CN113862395A - 用于鉴别FAdV-4和FAdV-8的三重PCR检测引物、试剂盒及检测方法 - Google Patents

用于鉴别FAdV-4和FAdV-8的三重PCR检测引物、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于鉴别FAdV‑4/FAdV‑10和FAdV‑8的三重PCR检测引物，检测引物序列如下：FAdVF：AACGGCTATCGGTTCTGGCC；FAdVR：GCGAAAGGCGTACGGAAGTA；FAdV4F：GACTGGGAACTGGCCGTAAA；FAdV4R:CGGATCCCTATGTTTCCCGG；FAdV8F：CGTTGAGCATTATCAGGGATCCG；FAdV8R：ACGGAAGACGCGTCGTAGAT。本发明建立方法可同时对FAdV‑4/FAdV‑10和FAdV‑8进行检测，简化操作程序、节约成本；通过电泳条带大小和数目判定结果；2h内即可完成扩增和检测，检测时间短。

Description

用于鉴别FAdV-4和FAdV-8的三重PCR检测引物、试剂盒及检测 方法
技术领域
本发明属于动物传染病学检测领域，具体地涉及用于鉴别FAdV-4/FAdV-10和FAdV-8的三重PCR检测引物、试剂盒及检测方法。
背景技术
I亚群禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)包括五个种，12种血清型。FAdV五个种包括：禽腺病毒A(FAdV-1)、禽腺病毒B(FAdV-5)、禽腺病毒C(FAdV-4、FAdV-10)、禽腺病毒D(FAdV-2、FAdV-3、FAdV-9、FAdV-11)、禽腺病毒E(FAdV-6、FAdV-7、FAdV-8a、FAdV-8b)。其中，FAdV-4、FAdV-8(FAdV-8a和FAdV-8b)被认为与家禽包涵体肝炎(IBH)、心包积液综合征(HPS)相关。2015年初，我国多个省份家禽出现以FAdV-4感染为主的肝病问题；2020年底，我国北方地区家禽爆发肝破裂，病原以FAdV-4、FAdV-8为主。FAdV-4主要引起鸡群HPS，FAdV-8则主要引起IBH。流行病学调查显示，FAdV-4和FAdV-8在鸡群中经常共同感染，这给FAdV分型鉴别诊断带来现实需求。
多重PCR方法是在一个反应体系中，同时加入两对以上引物进行的核酸扩增反应，可以实现对两种以上病原的同时检测。目前，国内对FAdV分型鉴定多采用通用引物测序方法，周期长、成本高，不适于FAdV快速鉴定。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，建立一种同时检测FAdV-4/FAdV-10和FAdV-8的三重PCR方法，可实现对FAdV快速鉴定和分型。
本发明采用的技术方案为：一种用于鉴别FAdV-4/FAdV-10和FAdV-8的三重PCR检测引物，所述检测引物序列如下：
FAdVF：AACGGCTATCGGTTCTGGCC；
FAdVR：GCGAAAGGCGTACGGAAGTA；
FAdV4F：GACTGGGAACTGGCCGTAAA；
FAdV4R:CGGATCCCTATGTTTCCCGG；
FAdV8F：CGTTGAGCATTATCAGGGATCCG；
FAdV8R：ACGGAAGACGCGTCGTAGAT；
其中FAdVF和FAdVR是I群FAdV通用引物，PCR扩增片段560bp；FAdV4F和FAdV4R是FAdV-4/FAdV-10特异性引物，PCR扩增片段884bp；FAdV8F和FAdV8R是FAdV-8特异性引物，PCR扩增片段388bp。
一种用于鉴别FAdV-4/FAdV-10和FAdV-8的三重PCR检测试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1所述的检测引物。
一种用于鉴别FAdV-4/FAdV-10和FAdV-8的三重PCR检测方法，包括以下步骤：首先，用权利要求1所述的检测引物对样品进行PCR扩增反应获得扩增产物；然后用1.5％的琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行鉴定，在凝胶成像系统下观察结果，确定腺病毒类型；所述三重PCR检测方法所构建的反应体系为：2×Taq PCR StarMix with Loading Dye 10μL、FAdVF 0.1μL、FAdVR 0.1μL、FAdV4F 1μL、FAdV4R 1μL、FAdV8F 1μL、FAdV8R 1μL、待检测样品核酸DNA2μL、无RNase/DNase灭菌去离子水3.8μL。
进一步地，所述PCR扩增反应的条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min；反应结束后，检测PCR产物：进行琼脂糖凝胶电泳，利用紫外成像系统检测电泳条带。
