CN115896348A - 一种用于犬瘟热病毒与犬冠状病毒双重TaqMan荧光定量PCR的引物和探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于犬瘟热病毒与犬冠状病毒双重TaqMan荧光定量PCR的引物和探针及其应用，属于分子生物学领域。本发明公开了一种犬瘟热病毒与犬冠状病毒双重检测引物和荧光探针，所述双重检测引物包括犬瘟热病毒的检测引物和犬冠状病毒的检测引物；所述荧光探针包括犬瘟热病毒荧光探针和犬冠状病毒荧光探针。本发明针对CDV、CCoV高度保守且特异性的基因，设计特异性引物和荧光探针，建立了一种新的双重TaqMan荧光定量RT‑PCR并应用于临床检测，为相应病原的检测和流行病学调查提供特异、高效、敏感的技术手段。

Description

一种用于犬瘟热病毒与犬冠状病毒双重TaqMan荧光定量PCR的引物和探针及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种用于犬瘟热病毒与犬冠状病毒双重TaqMan荧光定量PCR的引物和探针及其应用。

背景技术

犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)是一种严重导致狗和许多其他食肉动物患病的病原。尽管减毒疫苗在过去几年中大大降低了死亡率，并部分控制了该疾病，但在狗和野生动物宿主中仍报告了几次CDV的暴发。CDV是一种具有单链负义RNA基因组的包膜病毒，编码6个结构蛋白和2个非结构蛋白；其中，核蛋白(N蛋白)序列保守性高，对CDV转录、复制、组装和持续感染有重要的作用，能够诱导机体产生大量抗体，这使其成为研究CDV遗传/抗原多样性的合适靶点。

犬冠状病毒(Canine coronavirus，CCoV)是一种常见的狗的肠道病原体，幼犬感染后死亡率高，特别是当同时感染CDV或其他肠道病原体时。CCoV S蛋白是囊膜纤突结构的主要成分，可以诱导机体产生保护性中和抗体，具有宿主细胞蛋白酶受体的识别位点并决定宿主细胞的侵袭性，决定犬冠状病毒毒性强弱。CDV和CCoV的临床症状相似，这使得临床诊断更加模糊，因此，开发CDV和CCoV的鉴别诊断技术显得尤为重要。

目前对CDV和CCoV的诊断主要依赖于病毒的分离和分离血清学检测，但这些方法要么费时、费力、存在假阳性等问题，不适用于CDV或CCoV的快速和敏感诊断，要么依赖于昂贵的进口试剂，价格昂贵。虽然实时荧光定量PCR目前可用于CDV或CCoV的诊断，但是，同时检测CDV和CCoV的报道很少。而多重荧光定量PCR能在同一体系中同时鉴别检测多个病原，极大地提高了检测效率，节约了检测成本，是目前病原快速检测的首选手段。目前针对两种病原国内外学者建立了双重RT-PCR、荧光定量RT-PCR、ELISA等检测方法，但尚无同时区别检测CDV、CCoV的双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于犬瘟热病毒与犬冠状病毒双重TaqMan荧光定量PCR的引物和探针及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明针对CDV、CCoV高度保守且特异性的基因，设计特异性引物和荧光探针，建立了一种新的双重TaqMan荧光定量RT-PCR并应用于临床检测，为相应病原的检测和流行病学调查提供特异、高效、敏感的技术手段。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种用于犬瘟热病毒与犬冠状病毒双重检测的引物和荧光探针，所述引物包括犬瘟热病毒的检测引物和犬冠状病毒的检测引物；所述犬瘟热病毒的检测引物包括如SEQ ID NO：4-5所示的上游检测引物和下游检测引物；所述犬冠状病毒的检测引物包括如SEQ ID NO：1-2所示上游检测引物和下游检测引物；

所述荧光探针包括犬瘟热病毒荧光探针和犬冠状病毒荧光探针；所述犬冠状病毒荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述犬瘟热病毒荧光探针的核苷酸序列如SEQID NO：6所示。

