CN116814565B - 表达h3亚型禽流感病毒ha基因的重组火鸡疱疹病毒 - Google Patents
表达h3亚型禽流感病毒ha基因的重组火鸡疱疹病毒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116814565B CN116814565B CN202311108002.8A CN202311108002A CN116814565B CN 116814565 B CN116814565 B CN 116814565B CN 202311108002 A CN202311108002 A CN 202311108002A CN 116814565 B CN116814565 B CN 116814565B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- avian influenza
- influenza virus
- subtype avian
- recombinant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 title claims abstract description 68
- 101150039660 HA gene Proteins 0.000 title claims abstract description 31
- 241001502481 Meleagrid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 title claims abstract description 26
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 22
- 101150108190 US2 gene Proteins 0.000 claims description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 8
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 8
- 229940124873 Influenza virus vaccine Drugs 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 92
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 31
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 30
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 description 26
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 24
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 17
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 16
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 15
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 12
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 9
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 9
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 8
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 8
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 8
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 description 6
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 6
- 210000003555 cloaca Anatomy 0.000 description 6
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 6
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 6
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 6
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 4
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 4
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 4
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 3
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 3
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 206010015967 Eye swelling Diseases 0.000 description 2
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 235000021050 feed intake Nutrition 0.000 description 2
- 101150029683 gB gene Proteins 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 101150111468 H3 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 244000144992 flock Species 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 229940023832 live vector-vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 229940023147 viral vector vaccine Drugs 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种表达H3亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒。该重组病毒rHVT‑US2‑mCMV‑H3‑HA是将H3亚型禽流感病毒HA基因插入到火鸡疱疹病毒HVT FC126的US2区的140211nt‑140662nt位点，本发明提供的重组病毒rHVT‑US2‑mCMV‑H3‑HA，对于新发的H3亚型禽流感病毒感染提供更有效的保护，具有良好的市场应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因工程疫苗领域，尤其是涉及一种表达H3亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒。
背景技术
目前发现的人感染H3N8发病前均有活禽暴露史。随着H3亚型禽流感分离率的增高，其可能形成新的危害。由于现有的H5、H7、H9亚型的禽流感疫苗与H3抗原性明显不同，因而无法对H3亚型禽流感病毒感染起到有效的交叉保护效果。通过已有数据分析表明，最新流行的H3亚型禽流感病毒HA基因与我国以前发生的H3亚型禽流感病毒HA基因抗原存在着明显的差异，表现在HA蛋白主要的保护性抗原位点均有所变异，发生抗原漂移，从而导致最新流行的H3亚型禽流感病毒HA抗原与我国以往流行的H3抗原匹配性不高，用这样的H3疫苗免疫鸡群会导致针对新流行H3亚型禽流感病毒的免疫失败。
火鸡疱疹病毒（HVT）疫苗作为载体疫苗，可以用于构建重组禽病毒疫苗，避开母源抗体的干扰。因此将H3 AIV HA保护性抗原插入到HVT基因组中，构建重组病毒载体疫苗，是预防此类疫病的可行方法。目前，针对我国最新流行的H3亚型禽流感病毒，尚无有效的商品化疫苗加以预防和治疗。究其原因，一方面新的H3亚型禽流感病毒的抗原性与以往毒株存在明显不同；另一方面，鸡场母鸡受到H3亚型禽流感病毒感染耐过后，母源抗体势必会影响疫苗的免疫效果。因此，研发出具有抗原高度匹配性的、能够避开母源抗体干扰的H3亚型禽流感病毒疫苗是亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表达H3亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒。
为实现以上技术目的，本发明采用如下技术方案：
表达H3亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒，所述H3亚型禽流感病毒为H3亚型禽流感病毒H3-RP03株（Avian influenza virus H3-RP03），保藏时间2023年6月9日，保藏地址位于湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:V202357。
进一步的，所述H3亚型禽流感病毒HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步的，所述H3亚型禽流感病毒HA基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步的，所述重组火鸡疱疹病毒是在火鸡疱疹病毒基因组US2基因内插入H3亚型禽流感病毒HA基因的表达框后得到的。
进一步的，所述火鸡疱疹病毒基因组US2基因的插入位点为140211nt-140662nt。
进一步的，所述H3亚型禽流感病毒HA基因的表达框包括mCMV启动子和SV40终止子。
一种表达H3亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒在制备禽流感病毒疫苗和药物中的应用。
本发明首先利用同源重组原理，以HVT FC-126基因组为插入位点，分别构建含有插入位点两侧的同源臂的同源重组质粒，然后将H3插入到鼠真核启动子下，为了筛选重组病毒，本发明在H3基因的后面连入了eGFP标记基因，并且为了后期剔除eGFP蛋白，本研究又在eGFP基因的两端插入了LOXP位点。
