys Ser Asp Ser Phe Tyr Arg Ser Met Arg
145 150 155 160
Trp Leu Thr Gln Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Ile Gln Asp Ala Gln Tyr
165 170 175
Thr Asn Asn Gln Glu Lys Asn Ile Leu Phe Met Trp Gly Ile Asn His
180 185 190
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195 200 205
Thr Thr Ser Val Ala Thr Glu Glu Ile Asn Arg Thr Phe Lys Pro Leu
210 215 220
Ile Gly Pro Arg Pro Leu Val Asn Gly Leu Gln Gly Arg Ile Asp Tyr
225 230 235 240
Tyr Trp Ser Val Leu Lys Pro Gly Gln Thr Leu Arg Ile Arg Ser Asn
245 250 255
Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Gly His Ile Leu Ser Gly Glu Ser
260 265 270
His Gly Arg Ile Leu Lys Thr Asp Leu Lys Arg Gly Ser Cys Thr Val
275 280 285
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290 295 300
Asn Val Ser Lys Tyr Ala Phe Gly Asn Cys Ser Lys Tyr Ile Gly Ile
305 310 315 320
Lys Ser Leu Lys Leu Ala Val Gly Leu Arg Asn Val Pro Ser Arg Ser
325 330 335
Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp
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Ser Gly Leu Val Ala Gly Trp Tyr Gly Phe Gln His Ser Asn Asp Gln
355 360 365
Gly Val Gly Met Ala Ala Asp Arg Asp Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp
370 375 380
Lys Ile Thr Ser Lys Val Asn Asn Ile Val Asp Lys Met Asn Lys Gln
385 390 395 400
Tyr Glu Ile Ile Asp His Glu Phe Ser Glu Val Glu Thr Arg Leu Asn
405 410 415
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Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gln Lys Thr Leu Asp Glu
435 440 445
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Gly Thr Asn Ala Val Glu Asp Gly Lys Gly Cys Phe Glu Leu Tyr His
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Lys Cys Asp Asp Gln Cys Met Glu Thr Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asn
485 490 495
Arg Arg Lys Tyr Gln Glu Glu Ser Lys Leu Glu Arg Gln Lys Ile Glu
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Gly Val Lys Leu Glu Ser Glu Gly Thr Tyr Lys Ile Leu Thr Ile Tyr
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Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Ile Ala Met Gly Phe Ala Ala Phe
530 535 540
Leu Phe Trp Ala Met Ser Asn Gly Ser Cys Arg Cys Asn Ile Cys Ile
545 550 555 560
<210> 2
<211> 560
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H9-CNn1
<400> 2
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1 5 10 15
Asn Ala Asp Lys Ile Cys Ile Gly Tyr Gln Ser Thr Asn Ser Thr Glu
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Gly Gln Pro Leu Ile Leu Asp Thr Cys Thr Ile Glu Gly Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Gly Asn Pro Ser Cys Asp Leu Ser Leu Glu Gly Arg Glu Trp Ser Tyr
85 90 95
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165 170 175
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Met Ile Asn Asn Lys Ile Asp Asp Gln Ile Gln Asp Ile Trp Ala Tyr
420 425 430
Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gln Lys Thr Leu Asp Glu
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<210> 3
<211> 560
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H9-CNn2
<400> 3
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<400> 12
atggaagtag tatcactaat aactatacta ctagtagtaa cagtaagcaa tgcagataaa 60
