CN114990262B

CN114990262B - 一种用于血清4型禽腺病毒lamp检测的引物组及其应用

Info

Publication number: CN114990262B
Application number: CN202210700008.3A
Authority: CN
Inventors: 宋建领; 薛晓岩; 张振兴
Original assignee: Yunnan Animal Science and Veterinary Institute
Current assignee: Yunnan Animal Science and Veterinary Institute
Priority date: 2022-06-20
Filing date: 2022-06-20
Publication date: 2023-05-23
Anticipated expiration: 2042-06-20
Also published as: CN114990262A

Abstract

本发明涉及一种用于血清4型禽腺病毒LAMP检测的引物组及其应用，包括试剂盒及其检测方法，所述引物组包括以下4条引物：如SEQ ID NO:1‑4所示，本发明同时提供一种用于血清4型禽腺病毒LAMP检测的试剂盒和检测方法。采用本发明的引物组和检测方法，仅有FAdV‑4核酸检测呈阳性，其他禽类常见病核酸检测均呈阴性，表明本发明的引物组及检测方法对其他10种病原无交叉反应，仅针对FAdV‑4具有特异性。本发明采用的PicoGreen染料在反应前添加到PCR管的管盖上，反应结束后通过摇晃PCR管让PicoGreen染料与反应液混合，然后直接观察显色反应就可以获得检测结果，可以避免二次开管滴加染料形成气溶胶污染造成假阳性的风险，提高FAdV‑4型检测的准确性和可靠性，更有利于病毒检测和基层推广应用。

Description

一种用于血清4型禽腺病毒LAMP检测的引物组及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于血清4型禽腺病毒LAMP检测的引物组及其应用，包括试剂盒及其检测方法。

技术背景

禽腺病毒是腺病毒科腺病毒属的成员，根据限制性内切酶试验，禽腺病毒分为五个亚种(A-E)，根据血清交叉中和试验，它被分为12个血清型(1-8a，8b-11)。禽腺病毒是危害养禽类的病原之一，在养殖场中主要造成：禽肌胃糜烂、包涵体肝炎、心包积液综合症等。该病主要发生于20-30日龄的肉鸡，包括817、肉杂等，发病后4-8天为死亡高峰，病程8-15天，死亡率达20～30％。同时蛋鸡20-70日龄以及200-300 日龄也有发生，但死亡率低于肉鸡。目前，该病的发病区域不断扩大，给我国养鸡业造成了巨大的经济损失。现已证实，该病的病原为禽腺病毒4型(fowl adenovirus 4,FAdV-4)。因此，急待开发精确、灵敏、快速、无污染的临床病原微生物检验方法。

LAMP检测方法灵敏度高，比传统的PCR方法高2～5个数量级；反应时间短；临床使用不需要特殊的仪器；操作简单，不论模板是DNA还是RNA，均可肉眼观察结果，因此适宜用于快速检测血清4型禽腺病毒。目前国内已有数种针对FAdV-4 LAMP检测的技术，但现有技术存在选择靶基因保守性低、可视化方法操作较繁琐且误差大、操作结果易出现假阳性等问题，可靠性较低。

发明内容

本发明提供了一种用于血清4型禽腺病毒LAMP检测的引物组、试剂盒及其检测方法和应用，用于解决以上问题。

本发明提供了一种用于血清4型禽腺病毒LAMP检测的引物组，所述引物组包括以下4条引物：如SEQ ID NO:1-4所示：

FAdV-4-F3：5’-acgagtacatgaacaagcgc-3’；

FAdV-4-B3：5’-ggcacttggatgtggaagtt-3’；

FAdV-4-FIP：5’-tgtccatctggtcgatggacca-caccaacgtygtcgacatg-3’；

FAdV-4-BIP：5’-caaccccttcaaccaccacaga-acgtagcgrctgtttccca-3’。

进一步，所述引物组是以禽腺病毒特异性Hexon基因的高保守区域序列为目的基因设计获得，所述高保守区域序列如SEQ ID NO:5所示。

本发明同时提供一种用于血清4型禽腺病毒LAMP检测的试剂盒，所述试剂盒中包括所述引物组、dNTP混合物、MgSO4、10×Isothermal恒温反应的缓冲液、链置换DNA聚合酶、可视化染料、阳性对照和阴性对照。