利用同源重组技术，将含有H3 HA以及eGFP筛选基因的表达框的同源重组质粒转染预先感染HVT FC-126的鸡胚成纤维细胞，外源表达盒通过同源臂和HVT发生同源重组，外源基因整合到US2插入位点，通过eGFP筛选基因，多轮筛选到含有eGFP的重组病毒rHVT-H3-HA-eGFP。
利用cre酶，将含有cre酶的质粒pCDNA3.1-cre转染预先感染rHVT-H3-HA-eGFP的鸡胚成纤维细胞。eGFP筛选基因会在cre酶的作用下，其两端的LOXP位点会发生同源重组，从而eGFP基因被完整剔除，经过多轮筛选不含荧光的重组病毒rHVT-H3-HA。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
H3亚型禽流感病毒的HA蛋白是免疫保护性抗原，免疫鸡，可以刺激机体产生特异性的针对H3亚型禽流感的抗体，可激发机体抵御H3亚型禽流感病毒的感染。因此，本发明构建的表达H3 HA基因的重组活载体疫苗rHVT-H3-HA具有潜在的市场应用价值。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1 为H3亚型禽流感病毒H3-RP03株的遗传进化树分析图；
图2 为重组火鸡疱疹病毒rHVT-5354-gB-H3-HA构建图；
图3 为rHVT-5354-gB-H3-HA重组病毒PCR鉴定结果图，其中1：HVT FC-126，2：rHVT-5354-gB-H3-HA；3：空白对照；
图4 为rHVT-5354-gB-H3-HA重组病毒感染CEF细胞的结果图，其中，左图：健康CEF对照，右图：rHVT-5354-gB-H3-HA重组病毒感染CEF病变；
图5 为rHVT-5354-gB-H3-HA重组病毒间接免疫荧光鉴定结果图，其中左图：rHVT-5354-gB-H3-HA，右图：CEF对照；
图6 为rHVT-5354-gB-H3-HA疫苗免疫后的HI抗体水平变化情况图，其中wpi：weeks post-immunization，dpc：days post-challenge；
图7 为rHVT-US2-mCMV-H3-HA构建示意图；
图8 为rHVT-US2-mCMV-H3-HA重组病毒PCR鉴定结果图，其中1：HVT FC-126；2：rHVT-US2-mCMV-H3-HA；3：空白对照；
图9 为rHVT-US2-mCMV-H3-HA重组病毒感染CEF细胞的结果图，其中，左图：健康CEF对照，右图：rHVT-US2-mCMV-H3-HA重组病毒感染CEF病变；
图10 为rHVT-US2-mCMV-H3-HA重组病毒间接免疫荧光鉴定结果图，其中左图：rHVT-US2-mCMV-H3-HA，右图：CEF对照；
图11 为rHVT-US2-mCMV-H3-HA疫苗免疫后的HI抗体水平变化图。
本发明将H3亚型禽流感病毒为H3亚型禽流感病毒H3-RP03株（Avian influenzavirus H3-RP03），保藏时间2023年6月9日，保藏地址位于湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:V202357。
具体实施方式
以下具体说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。本领域的技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。
下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1：重组火鸡疱疹病毒rHVT-5354-gB-H3-HA的构建
1 实验材料
1.1 毒株、菌株和质粒
HVT FC-126疫苗株购自中国兽医药品监察所；大肠杆菌DH5alpha感受态细胞购自诺唯赞生物科技股份有限公司；pBluescript SK II质粒、含有PrV gB基因启动子和BGH多聚腺苷酸终止序列的真核表达质粒pgB、表达cre酶的质粒pCDNA3.1-cre由天津瑞普生物技术股份有限公司生物制品研究院保存；9-11日龄SPF鸡胚购自北京勃林格公司；原代鸡胚成纤维细胞取自9-11日龄鸡胚组织制备而成。
实验方法
2.1 H3 HA基因扩增与序列分析
H3亚型禽流感病毒H3-RP03株的分离：对有明显呼吸道症状的禽流感发病鸡，采集口咽拭子和肛拭子，将拭子置于2ml病毒保存液中（含有双抗），低温运至实验室进行检测和病毒分离鉴定。将拭子反复挤压，吸取液体置于1.5ml离心管中，12000 rpm 4度离心10分钟，无菌取出上清液，置于新的灭菌1.5ml离心管中，12000 rpm 4度离心10分钟，无菌取出上清液。将上清液进行10倍倍比稀释，0.2ml/胚，接于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔中；24h观察一次，弃掉死亡鸡胚。于接种后72h，收获尿囊液。测定血凝价，将血凝价大于4的尿囊液单独保存。没有血凝价的尿囊液继续盲传2代，3代之后再测血凝价，将有血凝价的尿囊液保存起来，弃掉没有血凝价的尿囊液，记作阴性。将含有血凝价的尿囊液进行10倍倍比稀释，然后按照0.2ml/胚接种9-11日龄SPF鸡胚，取有血凝价的最大稀释度对应的尿囊液，继续稀释，接SPF鸡胚，每次收获最大稀释度的尿囊液。连续传3代，收获病毒。
