CN116287462A - 同时检测FCoV、FPV和FeLV的多重RT-qPCR试剂盒及检测方法 - Google Patents

同时检测FCoV、FPV和FeLV的多重RT-qPCR试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了同时检测FCoV、FPV和FeLV的多重RT‑qPCR试剂盒及检测方法。所述的试剂盒中包括如序列表中SEQ ID NO.1～9所示的引物和探针。所述检测方法用于非疾病诊断和治疗目的，其是将从猫的鼻拭子、肛拭子、腹水和粪便等待测样品中提取的总DNA/RNA作为模版，再加入上述引物和探针配制扩增反应液并进行qRT‑PCR扩增，然后通过荧光定量PCR仪自带软件绘制扩增曲线，读取相应的Ct值并进行结果判定，从而确定并区分上述病毒，实现了对三种病毒的快速、准确的检测，为实验室检测区分上述病毒提供了有效的技术手段。

Description

同时检测FCoV、FPV和FeLV的多重RT-qPCR试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种同时检测猫冠状病毒（FCoV）、猫细小病毒（FPV）和猫白血病病毒（FeLV）的多重RT-qPCR试剂盒及检测方法。
背景技术
猫冠状病毒(Feline coronavirus，FCoV)是一种有包膜的、不分节段的单股正链RNA病毒，属于巢病毒目冠状病毒科冠状病毒亚科中的甲型冠状病毒属。FCoV包括猫肠道冠状病毒（FECV）和猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）两种生物型，根据编码刺突蛋白的S基因核苷酸序列的差异，FCoV可分为Ⅰ型和Ⅱ型两种血清型。FECV主要引起轻度到重度肠炎，FIPV主要引起感染猫腹膜炎、眼膜炎及神经症状等，临床病例多为渗出性FIP，以体腔积液、浆膜炎为显着病理改变。FCoV在猫群中的携带率超过20%。
猫细小病毒(Feline panleukopenia virus，FPV)又称猫泛白细胞减少症病毒、猫传染性肠炎病毒或猫瘟病毒。FPV属于细小病毒科、细小病毒亚科、细小病毒属，是一种小的单链无囊膜DNA病毒。猫瘟是一种以白细胞减少和出血性胃肠炎为特征的高致病性传染病，是一种侵害猫科动物的重要病原体，幼龄动物更易感，具有分布广、变异较快的特点，易感动物的发病率和死亡率高达25%～90%。
猫白血病病毒（Feline leukemia virus，FeLV）属于逆转录病毒科γ逆转录病毒属成员，基因组为单股正链线状RNA二聚体，于1964年首次从猫的淋巴细胞瘤中分离出来。FeLV可引起猫多种类型的白血病和其他疾病如淋巴细胞、成红细胞、骨髓细胞的增生或减少，以及肠炎、流产等疾病。
FCoV、FPV和FeLV三种病毒在猫群中的携带率都较高，而且存在同时携带多种病毒的情况，并且三种病毒的表现存在一定的相似性，使得区分三种病毒的难度增加。虽然目前已经报道了几种能够单独检测FCoV、FPV、FeLV的qPCR方法，但是仍然缺少能够快速有效的同时检测猫冠状病毒、猫细小病毒和猫白血病病毒的检测方法，无法满足实验室对于三种病毒的定性定量分析和研究。
发明内容
针对上述不足，本发明公开了一种同时检测猫冠状病毒（FCoV）、猫细小病毒（FPV）和猫白血病病毒（FeLV）的多重RT-qPCR试剂盒及检测方法，实现了对三种病毒的快速、准确的检测，为实验室检测区分上述病毒提供了有效的技术手段。
本发明是采用如下技术方案实现的：
一种同时检测FCoV、FPV和FeLV的多重RT-qPCR试剂盒，其包括以下引物和探针：
引物F1的序列为CCTGTTTGGTAAGTCGTCTAGTAT（序列表SEQ ID NO.1）；
引物R1的序列为CGAGGATCTTAAATTGTTTGGAACT（序列表SEQ ID NO.2）；
探针A的序列为FAM-TAGTTGGGTAGACCGGGTTCCGTC-BHQ1（序列表SEQ ID NO.3）；
引物F2的序列为GCTACTCAGCCACCAACTAAA（序列表SEQ ID NO.4）；
