CN103740759A - 表达h5n1亚型禽流感病毒ha基因的重组火鸡疱疹病毒 - Google Patents
表达h5n1亚型禽流感病毒ha基因的重组火鸡疱疹病毒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种重组火鸡疱疹病毒，所述重组火鸡疱疹病毒在其编码序列的非必需复制区中重组有H5亚型高致病力禽流感病毒的灭活疫苗Re-6株表面HA基因。所述重组火鸡疱疹病毒可以用于制备禽流感疫苗。
Description
技术领域
本发明涉及重组病毒领域。具体地，本发明涉及一种重组火鸡疱疹病毒，其包含H5亚型高致病力禽流感病毒的HA基因。
背景技术
火鸡疱疹病毒(HVT)为一种α疱疹病毒，因其与马立克氏病病毒(MDV)抗原相关性而被广泛用作预防马立克氏病(MD)的活疫苗。HVTFc-126株作为原型MD疫苗自1970年以来一直使用，该疫苗无致瘤性，保护效果良好，可以冻干，使用方便，在MD的控制过程中发挥了重要的作用[1-4]。近些年来，HVT作为病毒载体方面的研究也取得了许多进展，相比其他禽病病毒载体具有许多优点：HVT对鸡及其它动物均无致病性，安全性好；接种后在鸡体内形成长达数周的病毒血症，且终生潜伏感染，可刺激机体产生较高的细胞免疫反应和抗体水平，接种一次即可获得终生免疫[5-14]。目前，传染性法氏囊病毒等多种禽病保护性抗原均已在HVT载体中成功表达且在多个国家包括中国上市使用，显示出HVT作为载体疫苗良好的应用前景[14-19]。
禽流感是禽流行性感冒的简称，它是一种由A型流感病毒引起的具有高度传染性和致死性的疾病，被国际兽医局定为A类传染病，我国也高度重视本病的防控。按病毒致病类型的不同，禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性禽流感三大类。H5N1高致病性禽流感的发病率和死亡率均高，几乎是100%，能够给禽养殖业造成巨大损失，同时高致病性禽流感还可感染人类并致死，是公共卫生健康的一大威胁。
发明内容
本研究将目前使用的H5N1亚型高致病力禽流感的灭活疫苗Re-6株表面HA基因重组于HVT基因组的非必需复制区中，获得了表达禽流感病毒(AIV)HA基因的重组火鸡疱疹病毒(rHVT)，该重组病毒可用于免疫鸡、鸭等禽类，使其获得抵抗高致病性禽流感和马立克氏病毒的免疫力。
更具体地，本发明提供以下各项：
1.一种重组火鸡疱疹病毒，所述重组火鸡疱疹病毒在其编码序列的非必需复制区中的HVT053和HVT054基因之间重组有H5N1亚型禽流感病毒的HA基因。
2.根据1所述的重组火鸡疱疹病毒，其中所述HA基因来自H5N1亚型禽流感病毒Re-6株。
3.根据1所述的重组火鸡疱疹病毒，其中所述HA基因的序列如SEQID NO:1所示。
4.根据1所述的重组火鸡疱疹病毒，所述重组火鸡疱疹病毒已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：V201326。
5.根据1-4中任一项所述的重组火鸡疱疹病毒的编码核酸。
6.根据1-4中任一项所述的重组火鸡疱疹病毒或根据5所述的编码核酸在制备H5亚型禽流感疫苗中的用途。
7.根据1-4中任一项所述的重组火鸡疱疹病毒或根据5所述的编码核酸在制备H5亚型禽流感/火鸡疱疹二价疫苗中的用途。
8.一种H5亚型禽流感疫苗，其活性成分为根据1-4中任一项所述的重组火鸡疱疹病毒。
9.一种H5亚型禽流感/火鸡疱疹二价疫苗，其活性成分为根据1-4中任一项所述的重组火鸡疱疹病毒。
附图说明
图1：质粒pCAGGS的图谱。
图2：质粒pBlu-LR的图谱。
图3：质粒pCAGG-HA的图谱。
图4：质粒pBlu-LR-HA的图谱。
图5：转移载体pBlu-LR-HA构建过程示意图
图6：禽流感HA基因表达框架插入HVT基因组中位置示意图。
图7：重组病毒rHVT-5354HA Re-6的PCR鉴定，其中M：标记物；1：rHVT-5354HA Re-6；2：HVT；3：CEF。
