CN116837143A - 一种检测神经型牛星状病毒的引物探针组 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种检测神经型牛星状病毒的引物探针组，包括样品核酸1.8‑2.5μL、阳性标准品1.8‑2.5μL、阴性标准品1.8‑2.5μL、引物探针混合物4‑5μL、2X One Step RT‑qPCR Buffer(Probe)8‑12μL、浓度为5U/μl的Pro Taq HS DNA Polymerase 0.3‑0.5μL、Evo M‑MLV RTase Enzyme Mix 0.3‑0.5μL。综上，本发明通过牛星状病毒的ORF1ab基因的高度保守序列，设计得到引物对BAstV‑F、BAstV‑R及探针BAstV‑P，对神经型牛星状病毒引起的脑炎和脑膜炎疾病进行诊断，可以检测到病原体的核酸分子，敏感性和特异性都比较高，对BAstV感染引起脑炎和脑膜炎的研究提供理论参考。

Description

一种检测神经型牛星状病毒的引物探针组
技术领域
本发明涉及引物探针组技术领域，尤其涉及一种检测神经型牛星状病毒的引物探针组。
背景技术
牛星状病毒(BAstV)是单股正链RNA病毒，其结构在电镜下显示呈五角或者六角的总状结构，其基因组拥有3个连续的开放阅读框(ORF)，从5′端到3′端依次是ORF1a、ORF1b和ORF2。ORF1a和ORF1b都是编码病毒的非结构蛋白，而ORF2是编码病毒的唯一衣壳结构蛋白，是区分病毒基因型的主要依据。
感染BAstV会引起犊牛腹泻，且常与其它腹泻病原共感染，增加疾病的严重性。近年来也发现BAstV感染可引起牛发生脑炎和脑膜炎，主要表现为神经元变性和坏死、胶质增生，出现神经性疾病。尽管牛星状病毒是最早被发现和研究的哺乳动物星状病毒之一，但对于BAstV感染引起脑炎和脑膜炎的研究并不够充分。
聚合酶链式反应技术已广泛应用于各种的诊断检测，然而传统PCR需要在产物正常扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳的方式对产物染色、拍照，通过得到的条带亮度对PCR产物的量、片段长度进行分析，操作繁琐，且灵敏度相对较低。
公开号为CN 113388632 B的专利中，公开了一种牛星状病毒ELISA抗体检测的引物、试剂盒及应用，但是该技术的检测方式是ELISA，用于检测血清。
论文：牛星状病毒EvaGreen实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用.中国兽医学报,2021,1,41(1).公开了牛星状病毒EvaGreen的PCR检测方法，检出的最低拷贝数为13.6拷贝/μL，灵敏度非常高；但是该技术针对的是牛腹泻相关的星状病毒，且使用的是染料法，因此，该方法对于引起脑炎和脑膜炎的牛星状病毒，并没有借鉴价值。
论文：Detection of a Novel Bovine Astrovirus in a Cow withEncephalitis.Transboundary and Emerging Diseases.Received for publicationDecember 18,2015。公开了通过牛星状病毒的ORF2基因设计得到针对牛星状病毒的ORF2基因的引物对及探针，针对的是引起脑炎和脑膜炎的牛星状病毒，但是，该技术并没有对引物对及探针的性能进行相关验证，因此，其设计的引物对及探针的效果不得而知。
论文：牛星状病毒神经型与肠道型ORF2蛋白原核表达及间接ELISA的建立与初步应用.中国兽医学报,2022,7,42,(7)。公开了牛星状病毒神经型的检测方法，但是其使用的是血清学诊断方法，通过检测动物对抗病原体的免疫反应进行诊断，其结果受到多种因素的影响，包括感染时间、免疫状态等因素，敏感性和特异性相对较低；且血清学诊断方法对于早期诊断和控制传染病的方面效果不理想，当新型病原体出现时，血清学诊断需要更多的时间和研究来开发相应的检测方法，另外，血清学诊断方法无法提供病原体的数量，无法为临床提供更多的信息，其次，血清学诊断检测的成本较高，通过血清学诊断检测一个样本的成本为130-160元。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一种检测神经型牛星状病毒的引物探针组，通过牛星状病毒的ORF1ab基因(KX266905.1)的高度保守序列，设计得到引物对BAstV-F、BAstV-R及探针BAstV-P，对神经型牛星状病毒引起的脑炎和脑膜炎疾病进行诊断，可以检测到病原体的核酸分子，敏感性和特异性都比较高，对BAstV感染引起脑炎和脑膜炎的研究提供理论参考。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供了一种检测神经型牛星状病毒的引物探针组，包括样品核酸1.8-2.5μL、阳性标准品1.8-2.5μL、阴性标准品1.8-2.5μL、引物探针混合物4-5μL、2X One Step RT-qPCR Buffer(Probe)8-12μL、浓度为5U/μl的Pro Taq HSDNA Polymerase 0.3-0.5μL、EvoM-MLV RTase Enzyme Mix 0.3-0.5μL、DEPC水补足至20 -40μL。