优选地，所述可视化染料为PicoGreen染料。

本发明提供了一种血清4型禽腺病毒的LAMP检测方法，包括如下步骤：

步骤一：先建立LAMP反应体系(25μL)：在PCR管中加入以下组分：

步骤二：反应前将4μL PicoGreen荧光染料加入到PCR管内盖上；

步骤三：63℃孵育65min，反应结束后80℃反应4min终止LMAP反应；

步骤四：摇晃PCR管使管内盖上的PicoGreen荧光染料与管内反应液混合，即可直接观察，反应液为亮黄绿色的检测结果为阳性，反应液为橘色的检测结果为阴性。

本发明提供的引物组还可以用在其他检测样品中是否含有血清4型禽腺病毒的产品中。

本发明的有益效果如下：

1、本发明针对血清4型禽腺病毒(FAdV-4)hexon基因的保守区域(基座、P1和P2)和可变结构环区域(Loop 1-Loop 4)为目标区域，通过比对分析获取FAdV-4hexon高保守区域序列，如SEQ ID NO:5 所示，以这部分高保守区域序列为目的基因设计引物组，并经过筛选优化，获得本发明的具有高特异性的FAdV-4LAMP引物组。采用本发明的引物组和检测方法通过对FAdV-4、新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)、鸡传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)、禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)、禽传染性支气管炎病毒(avian infectious bronchitis virus,IBV)、禽传染性喉气管炎病毒(avian infectious laryngotracheitis virus,ILTV)、鸟鼻杆菌气管炎病菌(Ornithobacterium rhinotracheale,ORT)、鸡传染性贫血病毒(chicken infectiousanemia virus,CIAV)、禽白血病病毒(Avian Leukosis virus,ALV)的核酸进行特异性检测，结果表明仅有FAdV-4核酸检测呈阳性，其他核酸检测均呈阴性，如图6所示。表明本发明的引物组及检测方法对其他10种病原无交叉反应，仅针对FAdV-4具有特异性。

2、本发明的引物组可以在没有环引物的情况下，反应灵敏度和特异性依然很高，且反应时间快，降低了检测成本，提高了检测效率。

3、本技术方案中选择了可视化染料中的PicoGreen染料，Picogreen染料是一种新型的dsDNA染料，其检测灵敏度高，可检测到pg级DNA；检测范围宽，可跨越4个数量级；特异性好，基本不受ssDNA和RNA 的影响，并且可以耐受一定浓度的盐、尿素、乙醇、氯仿、去垢剂、蛋白等干扰；而且本发明中发现PicoGreen染料用量低且挂壁性比较好，在检测时只需4μL即可，由于添加量小且挂壁性好，所以可以在反应前添加到PCR管的管盖上，反应过程中并不会流入管内，到反应结束后通过摇晃PCR管让PicoGreen染料与反应液混合，然后直接观察显色反应就可以获得检测结果，可以避免二次开管滴加染料形成气溶胶污染造成假阳性的风险，提高FAdV-4型检测的准确性和可靠性，更有利于病毒检测和基层推广应用。

附图说明

图1为反应体系优化过程中MgSO4浓度筛选实验对比图；

图2为反应体系优化过程中dNTP浓度筛选试验对比图；

图3为反应体系优化过程中外内引物比例浓度筛选试验对比图；

图4为反应体系优化过程中温度优化筛选试验对比图；

图5为反应体系优化过程中时间优化筛选试验对比图；

图6为反应体系优化过程中特异性试验对比图；

图7为反应体系优化过程中敏感性试验对比图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1筛选引物组

通过对66个FAdV-Ⅰ群内不同血清型毒株的hexon全基因序列以及FAdV-4 国内外高致病性毒株和低致病性毒株的hexon全基因序列比对，获取hexon高保守区域序列。

