CN113226363A

CN113226363A - 含有多个外来基因的重组禽疱疹病毒

Info

Publication number: CN113226363A
Application number: CN201980085130.0A
Authority: CN
Inventors: 藤泽步
Original assignee: French Shihua Pharmaceutical Factory
Current assignee: French Shihua Pharmaceutical Factory; Ceva Sante Animale SA
Priority date: 2018-12-21
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2021-08-06
Also published as: CA3123174A1; KR20210108971A; BR112021012032A2; MX2021007408A; EP3897709A1; PH12021551428A1; CO2021007958A2; ZA202103810B; JP2022515172A; WO2020127964A1; US20220040287A1; PE20220232A1

Abstract

本发明涉及含有多个插入到单独的基因间区域中的基因的重组禽疱疹病毒、所述重组禽疱疹病毒的制造方法、包括所述重组禽疱疹病毒的组合物以及所述重组禽疱疹病毒的用途。

Description

含有多个外来基因的重组禽疱疹病毒

技术领域

本发明涉及已插入至少两个重组核苷酸序列的重组疱疹病毒和其用途。本发明特别适用于产生可以诱导对一种或多种禽病原体或一种或多种疾病的保护性免疫的多价病毒或组合物，如疫苗。

背景技术

家禽的肉和蛋是重要的食物来源，其消耗由于人口的增长和其巨大的性价比而不断增加。为了确保家禽健康以及食品安全和保障，家禽疫苗技术已成为全球关注。

通常使用表达病原体蛋白的病毒载体作为针对靶标病原体的家禽疫苗。包含此类病毒载体的疫苗会在受感染宿主体内诱导外来病原体蛋白的表达，这可能会导致保护性免疫。

已研究了许多不同类别的病毒，作为用于对禽类动物进行疫苗接种的候选载体，如腺病毒、AAV、禽痘病毒、疱疹病毒等。

已经确定了三种类型的疱疹病毒MDV1、MDV2和MDV3(也被称为火鸡疱疹病毒(HVT))。所述病毒之间存在高度相似性(参见Kingham等人,《普通病毒学杂志(Journal ofGeneral Virology)》(2001)82,1123-1135)，并且其均已用于制备重组病毒，其中已整合了衍生自病原体的外来基因，以用作禽类动物，具体地如鸡等家禽的疫苗。

尽管此类疫苗制剂为针对许多疾病对禽类物种进行疫苗接种提供了有效的结果，但是当对禽类动物注射两种或更多种重组疱疹病毒时，病原体之间可能存在竞争和免疫抑制，每种重组疱疹病毒都对不同抗原进行编码。

为了克服此干扰以及还促进针对多种疾病的疫苗接种，已经进行了各种尝试来产生对几种抗原进行编码的多价疱疹病毒。

首先研究了在疱疹病毒基因组的单个克隆位点中插入几个基因(参见例如，EP1026246)。然而，此类构建体不能提供期望水平的保护性免疫，或证明不稳定，外来基因中的所有或部分外来基因在培养细胞中重复传代期间缺失。

WO2013/144355报道了对使用位于病毒基因组的非编码区域中的克隆位点的组合获得的多种外来抗原进行编码的稳定疱疹病毒。

WO2013/057236、WO2013/082327和WO2013/082317报道了通过在疱疹病毒的US2编码序列内克隆至少一个基因来设计多价HVT的另一种方法。根据这些申请，US2对于病毒的复制不是必需的，但是此性质未得到证实。

考虑到病原体和物种的数量，本领域需要可以在体内稳定表达多个基因并且适用于禽类动物，具体地家禽的疫苗接种的另外的重组多价疱疹病毒。

发明内容

本发明提供了在病毒基因组的至少两个单独位置中含有多个重组核苷酸序列的重组禽疱疹病毒。

更具体地，本发明提供了包括至少第一和第二重组核苷酸序列的重组火鸡疱疹病毒(HVT)，每个重组核苷酸序列都对多肽进行编码，其中所述第一重组核苷酸序列插入到病毒基因组的位于HVT053(UL45)与HVT054(UL46)之间的基因间区域中，并且其中所述第二重组核苷酸序列插入到病毒基因组的位于HVT064(LORF3)与HVT070之间，尤其是HVT064(LORF3)与HVT065(UL55)之间、HVT065(UL55)与HVT066(LORF4)之间、HVT066(LORF4)与HVT067(LORF5)之间、HVT067(LORF5)与HVT069(LORF6)之间或HVT069(LORF6)与HVT070之间，甚至更具体地HVT065(UL55)与HVT066(LORF4)之间的基因间区域。

每个重组核苷酸可以对相同或不同的多肽，尤其是抗原、细胞因子、佐剂、激素等进行编码。在一个特定实施例中，每个重组核苷酸对可以相同或不同(或同一抗原的相同或不同部分)并且可以来自同一病原体或来自不同病原体的抗原进行编码。一种或多种抗原可以选自或衍生自例如一种或多种所述病原体的表面蛋白、分泌蛋白或结构蛋白，或其免疫原性片段。

本发明还涉及包括如以上定义的重组HVT的基因组的核酸，以及含有此核酸的载体(如质粒)。

本发明进一步涉及一种含有如上定义的重组HVT或核酸或载体的细胞。

本发明的另外的目的是一种包括如上定义的重组HVT和合适的赋形剂或稀释剂的组合物。

本发明的另外的目的是一种包括如上定义的核酸或细胞和其合适的赋形剂或稀释剂的组合物。

本发明的另一个目的在于一种包括如上所定义的有效免疫量的重组HVT、核酸和/或细胞的疫苗。

本发明的另外的目的在于一种如上定义的用于使禽类动物，如家禽获得对病原体的免疫的重组HVT、核酸或细胞。

本发明的另外的目的在于一种如上定义的用于保护禽类动物，如家禽免受由病原体引起的疾病的影响的重组HVT、核酸或细胞。

本发明的另外的目的在于一种如上定义的用于针对一种或多种病原体对禽类动物，如家禽进行疫苗接种的疫苗。

本发明的另外的目的在于一种用于对禽类动物进行疫苗接种的方法，所述方法包括向所述禽类动物施用如上定义的组合物或疫苗或病毒。

本发明的另外的目的在于一种用于诱导对禽类动物体内的抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向所述禽类动物施用如上定义的组合物或疫苗或病毒。

本发明还提供了一种用于使禽类动物获得免疫的疫苗接种试剂盒，所述疫苗接种试剂盒包括以下组成部分：

a.如上定义的有效量的组合物或疫苗；以及

b.用于对所述禽类动物施用所述组合物或疫苗的装置。

本发明可用于任何禽类动物，用于针对任何禽病原体进行疫苗接种。其特别适用于对家禽，如鸡进行疫苗接种。

附图说明

图1展示了HVT基因组的示意图(1A)。标记了独特长(UL)45(HVT053)和UL 46(HVT054)的位置以及独特长HVT064-070的位置。可以在HVT053(UL45)与HVT054(UL46)之间以及HVT064与065之间、和/或HVT065与066、和/或HVT066与067、和/或HVT067与069和/或HVT069与070之间的PCR生成的SfiI位点处插入重组核苷酸序列。还呈现了根据本发明的特定实施例的整合了核苷酸序列和启动子的不同簇的HVT构建体(1B)。

图2A示出了共表达NDV-F和ILTV-gB的感染了根据本发明的实施例的双重组HVT(FW241和FW242)的CEF(rHVT/ND/ILT感染细胞)的免疫荧光染色。通过抗F Mab(77-2)和Alexa Flour 488检测到蛋白F表达。通过抗gBN4兔血清和Alexa Flour 546检测到蛋白质gB表达。结果示出感染了FW241或FW242的两种细胞表达插入的NDV-F蛋白和插入的ILTV-gB蛋白两者。其是通过荧光显微镜在放大40倍的情况下观察到的。

图2B示出了感染了根据本发明的实施例的双重组HVT(FW259)的共表达IBDV VP2和ILTV-gB(受rHVT/IBD/ILT感染细胞)的CEF的免疫荧光染色。通过抗VP2 Mab(R63)和Alexa Flour 488检测到蛋白质VP2表达。通过抗gBN4兔血清和Alexa Flour 546检测到蛋白质gB表达。结果示出感染了FW259的细胞表达插入的IBDV-VP2蛋白和插入的ILTV-gB蛋白两者。其是通过荧光显微镜在放大100倍的情况下观察到的。

图3A和3B是蛋白质印迹分析，其示出了F蛋白和/或gB蛋白在感染了本发明的rHVT的CEF中的表达。如图3A中示出的，仅在具有受rHVT/ND/ILT感染细胞的泳道中观察到60千道尔顿(kDa)的蛋白质带，这是F蛋白质的期望的大小(

