CN116121464A - 一种猪肠道冠状病毒的多重RT-qPCR试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪肠道冠状病毒的多重RT‑qPCR试剂盒及检测方法，所述试剂盒包括如序列表中SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.12所示的引物和探针。所述的RT‑qPCR检测方法是将猪肠道组织样品、猪的粪便或肛门拭子样品进行总RNA提取，然后将得到的总RNA作为模板，添加如序列表中SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.12所示的引物和探针配制得到扩增反应液并进行扩增反应，然后通过荧光定量PCR仪自带软件绘制扩增曲线并读取相应的Ct值并进行结果判定，确定并区分不同的猪肠道冠状病毒。本发明方法具有特异性好、灵敏度高的优点，能够同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎(TGEV)、猪δ冠状病毒(PDCoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS‑CoV)，为实验室检测区分上述病毒株提供了有效的技术手段。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种猪肠道冠状病毒的多重RT-qPCR试剂盒及检测方法。
背景技术
迄今为止，已确定六种冠状病毒会导致猪的呼吸道疾病或胃肠炎，包括传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪呼吸道冠状病毒(PRCoV)、猪δ冠状病毒(PDCoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)。其中，PEDV、TGEV、PDCoV和SADS-CoV为可导致新生仔猪急性胃肠炎的四种猪肠道冠状病毒，这些猪肠道冠状病毒对全世界的养猪业造成了巨大的损失。
PEDV属于尼多病毒目冠状病毒科，其为单股正链RNA病毒，呈现球形，直径约为95～90nm，有囊膜；TGEV属于冠状病毒科冠状病毒属，病毒粒子呈多形性，大多为圆形和椭圆形，直径为90～200nm，表面有囊膜；PDCoV属于冠状病毒亚科，其为有囊膜的单股正链RNA病毒；SADS-CoV属于冠状病毒亚科α冠状病毒属。上述四种病毒具有相类似的结构，且它们存在两种或多种混合感染的情况，所以准确区分上述四种病毒存在很大困难。实时定量聚合酶链式反应（real-time RT-qPCR）在目标基因组的定量和检测方面具有很大的优势，具有高特异性、灵敏度和可重复性等优点。但是目前，未有报道能够同时检测多种猪肠道冠状病毒的RT-qPCR方法。因此，建立一种用于同时鉴别检测四种猪肠道冠状病毒的四重RT-qPCR方法，可以为实验室检测区分和研究上述病毒株提供有效技术手段。
发明内容
针对上述不足，本发明公开了一种猪肠道冠状病毒的多重RT-qPCR试剂盒及检测方法，其具有特异性好、灵敏度高等优点，能够同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎(TGEV)、猪δ冠状病毒(PDCoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)，为实验室快速、准确的检测区分上述病毒株提供了有效的技术手段。
本发明是采用如下技术方案实现的：
一种猪肠道冠状病毒的多重RT-qPCR试剂盒，其包括以下引物和探针：
引物F1的序列如序列表SEQ ID NO.1所示为CTGGAATGAGCAAATTCGCTG；
引物R1的序列如序列表SEQ ID NO.2所示为CAACCCAGAAAACACCCTCAG；
探针A的序列如序列表SEQ ID NO.3所示为
JOE-AGCGAATTGAACAACCTTCCAATTGGCA-BHQ1；
引物F2的序列如序列表SEQ ID NO.4所示为GCAATTCTTTGCGTTAGTGCAT；
引物R2的序列如序列表SEQ ID NO.5所示为AGCGTACAAATTCCCTGAAAGC；
探针B的序列如序列表SEQ ID NO.6所示为
Texas Red-CTTCCTCTCGAAGGTGTGCCAACTGG-BHQ2；