atctgcatcg gctaccaatc aacaaactcc acagaaactg tggacacact aacagaaaac 120
aatgtccctg tgacacatgc caaagaactg ctccacacag agcataatgg gatgctgtgt 180
gcaacaagct tgggacaacc tcttatttta gacacctgca ccattgaagg gctaatctat 240
ggcaatcctt cttgtgatct attgctggga ggaagagaat ggtcctatat cgtcgagaga 300
ccatcagctg ttaacggatt gtgttacccc gggaatgtag aaaacctaga agagctaagg 360
tcacttttta gttctgctag gtcttatcaa agaatccaga ttttcccaga cacaatctgg 420
aatgtgtctt acgatggaac aagcacagca tgctcaggtt cattctacag aagcatgaga 480
tggttgactc gaaagaacgg cgattaccct atccaagacg cccaatacac aaataatcaa 540
gggaagaaca ttcttttcat gtggggcata aatcacccac ccaccgatga tacgcagaga 600
aatctgtaca cgagaaccga cacaacaacg agtgtggcaa cagaagaaat aaataggatc 660
ttcaaaccat tgataggacc aaggcctctt gtcaacggtt tgatgggaag aattgattat 720
tattggtctg tattgaaacc gggtcaaaca ctgcgaataa aatctgatgg gaatctaata 780
gctccatggt atggacacat tctttcagga gagagccatg gaagaatcct gaagactgat 840
ttaaaaaggg gtagctgcac agtgcaatgt cagacagaga aaggtggctt aaacacaaca 900
ctgccattcc aaaatgtaag taagtatgca tttggaaact gctcaaaata cattggcata 960
aagagtctca aacttgcagt tggtctgagg aatgtgcctt ccagatctag tagaggacta 1020
ttcggggcca tagcaggatt catagaggga ggttggtcag ggctagttgc tggttggtat 1080
ggattccagc attcaaatga ccaaggggtt ggtatggcag cagatagaga ctcaacccaa 1140
aaggcaattg ataaaataac atccaaagtg aataacatag tggacaaaat gaacaagcag 1200
tatgaaatta ttgatcatga attcagtgag gttgaaacta gacttaacat gatcaataat 1260
aagattgatg atcaaattca agatatatgg gcatataatg cagaattgct agttctgctt 1320
gagaaccaga aaacactcga tgagcatgat gcaaatgtaa ataatctata taataaagtg 1380
aagagggcat tgggtaccaa tgcggtggaa gatgggaaag gatgtttcga gctataccac 1440
aaatgtgatg accagtgcat ggagacaatt cggaacggga cctacaacag gaggaagtat 1500
caagaagaat caaaattaga aaggcagaaa atagaggggg tcaagctgga atctgaagga 1560
acttacaaaa tcctcaccat ttattcgact gtcgcctcat ctcttgtaat tgcaatgggg 1620
tttgctgcct tcttgttctg ggccatgtcc aatgggtctt gcagatgcaa catttgtata 1680
taa 1683
<210> 13
<211> 1680
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> H9-CNn5
<400> 13
atggaagtag tatcactaat aactatacta ctagtagtaa cagtaagcaa tgcagataaa 60
atctgcatcg gctaccaatc aacaaactcc acagaaactg tggacacact aacagaaaac 120
aatgtccctg tgacacatgc caaagaactg ctccacacag agcataatgg gatgctgtgt 180
gcaacaagct tgggacaacc tcttatttta gacacctgca ccattgaagg gctaatctat 240
ggcaatcctt cttgtgatct atcgctggaa ggaagagaat ggtcctatat cgtcgagaga 300
ccatcagctg ttaacggatt gtgttacccc gggaatgtag aaaacctaga agagctaagg 360
tcacttttta gttctgctag gtcttatcaa agaatccaga ttttcccaga cacaatctgg 420
aatgtgtctt acgatggaac aagcacagca tgctcaggtt cattctacag aagcatgaga 480
tggttgactc gaaagaacgg cgattaccct atccaagacg cccaatacac aaataatcaa 540
gggaagaaca ttcttttcat gtggggcata aatcacccac ccaccgatga tacgcagaga 600
aatctgtaca cgagaaccga cacaacaacg agtgtggcaa cagaagaaat aaataggatc 660
ttcaaaccat tgataggacc aaggcctctt gtcaacggtt tgatgggaag aattgattat 720
tattggtctg tattgaaacc gggtcaaaca ctgcgaataa aatctgatgg gaatctaata 780
gctccatggt atggacacat tctttcagga gagagccatg gaagaatcct gaagactgat 840
ttaaaaaggg gtagctgcac agtgcaatgt cagacagaga aaggtggctt aaacacaaca 900
ctgccattcc aaaatgtaag taagtatgca tttggaaact gctcaaaata cattggcata 960
aagagtctca aacttgcagt tggtctgagg aatgtgcctt ccagatctag tagaggacta 1020
