CN112094824A - 表达禽腺病毒4型截短Fiber2蛋白的重组新城疫病毒耐热疫苗株及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种表达禽腺病毒4型截短Fiber2蛋白的重组新城疫病毒耐热疫苗株及其制备方法与应用，属疫苗基因工程领域。本发明采用RNA病毒的反向遗传操作技术，在转录质粒水平对NDV LaSota株进行基因改造，首先将其HN基因替换为耐热TS09‑C株的HN基因，再将禽腺病毒4型的截短Fiber2基因(961‑1440bp)插入至其P和M基因之间。将改造后的转录质粒转染宿主细胞，拯救并获得NDV rLS‑tFib2‑C株。该疫苗株具有显著的耐热特性，可极大降低对冷链系统的依赖，节省储运成本和提高疫苗热稳定性。该疫苗株表达的不是完整的Fiber2蛋白，只截取了其部分区域，针对性增强了疫苗的免疫保护效果。可用于制备禽安卡拉病、新城疫二联耐热活疫苗。

Description

表达禽腺病毒4型截短Fiber2蛋白的重组新城疫病毒耐热疫 苗株及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术及微生物学领域，具体涉及一种表达禽腺病毒4型截短Fiber2蛋白的重组新城疫病毒疫苗株rLS-tFib2-C。更具体地，本发明还涉及到利用反向遗传操作技术，以HN基因替换和截短Fiber2基因插入的方式，对新城疫病毒LaSota疫苗株进行改造，获得新的重组新城疫病毒疫苗株rLS-tFib2-C，以及该毒株在禽安卡拉病、新城疫二联耐热活疫苗制备方面的应用。
背景技术
禽腺病毒(Fowl Adenovirus，FAdV)是一种世界范围内流行的、家禽和野禽常发的传染病病原。FAdV属于腺病毒科禽腺病毒属的成员，该属病毒可以分为3个群，即Ⅰ群、Ⅱ群和Ⅲ群。Ⅱ群和Ⅲ群FAdV与疾病的关系相对清晰，而Ⅰ群FAdV的毒株种类最多，与疾病的关系最复杂，且Ⅰ群FAdV的血清型也多达12个。血清4型禽腺病毒(Fowl Adenovirus serotype4，FAdV-4)是Ⅰ群FAdV中具有代表性的毒株之一，该病毒主要引起禽安卡拉病，也称心包积水-肝炎综合征。该病首次发现于巴基斯坦的安卡拉地区，故称为禽安卡拉病，其致死率可达30％-70％。2015年以来，禽安卡拉病在我国河南、安徽和山东等多地流行与爆发，给我国养禽业造成了巨大的经济损失。目前市场上尚无针对禽安卡拉病的疫苗，给疫病的防控造成了很大的困难。开发安全高效的禽腺病毒疫苗是控制该病毒流行的重要手段。
FAdV是一种双链DNA病毒，它的分子直径大约在70-90nm，无囊膜结构，呈二十面体对称结构。病毒的衣壳蛋白主要由六邻体(Hexon)、五邻体(Penton)和纤突蛋白(Fiber)组成。Fiber和Penton在病毒感染周期中分别负责病毒吸附和侵入两个过程。Fiber蛋白具有两个独立的Fiber编码基因Fiber1和Fiber2。Penton和Fiber2具有抗原性，能诱导产生病毒中和抗体。
新城疫(Newcastle Disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)引起的鸡急性、高致死性和高传染性的疫病。ND的流行给养禽业造成了巨大的经济损失，被国际兽医局列为两种A禽传染病之一。NDV只有一个血清型，但不同毒株之间的毒力相差较大，按照毒力可以将新城疫病毒分为强毒株、中等毒力和弱毒株。
在我国新城疫属于国家强制免疫的动物疫病之一，新城疫疫苗分为2类：活疫苗和灭活苗。活疫苗有I系苗(Mukteswar株)、II系苗(HB1)、III系苗(F株)、IV系苗(LaSota株)、克隆30(Clone-30)、和V4株等。其中I系苗为中等毒力活疫苗，其他均为弱毒活疫苗。灭活苗多用IV或克隆30经灭活后制备成的油乳疫苗。LaSota株疫苗以其毒力低、免疫原性好和免疫保护率高，深受广大养殖户的青睐。但LaSota株病毒的热稳定性较差，由其制备成的活疫苗对冷链要求很高，不利于热带和偏远地区的推广应用。
随着反向遗传操作技术的不断进步，基于新城疫病毒载体的新型多联活疫苗成为了新型疫苗研发的热点。许多病原的免疫原性基因已经在新城疫病毒载体内成功表达，并取得了较好的免疫保护效果，如传染性法氏囊病毒的VP2蛋白、H5亚型禽流感病毒的HA蛋白等。此类疫苗具有可诱导全身性免疫、高鸡胚生长特性、生产成本低廉、免疫方式简便等优点。