引物F3的序列如序列表SEQ ID NO.7所示为ATCGACCACATGGCTCCAA；
引物R3的序列如序列表SEQ ID NO.8所示为CAGCTCTTGCCCATGTAGCTT；
探针C的序列如序列表SEQ ID NO.9所示为
FAM-CACACCAGTCGTTAAGCATGGCAAGCT-BHQ1；
引物F4的序列如序列表SEQ ID NO.10所示为TACTGGTCCTCACGCAGATG；
引物R4的序列如序列表SEQ ID NO.11所示为ACGATTGCGAACACCAAGAC；
探针D的序列如序列表SEQ ID NO.12所示为
Cy5-CAACAGCGACCCAATGCACACCCT-BHQ3。
所述引物F1、引物R1和探针A是用于检测PEDV中的N基因。
所述引物F2、引物R2和探针B是用于检测TGEV中的M基因。
所述引物F3、引物R3是用于检测PDCoV中的M基因。
所述引物F4、引物R4是用于检测SADS-CoV中的N基因。
一种猪肠道冠状病毒的多重RT-qPCR检测方法，用于非疾病诊断和治疗目的，其包括以下步骤：
（1）样品处理：采用RNA提取试剂盒对待测样品提取得到总RNA；所述待测样品包括猪肠道组织样品、猪的粪便、猪的肛门拭子样品中的任意一种或多种；
（2）扩增反应液配制：将步骤（1）中得到的总RNA作为模板进行RT-qPCR扩增反应，采用如序列表SEQ ID NO.1～NO.12所示的引物和探针配制扩增反应液，所述扩增反应液总体积为20μL，其包括：10µL的2× One-Step RT-PCR Buffer III(TaKaRa)，0.4µL的Ex TaqHS (5 U/μL) (TaKaRa)，0.4µL的PrimeScript RT Enzyme Mix II (TaKaRa)，2µL的模板，引物F1和引物R1各0.2µL，0.3μL的探针A，引物F2和引物R2各0.3µL，0.3μL的探针B，引物F3和引物R3各0.2µL，0.2μL的探针C，引物F4和引物R4各0.3µL，0.3μL的探针D，余量为无核酸酶水；
（3）RT-qPCR扩增：将步骤（2）中配制得到的扩增反应液在荧光定量PCR仪中依次进行如下扩增反应程序：
Step1：42℃反转录5min；
Step2：95℃预变性10s；
Step3：95℃变性5s，57℃退火30s，共进行40个循环，同时收集荧光信号；
（4）结果检测：通过荧光定量PCR仪自带软件绘制扩增曲线并读取相应的Ct值并进行结果判定。
进一步的，在步骤（1）中，将采集的猪肠道组织样品加入搅拌器中，接着加入pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液（PBS）搅拌均匀得到混合物，再取所述混合物加入小钢珠摇动5分钟得到均质化的样品，然后将均质化的样品反复冻融3次，接着在4℃下以10000×g的条件离心10分钟，然后取上清液进行总RNA的提取；当所述待测样品为猪的粪便或猪的肛门拭子样品时，将猪的粪便或猪的肛门拭子样品加入至pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液（PBS）中，然后使用涡旋振荡器震荡混匀30秒，接着反复冻融3次，接着在4℃ 下以10000×g的条件离心10分钟，然后取上清液进行总RNA的提取。
进一步的，步骤（2）中，所述的引物F1、引物R1、探针A、引物F2、引物R2、探针B、引物F3、引物R3、探针C、引物F4、引物R4和探针D的浓度均为20 pmol/μL。
进一步的，在步骤（4）中，当所得到的Ct值小于等于36个周期时，判定为阳性，当Ct值大于36个周期时，判定为阴性。
本技术方案与现有技术相比较具有以下有益效果：
猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎(TGEV)、猪δ冠状病毒(PDCoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)四种病毒的表现相似度高，使得它们难于区分鉴别，所以本发明针对PEDV N基因、TGEV M基因、PDCoV M基因和SADS-CoV N基因设计了四对特异性引物和相应的探针，并开发了一种基于TaqMan探针的多重RT-qPCR检测方法，其能够同时检测四种猪肠道冠状病毒毒株，并且本发明检测方法的检测下限为121copies/μL，可以特异性检测PEDV N基因、TGEV M基因、PDCoV M基因、SADS-CoV N基因，与其他猪病毒无交叉反应，综上所述，本发明方法具有快速、特异、灵敏、准确的优点，可方便地用于猪肠道冠状病毒病原体的定性定量检测，为实验室快速、准确的检测区分和研究上述病毒株提供了有效的技术手段。