ttcggggcca tagcaggatt catagaggga ggttggtcag ggctagttgc tggttggtat 1080
ggattccagc attcaaatga ccaaggggtt ggtatggcag cagatagaga ctcaacccaa 1140
aaggcaattg ataaaataac atccaaagtg aataacatag tggacaaaat gaacaagcag 1200
tatgaaatta ttgatcatga attcagtgag gttgaaacta gacttaacat gatcaataat 1260
aagattgatg atcaaattca agatatatgg gcatataatg cagaattgct agttctgctt 1320
gagaaccaga aaacactcga tgagcatgat gcaaatgtaa ataatctata taataaagtg 1380
aagagggcat tgggtaccaa tgcggtggaa gatgggaaag gatgtttcga gctataccac 1440
aaatgtgatg accagtgcat ggagacaatt cggaacggga cctacaacag gaggaagtat 1500
caagaagaat caaaattaga aaggcagaaa atagaggggg tcaagctgga atctgaagga 1560
acttacaaaa tcctcaccat ttcctttgcc atatcatgct ttttgctttg tgttgttcta 1620
ttggggttca ttatgtgggc ctgccagaat gggtcttgca gatgcaacat ttgtatataa 1680
<210> 14
<211> 1662
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F基因
<400> 14
atgggctcca gatcttctac caggatccca gtacctctga tgctgaccgt ccgaatcatg 60
ttggcactga gttgcgtctg tccgaccagc tcccttgatg gcaggcctct tgcagctgca 120
gggattgtgg taacaggaga caaagcagtc aacatataca cctcatctca gacagggtca 180
atcataatca agttactccc aaatatgccc aaggataaag aggcgtgtgc aaaagcccca 240
ttggaagcat acaacaggac attgactact ttgctcaccc cccttggtga ttctatccgt 300
aggatacaag agtctgtgac cacatccgga ggagggaaac agggacgtct tataggcgcc 360
attatcggtg gtgtagctct cggggttgca accgctgcac agataacagc agcctcggct 420
ctgatacaag ccaatcaaaa tgctgccaac atcctccggc tcaaagagag cattgctgca 480
accaatgagg ctgtgcacga ggtcactgac ggattatcac aactagcagt ggcagttggg 540
aagatgcagc aatttgttaa tgaccagttt aataaaacag ctcaggaatt ggactgtata 600
aaaattacac agcaggttgg tgtagaactc aacctgtacc taactgaatt gactacagta 660
ttcgggccac aaatcacttc ccctgcctta actcagctga ctatccaggc gctttacaat 720
ctagctggtg ggaatatgga ttacttgttg actaagttag gtgtaggaaa caaccaactc 780
agctcattaa ttggtagtgg cctgattacc ggcaacccta tcctgtacga ctcacagact 840
caactcttgg gtatacaggt caccctaccc tcagtcggga atctaaataa tatgcgtgcc 900
acctacctgg aaaccttgtc tgtaagtaca accaaaggat ttgcctcagc acttgtccca 960
aaagtagtga cacaggttgg ttccgtgata gaagagcttg acacctcgta ctgtatcgag 1020
accgatttgg acctatattg tacaagaata gtgacattcc ctatgtctcc tggtatttat 1080
tcctgtttga gtggcaatac atctgcttgc atgtattcaa agactgaagg cgcactcact 1140
acgccgtata tgaccctcaa aggctcagtt attgccaact gtaagatgac aacatgtaga 1200
tgtgcagacc ccccgggtat catatcgcag aattatggag aagctgtgtc tctaatagat 1260
aggcaatcat gcaatatctt atccttagac gggataactt tgaggctcag tggggaattt 1320
gatgcaactt atcaaaagaa tatctcaata caagattctc aagtaatagt tacaggcaat 1380
cttgacatct cgactgagct tgggaatgtc aacaactcga taagtaatgc tttggataag 1440
ttagaggaaa gcaacagcaa actagacaag gtcaatgtta aactgaccag cacatccgct 1500
cttattacct atatcgtttt aactgtcata tctcttgtat gtggtatact tagcctggtt 1560
ctagcatgct acctgatgta caagcaaaag gcgcaacaga agaccttgtt gtggcttggg 1620
aataataccc tagaccagat gagggccact acaaaaatgt ga 1662
<210> 15
<211> 557
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pec启动子
<400> 15
tgcagagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagy 60
tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgccggctga ccgcccaacg acccccgccc 120
attgacgtca ataatgacgt atgytcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg 180