但是，目前大多数研究报道都是单独研究安卡拉病疫苗或新城疫疫苗的，没有二联活疫苗的研究报道。故针对当前严重危害我国养禽业的禽安卡拉病和新城疫这两大重要疫病，急需研发一种安全、高效、稳定性强、免疫方式简便的新型二联活疫苗。
发明内容
本发明为解决上述技术问题提供一种表达禽腺病毒4型截短Fiber2蛋白的重组新城疫病毒耐热疫苗株及其制备方法与应用。该耐热疫苗株热稳定性强、免疫保护效果佳、免疫方式简便，可用于制备禽安卡拉病、新城疫二联耐热活疫苗。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一种表达禽腺病毒4型截短Fiber2蛋白的重组新城疫病毒耐热疫苗株rLS-tFib2-C，该耐热疫苗株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：V202042，保藏时间为2020年7月31日。
优选地，所述重组新城疫病毒耐热疫苗株rLS-tFib2-C是以新城疫病毒LaSota株作为母本株，将所述LaSota株的HN基因替换为新城疫病毒耐热TS09-C株的HN基因，然后在其P和M基因之间以单独编码框形式插入禽腺病毒4型截短Fiber2基因961-1440bp区域的片段。
优选地，所述新城疫病毒LaSota株的HN蛋白基因序列为SEQ NO:1。
优选地，所述的禽腺病毒4型截短Fiber2基因961-1440bp区域的序列为SEQ NO:2。
优选地，所述重组新城疫病毒耐热疫苗株在56度热处理120min具有血凝活性。
所述的重组新城疫病毒耐热疫苗株rLS-tFib2-C的制备方法，包括以下步骤：a.构建新城疫病毒LaSota株的转录质粒；b.将转录质粒中的HN基因替换成新城疫病毒耐热TS09-C株的HN基因；c.在转录质粒的P和M基因之间以单独编码框的形式插入禽腺病毒4型截短Fiber基因；d.将重组质粒与三个辅助质粒共同转染宿主细胞，获得重组新城疫病毒株rLS-tFib2-C。
优选地，步骤c中插入禽腺病毒4型截短Fiber2基因的961-1440bp区域的片段。
所述的重组新城疫病毒耐热疫苗株rLS-tFib2-C在制备禽安卡拉病、新城疫二联耐热活疫苗方面的应用。
本发明的有益效果是：
1)本发明以新城疫病毒LaSota株的转录质粒为基础，通过HN基因的替换和优化筛选插入的禽腺病毒免疫原性基因/截短区域，获得重组新城疫病毒株rLS-tFib2-C，既提高了疫苗株的热稳定性，也增强了免疫保护效果。
2)与禽腺病毒灭活疫苗、亚单位疫苗等相比，以本发明公开的毒株制备的禽安卡拉病、新城疫二联耐热活疫苗具有如下特点：
a.稳定性好，在储运过程中不过分依赖冷链设备、保质期长；
b.免疫方式简便，可通过点眼/滴鼻、气雾、饮水、拌料等方式免疫；
c.可同时防控禽安卡拉病和新城疫两个重要禽病。
3)本发明针对当前严重危害我国养禽业的禽安卡拉病和新城疫这两大重要疫病，得到了一种安全、高效、稳定性强、免疫方式简便的新型二联活疫苗。首先通过HN替换的方式显著增强了疫苗株的热稳定性，其次通过分别插入完整Fiber2基因、三个截短形式的Fiber2基因(分别为1-510bp、481-990bp和961-1440bp)和完整的Penton基因，共获得5株重组病毒。免疫保护试验结果表明，本发明插入截短Fiber2基因(961-1440bp)的重组新城疫病毒株rLS-tFib2-C的保护效果显著优于其它4株重组病毒，可用于制备禽安卡拉病、新城疫二联耐热活疫苗。
附图说明
图1为重组新城疫病毒耐热疫苗株的构建策略。
图2为重组新城疫病毒载体表达的禽腺病毒4型免疫原性基因示意图。
图3为重组新城疫病毒免疫试验鸡的禽腺病毒攻击生存曲线。
图4为重组新城疫病毒生长曲线。
具体实施方式
以下结合附图和实施例进一步对本发明进行说明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
表达禽腺病毒4型免疫原性基因的重组新城疫病毒耐热株的构建与拯救