表1进行hexon全基因序列比对的禽腺病毒毒株

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针对FAdV-4hexon基因的保守区域(基座、P1和P2)和可变结构环区域(Loop 1-Loop 4)为目标区域，通过比对分析获取FAdV-4hexon高保守区域序列。

目前国内外hexon蛋白中氨基酸位点变异主要集中在NCBI里公开的FAdV-4 hexon全基因序列的164、188、193、195、238、240、243、263、410等位置，本研究所选区域避开易突变区域，位于425-570，氨基酸序列比对也保守。

本发明最后确定获取的高保守区域序列如SEQ ID NO:5所示。

将该高保守区域序列导入在线LAMP引物序列设计网页，自主生成引物序列，将引物序列再比对，看是否有存在兼并引物并修改。

通过LAMP在线软件一共生成三套禽腺病毒4型LAMP引物组。

引物组1：

F3:ACGAGTACATGAACAAGCGC

B3:GGCACTTGGATGTGGAAGTT

FIP:TGTCCATCTGGTCGATGGACCA-CACCAACGTYGTCGACATG

BIP:CAACCCCTTCAACCACCACAGA-ACGTAGCGRCTGTTTCCCA

引物组2：

F3:ACGTYAACCCCTTCAACCA

B3:CCCAGACTGGATTGKAGGA

FIP:TGGGGCACTTGGATGTGGAAG-CACAGAAACTGGGGGCTG

BIP:TTCGCCATCAAAAACCTGCTGC-YCATGTTGGGGTCTTTGCG

引物组3：

F3:GTCGACATGTTCACGAACGT

B3:TCGTAGGTGTACGAGCCG

FIP:GCCCCCAGTTTCTGTGGTGG-GTTGGTCCATCGACCAGATG

BIP:CTCCCAGCTSCTGGGAAACA-GCAGGTTTTTGATGGCGAAG

对上述引物组内每条序列进行BLAST比对，看是否存在相同病毒种类之间引物的兼并性，并进行修改。比对结果表明引物组2兼并位点较多，检测灵敏度较低，引物3虽然兼并位点只有一个，但是BIP引物序列含有连续5个T碱基，且 3'端碱基为A，使得引发位点的引发效率较高，形成引发错误，最后确定选择引物组1进行后续试验。

实施例2筛选反应体系

先建立基础LAMP反应体系(25μL)：链置换DNA聚合酶(8U·μL^-1)1μL、 10×Isothermal恒温反应的缓冲液2.5μL、ddH₂O 8.5μL、dNTP混合物(10 mmol·L^-1)2.5μL、硫酸镁(MgSO₄，100mmol·L^-1)0.5μL、FAdV-4-F3(10 μmol·L^-1)2μL、FAdV-4-B3(10μmol·L^-1)2μL、FAdV-4-FIP(10μmol·L^-1) 2μL、FAdV-4-BIP(10μmol·L^-1)2μL和模板2μL，反应前将4μLPicoGreen 荧光染料加入到PCR管内盖上，设立基础反应条件为60℃孵育1h，反应结束后80℃反应4min终止LMAP反应。