优选的是，所述犬冠状病毒荧光探针的5'端的报告荧光基团为HEX，3'端的猝灭荧光基团为BHQ1。

优选的是，所述犬瘟热病毒荧光探针的5'端的报告荧光基团为ROX，3'端的猝灭荧光基团为BHQ1。

本发明还提供一种犬瘟热病毒与犬冠状病毒双重检测的试剂盒，包括上述引物和荧光探针。

本发明还提供一种非疾病诊断目的的犬瘟热病毒与犬冠状病毒的双重检测方法，以待测样品的DNA为模板，利用所述的引物和荧光探针进行实时荧光定量反应，基于模板DNA的Ct值判断是否含有犬瘟热病毒或犬冠状病毒。

优选的是，利用所述犬瘟热病毒与犬冠状病毒双重检测引物和荧光探针进行实时荧光定量反应的反应体系包括：2×5G qPCR Buffer BB 12.5μL，RT-qPCR Enzyme Mix UD1.3μL，犬瘟热病毒和犬冠状病毒的上游引物各0.4μL，下游引物各0.4μL，探针各1μL，质粒模板各1μL，蒸馏水模板补至25μL；

所述犬瘟热病毒和犬冠状病毒的上游引物和下游引物浓度为10pmol/μL；所述探针浓度为10pmol/μL；

反应程序为：37℃3min；95℃2min；95℃1min；95℃10s，52℃30s，40个循环。

本发明还提供上述犬瘟热病毒与犬冠状病毒双重检测引物和荧光探针在制备犬瘟热病毒与犬冠状病毒双重TaqMan荧光定量检测产品中的应用。

优选的是，所述产品包括药物、试剂或者试剂盒。

本发明公开了以下技术效果：

本发明针对CDV、CCoV高度保守且特异性的基因，设计特异性引物和荧光探针，建立了一种新的双重TaqMan荧光定量RT-PCR并应用于临床检测，本发明的反应体系采用热敏UNG酶和微量热敏双链DNA核酸酶双酶系统可有效去除气溶胶，减少假阳性；所选用的试剂具有高敏感性，检测更高效，配合高速荧光PCR仪检测时间可以缩短到40min以内，相比于传统RT-PCR速度提高了一倍以上。为CDV和CCoV的检测和流行病学调查提供特异、高效、敏感的技术手段。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为CCoV和CDV双重荧光定量RT-PCR标准曲线；

图2为双重荧光定量RT-PCR灵敏度试验，蓝色线条代表CCoV，红色代表CDV；CDV：1-8为浓度6.3×10⁸～6.3×10¹copies/μL的阳性质粒；CCoV：1-8为浓度6.17×10⁸～6.17×10¹copies/μL的阳性质粒；9为阴性对照；

图3为CCV和CDV双重荧光定量RT-PCR特异性试验，1为CDV阳性质粒样本，2为CCoV阳性质粒样本，3为CDV核酸样本，4为CCoV核酸样本，5-7为CPIV、CPV、CAV-2核酸样本；8为阴性对照。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

1材料与方法

1.1病毒及临床样本

犬瘟热疫苗(Canine distemper virus，CDV)购自吉林特研生物有限公司，犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)、犬冠状病毒(Canine coronavirus，CCoV)、犬传染性喉气管炎病毒2型(Canine infectious laryngeal tracheitis virus type 2，CAV-2)、犬副流感病毒(Canine parainfluenzavirus，CPIV)均由青岛农业大学预防兽医学实验室保存。犬、水貂、狐狸等48份临床样本采自山东省各养殖场，于-80℃冰箱保存备用。

1.2仪器与试剂

Probe 1-step RT-Qpcr 5G kit 2.0试剂盒购自天筛(上海)科技有限公司。琼脂糖、RT-PCR试剂盒、DL500Marker、核酸染料、DNA/RNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒均购自南京诺唯赞公司。DNA片段纯化试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。PCR仪购自杭州朗基公司。QuantStudio5实时荧光定量PCR仪和核酸浓度测定仪NanoDrop 2000均购自ThermoFisher公司。

1.3引物设计与合成

参照GenBank中近5年发布的CDV的N基因序列、CCoV的S基因序列，使用PirmerPermier5.0软件分别设计了针对这2种病毒的特异性引物以及相对应的不同荧光基团标记的特异性TaqMan水解探针(表1)，由派森诺生物(上海)股份有限公司合成。