附图说明
图1是实验例的步骤S4中得到的p-PEDV的扩增曲线图，其中曲线1～9依次表示浓度为1.21×109copies/μL、1.21×108copies/μL、1.21×107copies/μL、1.21×106copies/μL、1.21×105copies/μL、1.21×104copies/μL、1.21×103copies/μL、1.21×102copies/μL、阴性对照。
图2是实验例的步骤S4中得到的p-TGEV的扩增曲线图，其中曲线1～9依次表示浓度为1.21×109copies/μL、1.21×108copies/μL、1.21×107copies/μL、1.21×106copies/μL、1.21×105copies/μL、1.21×104copies/μL、1.21×103copies/μL、1.21×102copies/μL、阴性对照。
图3是实验例的步骤S4中得到的p-PDCoV的扩增曲线图，其中曲线1～9依次表示浓度为1.21×109copies/μL、1.21×108copies/μL、1.21×107copies/μL、1.21×106copies/μL、1.21×105copies/μL、1.21×104copies/μL、1.21×103copies/μL、1.21×102copies/μL、阴性对照。
图4是实验例的步骤S4中得到的p-SADS-CoV的扩增曲线图，其中曲线1～9依次表示浓度为1.21×109copies/μL、1.21×108copies/μL、1.21×107copies/μL、1.21×106copies/μL、1.21×105copies/μL、1.21×104copies/μL、1.21×103copies/μL、1.21×102copies/μL、阴性对照。
图5是实验例的步骤S4中得到的标准曲线图，其中曲线1～4依次表示p-PEDV、p-TGEV、p-PDCoV和p-SADS-CoV。
图6是实验例的S5步骤中检测不同病毒得到的扩增曲线图，其中曲线1、2、3、4依次表示p-PEDV、p-TGEV、p-PDCoV和p-SADS-CoV；曲线5、6、7、8依次表示PEDV、SADS-CoV、PDCoV和TGEV 阳性样本的荧光曲线；曲线9～16依次表示ASFV、FMDV、CSFV、PRRSV、PRV、PoRV、PCV1和PCV2；曲线17为无核酸酶水的阴性对照（WTC）。
图7是实验例的S6步骤中得到的p-PEDV的扩增曲线图，其中曲线1～10依次表示浓度为1.21×109copies/μL、1.21×108copies/μL、1.21×107copies/μL、1.21×106copies/μL、1.21×105copies/μL、1.21×104copies/μL、1.21×103copies/μL、1.21×102copies/μL、1.21×101copies/μL、1.21×100copies/μL。
图8是实验例的S6步骤中得到的p-TGEV的扩增曲线图，其中曲线1～10依次表示浓度为1.21×109copies/μL、1.21×108copies/μL、1.21×107copies/μL、1.21×106copies/μL、1.21×105copies/μL、1.21×104copies/μL、1.21×103copies/μL、1.21×102copies/μL、1.21×101copies/μL、1.21×100copies/μL。
图9是实验例的S6步骤中得到的p-PDCoV的扩增曲线图，其中曲线1～10依次表示浓度为1.21×109copies/μL、1.21×108copies/μL、1.21×107copies/μL、1.21×106copies/μL、1.21×105copies/μL、1.21×104copies/μL、1.21×103copies/μL、1.21×102copies/μL、1.21×101copies/μL、1.21×100copies/μL。