)。在rHVT/45-46BacVP2(FW181)泳道中无带。如图3B中示出的，在每个rHVT/ND/ILT的泳道中在54千道尔顿(kd)处观察到gB蛋白(

)。相反，在rHVT/45-46PecF(FW168)的泳道中不存在带。本发明的双rHVT表达NDV-F和ILTV-gB两者。

图4A和4B示出了对重组HVT FW242在连续传代中的稳定性检测的PCR分析的结果，其表明在20次传代之后F基因和gB基因在本发明的rHVT FW242中稳定表达。

图4C和4D示出了对经纯化的FW243的基因组结构检查和FW243在连续传代中的稳定性检查的PCR分析的结果。其指示，本发明的FW243、双重组HVT/ND/ILT具有预期的基因组结构，并且在20次传代之后F基因和gB基因在本发明的rHVT FW243中稳定表达。

图5A和5B示出了对重组HVT FW244在连续传代中的稳定性检查的蛋白质印迹分析的结果，这表明在20次传代之后F蛋白和gB蛋白在感染了本发明的rHVT FW244的CEF中稳定表达。

具体实施方式

本发明总体上涉及含有多个重组核苷酸序列的重组禽疱疹病毒、所述重组禽疱疹病毒的制造、包括所述重组禽疱疹病毒的组合物以及所述重组禽疱疹病毒用途。

定义

通过参考以下定义将最好地理解本公开：

与疱疹病毒相关的术语“重组”是指其基因组已通过插入至少一个核苷酸序列(例如，DNA，如基因)而进行修饰的疱疹病毒，所述核苷酸序列并非天然存在于疱疹病毒的基因组中，或其天然存在于所述基因组中但呈不同形式或处于不同位置处。应当理解，重组疱疹病毒可以通过多种方法制造，如本文所述的重组DNA技术，并且一旦制成就可以复制而无需进一步使用重组DNA技术。因此，“重组疱疹病毒”的结构是从DNA插入方面描述的。

在本说明书中，术语“核酸”、“核酸序列”和“核苷酸序列”可互换使用，并且是指具有确定的序列的核酸分子，所述核酸分子可以是脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸。可以首先通过例如重组、酶促和/或化学技术，并且随后在宿主细胞或体外系统中复制来制备核苷酸序列。核苷酸序列优先地包括编码分子(例如肽或蛋白质)的开放阅读框。核苷酸序列可以含有另外的序列，如启动子、转录终止子、信号肽、IRES等。优选地，重组核酸中的开放阅读框不含有内含子。

“重组核苷酸序列”表示不天然存在于疱疹病毒的基因组中或天然存在于所述基因组中但呈不同形式或处于不同位置处的序列。典型“重组核苷酸序列”是优选地对不是通过禽疱疹病毒天然产生的分子，如来自不同病毒或细胞的分子进行编码的基因。此“重组核苷酸序列”的上下文中的“基因”表示含有开放阅读框的任何核酸分子，如由开放阅读框组成或基本上由开放阅读框组成的核酸。例如，基因可以进一步含有调控元件，如启动子或终止子。

在本说明书中，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指包括至少2个连续氨基酸的聚合物的任何分子。

术语“基因间区域”是本领域众所周知的并且是指病毒基因组的位于两个指定的病毒ORF之间的任何区域。因此，位于UL45(HVT053)与UL46(HVT054)之间的基因间区域表示紧接着UL45的终止密码子的3'开始并且紧接着UL46的终止密码子的5'结束的区域(因为两个ORF处于相反的朝向)。位于HVT064与HVT065之间的基因间区域表示紧接着HVT064的起始密码子的3'开始并且紧接着HVT065的起始密码子的5'结束的区域(因为两个ORF处于反向朝向)。类似地，HVT065与HVT066之间的基因间区域表示紧接着HVT065的终止密码子的3'开始并且紧接着HVT066的终止密码子的5'结束的区域(因为两个ORF处于相反的朝向)。基因间区域可以包含调控区域，如终止子或启动子。

术语“禽类物种”旨在涵盖所有种类的禽类动物，如鸟纲类别的鸟，即，有羽毛、有翼、双足、吸热和产卵的脊椎动物。在本发明的上下文中，禽类动物或禽类物种更具体地是指具有经济和/或农艺利益的鸟类，如家禽(如鸡和火鸡)、水禽家禽(如鸭和鹅)和观赏鸟类(如天鹅和鹦鹉)。

如本文所用的术语“疫苗”表示可以用于引起、刺激或放大生物内的免疫应答的药剂。

如本文所用的与本发明的重组疱疹病毒、载体或疫苗相关的术语“多价”是指包括至少两个如上定义的重组核苷酸序列的重组疱疹病毒、载体或疫苗，所述序列相同或不同，并且来自同一病原体或不同的病原体。

多价重组HVT

本发明涉及在特定位置中含有多个外来基因的重组HVT。更具体地，本发明示出了在以下情况下可以获得稳定且有效的多价重组HVT：

.在基因组的位于HVT053与HVT054之间的基因间区域中克隆了至少一个重组核苷酸序列，并且

.在基因组的位于HVT064与HVT070之间的基因间区域中克隆了至少一个重组核苷酸序列。

如实例中示出的，当使用此位点组合时，重组HVT在CEF细胞中在至少10次、优选地至少15次、更优选地至少20次传代之上是稳定的。此外，使用此位点组合，在体内获得了足以取得高保护性免疫的基因的强且持久的表达。

许多潜在克隆位点存在于重组疱疹病毒中。具体地，在疱疹病毒基因组中存在几乎397个ORF，其中99个估计对功能性蛋白质产物进行编码(参见Afonso等人,《病毒学杂志(J.Virology)》75(2),2001,971)。此外，适用于单价病毒的上下文的一些克隆位点已经在用于多价病毒的上下文中显示出不稳定性，在同一病毒中使用两个不同的克隆位点的情况下尤其如此。本发明示出，HVT053与HVT054之间的基因间区域与HVT064与HVT070之间的基因间区域的组合允许克隆的重组核苷酸序列体外的表达稳定且水平合适。因此，此类特定重组病毒代表用于在体内诱导有效保护性免疫的新型有效药剂。

在一个特定实施例中，本发明涉及一种含有多个重组核酸(例如，外来基因)的重组HVT，其中：

.在基因组的位于HVT053与HVT054之间的基因间区域中克隆了至少一个重组核酸，并且

.在基因组的位于HVT064与HVT065之间的基因间区域中克隆了至少一个重组核酸。

在另外的特定实施例中，本发明涉及一种含有多个重组核酸(例如，外来基因)的重组HVT，其中：

.在基因组的位于HVT065与HVT066之间的基因间区域中克隆了至少一个重组核酸。

.在基因组的位于HVT066与HVT067之间的基因间区域中克隆了至少一个重组核酸。

在另一个特定实施例中，本发明涉及一种含有多个重组核酸(例如，外来基因)的重组HVT，其中：

.在基因组的位于HVT067与HVT069之间的基因间区域中克隆了至少一个重组核酸。此基因间区域在有限程度上可以与HVT068 ORF重叠，然而所述HVT068 ORF位于互补链上。因此，在此类基因间区域中进行克隆可能改变HVT068编码序列。

在另外的特定实施例中，本发明涉及一种含有多个重组核酸(例如，外来基因)的重组禽HVT，其中：

.在基因组的位于HVT069与HVT070之间的基因间区域中克隆了至少一个重组核酸。

本发明的重组HVT可以由任何HVT、优选地非致病性HVT制备。适用于本发明的非致病性HVT菌株(MDV3)的一个实例是FC126菌株。

FC126菌株的基因组序列可用于本领域(Afonso等人,同上；Altschul等人,同上)。引用的基因间区域的位置可以由技术人员使用本申请的教导、常识和可在文献中获得的序列信息容易地识别。例如，Kingham等人,同上报告了FC 126参考菌株的核苷酸序列，以及大多数ORF在所述基因组内的位置。

参考FC126完整基因组(GenBank：AF291866.1)，HVT053与HVT054之间的基因间区域优选地对应于HVT基因组的核苷酸95323-95443，HVT064与HVT065之间的基因间区域对应于HVT基因组的核苷酸111304-111499，HVT065与HVT066之间的基因间区域对应于HVT基因组的核苷酸112010-112207，HVT066与HVT067之间的基因间区域对应于HVT基因组的核苷酸112766-113107，HVT067与HVT069之间的基因间区域对应于HVT基因组的核苷酸113906-114078，并且HVT069与HVT070之间的基因间区域对应于HVT基因组的核苷酸116731-116831。