进一步地，所述确定病毒类型的质控标准为：阴性对照未出现条带，FAdV阳性标准品对照出现560bp条带，FAdV-4阳性标准品出现884bp条带，FAdV-8阳性标准品出现388bp条带；所述确定病毒类型的判定方法为：若出现560bp一条条带，判为FAdV阳性；若出现560bp和884bp两条条带，判为FAdV-4/FAdV-10阳性；若出现560bp和388bp两条条带，判为FAdV-8阳性；若出现560bp、884bp和388bp三条条带，判为FAdV-4/FAdV-10和FAdV-8共同感染。
本发明获得的有益效果为：1、同时检测：本发明建立方法可同时对FAdV-4/FAdV-10和FAdV-8进行检测，简化操作程序、节约成本，反应结束后，通过电泳条带大小和数目判定结果；2、特异性强：本发明建立方法通过hexon、fiber2两个基因共同鉴定FAdV-4/FAdV-10，通过hexon、fiber两个基因共同鉴定FAdV-8，降低单个基因非特异性扩增导致的假阳性，显著提升反应特异性；3、检测快速：本发明建立方法采用多重PCR法进行，2h内即可完成扩增和检测，检测时间短。
附图说明
图1为本发明I群FAdV通用引物设计；
图2为本发明FAdV-4/FAdV-10特异性引物设计；
图3为本发明FAdV-8特异性引物设计；
图4为本发明对不同稀释度阳性标准品的三重PCR检测图；
图5为本发明对不同病原样品的三重PCR检测图；
图6为本发明对临床样本的三重PCR检测图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1：FAdV-4/FAdV-10和FAdV-8三重PCR检测方法及使用
1相关试验病原
试验用病原血清4型禽腺病毒(FAdV-4，HYSY株)、血清8型禽腺病毒(FAdV-8，HYEY株)均由华裕农业科技有限公司鉴定和保存。
2三重PCR的引物设计与分析
2.1基因分析与比较
在GenBank数据库中检索12种血清型I群禽腺病毒基因序列，经MEGA7软件分析比对发现，hexon基因存在于所有血清型禽腺病毒中，其713-2814bp(HB1510株)区域在I群禽腺病毒毒株间高度保守，可作为通用引物设计靶区；fiber2基因仅出现于FAdV-1、FAdV-4、FAdV-10中，其序列在相同基因型毒株间保守，可作为FAdV-4/FAdV-10鉴别引物设计靶区；fiber基因出现于所有血清型禽腺病毒中，其序列在相同基因型毒株间保守，可作为FAdV-8鉴别引物设计靶区。
2.2引物设计
引物设计参考病毒基因序列为：FAdV-1(CELO株)、FAdV-2(SR48株)、FAdV-3(SR49株)、FAdV-4(HB1510株、JSJ13株、KR5株、ON1株、CG-D株、KC株、Kr-Yeoju株、MX-SHP95株、PB-05株、SDXT3-15株)、FAdV-5(340株)、FAdV-6(CR119株)、FAdV-7(YR36株)、FAdV-8a(TR59株)、FAdV-8b(764株、HG株、UPM04217株)、FAdV-9(A-2A株)、FAdV-10(C-2B株)、FAdV-11(380株)。
2.2.1 I群FAdV通用引物设计
经核苷酸同源性分析，设计针对I群FAdV的通用PCR引物(图1，注：*，一致核苷酸)，引物序列(参考KR5株)为：
FAdVF：AACGGCTATCGGTTCTGGCC(2236-2255bp)
FAdVR：GCGAAAGGCGTACGGAAGTA(2776-2795bp)
预期目的片段大小为560bp。
2.2.2 FAdV-4/FAdV-10特异性引物设计
经核苷酸同源性分析，设计针对FAdV-4/FAdV-10的特异性PCR引物(图2，注：*，一致核苷酸)，引物序列(参考HB1510株)为：
FAdV4F：GACTGGGAACTGGCCGTAAA(400-419bp)
FAdV4R:CGGATCCCTATGTTTCCCGG(1264-1283bp)
预期片段大小为884bp。
2.2.3 FAdV-8特异性引物设计
经核苷酸同源性分析，设计针对FAdV-8的特异性PCR引物(图3，注：*，一致核苷酸)，引物序列(参考HG株)为：
FAdV8F：CGTTGAGCATTATCAGGGATCCG(905-927bp)
FAdV8R：ACGGAAGACGCGTCGTAGAT(1273-1292bp)
预期片段大小为388bp。
3三重PCR检测方法的建立
3.1 FAdV阳性标准品的构建
引物序列为：FAdVF：AACGGCTATCGGTTCTGGCC和FAdVR：GCGAAAGGCGTACGGAAGTA，PCR产物大小为560bp。
用诺唯赞公司病毒核酸提取试剂盒DNA/RNAExtraction Kit提取FAdV-4(HYSY株)核酸DNA，按照康润公司2×Taq预混PCR反应体系说明书进行PCR反应，反应体系参考试剂盒说明书配制，反应体系为50μL，其中2×Taq反应液25μL、上下游引物(FAdVF 10μM和FAdVR10μM)各1μL、提取的核酸DNA 1μL，补充灭菌双蒸水至终体积50μL。反应条件为：95℃预变性5min；95℃30s，55℃30s，72℃60s，30个循环；循环结束后72℃延伸10min。