图8：重组病毒rHVT-5354HA Re-6的免疫印迹鉴定，其中M：标记物；1：rHVT-5354HA Re-6；2：HVT；3：CEF。
图9：重组病毒rHVT-5354HA Re-6的间接免疫荧光鉴定，其中A：rHVT5354HA Re-6，B：HVT。
图10：重组病毒免疫后HI抗体生成情况。
具体实施方式
材料
HVT疫苗株(FC-126)购自中国兽医药品监察所；禽流感病毒株A/duck/Guangdong/S1322/2010(H5N1)(2010年从广东分离的H5N1型禽流感毒株，由本发明人所在的国家禽流感参考实验室保存，该实验室是国内合法保存禽流感病毒的机构)。
实施例1、HVT基因组DNA的提取
用9-10日龄SPF鸡胚(由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供)，按照常规方法进行原代及次代鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备和培养。24h细胞长成单层后，按0.1MOI接种HVT，接种72h后，在细胞出现80%病变时，收取细胞。如Morgan等所述的方法制备病毒DNA[20]。
实施例2、含HA的HVT转移载体的构建
分别用设计的两对引物(LU和LD；RU和RD)依据重叠PCR的原理扩增HVT Fc-126株HVT053和HVT054基因之间(SEQ ID NO:3)及其两侧的同源序列L(SEQ ID NO:4)和R(SEQ ID NO:5)片段，大小分别为1.5kb和1.4kb，利用限制性内切酶SacI(购自NEB公司)和KpnI(购自NEB公司)将扩增所得片段定向克隆到pBluescript载体(购自Stratagene公司)，获得的重组质粒命名为pBlu-LR(参见附图2)；
LU:GAGCTCGGCGGCCGGAATGCTACAGCTGTACCGAC
LD:TTTAAAGCTTGTCGACTTTACTCATCGCATTAGAGAGGAC
RU:TGAGTAAA GTCGACAAGCTTTAAAAACGCACCTCTAACGG
RD:GGTACCGGCGGCCGATCGGAGGTGAAGCGCCACTTT
以pBD-HA Re-6质粒(其所包含的禽流感病毒血凝素HA基因是已缺失掉碱性裂解位点的HA基因，由H5N1型禽流感毒株A/duck/Guangdong/S1322/2010(H5N1)扩增得到[21]，HA基因的序列如SEQID NO:1所示，其所编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)为模板，用引物HAU和HAD通过PCR扩增出两侧分别为SacI(购自NEB公司)和NheI(购自NEB公司)酶切位点的HA基因。
HAU:ACAGAGCTCGCCACCATGGAAAAAATAGTGCTCC
HAD:GGACGCTAGCCTGAACTCACAAACTTAGATGC
将HA亚克隆到pCAGGS载体[22](图谱参见附图1)的相应位点，使其处于Pec启动子和加尾信号序列之间，将获得的重组质粒命名为pCAGG-HA(参见附图3)，利用限制性内切酶SalI(购自NEB公司)和HindIII(购自NEB公司)将HA基因表达框架(包含启动子、HA基因及加尾信号)亚克隆到pBlu-LR质粒的左右同源臂之间，构建成功pBlu-LR-HA(参见附图4)。
实施例3、重组火鸡疱疹病毒的构建
将20ug的转移载体pBlu-LR-HA用NotI(购自NEB公司)线性化后与10ug从HVT感染的CEF中提取的细胞总DNA混合，参照Reddy SM的方法利用磷酸钙(购自生命科学技术公司)共转染在60mm培养的CEF[23]。转染后第四天，用胰酶(购自GIBCO公司)将细胞消化混匀后转入一块空的96孔细胞培养板(150ul/孔)，每孔各取50ul细胞悬液加入两块铺满CEF的96孔细胞培养板中培养，三天后一块培养板用特异性鸡抗HA抗体(由pCAGG-HA质粒免疫SPF鸡后制备的单因子血清获得)进行间接免疫荧光检测，取另一块培养板相对应的阳性孔继续进行亚克隆，直至所有孔都为阳性。将阳性孔内细胞用胰酶消化后转入新制备的CEF中进行大量扩增，扩增后进行病毒滴度的测定。如此方法得到的重组病毒命名为rHVT-5354HA Re-6(其已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：V201326)。