利用反向遗传操作技术，以新城疫病毒LaSota株转录质粒为模板，首先将其HN基因替换为新城疫病毒耐热TS09-C株的HN基因，再分别将5个禽腺病毒4型免疫原性基因(完整Fiber2、三种截短的Fiber2和完整Penton)插入至LaSota株基因组的P和M基因之间。具体改造策略见图1，五个插入基因的序列位置见图2。将改造的转录质粒与三个辅助质粒共转染至BHK-21细胞，获得重组新城疫病毒5株，分别为rLS-Penton、rLS-Fib2、rLS-tFib2-A、rLS-tFib2-B和rLS-tFib2-C(本发明)。上述五种重组病毒的构建与拯救方案中，除用于扩增禽腺病毒免疫原性基因的引物有差异外，其余操作基本一致。
1.1新城疫病毒转录质粒的HN基因替换
以新城疫病毒LaSota株的cDNA克隆质粒为模版，PCR扩增除HN基因以外的片段，扩增引物为：上游引物5′-TTGAGTCAATTATAAAGGAGTTGGAAAGATG-3′，下游引物5′-GATTGAGGACTGTTGTCGGTGAAGC-3′；扩增完成后用核酸酶DpnI消化cDNA模板，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段1。
以新城疫病毒TS09-C耐热株基因组的cDNA为模板，PCR扩增HN基因，扩增引物为：上游引物5′-CAACAGTCCTCAATCATGGACCGCGCAGTTAGCCA-3′，下游引物5′-CTTTATAATTGACTCAATTATGGCCAACTGGCAGCGTAG-3′；琼脂糖凝胶电泳回收目的片段2。
利用In-fusion体外连接试剂盒连接目的片段1和目的片段2，连接产物转化大肠杆菌DH5a细胞，转化产物涂布LB培养基，挑选单菌落进液体培养基中培养，PCR扩增HN基因来鉴定阳性质粒，提取阳性质粒进行全质粒的测序分析，测序正确的质粒命名为pTS-HN。
1.2新城疫病毒转录质粒的禽腺病毒4型免疫原性基因插入
以重组新城疫病毒质粒pTS-HN为模板，以P和M的基因间隔区为起点，PCR扩增rTS-HN株的cDNA克隆质粒的全长，扩增引物为：上游引物5′-TTGGAGTGCCCCAATTGTGC-3′，下游引物5′-TCTTAAATGTAGCTAGATTAATTACGGTTACGC-3′；扩增完成后用核酸酶DpnI消化质粒模板，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段3。
以FAdV-4HB1510分离株的基因组DNA为模板，PCR扩增Fiber2基因上961-1440区域的片段(tFib2/C)，扩增引物为：上游引物5′-CTAGCTACATTTAAGATTAGAAAAAATACGGGTAGAAGCCACCATGGGGCTCCTTGTTACCTCCCTC-3′，下游引物5′-ATTGGGGCACTCCAATTCTACCCGTGTTTTTTCTAATTATTACGGGAGGGAGGCCGC-3′；琼脂糖凝胶电泳回收目的片段4。引物中加入了新城疫病毒的基因起始基序、基因终止基序、翻译Kozak基序、起始密码子和终止密码子。
利用In-fusion体外连接试剂盒连接目的片段3和目的片段4，连接产物转化大肠杆菌DH5a细胞，转化产物涂布LB培养基，挑选单菌落进液体培养基中培养，PCR扩增截短Fiber2基因片段来鉴定阳性质粒，提取阳性质粒进行全质粒的测序分析，测序正确的质粒命名为pLS-tFib2-C。
1.3重组新城疫病毒的拯救恢复
待BHK-21细胞生长至80-90％密度时，接种表达T7 RNA聚合酶重组牛痘病毒(0.01MOI)。1小时后，将转录质粒pLS-tFib2-C与3个辅助质粒(pVAX-NP、pVAX-P和pcDNA-L)共转染BHK-21细胞；转染后96-120h，收集培养上清，用0.22μm的滤器过滤培养上清。接种于9-10日龄SPF鸡胚，培养96-120h，收集鸡胚尿囊液。通过HA效价测定和RT-PCR测序分析，获得了重组新城疫病毒株rLS-tFib2-C。其余4株重组新城疫病毒株的构建方法和步骤基本与该毒株一致，最终获得了5株重组新城疫病毒株。
实施例2
表达禽腺病毒4型免疫原性基因的重组新城疫病毒耐热株的免疫原性试验