用1.0％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。按照宝生物公司pMD19-T连接试剂盒说明书将目的基因片段PCR产物克隆到pMD19-T载体上，随机挑取5个单菌落于氨苄青霉素(含量为100μg/mL)抗性的LB液体培养基培养14h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物(FAdVF和FAdVR)和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送上海桑尼生物科技有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，符合试验预期的阳性重组质粒作为FAdV阳性标准品，于-20℃保存备用。
3.2 FAdV-4阳性标准品的构建
引物序列为：FAdV4F：GACTGGGAACTGGCCGTAAA和FAdV4R:CGGATCCCTATGTTTCCCGG，PCR产物大小为884bp。
用诺唯赞公司病毒核酸提取试剂盒DNA/RNAExtraction Kit提取FAdV-4(HYSY株)核酸DNA，按照康润公司2×Taq预混PCR反应体系说明书进行PCR反应，反应体系参考试剂盒说明书配制，反应体系为50μL，其中2×Taq反应液25μL、上下游引物(FAdV4F 10μM和FAdV4R10μM)各1μL、提取的核酸DNA 1μL，补充灭菌双蒸水至终体积50μL。反应条件为：95℃预变性5min；95℃30s，55℃30s，72℃60s，30个循环；循环结束后72℃延伸10min。
用1.0％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。按照宝生物公司pMD19-T连接试剂盒说明书将目的基因片段PCR产物克隆到pMD19-T载体上，随机挑取5个单菌落于氨苄青霉素(含量为100μg/mL)抗性的LB液体培养基培养14h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物(FAdV4F和FAdV4R)和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送上海桑尼生物科技有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，符合试验预期的阳性重组质粒作为FAdV-4阳性标准品，于-20℃保存备用。
3.3 FAdV-8阳性标准品的构建
引物序列为：FAdV8F：CGTTGAGCATTATCAGGGATCCG和FAdV8R：ACGGAAGACGCGTCGTAGAT，PCR产物大小为388bp。
用诺唯赞公司病毒核酸提取试剂盒DNA/RNA Extraction Kit提取FAdV-8(HYEY株)核酸DNA，按照康润公司2×Taq预混PCR反应体系说明书进行PCR反应，反应体系参考试剂盒说明书配制，反应体系为50μL，其中2×Taq反应液25μL、上下游引物(FAdV8F 10μM和FAdV8R 10μM)各1μL、提取的核酸DNA 1μL，补充灭菌双蒸水至终体积50μL。反应条件为：95℃预变性5min；95℃30s，55℃30s，72℃60s，30个循环；循环结束后72℃延伸10min。
用1.0％的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。按照宝生物公司pMD19-T连接试剂盒说明书将目的基因片段PCR产物克隆到pMD19-T载体上，随机挑取5个单菌落于氨苄青霉素(含量为100μg/mL)抗性的LB液体培养基培养14h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物(FAdV8F和FAdV8R)和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送上海桑尼生物科技有限公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行BLAST分析验证，符合试验预期的阳性重组质粒作为FAdV-8阳性标准品，于-20℃保存备用。
3.4三重PCR方法的建立
3.4.1一种用于鉴别FAdV-4/FAdV-10和FAdV-8的三重PCR检测引物，所述检测引物序列如下：FAdVF：AACGGCTATCGGTTCTGGCC；
FAdVR：GCGAAAGGCGTACGGAAGTA；
FAdV4F：GACTGGGAACTGGCCGTAAA；
FAdV4R:CGGATCCCTATGTTTCCCGG；