引物R2的序列为TCATAGCTGCTGGAGTAAATGG（序列表SEQ ID NO.5）；
探针B的序列为CY5-ACTGCATCATTGATGGTTGCATTAG-BHQ3（序列表SEQ ID NO.6）；
引物F3的序列为CCCATCCAGGCAATCTCAAATA（序列表SEQ ID NO.7）；
引物R3的序列为GCAATGGAGGCATTAACAAGAG（序列表SEQ ID NO.8）；
探针C的序列为VIC-TAACACCTCACCATTCCCAAGGCA-BHQ1（序列表SEQ ID NO.9）。
所述引物F1、引物R1和探针A是用于检测FCoV中的5’UTR基因；
所述引物F2、引物R2和探针B是用于检测FPV中的VP2基因；
所述引物F3、引物R3和探针C是用于检测FeLV中的env基因。
一种同时检测FCoV、FPV和FeLV的多重RT-qPCR检测方法，其用于非疾病诊断和治疗目的，具体包括以下步骤：
（1）样品处理：采用核酸提取试剂盒对待测样品进行提取得到总DNA/RNA；所述待测样品包括猫的鼻拭子、肛拭子、腹水、粪便中的任意一种；
（2）扩增反应液配制：将步骤（1）中得到的总DNA/RNA作为模板进行qRT-PCR扩增反应，采用如SEQ ID NO.1～NO.9所示的引物和探针配制扩增反应液，所述扩增反应液总体积为20μL，其包括以下体积的组分：10μL的2×One Step RT-PCR Buffer，0.4μL的TaKaRa ExTaq HS，0.4μL的PrimeScript RT Enzyme Mix II，2μL的模板，引物F1、引物R1、探针A、引物F2、引物R2、探针B、引物F3、引物R3和探针C各0.3μL，余量为无核酸酶水；所述引物R1、探针A、引物F2、引物R2、探针B、引物F3、引物R3和探针C的浓度均为20 pmol/μL；
（3）qRT-PCR扩增：将步骤（2）中配制得到的扩增反应液在荧光定量PCR仪中依次进行如下扩增反应程序：
Step1：42℃反转录5min；
Step2：95℃预变性10s；
Step3：95℃变性5s，55℃退火30s，共进行40个循环，同时收集荧光信号；
（4）结果检测：通过荧光定量PCR仪自带软件绘制扩增曲线，读取相应的Ct值并进行结果判定。
进一步的，在步骤（1）中，将1mL 的pH 为7.2的 PBS液加入至灭菌离心管中，接着加入所述待测样品，然后反复震荡1min后，再在5000 r/min的条件下离心10 min，接着取上清液,并按照核酸提取试剂盒提取得到总RNA/DNA，然后于-80℃保存备用。
进一步的，在步骤（4）中，当所得到的Ct值小于等于38个周期时，判定为阳性，当Ct值大于38个周期时，判定为阴性。
本技术方案与现有技术相比较具有以下有益效果：
猫冠状病毒、猫细小病毒和猫白血病病毒存在一种或多种混合感染情况。本发明针对FCoV的5’UTR基因，FPV的VP2基因，FeLV的env基因设计了三对特异性引物和相应的探针，并开发了一种基于TaqMan探针的多重RT-qPCR检测方法，能够同时检测上述三种病毒。该方法只能检测出猫冠状病毒、猫细小病毒和猫白血病病毒的核酸，与猫和犬的其他病毒无交叉反应；只需一次实时荧光PCR反应即可同时检测三个病毒，大幅减少检测时间，提高检测效率，而且三个病毒的检测灵敏度均可达到15copies/μL。综上，本发明具有高特异性、快速高效、灵敏的优点，实现了对三种病毒的快速、准确的检测，为实验室定性定量区分和研究猫冠状病毒、猫细小病毒和猫白血病病毒提供了有效方法。
附图说明
图1是实验例的S4步骤中得到的pFCoV-5’UTR的扩增曲线图，其中曲线1～7依次表示浓度为1.50×108copies/μL、1.50×107copies/μL、1.50×106copies/μL、1.50×105copies/μL、1.50×104copies/μL、1.50×103copies/μL、1.50×102copies/μL。
图2是实验例的S4步骤中得到的pFPV-VP2的扩增曲线图，其中曲线1～7依次表示浓度为1.50×108copies/μL、1.50×107copies/μL、1.50×106copies/μL、1.50×105copies/μL、1.50×104copies/μL、1.50×103copies/μL、1.50×102copies/μL。