优选的，上述引物探针混合物包括BAstV-F、BAstV-R和BAstV-Probe。
进一步优选的，BAstV-F为上游引物，且基因序列为GTCACTTTGTGGCTAGGG，其中BAstV-F的识别号为SEQ ID NO.1；BAstV-R为下游引物且基因序列为AGCCATAATCACGCTTTG，其中BAstV-R的识别号为SEQ ID NO.2。
进一步优选的，BAstV-Probe为探针且基因序列为TCCAACATCTCCTCGGTGACATAG，其中BAstV-Probe的识别号为SEQ ID NO.3。
进一步优选的，BAstV-F和BAstV-R一起扩增得到的目的基因的序列为：
ACGTTCGTCCTCGATGTTGAGCATGGCCTCCACAAAGCGATAGAGGTCAACCACATCCCGGACCACCAACCAACCATCCTCGCCGCCGCCCTGATGCACGACAGATCTGAGAA。其中，上述目的基因的识别号为SEQID NO.4。
进一步优选的，其中BAstV-Probe的5'端连接有6-FAM，3'端连接有BHQ1。
进一步优选的，BAstV-F、BAstV-R和BAstV-Probe的浓度均为8-12μM。BAstV-F的含量为1.8-2.3μL、BAstV-R的含量为1.8-2.3μL，BAstV-Probe的含量为0.4-0.6μL。
优选的，上述阳性标准品为pUC57/BAstV；阴性标准品为不含BAstV核酸的生理盐水。
上述阳性标准品的合成方法为：
将识别号为SEQ ID NO.4的目的基因序列，委托上海生物工程有限公司合成，并克隆至pUC57载体后测序鉴定，得到鉴定正确的重组载体pUC57/BAstV。pUC57/BAstV作为阳性标准品。
本发明的检测神经型牛星状病毒的引物探针组相对于现有技术的有益技术效果：
1、本发明提供的检测神经型牛星状病毒的引物探针组，通过参考GenBank中牛星状病毒的ORF1ab基因(KX266905.1)的高度保守序列设计得到针对牛星状病毒的ORF1a基因的引物对(BAstV-F/R)及探针(BAstV-P)。
2、通过本发明的引物探针组，对神经型牛星状病毒进行脑炎和脑膜炎的诊断，可以检测到病原体的核酸分子，敏感性和特异性都比较高，对BAstV感染引起脑炎和脑膜炎的研究提供理论参考。
3、通过本发明的引物探针组进行核酸诊断，可以在脑炎和脑膜炎感染后的较早阶段检测到病原体的核酸，即，在症状出现之前就能进行检测，对于早期诊断和控制传染病具有重要意义。
4、本发明的引物探针组是一种基于病原体的遗传物质进行检测的方法，当新型病原体出现时，核酸诊断可以相对较快地进行适应和检测，灵活性和适应性更高。
5、通过本发明的引物探针组进行核酸诊断，可以提供病原体的数量信息，通过检测核酸的浓度来评估感染的程度，可以为临床提供更多的信息。
6、通过本发明的引物探针组进行核酸诊断，检测一个样本的成本为30-50元，成本非常低。
7、通过MAGAX进行基因的比对分析，筛选ORF1ab基因的高度保守序列，其序列在遗传进化过程中基本保持不变，能够较好的维护检测方法的特异性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中的神经型牛星状病毒病毒检测敏感性分析图；
图2为本发明实施例2中的神经型牛星状病毒检测特异性分析图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
本发明的引物探针组的使用方法，包括如下步骤：
步骤一 于2022在广东省某地区的牛场采集样本，并由实验室收集并鉴定保存。
步骤二 将样本用PBS按1:10混悬，反复冻融3次后，漩涡振荡，在4℃、8000r/min的条件下离心5min，获得上清液，-80℃保存用于后续试验。
步骤三 以BAstV毒株的核酸为模板，使用上述引物进行PCR扩增。反应体系为20μL：包括样品核酸2μL、阳性标准品2μL、阴性标准品2μL、引物探针混合物4.5μL、2X One StepRT-qPCR Buffer(Probe)10μL、浓度为5U/μl的Pro Taq HSDNA Polymerase 0.4μL、Evo M-MLV RTase Enzyme Mix 0.4μL、DEPC水补足至20μL。反应程序为：反应程序为：42℃5min，95℃30s；95℃5s，60℃30s，45个循环，在每一循环退火结束时收集荧光信号。
步骤四 以重组质粒pUC57/BAstV为模板，按照qPCR试剂盒提供的反应体系，将退火温度设置为55、56、57、58、59、60、61、62℃，共8个温度梯度，对退火温度进行优化。确定退火温度后将引物探针体积设置为0.5、1.0、1.5、2.0，循环数设置为35、40、45，分别对引物浓度和循环数进行优化筛选。循环条件：反转录42℃5min；预变性95℃30s；94℃5s；60℃34s，共45个循环。