用病毒RNA提取试剂盒提取H3亚型禽流感病毒H3-RP03株病毒基因组，然后用uni12反转录引物+随机引物进行反转录，用H3亚型病毒禽流感病毒HA基因特异性的引物进行PCR，然后将PCR产物连入T载体，将PCR鉴定为阳性的菌液送测序公司进行测序，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，然后与GenBank中收录的H3亚型禽流感病毒HA基因进行序列比对与分析。
测序结果表明，本研究获得的毒株的HA氨基酸与GenBank中收录的2022年之前的H3 HA的同源性在95%以下。遗传进化分析，H3HA H3-RP03株在进化树上处于单独的进化分支，与其它毒株遗传距离相距较远（图1）。H3亚型禽流感病毒HA1蛋白表面有5个特有的抗原区，H3HA Ringpu株在这5个区的序列特征为122ITESFT127（A1）、133QNGGSS138（A2）、143GPANG147（A3）、156TKSGSSYPL164（B1）、188TNQEQTDLYVQAS200（B2）、49TGKICNNP56（C1）、274PIETCI279（C2）、171NNYNF175（D1）、202RVTVSTRRSQQTIVPNIG219（D2）、242DVLVINSN249（D3）、63RD64（E1）、79GFQDEK84（E2）。
因此将H3亚型禽流感病毒H3-RP03株（Avian influenza virus H3-RP03）保藏，保藏时间2023年6月9日，保藏地址位于湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V202357。
2.1 中间转移质粒的构建
2.1.1 同源臂引物设计
rHVT-5354-gB-H3-HA重组病毒的构建示意图如图2所示。选择HVT FC-126 HVT053基因HVT054间隔区95332nt-95342nt作为插入位点，参照GenBank中登录的HVT FC126株（GenBank accession no. AF291866）的全基因组序列，用Primer Premier 5.0引物设计软件设计两对引物，分别PCR扩增HVT053基因左边区和HVT054右边区的同源臂，同源臂长度各3000bp。同源臂序列为HVT FC126基因组的92332nt-95332nt和95342nt-98342nt。
2.1.2 同源重组质粒pBlue-HVT5354的构建
用病毒DNA提取试剂盒提取HVT FC-126基因组DNA，然后用扩增HVT053左边区和HVT054右边区的引物对，分别扩增HVT053和HVT054区同源臂，然后应用诺唯赞infusion连接试剂盒，将左右区同源臂同时插入到pBluescript SK II载体中，构建的质粒命名为pBlue-HVT5354。
2.1.3 带有筛选基因的pBlue-HVT5354-eGFP的构建
以pIRES2-eGFP为模板，设计一对引物扩增eGFP基因表达框，同时在eGFP基因表达框的两端，引入LOXP识别位点，通过酶切克隆的方式，将LOXP-eGFP表达框，连入到pBlue-HVT5354中，通过酶切、PCR、测序验证，鉴定正确的质粒命名为pBlue-HVT5354-eGFP。
2.1.4 表达H3-HA的同源重组质粒pgB-H3-HA的构建
首先，提取实验室分离的H3亚型禽流感病毒的HA基因组，然后用特异性得HA基因扩增引物扩增H3-HA序列，获得H3亚型禽流感HA基因序列H3-HA。然后用酶切连接的方式，插入到pgB载体中，构建出真核表达质粒pgB-H3-HA。
2.1.5 表达H3-HA的同源重组质粒pBlue-HVT5354-HA-eGFP的构建
设计一对引物将gB-H3-HA表达盒整体扩增下来。然后，通过酶切连接的方式插入到含有同源臂的质粒pBlue-HVT5354-eGFP中，通过酶切、PCR、测序验证，鉴定正确的质粒命名为pBlue-HVT5354-gB-HA-eGFP。
2.2 含有eGFP基因的重组病毒rHVT-5354-gB-H3-HA-eGFP的获得
将pBlue-HVT5354-gB-HA-eGFP按照1:100比例接种LB培养基，12hpi，大提质粒。制备原代鸡胚成纤维细胞，然后按照200万/孔密度铺六孔板。次日，先用HVT FC126亲本病毒感染鸡胚成纤维细胞，接种比例为1MOI。2hpi，更换培养基，用invitrogen lipo3000脂质体转染试剂将大提质粒pBlue-HVT5354-gB-HA-eGFP转染HVT感染的鸡胚成纤维细胞。转染后12小时换液。5天后，将转染的细胞消化下来，按照不同细胞密度，接种到6孔板中，然后铺熔点琼脂。5天后，在荧光显微镜下观察，寻找有绿色荧光表达的细胞。将含有绿色荧光的细胞挑取出来，继续稀释接种鸡胚成纤维细胞，铺低熔点琼脂，筛绿色荧光蚀斑，经过连续10轮筛选，最终得到纯净的含有绿色荧光的重组病毒rHVT-5354-gB-H3-HA-eGFP。
2.3 剔除eGFP基因的重组病毒rHVT-5354-gB-H3-HA的获得