在本申请中，对菌株FC126的完整基因组的引用是对在本申请的申请日期在登录号AF291866.1下的Genbank中描述的所述菌株的引用。

插入在基因组中的重组核苷酸序列可以处于任何朝向。

在一个优选实施例中，本发明的重组HVT包括：

.在基因组的HVT053与HVT054之间的基因间区域中克隆的至少一个重组核苷酸序列，以及

.在基因组的HVT065与HVT066之间的基因间区域中克隆的至少一个重组核苷酸序列。

在一个特定实施例中，插入在HVT053与HVT054之间的基因间区域的核酸处于与HVT054相同的朝向。

在另一个特定实施例中，插入在HVT065与HVT066之间的基因间区域中的重组核苷酸序列处于与HVT066相同的朝向。

重组核苷酸序列或插入的核酸序列可以含有调控序列(或与其可操作地连接)，如启动子和/或终止子。所使用的启动子可以是合成或天然、内源或异源启动子。原则上可以使用任何启动子，只要其可以在靶细胞或宿主中有效其作用。在此方面，启动子可以是能够在多价载体的上下文中引导禽类细胞中的基因转录的真核生物、原核生物、病毒或合成启动子。同样，每个重组核苷酸序列都可以含有启动子，所述启动子可以彼此相同或不同。

优先地，用于每个重组核苷酸序列的启动子选自鸡β-肌动蛋白(beta-actin，Bac)启动子、Pec启动子、鼠巨细胞病毒(Murine Cytomegalovirus，Mcmv)ie1启动子、人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus，Hcmv)启动子、猿猴病毒40(Simian virus 40，SV40)启动子和劳斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma virus，RSV)启动子或其保留了启动子活性的任何片段。

鸡Bac启动子的核酸序列在SEQ ID NO:1中示出，Pec启动子的序列在SEQ ID NO:2中示出，并且Mcmv ie1启动子的序列在SEQ ID NO:3中示出。应当注意，对功能性启动子进行编码的此类序列的变体是已知的和/或可以由技术人员设计/测试以用于本发明。

在一个优选实施例中，插入到位于HVT053与HVT054之间的基因间区域中的重组核苷酸序列含有Pec启动子或Bac启动子。发明人获得的结果示出，此类启动子在本发明的多价载体的上下文中，在定位在所述克隆位点时是有效的。

在另一个优选实施例中，插入到位于HVT065与HVT066之间的基因间区域的外来基因含有Pec或Mcmv ie1启动子。发明人获得的结果示出，此类启动子在本发明的多价载体的上下文中，在定位在所述克隆位点时是特别有效的。

本发明的特别优选的重组HVT含有(i)在Pec或Mcmv ie1启动子的控制下插入到HVT065与HVT066之间的基因间区域中的重组核酸以及(ii)在Pec启动子的控制下插入到HVT053与HVT054之间的基因间区域的重组核酸。

重组核苷酸序列

重组核苷酸序列可以对所关注的任何多肽进行编码。重组核苷酸序列可以对多肽，例如抗原、细胞因子、激素或佐剂进行编码。

在一个具体实施例中，所述至少2个重组核苷酸序列中的一个或每一个对来自病原体的抗原或其免疫原性片段进行编码。

其可以衍生自或获得自能够引起禽类物种的感染的任何致病性生物。引起禽类动物感染的病原体的实例包含病毒、细菌、真菌和原生动物。

抗原可以是病原体的任何免疫原性肽或蛋白质，如选自或衍生自所述病原体的表面蛋白、分泌蛋白或结构蛋白的肽或蛋白质或其片段。

用于本发明的优选重组核苷酸序列对来自以下的抗原进行编码：禽流感病毒、禽副粘病毒1型(也被称为新城疫病病毒(Newcastle disease virus，NDV)、禽偏肺病毒、马立克氏病病毒(Marek's disease virus)、甘布罗病病毒(Gumboro disease virus)(也被称为传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV))、传染性喉气管炎病毒(ILVT)、传染性支气管炎病毒(IBV)、大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella)、多杀性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer)、鼻气管鸟杆菌(Ornithobacterium rhinotracheale)、鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)、滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae)、感染禽类物种的支原体微生物(Mycoplasmas microorganisms)和/或球虫。

优先地，插入到病毒基因组中的重组核苷酸序列中的至少一个对选自以下的抗原进行编码：NDV的F蛋白、IBDV的VP2蛋白、ILTV的gB蛋白、鸡毒支原体的40K蛋白和禽流感病毒的表面蛋白血凝素(HA)或其免疫原性片段。优先地，两个重组核苷酸序列都对此抗原进行编码，所述两个重组核苷酸序列可以相同或不同。

抗原的免疫原性片段表示可以在体内引发针对所述抗原的免疫应答的任何片段，优选地含有表位的任何片段。免疫原性片段通常含有抗原的5个到50个连续氨基酸残基，如5个到40个，或10个到40个。

可以考虑抗原肽的各种组合。

在一个实施例中，本发明的重组HVT含有对NDV的F蛋白或其免疫原性片段进行编码的重组核苷酸序列以及对IBDV的VP2蛋白或其免疫原性片段进行编码的核苷酸序列。

在另一个实施例中，本发明的重组HVT含有对IBDV的VP2蛋白或其免疫原性片段进行编码的核苷酸序列以及对ILTV的gB蛋白或其免疫原性片段进行编码的核苷酸序列。

在一个优选实施例中，本发明的重组HVT含有对NDV的F蛋白或其免疫原性片段进行编码的核苷酸序列以及对ILTV的gB蛋白或其免疫原性片段进行编码的核苷酸序列。

在另一个变体中，本发明的重组HVT表达来自同一病原体的两种或更多种抗原。所述抗原可以相同或不同。

在另外的变体中，重组核苷酸序列中的至少一个对活性分子，如细胞因子或免疫调节剂、佐剂、激素、抗寄生虫剂、抗菌剂等进行编码，另一个对例如抗原进行编码。

根据另外的实施例，将三个或更多个重组核苷酸序列插入到病毒基因组中。

构建方法

可以使用本领域本身已知的技术，如重组技术、同源重组、位点特异性插入、诱变等制备本发明的重组HVT。

基因克隆和质粒构建是本领域的普通技术人员众所周知的，并且基本上可以通过标准分子生物学技术执行(《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A LaboratoryManual.)》,第4版,纽约伍德伯里的冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press,Woodbury,N.Y.),2012)。

疱疹病毒可以在任何合适的宿主细胞和介质中传播。用于传播疱疹病毒的宿主和条件包含例如衍生自鸡的细胞，如CEF(鸡胚胎成纤维细胞)、鸡肾细胞等。此类细胞可以在培养基，如Eagle's MEM、Leibowitz-L-15/McCoy 5A(1:1混合物)培养基中在约37℃下培养3至4天。

可以根据任何常规方法从受病毒感染细胞中提取基因组DNA。具体地，在蛋白质在裂解缓冲液中变性并去除之后，可以用苯酚和乙醇提取DNA。

通常，可以通过在病毒基因组与包括要插入的侧接有来自插入位点的允许重组的核苷酸的重组核苷酸序列或核酸的构建体(例如，质粒)之间进行的同源重组来制备重组病毒。简而言之，首先将含有靶标基因间区域的序列克隆到质粒或其它合适的载体中。质粒的实例包括pBR322、pBR325、pBR327、pBR328、pUC18、pUC19、pUC7、pUC8和pUC9，噬菌体的实例包括λ噬菌体和Ml3噬菌体，并且粘粒的实例包括pHC79。克隆区域应优选地具有足够的长度，使得在插入外来基因时，侧接外来基因的序列具有适当长度，从而允许与病毒基因组在体外同源重组。优选地，每个侧翼序列的长度应为至少大约50个核苷酸。

为了将一个或多个重组核苷酸序列插入到基因间区域中，可以在基因间区域的特定位点处执行突变以产生限制酶的切割位点。执行突变的方法可以是常规方法，并且可以使用如体外诱变和PCR等本领域的技术人员通常使用的方法。因此，在PCR方法中，执行在PCR引物中进行的如缺失、替换或添加1到2个核苷酸的突变，并且然后使用引物来产生突变。可替代地，可以使用天然存在的限制位点。然后将外来基因(和启动子)插入到质粒中的病毒基因组的插入位点中。

可以使用任何合适的技术(例如，电穿孔、磷酸钙、基于脂质体的方法等)将所产生的质粒引入到受HV感染细胞或HV基因组转染的细胞中。当要引入的质粒的量在0.1到1000μg的范围内时，通过在HV基因组的同源区域与质粒之间进行重组生成重组病毒的效率在细胞中变高。这导致质粒与病毒基因组之间的重组事件，从而导致重组核苷酸序列插入到病毒中。