图3是实验例的S4步骤中得到的pFeLV-env的扩增曲线图，其中曲线1～7依次表示浓度为1.50×108copies/μL、1.50×107copies/μL、1.50×106copies/μL、1.50×105copies/μL、1.50×104copies/μL、1.50×103copies/μL、1.50×102copies/μL。
图4是实验例的S4步骤中得到的标准曲线图，其中曲线1～3依次表示pFCoV-5’UTR、pFPV-VP2、pFeLV-env。
图5是实验例的S5步骤中检测不同病毒得到的扩增曲线图，其中曲线1、2、3依次表示pFCoV-5’UTR、pFPV-VP2、pFeLV-env；曲线4、5、6依次表示野生型FCoV、FPV、FeLV在FAM、Cy5和VIC 荧光通道的荧光曲线；曲线7～10依次表示FCV、FHV、CDV、CPIV；曲线11为无核酸酶水的阴性对照（WTC）。
图6是实验例的S6步骤中得到的pFCoV-5’UTR的扩增曲线图，其中曲线1~9浓度依次为1.50×107copies/μL、1.50×106copies/μL、1.50×105copies/μL、1.50×104copies/μL、1.50×103copies/μL、1.50×102copies/μL、1.50×101copies/μL、1.50×100copies/μL、1.50×10-1copies/μL，曲线10为阴性对照。
图7是实验例的S6步骤中得到的pFPV-VP2的扩增曲线图，其中曲线1~9浓度依次为1.50×107copies/μL、1.50×106copies/μL、1.50×105copies/μL、1.50×104copies/μL、1.50×103copies/μL、1.50×102copies/μL、1.50×101copies/μL、1.50×100copies/μL、1.50×10-1copies/μL，曲线10为阴性对照。
图8是实验例的S6步骤中得到的pFeLV-env的扩增曲线图，其中曲线1~9浓度依次为1.50×107copies/μL、1.50×106copies/μL、1.50×105copies/μL、1.50×104copies/μL、1.50×103copies/μL、1.50×102copies/μL、1.50×101copies/μL、1.50×100copies/μL、1.50×10-1copies/μL，曲线10为阴性对照。
图9是实验例的S8步骤中得到的临床样品检测试验结果。
实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：一种同时检测FCoV、FPV和FeLV的多重RT-qPCR试剂盒，其包括以下引物和探针：
引物F1的序列为CCTGTTTGGTAAGTCGTCTAGTAT；
引物R1的序列为CGAGGATCTTAAATTGTTTGGAACT；
探针A的序列为FAM-TAGTTGGGTAGACCGGGTTCCGTC-BHQ1；
引物F2的序列为GCTACTCAGCCACCAACTAAA；
引物R2的序列为TCATAGCTGCTGGAGTAAATGG；
探针B的序列为CY5-ACTGCATCATTGATGGTTGCATTAG-BHQ3；
引物F3的序列为CCCATCCAGGCAATCTCAAATA；
引物R3的序列为GCAATGGAGGCATTAACAAGAG；
探针C的序列为VIC-TAACACCTCACCATTCCCAAGGCA-BHQ1。
一种同时检测FCoV、FPV和FeLV的多重RT-qPCR检测方法，其用于非疾病诊断和治疗目的，具体包括以下步骤：
（1）样品处理：将1mL 的pH 为7.2的 PBS液加入至灭菌离心管中，接着加入待测样品，然后反复震荡1min后，再在5000 r/min的条件下离心10 min，接着取上清液,并按照核酸提取试剂盒提取得到总RNA/DNA，然后于-80℃保存备用；所述待测样品包括猫的鼻拭子、肛拭子、腹水、粪便中的任意一种；