表1 CDV与CCoV引物探针序列

CCoV序列：

GGTGACAGCGATCTCGTTGCCAATGGGAACGGTGCCAAGTATTACCCACAACTGGCTGAATGTGTTCCATCTGTATCTAGCATTCTGTTTGGAAGCTATTGGACTGCAAAGGAAGATGGCGACCAGATTGAAG(SEQ ID NO：7)。

CDV序列：

AAATCAACGGACCTAAATTAACTGGGATTTTAATCAGTATCCTCTCCTTGTTCGTGGAATCCCCTGGACAGTTGATCCATAGGATCATAGACGACCCTGATGTAATCATCAAGTTAGTAGAGGTAATCCCAAGCATCAACTCTGTTTGCGGTCTTACATTTGCATCCAGAGGAGCAAGTTTGGATTCTGAGGCAGATGAGTT(SEQ ID NO：8)。

1.4样品核酸提取

分别取犬瘟热疫苗(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬冠状病毒(CCoV)、犬传染性喉气管炎病毒2型(CAV-2)、犬副流感病毒(CPIV)病毒液各200μL，按照诺唯赞快速提取试剂盒说明书步骤提取各个病毒的DNA或RNA。DNA、RNA于-20℃保存备用。

1.5重组质粒标准品的构建与鉴定

以犬瘟热疫苗(CDV)、犬冠状病毒(CCoV)的cDNA作为模板，分别采用CDV-F/R、CCoV-F/R引物，经PCR扩增相应病毒的目的基因，回收、纯化后连入p MD18-T载体构建各病毒的重组质粒，经PCR及测序鉴定正确的重组质粒分别命名为CDV-N、CCoV-S，作为质粒标准品。使用紫外分光光度计测定2种重组质粒浓度，根据拷贝数计算公式：6.02×10²³拷贝数/摩尔×(浓度)/(MW g/mol)＝copies/mL，其中，平均分子质量(MW)：ssDNA＝碱基数×330道尔顿/碱基，将质量浓度换算为拷贝数浓度。

1.6反应条件的优化及标准曲线的建立

将2种重组质粒标准品CDV-N、CCoV-S等体积比的混合物作为模板，利用2对特异性引物和TaqMan探针，在同一体系中进行荧光定量PCR扩增，采用矩阵法分别对退火温度(52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃)、2种引物终浓度(0.2pmol/μL、0.3pmol/μL、0.4pmol/μL、0.5pmol/μL)及2种探针终浓度(0.1pmol/μL、0.2pmol/μL、0.3pmol/μL、0.4pmol/μL)进行优化，以获得TaqMan荧光定量PCR最佳反应条件。将2种重组质粒标准品10倍倍比稀释后等体积混合，按照优化的TaqMan荧光定量PCR反应条件进行扩增，并绘制扩增曲线与标准曲线。

1.7特异性实验

分别以CDV、CCoV、CAV、CPIV的cDNA及CPV的DNA作为模板，以两种重组质粒标准品作为阳性对照，灭菌双蒸水作为阴性对照，利用建立的双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法扩增，评价该方法的特异性。

1.8灵敏度试验

将2种重组质粒标准品CDV-N、CCoV-S 10倍倍比稀释后等体积混合，选取CDV-N浓度为6.3×10⁸copies/μL～6.3×10¹copies/μL、CCoV-S浓度为6.17×10⁸copies/μL～6.17×10¹copies/μL的质粒标准品作为模板，利用建立的TaqMan荧光定量PCR扩增，评估该方法的敏感性。

1.9重复性实验

将2种重组质粒标准品CDV-N、CCoV-S 10倍倍比稀释后等体积混合，选取CDV-N浓度为6.3×10⁷copies/μL、6.3×10⁵copies/μL、6.3×10³copies/μL 3个浓度的质粒。CCoV-S浓度为6.17×10⁷copies/μL、6.17×10⁵copies/μL、6.17×10³copies/μL 3个浓度的质粒作为模板，利用建立的TaqMan荧光定量PCR扩增，进行组内重复性试验，每个样品重复3次；经相同方法对不同批次提取的重组质粒进行组间重复性试验。评价该方法的重复性。