FAdV8F：CGTTGAGCATTATCAGGGATCCG；
FAdV8R：ACGGAAGACGCGTCGTAGAT；
其中FAdVF和FAdVR是I群FAdV通用引物，PCR扩增片段560bp；FAdV4F和FAdV4R是FAdV-4/FAdV-10特异性引物，PCR扩增片段884bp；FAdV8F和FAdV8R是FAdV-8特异性引物，PCR扩增片段388bp。
3.4.2一种用于鉴别FAdV-4/FAdV-10和FAdV-8的三重PCR检测方法，包括以下步骤：首先，用上述检测引物对样品进行PCR扩增反应获得扩增产物；然后用1.5％的琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行鉴定，在凝胶成像系统下观察结果，确定病毒类型；琼脂糖凝胶电泳方法如下：配制1.5％琼脂糖凝胶，室温静置30min后上样，上样量为5μL/孔，琼脂糖电泳参数为120V、30min。
3.4.3三重PCR检测方法所构建的反应体系为：2×Taq PCR StarMix withLoading Dye 10μL、FAdVF 0.1μL、FAdVR 0.1μL、FAdV4F 1μL、FAdV4R 1μL、FAdV8F 1μL、FAdV8R 1μL、待检测样品核酸DNA 2μL、无RNase/DNase灭菌去离子水3.8μL。
3.4.4 PCR扩增反应的条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min；反应结束后，检测PCR产物：进行琼脂糖凝胶电泳，利用紫外成像系统检测电泳条带。确定病毒类型的质控标准为：阴性对照未出现条带，FAdV阳性标准品对照出现560bp条带，FAdV-4阳性标准品出现884bp条带，FAdV-8阳性标准品出现388bp条带；所述确定病毒类型的判定方法为：若出现560bp一条条带，判为FAdV阳性；若出现560bp和884bp两条条带，判为FAdV-4阳性；若出现560bp和388bp两条条带，判为FAdV-8阳性；若出现560bp、884bp和388bp三条条带，判为FAdV-4/FAdV-10和FAdV-8共同感染。
实施例2：灵敏度试验
1阳性标准品
阳性标准品为实施例1制备。
2试验步骤
纯化FAdV、FAdV-4、FAdV-8阳性质粒，通过NanoDrop超微量蛋白核酸分析仪测定浓度，根据阿伏伽德罗常数计算拷贝数，并将重组质粒分别稀释至1×109copies/μL、1×108copies/μL、1×107copies/μL、1×106copies/μL、1×105copies/μL、1×104copies/μL、1×103copies/μL、1×102copies/μL，对经梯度稀释的阳性标准品按照实施例1所述的三重PCR检测方法进行检测，验证所建立方法的灵敏度。
3结论
由图4(其中1-8，反应体系阳性标准品拷贝数：1×109copies、1×108copies、1×107copies、1×106copies、1×105copies、1×104copies、1×103copies、1×102copies)可见，本发明检测方法随模板核酸浓度的降低呈现条带亮度梯度下降，8个浓度质粒中(1×109copies/μL-1×102copies/μL)，FAdV阳性标准品和FAdV-4阳性标准品有4个浓度出现条带，FAdV-8阳性标准品有3个浓度出现条带。本发明建立的多重PCR方法对FAdV和FAdV-4的检测灵敏度为1×106copies，对FAdV-8的检测灵敏度为1×107copies。
实施例3：特异性试验
1试验步骤
提取禽流感病毒(AIV)、马立克病毒(MDV)、网状内皮组织增生症病毒(REV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、戊型肝炎病毒(HEV)、传染性贫血病毒(CAV)、禽白血病病毒(ALV)、空肠弯曲杆菌(C.jejuni)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、肠炎沙门菌(SE)核酸为模板，同时设阴性对照和FAdV、FAdV-4和FAdV-8阳性标准品对照，按照实施例1所述三重PCR方法进行检测，验证所建立方法的特异性。
2试验结果
由图5(其中1，AIV；2，MDV；3，REV；4，IBDV；5，HEV；6，CAV；7，ALV；8，C.jejuni；9，ILTV；10，IBV；11，SE；12，FAdV阳性标准品；14，FAdV-4阳性标准品；15，FAdV-8阳性标准品；15-16，无菌水)可见，本发明建立的多重PCR方法未从鸡群常见细菌和病毒病原核酸扩增出条带，特异性良好。
实施例4：肝肿大、肝破裂等肝病问题肝脏样品检测
1试验步骤
选取2020-2021年从河北地区收集并冻存于-20℃的19份蛋种鸡肝肿大、肝破裂等肝病问题肝脏样本，按照实施例1所述的三重PCR方法进行FAdV、FAdV-4/FAdV-10和FAdV-8检测，同时设阴性对照和阳性对照。