（2）扩增反应液配制：将步骤（1）中得到的总DNA/RNA作为模板进行qRT-PCR扩增反应，采用如SEQ ID NO.1～NO.9所示的引物和探针配制扩增反应液，所述扩增反应液总体积为20μL，其包括以下体积的组分：10μL的2×One Step RT-PCR Buffer，0.4μL的TaKaRa ExTaq HS，0.4μL的PrimeScript RT Enzyme Mix II，2μL的模板，引物F1、引物R1、探针A、引物F2、引物R2、探针B、引物F3、引物R3和探针C各0.3μL，余量为无核酸酶水；所述引物R1、探针A、引物F2、引物R2、探针B、引物F3、引物R3和探针C的浓度均为20 pmol/μL；
（3）qRT-PCR扩增：将步骤（2）中配制得到的扩增反应液在荧光定量PCR仪中依次进行如下扩增反应程序：
Step1：42℃反转录5min；
Step2：95℃预变性10s；
Step3：95℃变性5s，55℃退火30s，共进行40个循环，同时收集荧光信号；
（4）结果检测：通过荧光定量PCR仪自带软件绘制扩增曲线，读取相应的Ct值并进行结果判定；当所得到的Ct值小于等于38个周期时，判定为阳性，当Ct值大于38个周期时，判定为阴性。
实验例：对实施例1中所述的同时检测FCoV、FPV和FeLV的多重RT-qPCR试剂盒分别进行特异性、敏感性和重复性的试验分析，具体试验分析过程如下所示：
S1、实验用各种病毒的总核酸提取及反转录：分别取FCoV、FPV、FeLV临床阳性样品混悬液的上清液各200 µL，采用核酸提取试剂盒提取总DNA/RNA，并使用PrimeScriptⅡ1st strand Cdna Synthesis Kit 试剂盒将其反转录成cDNA，然后置于-20℃下保存备用；分别取FCV、FHV、CDV、CPIV的疫苗株病毒液各200 µL，采用病毒核酸提取试剂盒提取DNA/RNA ，将提取的DNA和经过反转录后所得到的cDNA，然后置于-20℃下保存备用。
S2、标准质粒的制备：以步骤S1中得到的FCoV、FPV、FeLV的DNA/cDNA作为模板，采用实施例1中所述的引物配制3个扩增反应液，第一个扩增反应液总体积为25µL，其包括12.5µL的Premix Ex Taq ，2.5µL的FCoV的cDNA，浓度为25 pmol/μL的引物F1和引物R1各0.4μL，余量为无核酸酶水；第二个扩增反应液总体积为25µL，其包括12.5µL的Premix ExTaq ，2.5µL的FPV的DNA，浓度为25 pmol/μL的引物F2和引物R2各0.4μL，余量为无核酸酶水；第三个扩增反应液总体积为25µL，其包括12.5µL的Premix Ex Taq ，2.5µL的FeLV的cDNA，浓度为25 pmol/μL的引物F3和引物R3各0.4μL，余量为无核酸酶水；将3个扩增反应液进行扩增反应；
扩增反应程序为：
Step1：94℃预变性3min；
Step2：94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸20s，共进行35个循环；
Step3：72℃终延伸10min。
回收扩增产物，将纯化的扩增产物克隆至pMD18-T载体中，转化到DH5α感受态细胞，阳性克隆体在37℃下培养18～20h，使用MiniBEST Plasmid Purification KitVer.4.0质粒抽提试剂盒提取质粒后进行酶切（Hind III +EcoR I 酶切）、PCR和测序鉴定。正确构建重组质粒后，将它们作为阳性标准品，分别命名为pFCoV-5’UTR、pFPV-VP2和pFeLV-env标准质粒，用核酸蛋白分析仪测定质粒OD260 nm值，计算质粒浓度并换算成拷贝数（copies/μL），pFCoV-5’UTR、pFPV-VP2和pFeLV-env标准质粒的初始浓度分别为2.03×1010copies/μL、3.11×1010copies/μL和 2.64×1010copies/μL。