1.10临床检测

对2022年山东省内各大养殖场收集的48份疑似患病腹泻样本，利用改良的核酸直扩方法进行核酸提取，12000rpm短暂离心后，取200μL上清放入1.5mL离心管中(含1mL裂解液)用手反复震荡混合多次，取2μL按优化后的双重TaqMan荧光定量PCR反应体系进行样本检测。同时根据国家标准(GB/T 27532-2011《犬瘟热诊断技术》)及王静建立的犬冠状病毒RT-PCR检测方法进行检测结果对比，验证双重qPCR方法的准确性。

2结果

2.1双重荧光定量RT-PCR方法的建立

2.1.1反应条件的优化

通过对各反应条件的优化，确定了2种引物最佳浓度为10pmol/μL，2种探针最佳浓度为10pmol/μL，CDV/CCoV双重荧光RT-PCR的最佳反应体系：2×5G qPCR Buffer BB 12.5μL，RT-qPCR Enzyme Mix UD 1.3μL，CDV和CCoV的上游引物(10pmol/μL)各0.4μL，下游引物(10pmol/μL)各0.4μL，探针(10pmol/μL)各1μL，重组质粒标准品各1μL，蒸馏水模板补至25μL。反应条件37℃3min；95℃2min；95℃1min；95℃10s，52℃30s，40个循环。

2.1.2标准曲线的绘制

用10倍系列稀释的质粒标准品为模板进行双重荧光RT-PCR标准曲线的绘制，最后得出了CDV-N和CCoV-S两个通道荧光定量RT-PCR具有良好的线型关系。其中CDV-N的标准曲线：线型回归方程为y＝-3.1817x+34.703，相关系数R²＝0.9972，CCoV-S的标准曲线：线型回归方程为y＝-3.1305x+36.426，相关系数R²＝0.997，如图1。

2.1.3灵敏度试验

将两个重组质粒等体积等浓度进行均匀混合。将重组质粒进行10倍梯度稀释，选取CDV-N浓度为6.3×10⁸～6.3×10¹copies/μL的阳性质粒，CCoV-S选取浓度6.17×10⁸～6.17×10¹copies/μL的阳性质粒将两个重组质粒等体积等浓度进行均匀混合。使用RNA无酶水做阴性对照，做双重RT-qPCR。分析CDV-N和CCoV-S的扩增曲线，由图2可知，CDV-N和CCoV-S的扩增曲线的最低检测拷贝数，CDV-N的检测下限为6.3×10¹copies/μL，CCoV-S的检测下限为6.17×10¹copies/μL。阴性对照的Ct值在35以上。表明本实验建立的双重RT-qPCR敏感性良好。

2.1.4特异性试验

将CPIV、CPV、CDV、CCoV、CAV-2的核酸为模板，ddH₂O为阴性对照，以CDV和CCoV的质粒标准品作为阳性对照。结果显示CDV和CCoV的核酸及质粒标准品有扩增条带，其他核酸和阴性对照均检测不到荧光信号。证明双重RT-qPCR具有良好的特异性。如图3。

2.1.5重复性试验

每个孔在同一条件下重复3次，组间和组间重复实验所选用的模板浓度分别是CDV为6.3×10⁷、6.3×10⁵、6.3×10³copies/μL和CCoV为6.17×10⁷、6.17×10⁵、6.17×10³copies/μL混合质粒为模板，每1周进行1次反应，进行3次。见表2。其中CDV与CCoV的组内与组间的CV％均小于5％，说明这两种病毒的双重RT-qPCR重复性好。

表2双重RT-qPCR重复性试验

2.1.6双重荧光定量RT-qPCR对临床样本的检测结果

在48份临床样本中，检出3份CDV，阳性率为6.25％；检出2份CCoV，阳性率为4.1％。其中CDV和CCoV混合感染1份，感染率为2％。同时根据国家标准(GB/T 27532-2011《犬瘟热诊断技术》)及王静建立的犬冠状病毒检测方法对同样的样品进行检测结果对比，验证双重qPCR方法的准确性。结果显示，这两种方法对这些样品的检测结果与本发明建立的方法检测结果均一致，三者的符合率为100％。表明，本发明建立的方法可以用于临床样品检测。