开展了上述5株重组新城疫病毒株对禽腺病毒的免疫保护试验。将70只一周龄的SPF雏鸡随机分为7组，10只/组。1-5组分别免疫重组新城疫病毒株rLS-Fib2、rLS-tFib2-A、rLS-tFib2-B、rLS-tFib2-C、rLS-Penton，第6组免疫LaSota株，第7组为空白对照组。免疫剂量为107EID50/只，免疫方式为滴鼻点眼。初次免疫后2周，用同样的方式和免疫剂量进行一次加强免疫。在加免后2周，对7组试验鸡进行禽腺病毒4型强毒攻击，剂量为10LD50/只。之后每天观察鸡的健康状态，记录死亡情况，并绘制试验鸡的存活曲线。如图3所示，rLS-Fib2、rLS-tFib2-A、rLS-tFib2-B、rLS-tFib2-C、rLS-Penton、LaSota和空白对照组的试验鸡存活率分别为80％、70％、60％、100％、50％、40％和40％。因此，在5株新构建的重组新城疫病毒中，仅有rLS-tFib2-C株能够为免疫鸡提供100％的禽腺病毒4型攻毒保护。rLS-tFib2-C株对新城疫病毒的攻毒保护率同样也为100％。因此，rLS-tFib2-C株可作为禽安卡拉病、新城疫二联耐热活疫苗的候选株。
实施例3
重组新城疫病毒株rLS-tFib2-C的热稳定性试验
将感染有重组新城疫病毒rLS-tFib2-C株的尿囊液在EP管中进行分装，100μL/管，56℃水浴进行热处理，设置LaSota株对照。分别于0、2、5、10、15、30、60、120、180min时取出病毒尿囊液，迅速置于冰上，检测病毒的血凝(HA)效价，统计效价变化情况。结果表明，rLS-tFib2-C株在热处理120min时，仍有血凝效价，而对照LaSota株在热处理5min时，已经下降为1log2，10min时降为0。进一步测定了病毒的感染力耐热性，在56度处理相应的时间后，梯度稀释接种至BHK-21细胞，测定其TCID50效价变化情况，绘制感染力耐热曲线，计算出感染力下降1log10(90％)所需的时间T90。结果表明，rLS-tFib2-C株和LaSota株的T90分别为12.4和1.5min。因此，与母本LaSota株相比，重组新城疫病毒rLS-tFib2-C株的热稳定性得到了显著的提升。
实施例4
重组新城疫病毒株rLS-tFib2-C的细胞增殖试验
为分析HN基因替换和Fiber2/C基因的插入是否对rLS-tFib2-C株的细胞增殖滴度造成影响，比较了rLS-tFib2-C与母本LaSota株在细胞上的增殖情况。将稀释后的两株病毒接种至已长成致密单层的BHK-21细胞，在接种后6、12、24、48、72和96小时，分别收取细胞上清液。将收取的上清液进行10倍梯度稀释，每个稀释度取100μL接种至含有单层BHK-21细胞的96孔板中，每个稀释度设置3个重复，根据细胞病变情况计算TCID50，绘制病毒的生长动力学曲线。结果如图4所示，rLS-tFib2-C株在感染细胞72h后基本达到平台期，效价为107.50TCID50/ml，与母本LaSota株生长曲线相似。因此，病毒基因改造未对rLS-tFib2-C株的细胞增殖滴度造成影响。
实施例5
重组新城疫病毒株rLS-tFib2-C的致病性试验
以病毒的鸡胚最小致死量的平均死亡时间(MDT/MLD)和脑内致病指数(ICPI)评价rLS-tFib2-C株的致病性。MDT/MLD检测方法：将rLS-tFib2-C株病毒尿囊液进行10倍梯度稀释，接种SPF鸡胚，100μL/枚，连续观察7天，记录鸡胚的死亡时间，计算出MDT/MLD值。ICPI检测方法：将10倍梯度稀释的rLS-tFib2-C株病毒尿囊液接种1日龄SPF雏鸡，10只/组，接种量50μL/只，每天观察一次，并给鸡打分，正常鸡为0，发病鸡为1，死亡鸡为2。共观察8天，计算出ICPI值。结果显示，不同稀释度的病毒接种鸡胚120h均不死亡，rLS-tFib2-C株的MDT/MLD值大于120h，ICPI值为0.00。同样，母本LaSota株的MDT也大于120h，ICPI值为0.00。因此，rLS-tFib2-C株保持了母本LaSota株的弱毒特性。
序列表
<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 表达禽腺病毒4型截短Fiber2蛋白的重组新城疫病毒耐热疫苗株及其制备方法与应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1851
<212> DNA
<213> 新城疫病毒(Newcastle disease virus)
<400> 1
atggaccgcg cagttagcca agttgcgcta gagaatgatg aaagagaggc aaagaataca 60