S3、qRT-PCR扩增反应的引物和探针浓度优化：初步设定扩增反应参数为：42℃反转录5min，95℃预变性10s，95℃变性5s，58℃退火30s，40个循环。为了确定qPCR的最佳反应条件，固定扩增反应体系中以下组分用量：10μL的2×One Step RT-PCR Buffer，0.4μL的TaKaRa Ex Taq HS，0.4μL的PrimeScript RT Enzyme Mix II，2μL的三种标准质粒的混合物，3种不同终浓度的引物和相应的探针，余量为无核酸酶水；所述标准质粒为步骤S2中得到的pFCoV-5’UTR、pFPV-VP2和pFeLV-env；
选定不同的退火温度（55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃）、不同的引物浓度（0.1pmol/μL、0.2 pmol/μL、0.3 pmol/μL、0.4 pmol/μL、0.5 pmol/ μL）和探针浓度（0.1 pmol/μL、0.2 pmol/μL、0.3 pmol/μL、0.4 pmol/μL、0.5 pmol/μL）通过排列组合试验进行扩增，确定得到实施例1中所述的扩增反应液和扩增反应程序。
S4、标准质粒的标准曲线绘制：将步骤S2中所得到的pFCoV-5’UTR、pFPV-VP2和pFeLV-env等体积混合，然后配制成溶液，使得所述溶液中三种标准质粒的浓度均为1.50×109copies/μL，然后连续稀释10倍依次得到三种标准质粒的浓度为1.50×108copies/μL、1.50×107copies/μL、1.50×106copies/μL、1.50×105copies/μL、1.50×104copies/μL、1.50×103copies/μL、1.50×102copies/μL的溶液，将上述溶液作为模板，按照实施例1中所述方法进行扩增，得到三种标准质粒的扩增曲线（参见图1～3）和并绘制标准曲线（参见图4），其中pFCoV-5’UTR对应的标准曲线为y=-3.235x+38.451，R2=0.999；pFPV-VP2对应的标准曲线为y=-3.305x+38.701，R2=1；pFeLV-env对应的标准曲线为y=-3.269x+39.166，R2=0.998。
S5、特异性试验：取步骤S1中得到的cDNA和总DNA/RNA以及步骤S2中得到的三种标准质粒，各取2μL作为模板，并且以无菌蒸馏水（NTC）和无核酸酶水（WTC）为阴性对照，按照实施例1中所述方法进行检测，结果见图5；
结果显示，仅有三种标准质粒的样本显示出阳性扩增曲线，而其他样本没有显示出扩增曲线，表明本发明的检测方法与其它病毒没有交叉反应，可以检测FCoV的5’UTR基因、FPV的VP2基因和FeLV的env基因，具有较强的特异性。
S6、敏感性试验：将步骤S2中所得到的pFCoV-5’UTR、pFPV-VP2和pFeLV-env标准质粒等体积混合，然后配制成溶液，使得所述溶液中三种标准质粒的浓度均为1.50×108copies/μL，然后连续10倍稀释依次得到三种标准质粒的浓度为1.50×107copies/μL、1.50×106copies/μL、1.50×105copies/μL、1.50×104copies/μL、1.50×103copies/μL、1.50×102copies/μL、1.50×101copies/μL、1.50×100copies/μL、1.50×10-1copies/μL的溶液，将上述溶液作为模板，按照实施例1中所述方法进行扩增，得到三种标准质粒的扩增曲线（参见图6～8）；
结果显示，三种标准质粒的qRT-PCR的检测下限均为15copies/μL，说明本发明建立的方法具有较高的敏感度。
S7、重复性试验：将步骤S2中所得到的pFCoV-5’UTR、pFPV-VP2和pFeLV-env标准质粒等体积混合，然后配制成溶液，所述溶液中三种标准质粒的浓度均为1.50×108copies/μL，然后连续稀释依次得到三种标准质粒的浓度为1.50×107copies/μL、1.50×105copies/μL、1.50×103copies/μL的溶液，将上述溶液作为模板，按照实施例1中所述方法进行扩增，得到三种标准质粒的扩增曲线，而且组内及组间重复性试验各进行3次，具体结果见表1。
结果显示，组内和组间的变异系数CV均小于1.45%，说明本发明方法具有良好的重复性。