图10是实验例的S6步骤中得到的p-SADS-CoV的扩增曲线图，其中曲线1～10依次表示浓度为1.21×109copies/μL、1.21×108copies/μL、1.21×107copies/μL、1.21×106copies/μL、1.21×105copies/μL、1.21×104copies/μL、1.21×103copies/μL、1.21×102copies/μL、1.21×101copies/μL、1.21×100copies/μL。
图11是实验例的S8步骤中得到的临床样品检测试验结果。
实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。下列实施例中未注明的具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：一种猪肠道冠状病毒的多重RT-qPCR试剂盒，其包括以下引物和探针：
引物F1的序列如序列表SEQ ID NO.1所示为CTGGAATGAGCAAATTCGCTG；
引物R1的序列如序列表SEQ ID NO.2所示为CAACCCAGAAAACACCCTCAG；
探针A的序列如序列表SEQ ID NO.3所示为
JOE-AGCGAATTGAACAACCTTCCAATTGGCA-BHQ1；
引物F2的序列如序列表SEQ ID NO.4所示为GCAATTCTTTGCGTTAGTGCAT；
引物R2的序列如序列表SEQ ID NO.5所示为AGCGTACAAATTCCCTGAAAGC；
探针B的序列如序列表SEQ ID NO.6所示为
Texas Red-CTTCCTCTCGAAGGTGTGCCAACTGG-BHQ2；
引物F3的序列如序列表SEQ ID NO.7所示为ATCGACCACATGGCTCCAA；
引物R3的序列如序列表SEQ ID NO.8所示为CAGCTCTTGCCCATGTAGCTT；
探针C的序列如序列表SEQ ID NO.9所示为
FAM-CACACCAGTCGTTAAGCATGGCAAGCT-BHQ1；
引物F4的序列如序列表SEQ ID NO.10所示为TACTGGTCCTCACGCAGATG；
引物R4的序列如序列表SEQ ID NO.11所示为ACGATTGCGAACACCAAGAC；
探针D的序列如序列表SEQ ID NO.12所示为
Cy5-CAACAGCGACCCAATGCACACCCT-BHQ3。
一种猪肠道冠状病毒的多重RT-qPCR检测方法，用于非疾病诊断和治疗目的，其包括以下步骤：
（1）样品处理：采用RNA提取试剂盒对待测样品提取得到总RNA；所述待测样品包括猪肠道组织样品、猪的粪便、猪的肛门拭子样品中的任意一种或多种；
当所述待测样品为猪肠道组织样品时，将采集的猪肠道组织样品加入搅拌器中，接着加入pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液（PBS）搅拌均匀得到混合物，再取所述混合物加入小钢珠摇动5分钟得到均质化的样品，然后将均质化的样品反复冻融3次，接着在4℃下以10000×g的条件离心10分钟，然后取上清液进行总RNA的提取；
当所述待测样品为猪的粪便或猪的肛门拭子样品时，将猪的粪便或猪的肛门拭子样品加入至pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液（PBS）中，然后使用涡旋振荡器震荡混匀30秒，接着反复冻融3次，接着在4℃ 下以10000×g的条件离心10分钟，然后取上清液进行总RNA的提取；
（2）扩增反应液配制：将步骤（1）中得到的总RNA作为模板进行RT-qPCR扩增反应，采用如序列表SEQ ID NO.1～NO.12所示的引物和探针配制扩增反应液，所述扩增反应液总体积为20μL，其包括：10µL的2× One-Step RT-PCR Buffer III(TaKaRa)，0.4µL的Ex TaqHS (5 U/μL) (TaKaRa)，0.4µL的PrimeScript RT Enzyme Mix II (TaKaRa)，2µL的模板，引物F1和引物R1各0.2µL，0.3μL的探针A，引物F2和引物R2各0.3µL，0.3μL的探针B，引物F3和引物R3各0.2µL，0.2μL的探针C，引物F4和引物R4各0.3µL，0.3μL的探针D，余量为无核酸酶水；所述的引物F1、引物R1、探针A、引物F2、引物R2、探针B、引物F3、引物R3、探针C、引物F4、引物R4和探针D的浓度均为20 pmol/μL；