2试验结果
如图6(其中1-19，蛋种鸡肝脏样品；20，FAdV阳性标准品；21，FAdV-4阳性标准品；22，FAdV-8阳性标准品；23，无菌水)所示，19份肝脏样本中，3份FAdV-4/FAdV-10阳性，5份FAdV-8阳性，3份FAdV-4/FAdV-10和FAdV-8共阳性，说明本发明建立的多重PCR方法适用于临床FAdV-4/FAdV-10和FAdV-8快速分鉴定和分型。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种用于鉴别FAdV-4/FAdV-10和FAdV-8的三重PCR检测引物，其特征在于：所述检测引物序列如下：
FAdVF：AACGGCTATCGGTTCTGGCC；
FAdVR：GCGAAAGGCGTACGGAAGTA；
FAdV4F：GACTGGGAACTGGCCGTAAA；
FAdV4R:CGGATCCCTATGTTTCCCGG；
FAdV8F：CGTTGAGCATTATCAGGGATCCG；
FAdV8R：ACGGAAGACGCGTCGTAGAT；
其中FAdVF和FAdVR是I群FAdV通用引物，PCR扩增片段560bp；FAdV4F和FAdV4R是FAdV-4/FADV-10特异性引物，PCR扩增片段884bp；FAdV8F和FAdV8R是FAdV-8特异性引物，PCR扩增片段388bp。
2.一种用于鉴别FAdV-4/FAdV-10和FAdV-8的三重PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含权利要求1所述的检测引物。
3.一种用于鉴别FAdV-4/FAdV-10和FAdV-8的三重PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：首先，用权利要求1所述的检测引物对样品进行PCR扩增反应获得扩增产物；然后用1.5％的琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行鉴定，在凝胶成像系统下观察结果，确定FADV类型；所述三重PCR检测方法所构建的反应体系为：2×Taq PCR StarMix with LoadingDye 10μL、FAdVF 0.1μL、FAdVR 0.1μL、FAdV4F 1μL、FAdV4R 1μL、FAdV8F 1μL、FAdV8R 1μL、待检测样品核酸DNA 2μL、无RNase/DNase灭菌去离子水3.8μL。
4.根据权利要求3所述一种用于鉴别FAdV-4/FAdV-10和FAdV-8的三重PCR检测方法，其特征在于：所述PCR扩增反应的条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min；反应结束后，检测PCR产物：进行琼脂糖凝胶电泳，利用紫外成像系统检测电泳条带。
5.根据权利要求3所述一种用于鉴别FAdV-4/FAdV-10和FAdV-8的三重PCR检测方法，其特征在于：所述确定病毒类型的质控标准为：阴性对照未出现条带，FAdV阳性标准品对照出现560bp条带，FAdV-4阳性标准品出现884bp条带，FAdV-8阳性标准品出现388bp条带；所述确定病毒类型的判定方法为：若出现560bp一条条带，判为FAdV阳性；若出现560bp和884bp两条条带，判为FAdV-4/FAdV-10阳性；若出现560bp和388bp两条条带，判为FAdV-8阳性；若出现560bp、884bp和388bp三条条带，判为FAdV-4/FAdV-10和FAdV-8共同感染。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN114196786A (zh) * 2021-11-11 2022-03-18 佛山科学技术学院 禽腺病毒4型、8型双重荧光定量pcr快速检测试剂盒及方法
CN114990262A (zh) * 2022-06-20 2022-09-02 云南省畜牧兽医科学院 一种用于血清4型禽腺病毒lamp检测的引物组及其应用

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114196786A (zh) * 2021-11-11 2022-03-18 佛山科学技术学院 禽腺病毒4型、8型双重荧光定量pcr快速检测试剂盒及方法
CN114990262A (zh) * 2022-06-20 2022-09-02 云南省畜牧兽医科学院 一种用于血清4型禽腺病毒lamp检测的引物组及其应用
CN114990262B (zh) * 2022-06-20 2023-05-23 云南省畜牧兽医科学院 一种用于血清4型禽腺病毒lamp检测的引物组及其应用

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