以此反应体系和反应条件为基础，优化内外引物比例、各反应试剂配比浓度、反应温度和反应时间。对最优反应体系和反应条件进行特异性和灵敏度的检测。

(1)MgSO₄浓度

如图1所示，MgSO4浓度在50mmol/L～80mmol/L时均能扩增出阶梯状扩增条带，管内均呈显著的黄绿色，浓度在60mmol/L时，扩增效果最为明显；

(2)dNTP浓度

如图2所示，dNTP浓度为6mmol/L～12mmol/L时均可获得阶梯状扩增条带，管内均呈显著的黄绿色，dNTP浓度为10mmol/L时扩增效果最明显。

(3)外内引物比

如图3所示，外内引物比在1:1和1:8时均可扩增出阶梯状条带，管内均呈显著的黄绿色，在1:8时扩增效果最明显。

(4)反应温度

如图4所示，反应温度在60℃、63℃、65℃均扩增出阶梯状条带，管内均呈显著的黄绿色，在63℃时扩增效果最明显。

(5)反应时间

如图5所示，反应温度在60min、65min、70min均能扩增出阶梯状条带，在65min时扩增效果最明显。

最终确定FAdV-4LAMP最佳反应体系为：10×Isothermal恒温反应的缓冲液2.5μL、ddH₂O 6.5μL、dNTP混合物(10mmol·L^-1)2.5μL、链置换DNA 聚合酶(8U·μL^-1)1μL、MgSO₄(6mmol·L^-1)0.5μL、FAdV-4-F3(10μmol·L^-1) 0.5μL、FAdV-4-B3(10μmol·L^-1)0.5μL、FAdV-4-FIP(10μmol·L^-1)4 μL、FAdV-4-BIP(10μmol·L^-1)4μL和模板2μL；最佳反应条件为63℃孵育65min，在反应前将4μL PicoGreen荧光染料加入到PCR管内盖上，反应过程中不开盖，反应结束后80℃反应4min终止LMAP反应，摇晃PCR管，使管内盖上的PicoGreen荧光染料与管内反应液混合，即可直接观察，反应液为亮黄绿色的检测结果为阳性，反应液为橘色的检测结果为阴性。

实施例3特异性检测

采用本发明的引物组和检测方法通过对FAdV-4、新城疫病毒(newcastle diseasevirus,NDV)、鸡传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)、禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)、禽传染性支气管炎病毒 (avian infectiousbronchitis virus,IBV)、禽传染性喉气管炎病毒(avian infectious laryngotracheitisvirus,ILTV)、鸟鼻杆菌气管炎病菌 (Ornithobacterium rhinotracheale,ORT)、鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus,CIAV)、禽白血病病毒(Avian Leukosisvirus,ALV) 的核酸进行特异性检测，结果表明仅有FAdV-4核酸检测呈阳性，其他核酸检测均呈阴性，如图6所示。表明本发明的引物组及检测方法对其他10种病原无交叉反应，仅针对FAdV-4具有特异性。

在图6中，A：FAdV-4LAMP特异性试验电泳图；B:FAdV-4LAMP特异性试验可视化结果；M：DL 2000DNA Marker；N：阴性对照；1：禽腺病毒4型；2、新城疫病毒；3、鸡传染性法氏囊病毒；4、禽流感H5亚型；5、禽流感H7亚型；6、禽流感H9亚型；7、禽传染性支气管炎病毒；8、禽传染性喉气管炎病毒；9、鼻气管鸟杆菌；10、鸡传染性贫血病毒；11、禽白血病病毒。

实施例4灵敏度检测

使用核酸定量仪测定FAdV-4阳性核酸样品浓度，然后将其10倍倍比稀释 10个稀释度(10^-1～10^-10),每个梯度分别为一个模板，通过LAMP体系和PCR体系，结果观察两种方法能检出最低核酸浓度。

试验结果如图7所示，A为lamp产物经凝胶电泳后，浓度7.5×10⁰-7.5×10^-8内均显示有特征性阶梯状扩增条带，则表明有阳性扩增产物；B为PicoGreen显色结果，浓度7.5×10⁰-7.5×10^-8内均呈显著的黄绿色，则表明有阳性扩增产物； C为常规PCR对10倍倍比稀释的阳性模板进行扩增，扩增结果经凝胶电泳后，浓度7.5×10⁰-7.5×10^-6内有目的条带。

灵敏度试验结果显示采用本发明的LAMP法检出最低DNA浓度为7.5×10^-8ng·μL^-1；PCR方法检出最低DNA浓度为7.5×10^-6ng·μL^-1，两者相比本发明的LAMP法较PCR灵敏度高100倍，敏感性较高，有助于病毒滴度较低时FAdV-4 的检出。