tggcgcttgg tattccggat cgcaatccta ctctcaacgg tggtgacctt agccatctct 120
gcagccgccc ttgcatatag catggaggcc agcacaccta gcgatcttgt aggcataccg 180
actgcgatct ctagagcaga ggaaaagatt acatctgcac tcggttccaa tcaagatgta 240
gtagatagga tatataagca ggtggccctc gaatctccac tggcattgct aaacaccgaa 300
tctacaatta tgaacgcaat aacgtctctc tcttatcaaa tcagtggggc cgcaagtagc 360
agcggatgtg gagcacccat tcatgatcca gattatattg gaggaatagg taaagaactt 420
attgtagatg atgctagcga cgtcacatca tactatccct ctgcgttcca agaacacctg 480
aactttatcc cggcgcctac tacaggatca ggttgcactc ggatgccctc atttgacatg 540
agcgctaccc actactgtta tactcacaat gtgatattat ctggctgcag agatcactcg 600
cactcacatc aatatttagc acttggtgtg cttcggacat ctgcaacagg gagggtattc 660
ttttccactc tgcgttccat caatctggat gacacccaaa atcggaagtc ttgcagtgtg 720
agtgcaaccc ccttgggttg tgatatgctg tgctctaaag tcacagagac tgaagaagag 780
gattataact cagctatccc cacgtcgatg gtacatggaa ggttagggtt cgacggccaa 840
taccacgaga aggacctaga tgtcacaaca ctattcgagg actgggtggc aaactaccca 900
ggagtaggag gcgggtcttt tattgacaac cgcgtatggt tcccagttta cggagggcta 960
aaacccaatt cgcccagtga caccgcacaa gaagggaaat atgtaatata caagcgatac 1020
aatgacacat gtccagatga gcaagattat cagattcaaa tggctaagtc ttcatataag 1080
cctgggcggt ttggagggaa acgcgtacag caggccgtct tatctatcaa agtgtcaaca 1140
tccttgggcg aggacccggt gctgactgta ccgcccaaca cagtaacact catgggggcc 1200
gaaggcagag ttctcacagt agggacatct catttccttt atcagcgagg gtcatcatac 1260
ttctcccctg ccctactata tcctatgata gtcagcaaca aaacagccac tcttcatagt 1320
ccttatacat tcaatgcctt cactcgacca ggtagtgtcc cttgccaggc ttcagcaaga 1380
tgccctaact catgtgttac cggagtctat actgatccat atcccttggt cttctatagg 1440
aaccacacct tgcgaggggt attcgggacg atgcttgatg ataaacaagc aagactcaac 1500
cctgtatctg cagtatttga cagcatatcc cgcagtcgca taacccgggt gagttcaagc 1560
agcaccaagg cagcatacac aacatcaaca tgttttaaag ttgtaaagac caataaaacc 1620