（3）RT-qPCR扩增：将步骤（2）中配制得到的扩增反应液在荧光定量PCR仪中依次进行如下扩增反应程序：
Step1：42℃反转录5min；
Step2：95℃预变性10s；
Step3：95℃变性5s，57℃退火30s，共进行40个循环，同时收集荧光信号；
（4）结果检测：通过荧光定量PCR仪自带软件绘制扩增曲线并读取相应的Ct值并进行结果判定，当所得到的Ct值小于等于36个周期时，判定为阳性，当Ct值大于36个周期时，判定为阴性。
实验例：对实施例1中所述的猪肠道冠状病毒的多重RT-qPCR试剂盒及检测方法进行特异性、敏感性和重复性的试验分析，具体试验分析过程如下：
S1、实验用各种病毒的总核酸提取及反转录：分别取PEDV（CV777株）、TGEV（H株）、PoRV（NX株）、FMDV（O株）、CSFV（C株）、PRRSV（TJM-F92株）、PRV（Bartha-K61）和PCV2（SX07株）的病毒液各200 µL以及PDCoV、ASFV、PCV1、SADS-COV的临床阳性样品混悬液上清液各200 µL，采用Ex-RNA/RNA病毒核酸提取试剂盒提取总RNA/DNA，并使用FastKing cDNA第一链合成试剂盒将PEDV、TGEV和PDCoV的总RNA反转录成cDNA，将提取的RNA和经过反转录后所得到的cDNA置于-80℃下保存备用。
S2、标准质粒的制备：分别以步骤S1中得到的PEDV、TGEV和PDCoV 的cDNA以及含有SADS-CoV 总RNA作为模板，采用实施例1所述扩增反应进行扩增；
回收扩增产物，将纯化的扩增产物克隆至pMD18-T 载体中，转化到DH5α感受态细胞，阳性克隆体在37℃下培养18～20h，使用MiniBEST Plasmid Extraction Kit Ver.5.0提取质粒后进行酶切（
Hind III +
EcoR I 酶切）、PCR和测序鉴定；正确构建重组质粒后，将它们作为阳性标准品，并且分别命名为p-PEDV、p-TGEV、p-PDCoV和p-SADS-CoV标准质粒，用核酸蛋白分析仪测定质粒OD260 nm值，计算质粒浓度并换算成拷贝数（copies/μL），p-PEDV、p-TGEV、p-PDCoV和p-SADS-CoV标准质粒的初始浓度分别为3.53×1010copies/μL、1.34×1010copies/μL、2.13×1010copies/μL和 1.21×1010copies/μL。
S3、RT-qPCR扩增反应的引物和探针浓度优化：初步设定扩增反应参数为：42℃反转录5 min , 95℃变性10 s，95℃变性5 s，58℃退火30 s，40个循环；为了确定RT-qPCR的最佳反应条件，固定扩增反应体系中以下组分用量：10µL的2× One-Step RT-PCR BufferIII(TaKaRa)，0.4µL的Ex Taq HS (5 U/μL) (TaKaRa)，0.4µL的PrimeScript RT EnzymeMix II (TaKaRa)，2µL的四种标准质粒的混合物，4对不同终浓度的引物和相应的探针，余量为无核酸酶水；所述标准质粒为步骤S2中得到的p-PEDV、p-TGEV、p-PDCoV和p-SADS-CoV；
依次选定不同的退火温度（56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃）、不同的引物浓度（0.1 pmol/μL、0.2 pmol/μL、0.3 pmol/μL、0.4 pmol/μL、0.5 pmol/ μL）和探针浓度（0.1pmol/μL、0.2 pmol/μL、0.3 pmol/μL、0.4 pmol/μL、0.5 pmol/μL）通过排列组合试验进行扩增，确定得到实施例1中所述的扩增反应液和扩增反应程序。
S4、标准质粒的标准曲线绘制：将步骤S2中所得到的p-PEDV、p-TGEV、p-PDCoV和p-SADS-CoV标准质粒等体积混合，然后配制成溶液，所述溶液中四种标准制粒的浓度均为1.21×109copies/μL的溶液，然后连续稀释10倍依次得到四种标准制粒的浓度为1.21×108copies/μL、1.21×107copies/μL、1.21×106copies/μL、1.21×105copies/μL、1.21×104copies/μL、1.21×103copies/μL、1.21×102copies/μL的溶液，将上述溶液作为模板，按照实施例1中所述方法进行扩增，得到四种标准质粒的扩增曲线（参见图1～4）和并绘制标准曲线（参见图5），其中p-PEDV对应的标准曲线为y=-3.130x+40.803，R2=0.999；p-TGEV对应的标准曲线为y=-3.148x+41.509，R2=0.999；p-PDCoV对应的标准曲线为y=-3.189x+40.821，R2=0.999；p-SADS-CoV对应的标准曲线为y=-3.100x+40.184，R2=0.999。