可以使用已知的选择技术，例如，通过杂交、检测由与重组核酸序列一起共整合的基因编码的酶活性或免疫学地检测由重组疱疹病毒表达的抗原肽，基因型地或表型地选择所产生的重组病毒。

所选重组疱疹病毒可以在细胞培养物中大规模培养。一旦创建，病毒就可以在合适的细胞中传播。

优选实施例

以下重组HVT是本发明的优选具体实施例。如实例中示出的，其允许在体内针对由每个重组核苷酸序列编码的抗原的强烈免疫应答。

本发明的特别优选的重组HVT包括：(i)插入在HVT065与HVT066之间的基因间区域中的，优先受Mcmv ie1启动子的控制的对NDV的F蛋白或其免疫原性片段进行编码的重组核苷酸序列；以及(ii)插入在HVT053与HVT054之间的基因间区域中的，优先受Pec启动子的控制的对ILTV的gB蛋白或其免疫原性片段进行编码的重组核苷酸序列(FW243)。

本发明的另一个特别优选的重组HVT是重组禽疱疹病毒，所述重组禽疱疹病毒包括：(i)插入在HVT065与HVT066之间的基因间区域中的，优先受Pec启动子的控制的对ILTV的gB蛋白或其免疫原性片段进行编码的重组核苷酸序列；以及(ii)插入在HVT053与HVT054之间的基因间区域中的，优先受Pec启动子的控制的对NDV的F蛋白或其免疫原性片段进行编码的重组核苷酸序列(FW242)。

本发明的另一个特别优选的重组HVT是重组禽疱疹病毒，所述重组禽疱疹病毒包括：(i)插入在HVT065与HVT066之间的基因间区域中的，优先受Mcmv ie1启动子的控制的对ILTV的gB蛋白或其免疫原性片段进行编码的重组核苷酸序列；以及(ii)插入在HVT053与HVT054之间的基因间区域中的，优先受Pec启动子的控制的对NDV的F蛋白或其免疫原性片段进行编码的重组核苷酸序列(FW244)。

本发明的另一个特别优选的重组HVT包括：(i)插入在HVT065与HVT066之间的基因间区域中的，优先受Pec启动子的控制的对NDV的F蛋白或其免疫原性片段进行编码的重组核苷酸序列；以及(ii)插入在HVT053与HVT054之间的基因间区域中的，优先受Pec启动子的控制的对ILTV的gB蛋白或其免疫原性片段进行编码的重组核苷酸序列(FW241)。

本发明的另一个重组HVT包括：(i)插入在HVT065与HVT066之间的基因间区域中的，优先受Mcmv ie1启动子或Pec启动子的控制的对IBDV的VP2蛋白或其免疫原性片段进行编码的重组核苷酸序列；以及(ii)插入在HVT053与HVT054之间的基因间区域中的，优先受Pec启动子的控制的对ILTV的gB蛋白或其免疫原性片段进行编码的重组核苷酸序列。

本发明的另外的重组HVT包括：(i)插入在HVT065与HVT066之间的基因间区域中的，优先受Mcmv ie1启动子或Pec启动子的控制的对ILTV的gB蛋白或其免疫原性片段进行编码的重组核苷酸序列；以及(ii)插入在HVT053与HVT054之间的基因间区域中的，优先受Pec启动子的控制的对IBDV的VP2蛋白或其免疫原性片段进行编码的重组核苷酸序列(FW259)。

本发明的重组HVT可以在细胞培养物中传播。在优选实施例中，使用了CEF、含胚蛋、鸡肾细胞等作为用于传播重组HVT的宿主细胞。本发明的多价重组HVT可以在培养基，如Eagle's MEM、Leibowitz-L-15/McCoy 5A(1:1混合物)培养基中在约37℃下培养3至4天。将由此获得的受感染细胞悬浮在含有10％二甲基亚砜(DMSO)的培养基中，并在液氮下冷冻储存。

有利地，本发明的重组多价HVT贯穿传代呈现出高水平的稳定性，这对应于重组核苷酸序列在禽类物种的细胞，优选地CEF细胞中的共表达，甚至在10次或更多次传代之后，优选地在15次传代之后，甚至更优选的在20次传代之后也是如此。在本发明的上下文中，“传代”或“细胞传代”意指在合适的条件下培养细胞以允许其生长并保持其存活，直至其90％到100％汇合为止。传代步骤在于将先前汇合培养物的少量细胞转移到新培养基中。可以在大体积的新鲜培养基中对含有很少细胞的先前汇合培养物的等分试样进行稀释。

可以使用常规技术收集或纯化病毒。可以将所述病毒储存在任何合适的介质中，冷冻和/或冻干。

核酸和细胞

本发明的另一个目的涉及如上定义的病毒中含有的任何核酸。核酸可以是单链的或双链的、DNA或RNA或其变体。

本发明还涉及一种含有本发明核酸的载体(例如，质粒、粘粒、人工染色体等)。

本发明还涉及一种含有本发明的重组HVT、核酸或载体的细胞。细胞通常是如禽类细胞等真核细胞或原核细胞(条件是载体适合于在此细胞类型中进行复制或维持)。

疫苗组合物

本发明还涉及包括本发明的多价重组HVT、本发明的核酸或本发明的细胞的组合物，如疫苗。

本发明的疫苗通常包括药学上可接受的媒剂中的免疫学上有效量的如上所述的重组HVT。

根据本发明的组合物和疫苗通常包括合适的溶剂或稀释剂或赋形剂，例如水性缓冲液或磷酸盐缓冲液。组合物还可以包括以足以增强免疫应答的量与疫苗一起施用的添加剂，如衍生自动物的蛋白质或肽(例如，激素、细胞因子、共刺激因子)、衍生自病毒和其它来源的核酸(例如，双链RNA、CpG)等。另外，前述物质的任何数量的组合都可以提供免疫增强作用，并且因此，可以形成本发明的免疫增强剂。

本发明的疫苗可以进一步与用于维持等渗性、生理pH和稳定性的一种或多种另外的添加剂一起调配，例如生理盐水(0.85％)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、柠檬酸盐缓冲液、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、Tris缓冲盐水等缓冲液或例如新霉素或链霉素等抗生素。

施用途径可以是任何途径，包含口服、眼部(例如，通过滴眼液)、眼鼻施用、使用气雾剂、鼻内、泄殖腔、进食中、水中、或通过喷雾、卵内、局部或通过注射(例如，静脉内、皮下、肌肉内、眶内、眼内、皮内和/或腹膜内)疫苗接种。技术人员将容易地针对每种类型的施用途径调整疫苗组合物的调配。

每种疫苗剂量可含有足以在禽类物种体内引发保护性免疫应答的合适剂量。此剂量的优化是本领域公知的。每剂量的抗原的量可以通过使用抗原/抗体反应的已知方法，例如通过ELISA方法确定。

本发明的疫苗可以单剂量或重复剂量形式施用，这取决于疫苗接种方案。

本发明的疫苗的另外的优势在于其在3周疫苗接种之后赋予鸟类物种针对靶向禽病原体的高达80％的保护。

本发明进一步涉及如上所述的疫苗用于使禽类物种，如家禽获得对病原体的免疫的用途。

本发明进一步涉及一种通过施用免疫有效量的根据本发明的疫苗来使禽类物种获得免疫的方法。疫苗可以有利地皮内、皮下、肌内、口服、卵内、通过粘膜施用或通过眼鼻施用来施用。

本发明进一步涉及用于使禽类物种获得免疫的疫苗接种试剂盒，所述疫苗接种试剂盒包括有效量的上述多价疫苗以及用于向所述物种施用所述组分的装置。例如，此试剂盒包括填充有根据本发明的多价疫苗的注射装置，以及用于皮内、皮下、肌内或卵内注射的说明书。可替代地，所述试剂盒包括填充有根据本发明的多价疫苗的喷雾剂/气雾剂或滴眼剂装置以及用于眼鼻施用、口服或粘膜施用的说明书。

现在将在以下实例中公开本申请的另外的方面和优点，这些实例说明了本发明。

实例

在实验章节，已经生成了几种重组HVT(根据本发明为单价或多价)，其命名如下(HVT/第一插入位点-第一外来基因/第二插入位点-第二外来基因)：

单价：

FW200：HVT/65-66 Pec F

FW219：HVT/65-66 Pec gB

FW168：HVT/45-46 Pec F

FW169：HVT/45-46 Bac VP2

FW181：HVT/45-46 Pec gB

多价：

FW241：HVT/65-66 Pec F/45-46 Pec gB

FW242：HVT/65-66 Pec gB/45-46 Pec F

FW243：HVT/65-66 Mcmv ie1 F/45-46 Pec gB

FW244：HVT/65-66 Mcmv ie1 gB/45-46 Pec F

FW259：HVT/65-66 Pec gB/45-46 Bac VP2

实例1：同源载体的构建

基本上通过标准分子生物学技术执行质粒构建(《分子克隆：实验室手册》第4版,纽约冷泉港的冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.),2012)。在琼脂糖凝胶上对DNA限制片段进行电泳，并且用Plasmid plus Midi试剂盒(凯杰公司(QIAGEN)，目录号12945)进行纯化。