实施例5实料检测

以采集的疑似FAdV-4的家禽病料的核酸为模板，分别通过本发明的LAMP 法和常规的PCR法进行核酸检测，将LAMP法阳性率和PCR阳性率比对，得出相符率。

表1 LAMP法与PCR法检测疑似FAdV-4的家禽病料阳性率和相符率

如表1所示，通过对80份疑似FAdV-4病料进行检测，采用本发明的LAMP 法阳性检出率为13.8％(11/80)，采用PCR检测阳性率为12.5％(10/80)，两者相符率为90.5％，结果表明本发明的LAMP法更灵敏且更准确。由于本发明的LAMP 法操作简单、结果可视，更适合于基层推广。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

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序列表

<110> 云南省畜牧兽医科学院

<120> 一种用于血清4型禽腺病毒LAMP检测的引物组及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 禽腺病毒(avian)

<400> 1

acgagtacat gaacaagcgc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 禽腺病毒(avian)

<400> 2

ggcacttgga tgtggaagtt 20

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 禽腺病毒(avian)

<400> 3

tgtccatctg gtcgatggac cacaccaacg tygtcgacat g 41

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 禽腺病毒(avian)

<400> 4

caaccccttc aaccaccaca gaacgtagcg rctgtttccc a 41

<210> 5

<211> 440

<212> DNA

<213> 禽腺病毒(avian)

<400> 5

aatcgatatc agcgctaccc agaggcgcaa ctttatcatg gccaacatcg ccgagtatct 60

gcccgaccgt tacaagttta gcatctccgg cttcgacgcc accagcgtcg cgcctaccac 120

ctacgagtac atgaacaagc gcgtccccct caccaacgtc gtcgacatgt tcacgaacgt 180

gggtgcgcgt tggtccatcg accagatgga caacgtcaac cccttcaacc accacagaaa 240

ctgggggctg aaataccgct cccagctgct gggaaacagt cgctacgtca acttccacat 300

ccaagtgccc caaaaattct tcgccatcaa aaacctgctg ctgctctccg gctcgtacac 360

ctacgagtgg gtgctgcgca aagaccccaa catgatcctc caatccagtc tgggcaacga 420

cctgcgcgcc gacggcgcca 440

Claims

1.一种用于血清4型禽腺病毒LAMP检测的引物组，其特征在于，所述引物组包括以下4条引物：如SEQ ID NO:1-4所示：

FAdV-4-F3：5’-ACGAGTACATGAACAAGCGC-3’；

FAdV-4-B3：5’-GGCACTTGGATGTGGAAGTT-3’；

FAdV-4-FIP：5’-TGTCCATCTGGTCGATGGACCA-CACCAACGTYGTCGACATG-3’；

FAdV-4-BIP：5’-CAACCCCTTCAACCACCACAGA-ACGTAGCGRCTGTTTCCCA-3’；所述引物组是以禽腺病毒特异性Hexon基因的高保守区域序列为目的基因设计获得，所述高保守区域序列如SEQ ID NO:5所示。

2.一种用于血清4型禽腺病毒LAMP检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求1所述引物组、dNTP混合物、MgSO4、10×Isothermal恒温反应的缓冲液、链置换DNA聚合酶、可视化染料、阳性对照和阴性对照；所述可视化染料为PicoGreen染料。

3.一种非诊断目的的血清4型禽腺病毒的LAMP检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：以权利要求1所述引物组先建立LAMP反应体系：在PCR管中加入以下组分：

10×Isothermal恒温反应的缓冲液 2.5 μL；

ddH₂O 6.5 μL；

10 mmol·L^-1 的dNTP混合物 2.5 μL；

8 U·μL^-1的链置换DNA聚合酶 1 μL；

6 mmol·L^-1的MgSO₄0.5 μL；

10 μmol·L^-1的FAdV-4-F3 0.5 μL；

10 μmol·L^-1的FAdV-4-B3 0.5 μL；

10 μmol·L^-1的FAdV-4-FIP 4 μL；

10 μmol·L^-1的FAdV-4-BIP 4 μL；

模板 2 μL；

步骤二：反应前将4 μL PicoGreen荧光染料加入到PCR管内盖上；

步骤三：63 ℃孵育65min，反应结束后80 ℃反应4 min终止LMAP反应；

4.权利要求1所述引物组在制备检测样品中是否含有血清4型禽腺病毒的产品中的应用。