将筛选得到的重组病毒rHVT-5354-gB-H3-HA-eGFP进行扩大培养。制备原代鸡胚成纤维细胞，然后按照200万/孔密度铺六孔板。次日，先用重组病毒rHVT-5354-gB-H3-HA-eGFP感染鸡胚成纤维细胞，接种比例为1MOI。2hpi，更换培养基，用invitrogen lipo3000脂质体转染试剂将大提质粒pCDNA3.1-cre转染重组病毒rHVT-5354-gB-H3-HA-eGFP感染的鸡胚成纤维细胞。转染后12小时换液。5天后，将转染的细胞消化下来，按照不同细胞密度，接种到6孔板中，然后铺熔点琼脂。5天后，在荧光显微镜下观察，寻找没有绿色荧光表达的蚀斑细胞。将不含有绿色荧光的细胞挑取出来，继续稀释接种鸡胚成纤维细胞，铺低熔点琼脂，筛绿没有色荧光蚀斑，经过连续5-7轮筛选，最终得到纯净的不含有绿色荧光的重组病毒rHVT-5354-gB-H3-HA。
2.4 重组病毒的鉴定
2.4.1 重组病毒的PCR鉴定结果
提取重组病毒DNA、亲本病毒DNA，然后用扩H3 HA基因和特异性的引物进行PCR鉴定，试验结果表明，通过目的基因特异性引物进行鉴定，重组病毒扩增出约1700bp的HA基因（图3），但亲本病毒HVT FC-126中扩增不到相应的目的基因。以上结果说明，H3-HA基因正确的插入到HVT基因组的HVT053/HVT054区。
2.4.2 重组病毒的细胞病变观察
将重组病毒rHVT-5354-gB-H3-HA、HVT FC-126亲本病毒接种原代鸡胚成纤维细胞，然后观察重组病毒与亲本病毒在原代鸡胚成纤维细胞上的生长状态有无差异。试验结果表明，重组病毒和亲本病毒接种细胞后，细胞病变的状态、产生细胞病变的时间大致都差不多，肉眼观察无明显差异（图4）。
2.4.3 重组病毒的间接免疫荧光鉴定结果
将未重组的火鸡疱疹病毒和纯化的重组病毒rHVT-5354-gB-H3-HA分别以0.5MOI感染CEF细胞，待感染后的CEF出现病变时，分别用H3亚型禽流感病毒阳性血清作为一抗，Alexa Fluor-488标记的羊抗鸡的荧光二抗做间接免疫荧光试验检测目的基因的表达。接种重组病毒rHVT-5354-gB-H3-HA的CEF细胞病变区域发出较亮的绿色荧光，接种未感染重组病毒的CEF细胞没有检测出绿色荧光，说明目的基因HA在重组HVT病毒中很好的表达（图5）。
2.5 重组病毒rHVT-5354-gB-H3-HA对H3亚型禽流感病毒的免疫保护评价
将30只1日龄SPF鸡随机分成三组，分别为rHVT-5354-gB-H3-HA组、HVT FC-126组和空白对照组；其中rHVT-5354-gB-H3-HA组、HVT FC-126组在1日龄时通过颈部皮下接种4000PFU/羽份的重组病毒或亲本病毒，攻毒对照组仅接种疫苗稀释液。各组在免疫后21天，用H3亚型禽流感病毒H3-RP03株攻毒，攻毒方式为滴鼻感染，攻毒剂量为106EID50/0.2 ml，攻毒后第5日，采集每只鸡的咽拭子和泄殖腔拭子，进行病毒分离。临床观察结果表明，重组病毒载体疫苗rHVT-5354-gB-H3-HA、HVT FC-126和空白对照组在接种后，SPF鸡均无异常；接种H3亚型禽流感病毒后，5天内观察，所有组鸡均存活，但rHVT-5354-gB-H3-HA组和HVTFC-126组部分鸡行动迟缓、被毛眼观异常、采食量下降和眼睛肿胀等现象；而未免疫组未出现上述变化，临床观察无异常。将采集的咽拭子和泄殖腔拭子，进行无菌处理后，接种SPF鸡胚，3天后，测定HA效价，检测病毒分离情况。试验结果表明，rHVT-5354-gB-H3-HA疫苗免疫组仅有1只鸡咽拭子和泄殖腔拭子病毒分离阴性，综合保护率为10%；HVT FC-126疫苗组仅1只鸡病毒分离阴性，综合保护率10%，而空白对照组均未分离到病毒（表1）。以上结果表明，H3-HA插入位点为HVT053/HVT054位点，启动子为PrV gB基因启动子的表H3-HA重组火鸡疱疹病毒rHVT-5354-gB-H3-HA免疫鸡之后，无法抵御H3亚型禽流感病毒的感染。
表1 攻毒5天后，H3亚型流感病毒分离结果
疫苗免疫后，每组随机取5只鸡采血，分离血清，用H3亚型禽流感病毒H3-RP03株抗原检测免疫后血清HI效价水平。试验结果表明，整个免疫期直至攻毒前采血，均未检测到H3亚型禽流感病毒特异性抗体。攻毒后第5天，采血，HI抗体有一过性升高（图6）。
实施例2：重组火鸡疱疹病毒rHVT-US2-mCMV-H3-HA的构建
1 实验材料
1.1 毒株、菌株和质粒
大肠杆菌DH5alpha感受态细胞购自诺唯赞生物科技股份有限公司；pBluescriptSK II质粒、含有mCMV启动子和SV40终止子的真核表达质粒pmCMV、表达cre酶的质粒pCDNA3.1-cre由天津瑞普生物技术股份有限公司生物制品研究院保存；9-11日龄SPF鸡胚购自北京勃林格公司；原代鸡胚成纤维细胞取自9-11日龄鸡胚组织制备而成。
2实验方法
2.1 中间转移质粒的构建
2.1.1 同源臂引物设计
rHVT-US2-mCMV-H3-HA重组病毒的构建示意图如图7所示。选择HVT FC-126 US2基因140211nt-140662nt作为插入位点，参照GenBank中登录的HVT FC126株（GenBankaccession no. AF291866）的全基因组序列，用Primer Premier 5.0引物设计软件设计两对引物，分别PCR扩增US2基因左边区和右边区的同源臂，同源臂长度各3000bp。同源臂序列为HVT FC126基因组的137211nt-140211nt和140662nt-143662nt。
2.1.2 同源重组质粒pBlue-US2的构建
用病毒DNA提取试剂盒提取HVT FC-126基因组DNA，然后用扩US2左边区和右边区的引物对，分别扩增US2区同源臂，然后应用诺唯赞infusion连接试剂盒，将左右区同源臂同时插入到pBluescript SK II载体中，构建的质粒命名为pBlue-US2。