步骤五 将重组质粒依次进行10倍倍比稀释，得到3.05×108-3.05×10-1拷贝/μL等10个稀释度的标准品模板，按照步骤五中的优化反应条件进行扩增，绘制标准曲线。
通过荧光定量PCR仪自带软件读取相应的Ct值。具体成立条件和判定标准如表1所示(注：Ct值＞38，判定为可疑，若重复试验，扩增曲线有明显起峰判定为阳性，否则为阴性，“+”表示重复试验为阳性，“-”表示重复试验为阴性)。
表1成立条件和判定标准
实施例1灵敏度检测
将阳性标准品(pUC57/BAstV)进行10倍梯度稀释，稀释8个梯度，得到浓度在3.05×100-3.05×108copies/μL的阳性标准品溶液。以优化后的反应体系和反应程序对3.05×100-3.05×108copies/μL的阳性标准品溶液进行多重荧光RT-PCR反应，每个梯度设置8个重复，检测上述方法的灵敏度。
用超微量分光光度计测定重组质粒的浓度，计算拷贝数(拷贝数＝质粒浓度×10-9×6.02×1023/(660×质粒总长度))。以拷贝数衡量灵敏度，稀释倍数106的反应孔阳性率为100％(8/8)。结果如图1所示，在图1中：1-7质粒浓度为3.05×108-3.05×102copies/μL。
通过图1可以看出，上述方法对BAstV的最低检测限均为稀释倍数106，即浓度为305copies/μL。
实施例2特异性检测
用上述检测方法对牛病毒性腹泻病毒，口蹄疫病毒，牛冠状病毒，牛传染性鼻气管炎病毒的临床样品，无核酸酶水作为阴性对照及重组质粒pUC57/BAstV进行检测，结果如图2所示，在图2中：1为BAstV；2-6:BVDV、FMDV、BCV、IBRV及阴性对照。
通过图2可以看出，该方法仅对牛星状病毒有扩增，其他病原及阴性对照均无特异性扩增。
实施例3组内重复性检测
将阳性标准品(pUC57/BAstV)进行稀释，得到浓度分别为3.05×104、3.05×105、3.05×106copies/μL的阳性标准品溶液，以DEPC水作为阴性对照。以上述阳性标准品溶液和阴性对照作为检测对象，检测上述方法的组内和组间重复性试验。每个浓度重复3次。检测结果见表2.
表2：重复性检测结果
通过表2中数据可以看出，三个梯度的重复性十分良好，组内变异系数在0.90％-1.23％范围内,组间变异系数在0.63％-1.47％范围内。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种检测神经型牛星状病毒的引物探针组，其特征在于：包括样品核酸1.8-2.5μL、阳性标准品1.8-2.5μL、阴性标准品1.8-2.5μL、引物探针混合物4-5μL、2X One Step RT-qPCR Buffer 8-12μL、Pro Taq HSDNA Polymerase 0.3-0.5μL、Evo M-MLV RTase EnzymeMix 0.3-0.5μL；
所述引物探针混合物包括BAstV-F、BAstV-R和BAstV-Probe；
所述BAstV-F为上游引物，且基因序列为GTCACTTTGTGGCTAGGG；
所述BAstV-R为下游引物，且基因序列为AGCCATAATCACGCTTTG；
所述BAstV-Probe为探针，且基因序列为TCCAACATCTCCTCGGTGACATAG。
2.如权利要求1所述的检测神经型牛星状病毒的引物探针组，其特征在于：所述BAstV-F的识别号为SEQ ID NO.1；BAstV-R的识别号为SEQ ID NO.2；所述BAstV-Probe的识别号为SEQ ID NO.3。
3.如权利要求1所述的检测神经型牛星状病毒的引物探针组，其特征在于：所述BAstV-F和BAstV-R一起扩增得到的目的基因的序列为：
ACGTTCGTCCTCGATGTTGAGCATGGCCTCCACAAAGCGATAGAGGTC AACCACATCCCGGACCACCAACCAACCATCCTCGCCGCCGCCCTGATGCA CGACAGATCTGAGAA。
4.如权利要求3所述的检测神经型牛星状病毒的引物探针组，其特征在于：所述目的基因的识别号为SEQ ID NO.4。
5.如权利要求1所述的检测神经型牛星状病毒的引物探针组，其特征在于：所述BAstV-Probe的5'端连接有6-FAM，3'端连接有BHQ1。
6.如权利要求1所述的检测神经型牛星状病毒的引物探针组，其特征在于：所述BAstV-F、BAstV-R和BAstV-Probe的工作浓度均为8-12μM。
7.如权利要求6所述的检测神经型牛星状病毒的引物探针组，其特征在于：所述BAstV-F的含量为1.8-2.3μL、BAstV-R的含量为1.8-2.3μL，BAstV-Probe的含量为0.4-0.6μL。
8.如权利要求1所述的检测神经型牛星状病毒的引物探针组，其特征在于：所述阳性标准品为pUC57/BAstV；阴性标准品为不含BAstV核酸的生理盐水。
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