tcaatgggtg gagtayttac ggtaaactgc ccattggcag tacatcaagt gtatcatatg 240
ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatgga tgcagtattt tgtgcagcga 300
tgggggcggg gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg 360
ggcgaggcgg agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt 420
tatggcgagg cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgggagt 480
cgctgcgcgc tgccttcgcc ccgtgccccg ctccgccgcc gcctcgcgcc gcccgccccg 540
gctctgactg accgcgt 557
<210> 16
<211> 572
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mcmv-ie1启动子
<400> 16
ggccaataag gctgcagtac tgagtcatta gggactttcc aatgggtttt gcccagtaca 60
taaggtcaat aggggtgaat caacaggaaa gtcccattgg agccaagtac actgagtcaa 120
tagggacttt ccattgggtt ttgcccagta caaaaggtca atagggggtg agtcaatggg 180
tttttcccat tattggcacg tacataaggt caataggggt gagtcattgg gtttttccag 240
ccaatttaat taaaacgcca tgtactttcc caccattgac gtcaatgggc tattgaaact 300
aatgcaacgt gacctttaaa cggtactttc ccatagctga ttaatgggaa agtaccgttc 360
tcgagccaat acacgtcaat gggaagtgaa agggcagcca aaacgtaaca ccgccccggt 420
tttcccctgg aaattccata ttggcacgca ttctattggc tgagctgcgt tctacgtggg 480
tataagaggc gcgaccagcg tcggtaccgt cgcagtcttc ggtctgacca ccgtagaacg 540
cagagctcct cgctgcaggc ggccgctcta ga 572
<210> 17
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> polyA信号
<400> 17
ctgcaggcgg ccgctctaga gtcgacaata aaagatcttt attttcatta gatctgtgtg 60
ttggtttttt gtgtggccaa taaggcc 87
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
ggggaagtct tccggttaag ggac 24
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 19
ggtgcaattc gtaagaccga tggg 24
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 20
gcgcgactcc atacattga 19
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 21
agtccacatg caccccacct aaac 24

Claims (20)

1.一种重组火鸡疱疹病毒(rHVT)，其包含：(i)插入到所述病毒基因组的第一插入位点中，编码具有选自SEQ ID NO：1-6中的任一者的氨基酸序列的血凝素(HA)蛋白或其免疫原性片段或变体的核苷酸序列；和(ii)插入到所述病毒基因组的第二插入位点中，编码新城疫病毒的F蛋白或其免疫原性片段或变体的核苷酸序列，所述第一插入位点和第二插入位点位于所述病毒基因组的选自以下的不同非编码区中：在UL45与UL46之间的非编码区、以及在SORF3与US2之间的非编码区。
2.根据权利要求1所述的rHVT，其中编码血凝素(HA)蛋白或其免疫原性片段或变体的核苷酸序列被插入到所述病毒基因组的位于SORF3与US2之间的非编码区中，并且其中所述编码新城疫病毒的F蛋白或其免疫原性片段或变体的核苷酸序列被插入到所述病毒基因组的位于UL45与UL46之间的非编码区中。
3.根据权利要求1所述的rHVT，其中编码血凝素(HA)蛋白或其免疫原性片段或变体的核苷酸序列被插入到所述病毒基因组的位于UL45与UL46之间的非编码区中，并且其中所述编码新城疫病毒的F蛋白或其免疫原性片段或变体的核苷酸序列被插入到所述病毒基因组的位于SORF3与US2之间的非编码区中。
4.根据权利要求1至3中的任一项所述的rHVT，其中所述新城疫病毒的F蛋白包含SEQID NO：7的氨基酸序列或由SEQ ID NO：7的氨基酸序列构成。
5.根据权利要求1至4中的任一项所述的rHVT，其中编码HA蛋白的核苷酸序列选自SEQID NO：8至13中的任一者。
6.根据权利要求1至5中的任一项所述的rHVT，其中编码HA蛋白的核苷酸序列在CMV立即早期启动子的控制之下。
7.根据权利要求6所述的rHVT，其中所述CMV立即早期启动子是鼠类或人类CMV立即早期启动子。
8.根据权利要求7所述的rHVT，其中所述mCMV IE1启动子包含SEQ ID NO：16的序列。
9.根据权利要求1至8中的任一项所述的rHVT，其中编码F蛋白的核苷酸序列在Pec启动子的控制之下。
10.根据权利要求9所述的rHVT，其中所述Pec启动子包含SEQ ID NO：15的序列。
11.一种疫苗，其包含根据权利要求1至10中的任一项所述的rHVT。
12.根据权利要求1至10中的任一项所述的rHVT，其用于疫苗接种禽类例如家禽，优选为鸡。
13.一种用于免疫接种禽类的疫苗接种试剂盒，所述试剂盒包含下述组分：
a)有效量的根据权利要求11所述的疫苗，和
b)用于将所述疫苗给药到所述禽类的工具。
14.一种多肽，其包含选自SEQ ID NO：2至6中的任一者的序列、基本上由所述序列构成或由所述序列构成。
15.一种核酸，其编码根据权利要求14所述的多肽。
16.根据权利要求15所述的核酸，其包含选自SEQ ID NO：9至13中的任一者的序列、基本上由所述序列构成或由所述序列构成。
17.一种载体，其包含根据权利要求15或16所述的核酸。
18.根据权利要求17所述的载体，其是重组病毒。
19.一种重组细胞，其包含根据权利要求15或16所述的核酸或根据权利要求17或18所述的载体。
20.一种疫苗，其包含根据权利要求14所述的多肽或根据权利要求15或16所述的核酸或根据权利要求17至20中的任一项所述的载体或细胞。
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