2.1.3 带有筛选基因的pBlue-US2-eGFP的构建
以pIRES2-eGFP为模板，设计一对引物扩增eGFP基因表达框，同时在eGFP基因表达框的两端，引入LOXP识别位点，通过酶切克隆的方式，将LOXP-eGFP表达框，连入到pBlue-US2中，通过酶切、PCR、测序验证，鉴定正确的质粒命名为pBlue-US2-eGFP。
2.1.4 表达H3 HA的同源重组质粒pmCMV-HA的构建
首先，提取实验室分离的H3亚型禽流感病毒的HA基因组，然后用特异性得HA基因扩增引物扩增H3-HA基因，获得H3亚型禽流感HA基因序列H3-HA。然后用酶切连接的方式，插入到pmCMV载体中，构建出真核表达质粒pmCMV-H3-HA。
2.1.5 表达H3 HA的同源重组质粒pBlue-US2-mCMV-H3-HA-eGFP的构建
设计一对引物将mCMV-H3-HA表达盒整体扩增下来。然后，通过酶切连接的方式插入到含有同源臂的质粒pBlue-US2-eGFP中，通过酶切、PCR、测序验证，鉴定正确的质粒命名为pBlue-US2-mCMV-H3-HA-eGFP。
2.2 含有eGFP基因的重组病毒rHVT-US2-mCMV-H3-HA-eGFP的获得
将pBlue-US2-mCMV-H3-HA-eGFP按照1:100比例接种LB培养基，12hpi，大提质粒。制备原代鸡胚成纤维细胞，然后按照200万/孔密度铺六孔板。次日，先用HVT FC126亲本病毒感染鸡胚成纤维细胞，接种比例为1MOI。2hpi，更换培养基，用invitrogen lipo3000脂质体转染试剂将大提质粒pBlue-US2-mCMV-H3-HA-eGFP转染HVT感染的鸡胚成纤维细胞。转染后12小时换液。5天后，将转染的细胞消化下来，按照不同细胞密度，接种到6孔板中，然后铺熔点琼脂。5天后，在荧光显微镜下观察，寻找有绿色荧光表达的细胞。将含有绿色荧光的细胞挑取出来，继续稀释接种鸡胚成纤维细胞，铺低熔点琼脂，筛绿色荧光蚀斑，经过连续10轮筛选，最终得到纯净的含有绿色荧光的重组病毒rHVT-US2-mCMV-H3-HA-eGFP。
2.3 剔除eGFP基因的重组病毒rHVT-US2-mCMV-H3-HA的获得
将筛选得到的重组病毒rHVT-US2-mCMV-H3-HA-eGFP进行扩大培养。制备原代鸡胚成纤维细胞，然后按照200万/孔密度铺六孔板。次日，先用重组病毒rHVT-US2-mCMV-H3-HA-eGFP感染鸡胚成纤维细胞，接种比例为1MOI。2hpi，更换培养基，用invitrogen lipo3000脂质体转染试剂将大提质粒pCDNA3.1-cre转染重组病毒rHVT-US2-mCMV-H3-HA-eGFP染的鸡胚成纤维细胞。转染后12小时换液。5天后，将转染的细胞消化下来，按照不同细胞密度，接种到6孔板中，然后铺熔点琼脂。5天后，在荧光显微镜下观察，寻找没有绿色荧光表达的蚀斑细胞。将不含有绿色荧光的细胞挑取出来，继续稀释接种鸡胚成纤维细胞，铺低熔点琼脂，筛绿没有色荧光蚀斑，经过连续5-7轮筛选，最终得到纯净的不含有绿色荧光的重组病毒rHVT-US2-mCMV-H3-HA。
2.4 重组病毒的鉴定
2.4.1 重组病毒的PCR鉴定结果
提取重组病毒DNA、亲本病毒DNA，然后用扩H3 HA基因特异性的引物进行PCR鉴定，试验结果表明，通过目的基因特异性引物进行鉴定，重组病毒扩增出约1700bp的HA基因（图8），但亲本病毒HVT FC-126中扩增不到相应的目的基因。以上结果说明，H3-HA基因正确的插入到HVT基因组的US2区。
2.4.2 重组病毒的细胞病变观察
将重组病毒rHVT-US2-mCMV-H3-HA、HVT FC-126亲本病毒接种原代鸡胚成纤维细胞，然后观察重组病毒与亲本病毒在原代鸡胚成纤维细胞上的生长状态有无差异。试验结果表明，重组病毒和亲本病毒接种细胞后，细胞病变的状态、产生细胞病变的时间大致都差不多，肉眼观察无明显差异（图9）。
2.4.3 重组病毒的间接免疫荧光鉴定结果
将未重组的火鸡疱疹病毒和纯化的重组病毒rHVT-US2-mCMV-H3-HA分别以0.5MOI感染CEF细胞，待感染后的CEF出现病变时，分别用H3亚型禽流感病毒阳性血清作为一抗，Alexa Fluor-488标记的羊抗鸡的荧光二抗做间接免疫荧光试验检测目的基因的表达。接种重组病毒rHVT-US2-mCMV-H3-HA的CEF细胞病变区域发出较亮的绿色荧光，接种未重组病毒的CEF细胞没有检测出绿色荧光，说明目的基因H3 HA在重组HVT病毒中很好的表达（图10）。
2.5 重组病毒rHVT-US2-mCMV-H3-HA对H3亚型禽流感病毒的免疫保护评价
将30只1日龄SPF鸡随机分成三组，分别为rHVT-US2-mCMV-H3-HA组、HVT FC-126组和空白对照组；其中rHVT-US2-mCMV-H3-HA组、HVT FC-126组在1日龄时通过颈部皮下接种4000PFU/羽份的重组病毒或亲本病毒，攻毒对照组仅接种疫苗稀释液。各组在免疫后21天，用H3亚型禽流感病毒H3-RP03株攻毒，攻毒方式为滴鼻感染，攻毒剂量为106EID50/0.2 ml，攻毒后第5日，采集每只鸡的咽拭子和泄殖腔拭子，进行病毒分离。临床观察结果表明，重组病毒载体疫苗rHVT-US2-mCMV-H3-HA、HVT FC-126和空白对照组在接种后，SPF鸡均无异常。接种H3亚型禽流感病毒后，5天内观察，所有组鸡均存活，但HVT FC-126组部分鸡出现明显行动迟缓、被毛眼观异常、采食量下降和眼睛肿胀等现象；未免疫组未出现上述变化，临床观察无异常；rHVT-US2-mCMV-H3-HA组仅有1只鸡出现被毛异常、眼睛肿胀等不正常现象。将采集的咽拭子和泄殖腔拭子，进行无菌处理后，接种9日龄SPF鸡胚，3天后，测定尿囊液HA效价，检测病毒分离情况。试验结果表明，rHVT-US2-mCMV-H3-HA疫苗免疫组仅有2只鸡咽拭子和1只鸡泄殖腔拭子病毒分离阳性，综合保护率为80%；HVT FC-126疫苗组仅全部鸡病毒分离阳性，综合保护率0%，而空白对照组均未分离到病毒（表2）。