实施例4、重组病毒rHVT-5354HA Re-6的PCR鉴定
常规方法制备CEF细胞，将重组病毒连续传20代，以0.1MOI接种第20代重组病毒rHVT-5354HA Re-6于新鲜制备的CEF，待80％细胞出现病变时去除上清，收获细胞提取总DNA，用特异性引物(HAU和HAD)扩增HA基因，结果如附图7所示。重组病毒样品泳道出现特异性的大小约为1.7kb的条带而亲本HVT及CEF细胞泳道相应条带，说明禽流感病毒HA基因能够在重组火鸡疱疹病毒基因组中稳定存在。
实施例5、重组病毒rHVT-5354HA Re-6的免疫印迹鉴定
常规方法制备CEF细胞，以0.1MOI接种第20代重组病毒rHVT-5354HA Re-6，待80％细胞出现病变时去除上清，收获细胞进行SDS-PAGE电泳，先用甲醇润湿PVDF膜(购自密理博公司)后，用转膜液浸泡膜和滤纸10分钟，用半干法进行转印，转膜条件为电压15V，15分钟。用PBS洗膜3次，每次5分钟。将膜放置于平皿中，加5％脱脂乳封闭液，于37℃摇荡1小时后，加入用封闭液按1:200的比例稀释的鸡抗HA抗体(国家禽流感参考实验室按常规方法制备并保存)作为一抗，室温摇荡1小时，用PBST洗膜3次，每次5分钟；加入用封闭液按1:5000的比例稀释的红外荧光标记的抗鸡IgG抗体(购自Sigma公司)(作为二抗)，室温摇荡1小时，用PBST洗膜3次，每次5分钟；最后加入少许PBS，在奥德赛扫描仪中拍照。结果如附图8所示。重组病毒样品泳道出现特异性的大小约为72kd目的条带，亲本病毒及CEF泳道无特异性条带，证明该蛋白条带即重组病毒表达的禽流感病毒HA蛋白。
实施例6、重组病毒rHVT-5354HA Re-6的间接免疫荧光鉴定
常规方法制备CEF细胞，以0.1MOI接种第20代重组病毒rHVT-5354HA Re-6，待出现细胞病变时去除上清，用PBS洗2次，用4％多聚甲醛于室温条件下固定细胞20分钟，PBS洗3次，加入用1％BSA封闭液按1:200的比例稀释的鸡抗HA抗体(国家禽流感参考实验室制备并保存)，37℃作用1小时。用PBST洗5次，每次3分钟。用绿色荧光(FITC)标记的羊抗鸡IgG抗体(购自密理博公司)在37℃作用1小时。用PBS洗5次，在荧光显微镜下观察并拍照。结果如附图9所示。重组病毒感染细胞出现特异性的荧光信号而HVT亲本病毒则无信号，由此证明重组病毒可在CEF细胞中正确表达禽流感病毒HA蛋白。
实施例7、动物实验
将60只1日龄SPF鸡(由哈尔滨兽医研究所动物房提供)随机分为3组，每组20只，第一组以5000PFU剂量免疫重组病毒rHVT-5354HA Re-6；第二组以5000PFU剂量免疫亲本HVT；第三组免疫不含病毒的M199细胞培养液；所有病毒和细胞均用M199细胞培养液进行稀释后经颈部皮下注射方式免疫雏鸡。免疫后每周翅静脉采取血液并分离血清。5周后通过滴鼻方式以100CLD50剂量的高致病性禽流感病毒A/duck/Guangdong/S1322/2010(2010年从广东分离的H5N1型禽流感毒株，由本发明人所在的国家禽流感参考实验室保存，该实验室是国内合法保存禽流感病毒的机构)感染所有组鸡只。攻毒后持续观察两周，记录各组发病及死亡情况。结果如表1所示，重组病毒rHVT-5354HA Re-6免疫组鸡只得到100%保护，攻毒后所有鸡全部存活，均没有发病、死亡；HVT及CEF对照组鸡只全部发病且死亡。上述结果表明重组病毒rHVT-5354HA Re-6能够提供针对H5亚型高致病性禽流感病毒的完全保护力。
表1攻毒保护实验结果
实施例8、重组病毒rHVT-5354HA Re-6诱导产生的血凝抑制抗体(HI)抗体