根据Lee等人的方法，由感染了HVT FC126菌株的CEF细胞制备HVT DNA(普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)》,51:245-253,1980)。使用获得的HVT DNA作为模板通过PCR对HVT064-071进行扩增。使用了两种引物，一种是SEQ ID NO:4(5'-GGATGTCCAATTCGCACATG-3')，并且另一种是SEQ ID NO:5(5-GCTACAGTTACGGGATTCATAGG-3')。依据GenBankAF291866.1的信息设计每种引物。

pHVT64-65的构建

使用HVT064-071作为模板，用两个引物对执行PCR。通过PCR制备在两个ORF——HVT064(LORF3)和HVT065(UL55)——之间具有SfiI位点的DNA片段，并且将其克隆到pUC18中。

第一对是SEQ ID NO:6(5'-GGGGGAATTCACTACTTTTAATTCTCTTTA-3')和SEQ ID NO:7(5'-GGGGGCCAATAAGGCCGCTAGCGGCCGCCTAACACCCCCGAATATTAGTC-3')。

第二对是SEQ ID NO:8(5'-GGGGCGGCCGCTAGCGGCCTTATTGGCCTCACGTGTAGCCCATTGTGTGCATATAAC-3')和SEQ ID NO:9(5'-GGGAAGCTTAGATCTGAAATAACGCAGTTG-3')。

用EcoRI和NheI使第一所产生的片段消化。用NheI和HindIII使第二所产生的片段消化。将这些切割的片段整合到用EcoRI和HindIII切割的pUC18中，从而产生质粒pHVT 64-65。

pHVT65-66的构建

使用HVT064-071作为模板，用两个引物对执行PCR。通过PCR制备在两个ORF——HVT065(UL55)和HVT066(LORF4)——之间具有SfiI位点的DNA片段，并且将其克隆到pUC18中。

第一对是SEQ ID NO:10(5'-GGGGAATTCGCCAGATATCCAAAGTACAGC-3')和SEQ IDNO:11(5'-GGGGGCCAATAAGGCCGCTAGCGGCCGCCAATTATTTTATTTAATAACATAT-3')。

第二对是SEQ ID NO:12(5'-GGGGCGGCCGCTAGCGGCCTTATTGGCCACCAGTGAACAATTTGTTTAATGTTA-3')和SEQ ID NO:13(5'-GGGAAGCTTGGGTCTGTCCTAGCGATATAA-3')。

用EcoRI和NheI使第一所产生的片段消化。用NheI和HindIII使第二所产生的片段消化。将这些切割的片段整合到用EcoRI和HindIII切割的pUC18中，从而产生质粒pHVT 65-66。

pHVT66-67的构建

使用HVT064-071作为模板，用两个引物对执行PCR。通过PCR制备在两个ORF——HVT066(LORF4)和HVT067(LORF5)——之间具有SfiI位点的DNA片段，并且将其克隆到pUC18中。

第一对是SEQ ID NO:14(5'-GGGGGAATTCTCCAGATTGTTGGATATCTG-3')和SEQ IDNO:15(5'-GGGGGCCAATAAGGCCGCTAGCGGCCGCCTTATTGATTTATAAAAACATACATGCAGTG-3')。

第二对是SEQ ID NO:16(5'-GGGGCGGCCGCTAGCGGCCTTATTGGCCAGTACATAATTTATTACGTATCATTTCCG-3')和SEQ ID NO:17(5'-GGGAAG CTTCCTGCAAGACCTCATACGGAA-3')。

用EcoRI和NheI使第一所产生的片段消化。用NheI和HindIII使第二所产生的片段消化。将这些切割的片段整合到用EcoRI和HindIII切割的pUC18中，从而产生质粒pHVT 66-67。

pHVT67-69的构建

使用HVT064-071作为模板，用两个引物对执行PCR。通过PCR制备在两个ORF——HVT067(LORF5)和HVT069(LORF6)——之间具有SfiI位点的DNA片段，并且将其克隆到pUC18中。

第一对是SEQ ID NO:18(5'-GGGGGAATTCATTTCTTCATTGCAACGACG-3')和SEQ IDNO:19(5'-GGGGGCCAATAAGGCCGCTAGCGGCCGCATGATC GTGCTCATTACTGCATCG-3')。

第二对是SEQ ID NO:20(5'-GGGGCGGCCGCTAGCGGCCTTATTGGCCGGGCGGGGCGATGACGTTCTATTTGC-3')和SEQ ID NO:21(5'-GGGAAGCTTAATACGCAGATTCTTTTCGG-3')。

用EcoRI和NheI使第一所产生的片段消化。用NheI和HindIII使第二所产生的片段消化。将这些切割的片段整合到用EcoRI和HindIII切割的pUC18中，从而产生质粒pHVT 67-69。

pHVT69-70的构建

使用HVT064-071作为模板，用两个引物对执行PCR。通过PCR制备在两个ORF——HVT069(LORF6)和HVT070——之间具有SfiI位点的DNA片段，并且将其克隆到pUC18中。

第一对是SEQ ID NO:22(5'-GGGGGAATTCTAAAGAATCGTACATGAGCG-3')和SEQ IDNO:23(5'-GGGGGCCAATAAGGCCGCTAGCGGCCGCCTGAT GTATAAGATTGCCGAAAAG-3')。

第二对是SEQ ID NO:24(5'-GGGGCGGCCGCTAGCGGCCTTATTGGCCCGGGTTGCGTGAATACTGGTCACAG-3')和SEQ ID NO:25(5'-GGGAAGCTTACGATCTGGCAAAAGGGTCC-3')。

用EcoRI和NheI使第一所产生的片段消化。用NheI和HindIII使第二所产生的片段消化。将这些切割的片段整合到用EcoRI和HindIII切割的pUC18中，从而产生质粒pHVT 69-70。

同源载体pHVT65-66 Pec F的构建

使用重组碱性磷酸酶希瓦氏菌S1B1(Alkaline Phosphatase Shewanellasp.S1B1Recombinant)(PAP)(Funakoshi编号DE110)对SfiI切割的pHVT65-66去磷酸化。将片段与BglI切割的p45/46Pec F(WO2003 001066)连接，从而产生质粒pHVT65-66 Pec F。将合成的短polyA信号(SPA:SEQ ID NO:26CTGCAGGCGGCCGCTCTAGAGTCGACAATAAAAGATCTTTATTTTCATTAGATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGGCCAATAAGGCC)整合到用SalI和SfiI切割的pHVT65-66 PecF中，从而产生同源质粒pHVT65-66 Pec F SPA。

同源载体pHVT65-66 Pec gB的构建

用XbaI和NotI切割同源载体pHVT65-66 Pec F SPA。将5210-bp片段与Xbal/Notl切割的pHVT87-88 Pec ILgB del(WO2013 144355)(1506bp)连接，从而产生同源质粒pHVT65-66Pec gB SPA。

化学合成的Mcmv ie1启动子

依据Koszinowski,U.H.报道的Gene Bank L06816.1中的4191-4731bp的信息合成Mcmv ie1启动子(SEQ ID NO:3)。将合成的Mcmv ie1启动子设计为在其前面添加BglI-PstI位点并且在末端添加XbaI-NotI位点。

实例2：对感染了每种转移载体的CEF中的重组HVT进行纯化

如Morgan等人描述的制备HVT野生型FC126菌株(wt-HVT)的病毒DNA(《禽类疾病(Avian Diseases)》,34:345-351,1990)。以相似方法制备FW168(rHVT/45-46PecF)、FW169(rHVT/45-46BacVP2)和FW181(rHVT/45-46PecgBdel)(WO2005 093070)的病毒DNA。第一双rHVT模式是用制备的wt-HVT DNA和pHVT65-66 Pec F(例如FW200)对CEF细胞进行转染。第二模式是用制备的FW168 DNA和pHVT65-66 Pec gB(例如FW242)对CEF细胞进行转染。第三模式是用制备的FW181 DNA和pHVT65-66 Pec F(例如FW241)对CEF细胞进行转染。第四模式是用制备的FW169 DNA和pHVT65-66 Pec gB(例如FW259)对CEF进行转染。这些所产生的重组病毒是通过用抗ILTV gB抗体、抗NDV-F抗体或抗IBDV-VP2抗体对噬菌斑进行染色来纯化的噬菌斑。