S5、特异性试验：取步骤S1中得到的总RNA以及步骤S2中得到的四种标准质粒，各取2μL作为模板，并且以无菌蒸馏水（NTC）和无核酸酶水（WTC）为阴性对照，按照实施例1中所述方法进行检测，结果见图6。
结果显示，仅有PEDV、TGEV、PDCoV和SADS-CoV阳性样本以及四种标准质粒的样本显示出阳性扩增曲线，而其他样本没有显示出扩增曲线，表明本发明的检测方法与其它病毒没有交叉反应，可以检测PEDV N基因、TGEV M基因、PDCoV M基因和SADS-CoV N基因，具有较强的特异性，能准确地区分四种猪肠道冠状病毒。
S6、敏感性试验：将步骤S2中所得到的p-PEDV、p-TGEV、p-PDCoV和p-SADS-CoV标准质粒等体积混合，然后配制成溶液，所述溶液中四种标准质粒的浓度均为1.21×109copies/μL的溶液，然后连续稀释10倍依次得到四种标准质粒的浓度为1.21×108copies/μL、1.21×107copies/μL、1.21×106copies/μL、1.21×105copies/μL、1.21×104copies/μL、1.21×103copies/μL、1.21×102copies/μL、1.21×101copies/μL、1.21×100copies/μL的溶液，将上述溶液作为模板，按照实施例1中所述方法进行扩增，得到四种标准质粒的扩增曲线（参见图7～10）。
结果显示，四种标准质粒的RT-qPCR的检测下限均为为1.21×102copies/μL，说明本发明方法具有较高的敏感度。
S7、重复性试验：将步骤S2中所得到的p-PEDV、p-TGEV、p-PDCoV和p-SADS-CoV标准质粒等体积混合，然后配制成溶液，所述溶液中四种标准质粒的浓度均为1.21×109copies/μL的溶液，然后连续稀释依次得到四种标准质粒的浓度为1.21×107copies/μL、1.21×105copies/μL的溶液，将上述三种浓度的溶液作为模板，按照实施例1中所述方法进行扩增，得到四种标准质粒的扩增曲线，而且组内及组间重复性试验各进行3次，具体结果见表1。
结果显示，组内和组间的变异系数CV均小于2%，说明本发明方法具有良好的重复性。
表1 重复性试验数据
S8、临床样品检测试验：在2020年10月到2022年10月期间，在广西采集临床样本3236份，临床样本包括包括猪肠道组织样品、猪的粪便和肛门拭子样品；
将采集猪的肠道组织样品加入搅拌器中，接着加入pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液（PBS）搅拌均匀得到混合物，再取所述混合物加入小钢珠摇动5分钟得到均质化的样品，然后将均质化的样品反复冻融3次，接着在4℃ 下以10000×g 离心10分钟，然后取上清液按照实施例1中所述方法提取总RNA；
将猪的粪便、肛门拭子样品在试管中用1.0 mL PBS（pH 7.2）稀释，涡旋30秒，并在4℃下以10000×g 离心10分钟，然后取上清液按照实施例1中所述方法提取总RNA；
同时以无菌蒸馏水为阴性对照，按照实施例1所述方法进行检测，具体结果参见图11。
根据图11数据可知，在3236份样本中有591份呈PEDV阳性，阳性率为18.26%；有15份呈TGEV阳性，阳性率为0.46%；有426份呈PDCoV阳性，阳性率为13.16%；有5份呈SADS-CoV阳性，阳性率为0.15%；有2份呈PDCoV和TGEV混合阳性，阳性率为0.06%；有46份呈PEDV和PDCoV混合阳性，阳性率为1.42%。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (5)
1.一种猪肠道冠状病毒的多重RT-qPCR试剂盒，其特征在于：包括以下引物和探针：
引物F1的序列如序列表SEQ ID NO.1所示为CTGGAATGAGCAAATTCGCTG；