将采取的血液置于低速离心机中离心分离血清，测定分离获得的血清中血凝抑制抗体的步骤如下：在96孔血凝板中先加入25微升PBS缓冲液，然后2倍比梯度稀释血清，之后每孔加入25微升的4单位抗原(即灭活的禽流感病毒)，所述抗原用A/duck/Guangdong/S1322/2010毒株(由本发明人所在国家禽流感参考实验室保存)制备，室温下作用25分钟，之后加入25微升1%鸡红细胞(由本研究室按常规方法制备)，室温下作用25分钟，观察结果。结果如附图10所示：重组病毒rHVT-5354HA Re-6免疫后第三周抗体转阳，之后滴度逐渐升高，免疫后第六周达到峰值，平均值为7log2。在整个试验期HVT免疫组及M199对照组均未检测到特异性的HI抗体，上述结果表明，重组病毒rHVT-5354HA Re-6可在鸡体内诱导产生特异性的针对H5亚型禽流感病毒抗体。
讨论
流感病毒亚型众多，变异频繁，给防控带来巨大的挑战。我国禽流感防控所采用是免疫预防与发病后扑杀相结合的政策，目前在我国使用范围最广的禽流感疫苗是禽流感灭活疫苗，此疫苗免疫后能够产生较高水平的抗体，效果显著，但缺点是生产成本高，接种后有不良副作用等。实际生产中，禽流感灭活疫苗一般在2-3周龄时接种，接种后需要两周左右才能提供完全保护，而母源抗体也只能维持到孵化后两周，故从孵化后的两周到四周是禽流感疫苗的免疫空白期，在这段时间内禽类对流感病毒的抵抗力较低，存在较高的感染风险。解决这一问题的途径之一是降低免疫日龄，但对于灭活疫苗来说降低的空间较小，而利用火鸡疱疹病毒为载体的新型基因工程疫苗有望填补这一空白。火鸡疱疹病毒可以在18日胚龄或1日龄时进行免疫接种，免疫后三周即可提供完全保护力。近些年来，以火鸡疱疹病毒为载体的新型基因工程疫苗陆续被批准上市，并且在临床上也取得很好的应用效果[18,24,25]。本研究构建了表达H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白的重组火鸡疱疹病毒并在SPF鸡上进行了免疫评价，结果表明，接种此重组病毒后可使SPF鸡获得针对H5N1亚型禽流感病毒的完全免疫力。此重组二价疫苗如果用于生产实际将产生巨大的经济效益，具有广阔的应用前景。
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Claims (9)
1.一种重组火鸡疱疹病毒，所述重组火鸡疱疹病毒在其编码序列的非必需复制区中的HVT053和HVT054基因之间重组有H5N1亚型禽流感病毒的HA基因。
2.根据权利要求1所述的重组火鸡疱疹病毒，其中所述HA基因来自H5N1亚型禽流感病毒Re-6株。
3.根据权利要求1所述的重组火鸡疱疹病毒，其中所述HA基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根据权利要求1所述的重组火鸡疱疹病毒，所述重组火鸡疱疹病毒已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：V201326。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的重组火鸡疱疹病毒的编码核酸。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的重组火鸡疱疹病毒或根据权利要求5所述的编码核酸在制备H5亚型禽流感疫苗中的用途。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的重组火鸡疱疹病毒或根据权利要求5所述的编码核酸在制备H5亚型禽流感/火鸡疱疹二价疫苗中的用途。
8.一种H5亚型禽流感疫苗，其活性成分为根据权利要求1-4中任一项所述的重组火鸡疱疹病毒。
9.一种H5亚型禽流感/火鸡疱疹二价疫苗，其活性成分为根据权利要求1-4中任一项所述的重组火鸡疱疹病毒。
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