表3双重TaqManRT-qPCR检测方法与RT-PCR检测方法对临床样品检测结果的比较

本发明通过大量序列比对，通过对目的基因的选择、密码子的优化、探针的选择，最终确定了N基因区域和S蛋白区域来设计引物。研究表明，CDV核蛋白(N蛋白)为髓芯蛋白，参与RNA的转录和复制，有包裹及保护内部基因的功能，与病毒感染相关，是麻疹病毒属中主要的交叉抗原。不同分离株的N蛋白基因及其抗原性未见显著差异。因此，本发明选择CDVN基因作为靶基因，设计特异性检测引物和探针。而CCoV的S基因序列同源性低，处于不同的进化分支，表明二者抗原相关性较低，所以本发明以CCoV的S基因为靶序列，设计鉴别检测引物。经优化反应条件，建立了同时区分检测上述病原的双重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。

本发明的反应体系采用热敏UNG酶和微量热敏双链DNA核酸酶双酶系统可有效去除气溶胶，减少假阳性；所选用的试剂具有高敏感性，检测更加高效，配合高速荧光PCR仪检测时间可以缩短到40min以内，相比于传统RT-PCR速度提高了一倍以上。为验证建立的双重荧光定量TaqMan RT-PCR方法在临床样品中的应用，本发明对48份疑似腹泻样本进行检测时采用直扩型的qPCR液，该反应液对核酸纯度要求低、耐受性好，适用于低浓度样本的检测。同时根据国家标准(GB/T 27532-2011《犬瘟热诊断技术》)及王静建立的犬冠状病毒检测方法进行复核，结果显示三者的总符合率为100.0％，但临床感染率较低，可能是由于疫苗的免疫效果强及养殖户的防范意识强导致。

本发明在单重荧光RT-PCR的基础上，通过对反应条件的优化建立了CDV和CCoV的双重荧光RT-PCR的检测方法，该方法可以对单一样本同时进行两种不同病原的检测，具有特异性强、敏感性高、操作简单和气溶胶污染机会少的优点，为毛皮动物病毒性腹泻的流行病学调查和鉴别诊断提供了技术支持。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种用于犬瘟热病毒与犬冠状病毒双重检测的引物和荧光探针，其特征在于，所述引物包括犬瘟热病毒的检测引物和犬冠状病毒的检测引物；所述犬瘟热病毒的检测引物包括如SEQ ID NO：4-5所示的上游检测引物和下游检测引物；所述犬冠状病毒的检测引物包括如SEQ ID NO：1-2所示上游检测引物和下游检测引物；

所述荧光探针包括犬瘟热病毒荧光探针和犬冠状病毒荧光探针；所述犬冠状病毒荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述犬瘟热病毒荧光探针的核苷酸序列如SEQ IDNO：6所示。

2.如权利要求1所述的引物和荧光探针，其特征在于，所述犬冠状病毒荧光探针的5'端的报告荧光基团为HEX，3'端的猝灭荧光基团为BHQ1。

3.如权利要求1所述的引物和荧光探针，其特征在于，所述犬瘟热病毒荧光探针的5'端的报告荧光基团为ROX，3'端的猝灭荧光基团为BHQ1。

4.一种用于犬瘟热病毒与犬冠状病毒双重检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的引物和荧光探针。

5.一种非疾病诊断目的的犬瘟热病毒与犬冠状病毒的双重检测方法，其特征在于，以待测样品的DNA为模板，利用权利要求1-3任一项所述的引物和荧光探针进行实时荧光定量反应，基于模板DNA的Ct值判断是否含有犬瘟热病毒或犬冠状病毒。

6.如权利要求5所述的双重检测方法，其特征在于，利用所述犬瘟热病毒与犬冠状病毒双重检测引物和荧光探针进行实时荧光定量反应的反应体系包括：2×5G qPCR Buffer BB12.5μL，RT-qPCR Enzyme Mix UD 1.3μL，犬瘟热病毒和犬冠状病毒的上游引物各0.4μL，下游引物各0.4μL，探针各1μL，质粒模板各1μL，蒸馏水模板补至25μL；

所述犬瘟热病毒和犬冠状病毒的上游引物和下游引物浓度为10pmol/μL；所述探针浓度为10pmol/μL；

反应程序为：37℃3min；95℃2min；95℃1min；95℃10s，52℃30s，40个循环。

7.如权利要求1-3任一项所述的犬瘟热病毒与犬冠状病毒双重检测引物和荧光探针在制备犬瘟热病毒与犬冠状病毒双重TaqMan荧光定量检测产品中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述产品包括药物、试剂或者试剂盒。

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