简言之，将10⁷个原代CEF细胞悬浮在100μl MEF-1(Lonza LNJVD-1004)中，并且将其与1μg同源载体，例如pHVT65-66 PecF和pHVT65-66 Mcmv ie1 gB和2μg HVT DNA，例如通过电穿孔得到的FC126、FW181和FW168共转染。在Nucleofector II上执行电穿孔。在20mlLeibovitz's L-15(GIBCO BRL，目录号41300-39)、McCoy's 5A培养基(GIBCO BRL，目录号21500-061)(1:1)和4％小牛血清(即溶液LM(+)培养基)中对经转染的细胞进行稀释，涂抹在96孔板的每孔100ul。

在37℃下在5％CO₂中进行培育，直到噬菌斑变得可见为止，通过胰蛋白酶化将细胞与板分离，在新鲜制备的二级CEF细胞中进行稀释，等量转移到两个96孔板中并且培育3天以观察噬菌斑。然后用抗体对两个板之一进行染色，借此检测到每个转移载体中容纳的插入的基因作为第一抗体。通过抗Fc兔血清或Mab77-2检测到NDV-F。通过抗ILTV gBN4兔血清或Mab编号1_B4_7检测到ILTV-gB。通过抗VP2单克隆抗体R63(ATCC编号：HB-9490)检测到IBDV-VP2。在检测到孔含有染色的重组噬菌斑之后，回收来自另一板的对应孔的细胞，在新鲜二级CEF细胞中对其进行稀释并且等量转移到两个96孔板中，以完成第一轮纯化。重复纯化程序，直到每个多克隆抗体或单克隆抗体对每个获得的噬菌斑进行了阳性染色为止。之后，由另一抗体对双rHVT候选物进行染色。最后，通过双重IFA染色证实候选rHVT的所有噬菌斑进行的蛋白质的表达。用冷丙酮-甲醇(2:1)将被每种rHVT感染的CEF固定，用PBS洗涤，与抗体混合物(1:1000稀释的抗gBN4兔血清(或Mab编号1_B4_1)和抗Fc兔血清(Mab77-2)或抗VP2小鼠Mab R63)在37℃下在60分钟内反应。在用PBS洗涤3次之后，将细胞与荧光抗体混合物(由英杰公司(Invitrogen)提供的1:1000稀释的Alexa Fluor488抗兔和AlexaFluor546抗小鼠)在37℃在60分钟内反应。在用PBS洗涤3次之后，通过荧光显微镜放大40或100倍对其进行观察。

通过抗gBN4兔血清和Alexa Flour 546检测到蛋白质gB表达。通过抗F Mab 77-2和Alexa Flour 488检测到蛋白F表达。通过抗VP2 Mab(R63)和Alexa Flour 546检测到蛋白质VP2表达。当所有噬菌斑表达F和gB两者(gB和VP2两者)时，得出结论纯化完成。图2A和B示出了双IFA的一些实例。

经纯化的重组HVT被命名为rHVT/ND/ILT或rHVT/ILT/IBDV。

以下表1示出了从不同rHVT/ND/ILT获得的gB和蛋白质F的表达。

菌株FW168(HVT/45-46PecF)和FW200(HVT/65-66PecF)对应于用作蛋白质F表达的对照的单价重组疱疹病毒，并且FW181(HVT/45-46Pec gBdel)和FW219(HVT/65-66PecgBdel)对应于用作蛋白质gB表达的对照的单价重组疱疹病毒，并且FW169(HVT/45-46BacVP2)对应于用作VP2表达的对照的单价重组疱疹病毒。

结果示出本发明的二价构建体表达两种抗原。

表1：通过rHVT/ND/ILT表达插入的NDV-F和ILTV gB基因(荧光检测).

+：检测到，-：未检测到

实例3：两种蛋白质在感染了双重组HVT的CEF中的共表达.

使含有2×10⁵个CEF细胞的2ml感染重组HVT，并在37℃下，在5％CO₂中培育3天。

然后将培养物以300g离心，持续3分钟，并且将沉淀的细胞重悬于100ul中。将Laemmli缓冲液(100ul)添加到细胞悬浮液中。然后将所得混合物煮沸，持续5分钟，并且使其中的5ul经受10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将经电泳的蛋白质从SDS-GEL转移到PVDF膜(密理博公司(Millipore)的Immobilon-P)，在室温下在含1％w/v脱脂乳粉的PBS中阻断，持续一小时。

对于F检测(图3A)，然后使经处理的膜与500倍稀释下的抗Fc兔抗血清在室温下反应，持续一小时，用PBS洗涤三次，并且与生物素化的抗兔山羊抗血清一起培育一小时。

对于gB检测(图3B)，然后使经处理的膜与500倍稀释下的抗gBN4兔血清在室温下反应，持续一小时，用PBS洗涤三次，并且与生物素化的抗兔山羊抗血清一起培育一小时。

用PBS洗涤三次之后，用亲和素-碱性磷酸酶复合物将膜培育一小时，用PBS洗涤三次，并且用TBS(Tris缓冲盐水)洗涤一次，并且与BCIP-NBT(碱性磷酸酶的底物)反应。如图3A所示，仅在具有受rHVT/ND/ILT感染细胞的泳道中观察到60千道尔顿(kDa)的蛋白质带，这是F蛋白的期望大小()。rHVT/45-46Pec gB(FW181)泳道中不存在条带。

图3B示出了在每个rHVT/ND/ILT的泳道中在54千道尔顿(kd)下观察到gB蛋白(

)。相反，在rHVT/45-46PecF(FW168)的泳道中不存在带。54-kd是插入在rHVT/ND/ILT或rHVT/ILT/IBD中的gB截短的蛋白(469aa；WO2005/093070)。

根据本发明的双重组HVT表达NDV-F和ILTV-gB两者。

实例4：基因组结构的验证

PCR分析

将经纯化的rHVT/ND/ILT在一个6孔板的CEF细胞上传播，以获得汇合噬菌斑。通过刮削从盘中回收细胞，将其转移到Falcon管中并且经受300×g下的离心，持续5分钟。将收获的细胞(来自一个孔)的十分之一悬浮在0.1ml裂解缓冲液(20mM Tris-HCl、100mM NaCl、5mM EDTA、0.1％SDS)中，并且通过涡旋1分钟来进行裂解。将裂解物在60℃下与2μl蛋白酶K(10mg/ml)一起培育，持续10分钟。将获得的混合物用苯酚-氯仿处理两次。将水相(病毒DNA)用作模板。

为每个插入位点设计引物组。

围绕HVT65/66的分析

65R(SEQ ID NO:27)：5'-CCACTGCCACTGTGATGATAAG-3'

66F(SEQ ID NO:28)：5'-GCCTACTATGCACATTGTTACTCCT-3'

围绕UL45/46的分析

45-46F-K(SEQ ID NO:29)：5'-GGGGAAGTCTTCCGGTTAAGGGAC-3'

45-46R(SEQ ID NO:30)：5'-GGTGCAATTCGTAAGACCGATGGG-3'

根据制造商手册使用Tks Gflex DNA聚合酶执行PCR(TAKARA BIO公司编号R060)。

图4C中的PCR的结果示出，在来自经纯化的FW243(p+1)的DNA中，用引物组66F/65R对2550-bp片段进行了扩增。在转移质粒pHVT65-66 ie1 NDV-F中扩增的片段大小相同。另外，在来自经纯化的FW243(p+1)的DNA中用另一个引物组45-46-K/45-46R对2281-bp片段进行了扩增(图4D)。在p45-46 Pec gBdel中检测到相同的带。在pNZ45-46 Sfi-T中对较低片段进行了扩增(546bp)。

图4C-D(p+1)表明获得的双重组HVT/ND/ILT具有预期的基因组结构。证实重组病毒是纯的，因为对应于亲本菌株的带未进行扩增。

实例5：重组HVT在传代中的稳定性

PCR分析

将每个rHVT/ND/ILT在CEF细胞中传代二十次，并且使其经受如实验4中所述的PCR分析。结果与实验4中获得的那些相同，这表明重组病毒甚至在20次传代后仍稳定。

图4A中的PCR的结果示出，在来自FW242(p+5、+10、+15、+20)和转移质粒pHVT65-66Pec gBdel的DNA中，用引物组66F/65R对2118-bp片段进行了扩增。相反，在未纯化的克隆中对较低片段进行了扩增(252bp)。

图4B示出了在FW242(p+5、+10、+15、+20)和第2p45-46 Pec F中用另一个引物组45-46-K/45-46R对3083-bp片段进行了扩增。在pNZ45-46 Sfi-T(US 7569365)中对较低的带(547bp)进行了扩增。

图4C示出了在传代的FW243(p+5、+10、+15、+20)中对2550-bp片段进行了扩增。图4D示出了在传代的FW243(p+5、+10、+15、+20)中对2281-bp片段进行了扩增。

利用65R/66F和45-46-K/45-46R进行的PCR分析示出F基因或gB基因分别稳定地维持在FW242和FW243中的插入位点HVT65/66或UL45/46处。

蛋白质印迹分析

将双重组HVT在鸡胚胎成纤维细胞(CEF)上连续传代(高达20次)。然后将细胞裂解物应用于蛋白质印迹分析。在第一组中(图5A)，印迹与抗Fc兔血清反应(1:500)。在第二组(图5B)中，印迹与抗gBN4兔血清(1:500)反应。

模拟物：未感染的CEF

M：Precision Plus Protein标准品Bio Rad编号161-0374

20次传代之后，NDV-F蛋白(

)和ILTV-gB(

)在感染了双重组HVT的CEF中稳定表达。

实例6：在接种有双重组HVT的鸡中诱导抗NDV抗体

使用20号注射器将双重组HVT皮下接种到十只一日龄的SPF鸡(NISSEIKEN公司的LineM)的背部中。接种剂量在表2中示出。从经疫苗接种的鸟类收集血清，并且通过商业ELISA试剂盒(IDVET，用于诊断新城疫病的ID screen新城疫病间接试剂盒)测量了抗NDV抗体滴度。未向阴性对照组(未获得免疫的)的鸡施用任何疫苗。

表2通过S/P值示出了抗NDV滴度，并且结果清楚地示出，根据本发明的双重组HVT早在接种后三周诱导了抗NDV抗体，并且此后增加了抗NDV抗体。

表2：在接种有双重组体的SPF鸡中诱导抗NDV抗体.

实例7：rHVT/ND/ILT在SPF鸡体内对ILTV的功效

通过用ILTV USDA菌株攻击来评估rHVT/ND/ILT(FW241、FW242、FW243、FW244)作为ILT疫苗的功效。

将双重组HVT皮下接种到一日龄SPF鸡的背部。接种后四周，在气管内(IT)用10³EID₅₀/鸟的ILTV USDA菌株攻击经疫苗接种的鸡。每天观察受攻击的鸡以检查死亡率并检测传染性喉气管炎的任何症状，如抑郁、呼吸困难、罗音、喀血、打喷嚏、喘气、摇头、伸脖子或羽毛竖立。攻击后第10天的结果在表3中汇总。

表3：用强毒性ILTV US菌株对经rHVT/ND/ILT疫苗接种的SPF鸡进行的攻击实验

如表3所示，根据本发明的所有双重组HVT在鸡体内诱导对用强毒性ILTV进行的攻击的保护性免疫。

实例8：rHVT/ND/ILT在SPF鸡体内对NDV的功效

评估了rHVT/ND/ILT(FW241、FW242、FW243、FW244)作为ND疫苗的功效。

使用20号注射器将2,000PFU/200μl/鸟的rHVT/ND/ILT皮下接种到十五只一日龄的SPF鸡(日本生物实验室(Japan Biological Laboratories)的LineM)的背部。从疫苗接种后三周起，从经疫苗接种的鸟类收集血清，并且通过商业ELISA试剂盒(IDVET，用于诊断新城疫病的ID screen新城疫病间接试剂盒)测量抗NDV抗体滴度。

未向阴性对照组的鸡施用任何疫苗(NI：未获得免疫的)。

49日龄时(疫苗接种后48天)，用10³EID₅₀的NDV-TexasGB——在功效研究中常用作攻击菌株的菌株——通过肌肉内注射到股骨区域中来攻击所有五个组的鸡。每天观察受攻击的鸡以检查死亡率并检测新城疫病的任何症状，如抑郁、喘气、神经系统症状和垂死。攻击后第10天的结果在表4中呈现。

表4：用强毒性NDV对rHVT/ND/ILT疫苗接种的SPF鸡进行的攻击实验

如表4所示，根据本发明的所有双重组HVT在鸡体内诱导对用NDV进行的攻击的保护性免疫。

序列表

<110> 法国诗华大药厂（CEVA SANTE ANIMALE）

<120> 含有多个外来基因的重组禽疱疹病毒

<130> B2916

<160> 30

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 1506

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Bac启动子

<400> 1

tgcagctcag tgcatgcacg ctcattgccc atcgctatcc ctgcctctcc tgctggcgct 60

ccccgggagg tgacttcaag gggaccgcag gaccacctcg ggggtggggg gagggctgca 120

cacgcggacc ccgctccccc tccccaacaa agcactgtgg aatcaaaaag gggggagggg 180

ggatggaggg gcgcgtcaca cccccgcccc acaccctcac ctcgaggtga gccccacgtt 240

ctgcttcact ctccccatct cccccccctc cccaccccca attttgtatt tatttatttt 300

ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg gcgcgcgcca ggcggggcgg 360

ggcggggcca ggggcggggc ggggcgaggc ggagaggtgc ggcggcagcc aatcagagcg 420

gcgcgctccg aaagtttcct tttatggcga ggcggcggcg gcggcggccc tataaaaagc 480

gaagcgcgcg gcgggcggga gtcgctgcgc gctgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg 540

ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc 600

gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt agcgcttggt ttaatgacgg ctcgtttctt 660

ttctgtggct gcgtgaaagc cttaaagggc tccgggaggg ccctttgtgc gggggggagc 720

ggctcggggg gtgcgtgcgt gtgtgtgtgc gtggggagcg ccgcgtgcgg ctccgcgctg 780

cccggcggct gtgagcgctg cgggcgcggc gcggggcttt gtgcgctccg cagtgtgcgc 840

gaggggagcg cggccggggg cggtgccccg cggtgcgggg ggggctgcga ggggaacaaa 900

ggctgcgtgc ggggtgtgtg cgtggggggg tgagcagggg gtgtgggcgc ggcggtcggg 960

ctgtaacccc cccctgcacc cccctccccg aagttgctga gcacggcccg gcttcgggtg 1020

cggggctccg tgcggggcgt ggcgcggggc tcgccgtgcc gggcgggggg tggcggcagg 1080

tgggggtgcc gggcggggcg gggccgcctc gggccgggga gggctcgggg gaggggcgcg 1140

gcggcccccg gagcgccggc ggctgtcgag gcgcggcgag ccgcagccat tgccttttat 1200

ggtaatcgtg cgagagggcg cagggacttc ctttgtccca aatctgtgcg gagccgaaat 1260

ctgggaggcg ccgccgcacc ccctctagcg ggcgcggggc gaagcggtgc ggcgccggca 1320

ggaaggaaat gggcggggag ggccttcgtg cgtcgccgcg ccgccgtccc cttctccatc 1380

tccagcctcg gggctgtccg cagggggacg gctgccttcg ggggggacgg ggcagggcgg 1440

ggttcggctt ctggcgtgtg accggcgggg tttatatctt cccttctctg ttcctccgca 1500

gccccc 1506

<210> 2

<211> 557

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Pec启动子

<400> 2

tgcagagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagy 60

tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgccggctga ccgcccaacg acccccgccc 120

attgacgtca ataatgacgt atgytcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg 180

tcaatgggtg gagtayttac ggtaaactgc ccattggcag tacatcaagt gtatcatatg 240

ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatgga tgcagtattt tgtgcagcga 300

tgggggcggg gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg 360

ggcgaggcgg agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt 420

tatggcgagg cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgggagt 480

cgctgcgcgc tgccttcgcc ccgtgccccg ctccgccgcc gcctcgcgcc gcccgccccg 540

gctctgactg accgcgt 557

<210> 3

<211> 572

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Mcmv ie1启动子

<400> 3

ggccaataag gctgcagtac tgagtcatta gggactttcc aatgggtttt gcccagtaca 60

taaggtcaat aggggtgaat caacaggaaa gtcccattgg agccaagtac actgagtcaa 120

tagggacttt ccattgggtt ttgcccagta caaaaggtca atagggggtg agtcaatggg 180

tttttcccat tattggcacg tacataaggt caataggggt gagtcattgg gtttttccag 240

ccaatttaat taaaacgcca tgtactttcc caccattgac gtcaatgggc tattgaaact 300

aatgcaacgt gacctttaaa cggtactttc ccatagctga ttaatgggaa agtaccgttc 360

tcgagccaat acacgtcaat gggaagtgaa agggcagcca aaacgtaaca ccgccccggt 420

tttcccctgg aaattccata ttggcacgca ttctattggc tgagctgcgt tctacgtggg 480

tataagaggc gcgaccagcg tcggtaccgt cgcagtcttc ggtctgacca ccgtagaacg 540

cagagctcct cgctgcaggc ggccgctcta ga 572

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 4

ggatgtccaa ttcgcacatg 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 5

gctacagtta cgggattca 19

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 6

gggggaattc actactttta attctcttta 30

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 7

gggggccaat aaggccgcta gcggccgcct aacacccccg aatattagtc 50

<210> 8

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 8

ggggcggccg ctagcggcct tattggcctc acgtgtagcc cattgtgtgc atataac 57

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 9

gggaagctta gatctgaaat aacgcagttg tagg 34

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 10

ggggaattcg ccagatatcc aaagtacagc 30

<210> 11

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 11

gggggccaat aaggccgcta gcggccgcca attattttat ttaataacat at 52

<210> 12

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 12

ggggcggccg ctagcggcct tattggccac cagtgaacaa tttgtttaat gtta 54

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 13

gggaagcttg ggtctgtcct agcgatataa 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 14

gggggaattc tccagattgt tggatatctg 30

<210> 15

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 15

gggggccaat aaggccgcta gcggccgcct tattgattta taaaaacata catgcagtg 59

<210> 16

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 16

ggggcggccg ctagcggcct tattggccag tacataattt attacgtatc atttccg 57

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 17

gggaagcttc ctgcaagacc tcatacggaa 30

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 18

gggggaattc atttcttcat tgcaacgacg 30

<210> 19

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 19

gggggccaat aaggccgcta gcggccgcat gatcgtgctc attactgcat cg 52

<210> 20

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 20

ggggcggccg ctagcggcct tattggccgg gcggggcgat gacgttctat ttgc 54

<210> 21

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 21

gggaagctta atacgcagat tcttttcgg 29

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 22

gggggaattc taaagaatcg tacatgagcg 30

<210> 23

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 23

gggggccaat aaggccgcta gcggccgcct gatgtataag attgccgaaa ag 52

<210> 24

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 24

ggggcggccg ctagcggcct tattggcccg ggttgcgtga atactggtca cag 53

<210> 25

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 25

gggaagctta cgatctggca aaagggtcc 29

<210> 26

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 26

ctgcaggcgg ccgctctaga gtcgacaata aaagatcttt attttcatta gatctgtgtg 60

ttggtttttt gtgtggccaa taaggcc 87

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 27

ccactgccac tgtgatgata ag 22

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 28

gcctactatg cacattgtta ctcct 25

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 29

ggggaagtct tccggttaag ggac 24

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 寡核苷酸

<400> 30

ggtgcaattc gtaagaccga tggg 24

Claims

1.一种重组火鸡疱疹病毒(“HVT”)，其包括至少第一重组核苷酸序列和第二重组核苷酸序列，每个重组核苷酸序列都对多肽进行编码，其中所述第一重组核苷酸序列插入到病毒基因组的位于HVT053与HVT054之间的基因间区域中，并且其中所述第二重组核苷酸序列插入到病毒基因组的位于HVT064与HVT070之间的基因间区域中。

2.根据权利要求1所述的重组HVT，其中所述第二重组核苷酸序列插入到病毒基因组的位于HVT064与HVT065之间的基因间区域中。

3.根据权利要求1所述的重组HVT，其中所述第二重组核苷酸序列插入到病毒基因组的位于HVT065与HVT066之间的基因间区域中。

4.根据权利要求1所述的重组HVT，其中所述第二重组核苷酸序列插入到病毒基因组的位于HVT066与HVT067之间的基因间区域中。

5.根据权利要求1所述的重组HVT，其中所述第二重组核苷酸序列插入到病毒基因组的位于HVT067与HVT069之间的基因间区域中。

6.根据权利要求1所述的重组HVT，其中所述第二重组核苷酸序列插入到病毒基因组的位于HVT069与HVT070之间的基因间区域中。

7.根据权利要求1到6中任一项所述的重组HVT，其中每个重组核苷酸序列都对来自禽病原体的抗原或其免疫原性片段进行编码。

8.根据权利要求7所述的重组HVT，其中每个抗原都选自所述禽病原体的表面蛋白、分泌蛋白和结构蛋白或其免疫原性片段。

9.根据权利要求7或8所述的重组HVT，其中每个重组核苷酸序列都对在以下之中选择的抗原进行编码：禽副粘病毒1型的抗原，优选地新城疫病病毒(Newcastle diseasevirus，NDV)的F蛋白或其免疫原性片段；甘布罗病病毒(Gumboro disease virus)的抗原，优选地传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)的VP2蛋白或其免疫原性片段；传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus，ILTV)的抗原，优选地gB蛋白或其免疫原性片段；鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)的抗原，优选地40K蛋白或其免疫原性片段；以及禽流感病毒的抗原，优先地表面蛋白血球凝集素(HA)或其免疫原性片段。

10.根据前述权利要求中任一项所述的重组HVT，其中所述第一重组核苷酸序列和所述第二重组核苷酸序列对来自同一病原体或不同病原体的不同抗原或其免疫原性片段进行编码。

11.根据权利要求1到10中任一项所述的重组HVT，其中每个重组核苷酸序列都受启动子控制。

12.根据权利要求11所述的重组HVT，其中控制重组核苷酸序列的表达的每个启动子是在以下之中选择的：鸡β-肌动蛋白(beta-actin，Bac)启动子、Pec启动子、鼠巨细胞病毒(Murine Cytomegalovirus，Mcmv)即刻早期(immediate-early，ie)1启动子、人巨细胞病毒启动子(Human Cytomegalovirus，Hcmv)、猿猴病毒(Simian virus，SV)40启动子和劳斯肉瘤病毒(Raus Sarcoma virus，RSV)启动子或其保留了启动子活性的任何片段。

13.根据权利要求1到12中任一项所述的重组HVT，其包括：(i)插入在HVT065与HVT066之间的基因间区域中的优先受Mcmv ie1启动子控制的对NDV的F蛋白或其免疫原性片段进行编码的重组核苷酸序列；以及(ii)插入在HVT053与HVT054之间的基因间区域中的优先受Pec启动子控制的对ILTV的gB蛋白或其免疫原性片段进行编码的重组核苷酸序列。

14.根据权利要求1到12中任一项所述的重组HVT，其包括：(i)插入在HVT065与HVT066之间的基因间区域中的优先受Mcmv ie1启动子控制的对NDV的F蛋白或其免疫原性片段进行编码的重组核苷酸序列；以及(ii)插入在HVT053与HVT054之间的基因间区域中的优先受Pec启动子控制的对ILTV的gB蛋白或其免疫原性片段进行编码的重组核苷酸序列。

15.根据权利要求1到12中任一项所述的重组HVT，其包括：(i)插入在HVT065与HVT066之间的基因间区域中的优先受Pec启动子控制的对NDV的F蛋白或其免疫原性片段进行编码的重组核苷酸序列；以及(ii)插入在HVT053与HVT054之间的基因间区域中的优先受Pec启动子控制的对ILTV的gB蛋白或其免疫原性片段进行编码的重组核苷酸序列。

16.根据权利要求1到12中任一项所述的重组HVT，其包括：(i)插入在HVT065与HVT066之间的基因间区域中的优先受Mcmv ie1启动子控制的对ILTV的gB蛋白或其免疫原性片段进行编码的重组核苷酸序列；以及(ii)插入在HVT053与HVT054之间的基因间区域中的优先受Pec启动子控制的对NDV的F蛋白或其免疫原性片段进行编码的重组核苷酸序列。

17.一种核酸，其包括根据权利要求1到16中任一项所述的重组HVT的基因组。

18.一种细胞，其含有根据权利要求1到16中任一项所述的重组HVT或根据权利要求17所述的核酸。

19.一种组合物，其包括权利要求1到16中任一项的重组禽疱疹病毒和合适的赋形剂或稀释剂。

20.一种组合物，其包括根据权利要求17所述的核酸或根据权利要求18所述的细胞以及合适的赋形剂或稀释剂。

21.一种多价疫苗，其包括有效免疫量的权利要求1到16中任一项的重组禽疱疹病毒、根据权利要求17所述的核酸和/或根据权利要求18所述的细胞。

22.根据权利要求1到16中任一项所述的重组HVT，其用于使如家禽等禽类动物获得对病原体的免疫。

23.根据权利要求21所述的多价疫苗，其在用于对禽类动物进行同时针对至少两种病原体的疫苗接种的方法中使用。

24.一种用于使禽类动物获得免疫的疫苗接种试剂盒，所述疫苗接种试剂盒包括以下组成部分：

c.有效量的根据权利要求21所述的多价疫苗；以及

d.用于向所述禽类动物施用所述疫苗的装置。