表1 重复性试验数据
Figure SMS_1
S8、临床样品检测试验：在2021年12月到2022年11月期间，在广西采集临床样本648份，临床样本类型包括猫的鼻拭子、肛拭子、粪便、腹水等；将采集的猫鼻拭子、肛拭子、粪便、腹水加入含1mL（PH 7.2）PBS液的灭菌离心管中，反复震荡1min，5000 r/min离心10min，取上清液按照核酸提取试剂盒抽提样品上清中总RNA/DNA；
以无菌蒸馏水为阴性对照，按照实施例1所述方法进行检测，具体结果参见图9；同时从中随机挑选FCoV、FPV和FeLV各一份阳性毒株进行测序鉴定。
根据图9数据可知，在648份样本中，有132份呈FCoV阳性，阳性率为20.4%，其中腹水样品的检出率最高；有156份呈FPV阳性，阳性率为24.1%，其中肛拭子样品的检出率最高；有334份呈FeLV阳性，阳性率为51.5%，各类样品的检出率均很高。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (4)

1.一种同时检测FCoV、FPV和FeLV的多重RT-qPCR试剂盒，其特征在于：包括以下引物和探针：
引物F1的序列为CCTGTTTGGTAAGTCGTCTAGTAT；
引物R1的序列为CGAGGATCTTAAATTGTTTGGAACT；
探针A的序列为FAM-TAGTTGGGTAGACCGGGTTCCGTC-BHQ1；
引物F2的序列为GCTACTCAGCCACCAACTAAA；
引物R2的序列为TCATAGCTGCTGGAGTAAATGG；
探针B的序列为CY5-ACTGCATCATTGATGGTTGCATTAG-BHQ3；
引物F3的序列为CCCATCCAGGCAATCTCAAATA；
引物R3的序列为GCAATGGAGGCATTAACAAGAG；
探针C的序列为VIC-TAACACCTCACCATTCCCAAGGCA-BHQ1。
2.一种同时检测FCoV、FPV和FeLV的多重RT-qPCR检测方法，用于非疾病诊断和治疗目的，其特征在于：包括以下步骤：
（1）样品处理：采用核酸提取试剂盒对待测样品进行提取得到总DNA/RNA；所述待测样品包括猫的鼻拭子、肛拭子、腹水、粪便中的任意一种；
（2）扩增反应液配制：将步骤（1）中得到的总DNA/RNA作为模板进行qRT-PCR扩增反应，采用如SEQ ID NO.1～NO.9所示的引物和探针配制扩增反应液，所述扩增反应液总体积为20μL，其包括以下体积的组分：10μL的2×One Step RT-PCR Buffer，0.4μL的TaKaRa ExTaq HS，0.4μL的PrimeScript RT Enzyme Mix II，2μL的模板，引物F1、引物R1、探针A、引物F2、引物R2、探针B、引物F3、引物R3和探针C各0.3μL，余量为无核酸酶水；所述引物R1、探针A、引物F2、引物R2、探针B、引物F3、引物R3和探针C的浓度均为20 pmol/μL；
（3）qRT-PCR扩增：将步骤（2）中配制得到的扩增反应液在荧光定量PCR仪中依次进行如下扩增反应程序：
Step1：42℃反转录5min；
Step2：95℃预变性10s；
Step3：95℃变性5s，55℃退火30s，共进行40个循环，同时收集荧光信号；
（4）结果检测：通过荧光定量PCR仪自带软件绘制扩增曲线，读取相应的Ct值并进行结果判定。
3. 根据权利要求2所述的同时检测猫冠状病毒、猫细小病毒和猫白血病病毒的检测方法，其特征在于：在步骤（1）中，将1mL 的pH 为7.2的 PBS液加入至灭菌离心管中，接着加入所述待测样品，然后反复震荡1min后，再在5000 r/min的条件下离心10 min，接着取上清液,并按照核酸提取试剂盒提取得到总RNA/DNA，然后于-80℃保存备用。
4.根据权利要求2所述的同时检测猫冠状病毒、猫细小病毒和猫白血病病毒的检测方法，其特征在于：在步骤（4）中，当所得到的Ct值小于等于38个周期时，判定为阳性，当Ct值大于38个周期时，判定为阴性。
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