表2 攻毒5天后，H3亚型流感病毒分离结果
疫苗免疫后，每组随机取5只鸡采血，分离血清，用H3亚型禽流感病毒H3-RP03株抗原检测免疫后血清HI效价水平。试验结果表明，免疫后1周即可检测到HI效价，第二周开始达到保护水平的抗体效价，第三周抗体效价能够达到2^6。攻毒后第5天，采血，抗体效价能够达到2^7（图11）。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.表达H3亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于，
所述H3亚型禽流感病毒为H3亚型禽流感病毒H3-RP03株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:V202357；
所述H3亚型禽流感病毒HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述H3亚型禽流感病毒HA基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述重组火鸡疱疹病毒是在火鸡疱疹病毒FC-126株基因组的US2基因内插入H3亚型禽流感病毒HA基因的表达框后得到的。
2.根据权利要求1所述的表达H3亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于，所述火鸡疱疹病毒基因组US2基因的插入位点为140211nt-140662nt。
3.根据权利要求1所述的表达H3亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒，其特征在于，所述H3亚型禽流感病毒HA基因的表达框包括mCMV启动子和SV40终止子。
4.一种如权利要求1所述表达H3亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒在制备禽流感病毒疫苗中的应用。
5.一种如权利要求1所述表达H3亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒在制备禽流感病毒药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311108002.8A CN116814565B (zh) | 2023-08-31 | 2023-08-31 | 表达h3亚型禽流感病毒ha基因的重组火鸡疱疹病毒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311108002.8A CN116814565B (zh) | 2023-08-31 | 2023-08-31 | 表达h3亚型禽流感病毒ha基因的重组火鸡疱疹病毒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116814565A CN116814565A (zh) | 2023-09-29 |
| CN116814565B true CN116814565B (zh) | 2023-12-01 |
Family
ID=88113136
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311108002.8A Active CN116814565B (zh) | 2023-08-31 | 2023-08-31 | 表达h3亚型禽流感病毒ha基因的重组火鸡疱疹病毒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116814565B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103740759A (zh) * | 2014-01-20 | 2014-04-23 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 表达h5n1亚型禽流感病毒ha基因的重组火鸡疱疹病毒 |
| CN106117322A (zh) * | 2010-10-30 | 2016-11-16 | 刘大才 | 重组流感病毒血凝素(ha)抗原蛋白和含其的疫苗 |
| CN111526886A (zh) * | 2017-10-27 | 2020-08-11 | 国家血清研究所 | 多基因流感疫苗 |
-
2023
- 2023-08-31 CN CN202311108002.8A patent/CN116814565B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106117322A (zh) * | 2010-10-30 | 2016-11-16 | 刘大才 | 重组流感病毒血凝素(ha)抗原蛋白和含其的疫苗 |