引物R1的序列如序列表SEQ ID NO.2所示为CAACCCAGAAAACACCCTCAG；
探针A的序列如序列表SEQ ID NO.3所示为
JOE-AGCGAATTGAACAACCTTCCAATTGGCA-BHQ1；
引物F2的序列如序列表SEQ ID NO.4所示为GCAATTCTTTGCGTTAGTGCAT；
引物R2的序列如序列表SEQ ID NO.5所示为AGCGTACAAATTCCCTGAAAGC；
探针B的序列如序列表SEQ ID NO.6所示为
Texas Red-CTTCCTCTCGAAGGTGTGCCAACTGG-BHQ2；
引物F3的序列如序列表SEQ ID NO.7所示为ATCGACCACATGGCTCCAA；
引物R3的序列如序列表SEQ ID NO.8所示为CAGCTCTTGCCCATGTAGCTT；
探针C的序列如序列表SEQ ID NO.9所示为
FAM-CACACCAGTCGTTAAGCATGGCAAGCT-BHQ1；
引物F4的序列如序列表SEQ ID NO.10所示为TACTGGTCCTCACGCAGATG；
引物R4的序列如序列表SEQ ID NO.11所示为ACGATTGCGAACACCAAGAC；
探针D的序列如序列表SEQ ID NO.12所示为
Cy5-CAACAGCGACCCAATGCACACCCT-BHQ3。
2.一种猪肠道冠状病毒的多重RT-qPCR检测方法，用于非疾病诊断和治疗目的，其特征在于：包括以下步骤：
（1）样品处理：采用RNA提取试剂盒对待测样品提取得到总RNA；所述待测样品包括猪肠道组织样品、猪的粪便、猪的肛门拭子样品中的任意一种或多种；
（2）扩增反应液配制：将步骤（1）中得到的总RNA作为模板进行RT-qPCR扩增反应，采用如序列表SEQ ID NO.1～NO.12所示的引物和探针配制扩增反应液，所述扩增反应液总体积为20μL，其包括：10µL的2× One-Step RT-PCR Buffer III，0.4µL的Ex Taq HS，0.4µL的PrimeScript RT Enzyme Mix II ，2µL的模板，引物F1和引物R1各0.2µL，0.3μL的探针A，引物F2和引物R2各0.3µL，0.3μL的探针B，引物F3和引物R3各0.2µL，0.2μL的探针C，引物F4和引物R4各0.3µL，0.3μL的探针D，余量为无核酸酶水；
（3）RT-qPCR扩增：将步骤（2）中配制得到的扩增反应液在荧光定量PCR仪中依次进行如下扩增反应程序：
Step1：42℃反转录5min；
Step2：95℃预变性10s；
Step3：95℃变性5s，57℃退火30s，共进行40个循环，同时收集荧光信号；
（4）结果检测：通过荧光定量PCR仪自带软件绘制扩增曲线并读取相应的Ct值并进行结果判定。
3. 根据权利要求2所述的猪肠道冠状病毒的多重RT-qPCR检测方法，其特征在于：在步骤（1）中，将采集的猪肠道组织样品加入搅拌器中，接着加入pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液搅拌均匀得到混合物，再取所述混合物加入小钢珠摇动5分钟得到均质化的样品，然后将均质化的样品反复冻融3次，接着在4℃下以10000×g的条件离心10分钟，然后取上清液进行总RNA的提取；当所述待测样品为猪的粪便或猪的肛门拭子样品时，将猪的粪便或猪的肛门拭子样品加入至pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液中，然后使用涡旋振荡器震荡混匀30秒，接着反复冻融3次，接着在4℃ 下以10000×g的条件离心10分钟，然后取上清液进行总RNA的提取。
4. 根据权利要求2所述的猪肠道冠状病毒的多重RT-qPCR检测方法，其特征在于：步骤（2）中，所述的引物F1、引物R1、探针A、引物F2、引物R2、探针B、引物F3、引物R3、探针C、引物F4、引物R4和探针D的浓度均为20 pmol/μL。
5.根据权利要求2所述的猪肠道冠状病毒的多重RT-qPCR检测方法，其特征在于：在步骤（4）中，当所得到的Ct值小于等于36个周期时，判定为阳性，当Ct值大于36个周期时，判定为阴性。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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