tattgtctca gcattgccga aatatccaat accctcttcg gggaattcag aatcgtccct 1680
ttactagttg agattctcaa ggatgatggg gttagagaag ccaggtctag ccggttgagt 1740
caactgcgag agggttggaa agatgacatt gtatcaccta tcttttgcga cgccaagaat 1800
caaactgaat accggcacga gctcgagtcc tacgctgcca gttggccata a 1851
<210> 2
<211> 480
<212> DNA
<213> 禽腺病毒4型(Fowl Adenovirus Serotype 4)
<400> 2
gggctccttg ttacctccct ctacttgaaa ttggacagcg ccaccatggg gaatcgccct 60
ggggacctca actccgccaa tgccaaatgg ttcacctttt gggtgtccgc ctatctccag 120
caatgcaacc cctccgggat tcaagcggga acggtcagcc cctccaccgc caccctcacg 180
gactttgaac ccatggccaa taggagcgtg accagcccat ggacgtactc ggccaatgga 240
tactatgaac catccatcgg ggaattccaa gtgttcagcc cggtggtaac aggtgcctgg 300
aacccgggaa acatagggat ccgcgtcctc cccgtgccgg tttcggcctc cggagagcga 360
tacacccttc tatgctatag tctgcagtgc acgaacgcga gcatttttaa tccaaacaac 420
agcggaacca tgatcgtggg acccgtgctc tacagctgtc cagcggcctc cctcccgtaa 480

Claims (8)

1.一种表达禽腺病毒4型截短Fiber2蛋白的重组新城疫病毒耐热疫苗株rLS-tFib2-C，该耐热疫苗株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：V202042。
2.如权利要求1所述的重组新城疫病毒耐热疫苗株rLS-tFib2-C，其特征在于，所述重组新城疫病毒耐热疫苗株rLS-tFib2-C是以新城疫病毒LaSota株作为母本株，将所述LaSota株的HN基因替换为新城疫病毒耐热TS09-C株的HN基因，然后在其P和M基因之间以单独编码框形式插入禽腺病毒4型截短Fiber2基因961-1440bp区域的片段。
3.如权利要求1所述的重组新城疫病毒耐热疫苗株rLS-tFib2-C，其特征在于，所述新城疫病毒LaSota株的HN蛋白基因序列为SEQ NO:1。
4.如权利要求1所述的重组新城疫病毒耐热疫苗株rLS-tFib2-C，其特征在于，所述的禽腺病毒4型截短Fiber2基因961-1440bp区域的序列为SEQ NO:2。
5.如权利要求1所述的重组新城疫病毒耐热疫苗株rLS-tFib2-C，其特征在于，所述重组新城疫病毒耐热疫苗株在56度热处理120min具有血凝活性。
6.如权利要求1至5任一项所述的重组新城疫病毒耐热疫苗株rLS-tFib2-C的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a.构建新城疫病毒LaSota株的转录质粒；b.将转录质粒中的HN基因替换成新城疫病毒耐热TS09-C株的HN基因；c.在转录质粒的P和M基因之间以单独编码框的形式插入禽腺病毒4型截短Fiber基因；d.将重组质粒与三个辅助质粒共同转染宿主细胞，获得重组新城疫病毒株rLS-tFib2-C。
7.如权利要求6所述的重组新城疫病毒耐热疫苗株rLS-tFib2-C的制备方法，其特征在于，步骤c中插入禽腺病毒4型截短Fiber2基因的961-1440bp区域的片段。
8.如权利要求1至5任一项所述的重组新城疫病毒耐热疫苗株rLS-tFib2-C在制备禽安卡拉病、新城疫二联耐热活疫苗方面的应用。
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