| CN103740759A (zh) * | 2014-01-20 | 2014-04-23 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 表达h5n1亚型禽流感病毒ha基因的重组火鸡疱疹病毒 |
| CN111526886A (zh) * | 2017-10-27 | 2020-08-11 | 国家血清研究所 | 多基因流感疫苗 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Expression of HA of HPAI H5N1 virus at US2 gene insertion site of turkey herpesvirus induced better protection than that at US10 gene insertion site;Gao H;PLoS One;第6卷(第7期);全文 * |
| Zhang,X.-a..hemagglutinin [Influenza A virus]，GenBank: UPM56598.1.NCBI Genbank database.2022,全文. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116814565A (zh) | 2023-09-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10655146B2 (en) | Turkey herpesvirus vectored recombinant containing avian influenza genes | |
| CN111575247B (zh) | 一种新城疫嵌合病毒标记疫苗株及其构建方法和应用 | |
| CN110218706B (zh) | 表达h7n9亚型高致病性禽流感病毒ha蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建与应用 | |
| CN110904058B (zh) | 重组鸭瘟病毒疫苗及其构建方法和应用 | |
| CN109136198B (zh) | 一种表达鸡传染性贫血病毒vp1、vp2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗 | |
| CN110607285A (zh) | 一种耐热的血清4型禽腺病毒基因工程疫苗候选株及其构建方法 | |
| CN112094824A (zh) | 表达禽腺病毒4型截短Fiber2蛋白的重组新城疫病毒耐热疫苗株及其制备方法与应用 | |
| CN117417904A (zh) | 表达C型aMPV F蛋白和G蛋白的新城疫病毒载体疫苗株及其应用 | |
| Han et al. | Pathogenicity and vaccine efficacy of a thymidine kinase gene deleted infectious laryngotracheitis virus expressing the green fluorescent protein gene | |
| CN107142280A (zh) | 一种表达h9亚型禽流感病毒ha基因的重组火鸡疱疹病毒株 | |
| CN114292823A (zh) | 携带基因VII型新城疫病毒F和HN基因的重组LaSota疫苗株及其构建方法和应用 | |
| CN106031793B (zh) | 一种活疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN107296956A (zh) | 一种基因重组活载体疫苗 | |
| CN105695422B (zh) | 表达J亚群禽白血病病毒Gag和Env基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株及其构建方法和应用 | |
| CN116814565B (zh) | 表达h3亚型禽流感病毒ha基因的重组火鸡疱疹病毒 | |
| CN108929864B (zh) | 用于预防鸡传染性法氏囊病的致弱病毒及用途 | |
| CN110499296A (zh) | 一种耐热的血清8b型禽腺病毒基因工程疫苗候选株及其构建方法 | |
| CN107058244B (zh) | 一种p蛋白突变构建的基因vii型新城疫病毒弱毒株 | |
| CN112891528B (zh) | 一种鸡传染性支气管炎疫苗株 | |
| CN111647610B (zh) | 一种互换ha和ns1缺失基因包装信号的h9n2亚型禽流感病毒及其构建方法和应用 | |
| CN114292824A (zh) | 表达鸡传染性法氏囊病病毒变异株vp2基因的重组嵌合型新城疫病毒的构建方法与应用 | |
| CN109439633B (zh) | 一种插入h7n9的ha蛋白的新城疫病毒重组疫苗株 | |
| CN103667351B (zh) | 以鸭病毒性肠炎病毒疫苗株为载体的重组病毒疫苗在鸡形目禽类中的应用 | |
| CN118086231B (zh) | 重组火鸡疱疹病毒rHVT-HA-VP2-gDgI及应用 | |
| CN112546215A (zh) | 血清4型禽腺病毒灭活疫苗及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |