CN117344061B - 一种同时检测五种人源病毒ebv、hbv、hcv、hiv、hpv的方法、试剂盒、引物和探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，公开了一种同时检测五种人源病毒EBV、HBV、HCV、HIV、HPV的方法、试剂盒、引物和探针及其应用；通过优化五种人源病毒的特异性引物、特异性探针和qPCR程序，使其在混合检测中不会相互影响，可以达到单一病毒检测的效果。阳性对照采用分别包含五种人源病毒EBV、HBV、HCV、HIV和HPV的扩增靶序列的质粒，浓度为1×102 copy，能够同时实现较高的检测灵敏度和对病毒的定量。采用本申请的方法能够混合同时检测五种人源病毒，最低检测限度为1copy，检测完成只需要2h，节约了检测过程所需的成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种同时检测五种人源病毒EBV、HBV、HCV、HIV、HPV的方法、试剂盒、引物和探针及其应用。
背景技术
本节中的陈述仅提供与本申请公开相关的背景信息，并且可能不构成现有技术。
干细胞临床研究管理办法（试行）中规定了干细胞制剂的质量控制对干细胞供者的要求，每一干细胞制剂都须具有包括供者信息在内的、明确的细胞制备及生物学性状信息。作为细胞制备信息中的重要内容之一，需提供干细胞的获取方式和途径以及相关的临床资料，包括供者的一般信息、既往病史、家族史等。既往史和家族史要对遗传病（单基因和多基因疾病，包括心血管疾病和肿瘤等）相关信息进行详细采集。对用于异体干细胞临床研究的供者，必须经过检验筛选证明无人源特定病毒（包括HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV等）的感染，无梅毒螺旋体感染。
HIV直接侵犯人体的免疫系统，破坏人体的细胞免疫和体液免疫。HIV是一种攻击人体免疫系统的逆转录RNA病毒，通过破坏CD4 T淋巴细胞，使人体失去免疫功能，从而易于感染各种疾病并导致死亡。HIV核酸检测可用于检测HIV病毒是否存在。
乙型病毒性肝炎（Viral Hepatitis Type B，简称乙肝）系由乙肝病毒（HBV）引起，乙肝通过血液与体液传播，具有慢性携带状态。因其可能通过性生活传播，国际上将其列入性传播疾病。乙型病毒性肝炎在中国流行广泛，人群感染率高，在某些地区感染率达35%以上。乙型肝炎与肺结核和艾滋病并列世界上最常见的传染病。HBV研究及其临床应用的一个主要限制是缺乏标准化的基于PCR的方法，但由于病毒复制中间体（RI）的共检测，可能会出现不准确的定量，而定量PCR（qPCR）没有这样的限制。
丙型肝炎由丙型肝炎病毒感染所致，主要由血液、体液传播。据世界卫生组织估计，全球有1.7亿人感染HCV。在我国健康人群抗HCV阳性率为0.7%~3.1%，约3800万人。由于病毒生物学特点和宿主免疫功能等多方面因素，机体免疫往往难以有效清除病毒，致使约50%~80%HCV感染者发展为慢性肝炎，其中20%~30%将发展成肝硬化。肝硬化患者中每年有1%~4%发展成为肝细胞癌症。
人类乳头瘤病毒（Human Papilloma Virus，简称HPV）是一种嗜上皮性病毒，有高度的特异性，长期以来，已知HPV可引起人类良性的肿瘤和疣，如生长在生殖器官附近皮肤和粘膜上的人类寻常疣、尖锐湿疣以及生长在粘膜上的乳头状瘤。像乙肝病毒一样，HPV也是一种DNA病毒。
Epstein-Barr病毒（EBV）为疱疹病毒科嗜淋巴细胞病毒属的成员。它在世界各地都有分布，为95%以上的成人所携带。EBV是传染性单核细胞增多症的病原体，更为重要的是，EBV与鼻咽癌、儿童淋巴瘤的发生有密切相关性，被列为可能致癌的人类肿瘤病毒之一。
实时荧光定量PCR技术使用的荧光化学方法主要包括双链DNA结合荧光染料发光法和探针法（如TaqMan探针）。双链DNA结合荧光染料发光法主要包括SYBR I染料法和近年兴起的更为敏感的EvaGreen染料法。虽然成本低廉，但是，双链DNA结合荧光染料发光法具有一个显著的缺点，即其特异性非常容易受到非特异性基因扩增和引物二聚体形成的影响，这使得双链DNA结合荧光染料qPCR方法一直无法能够有效地应用于临床检测。探针法qPCR可以有效地解决双链DNA结合荧光染料qPCR非特异性问题，但其最主要的缺点就是探针设计成本太高，无法广泛地应用到像HIV、HBV、HCV、HPV、EBV等病毒快速筛查和检测中去。
因此，亟须一种能够应用于快速检测且成本非常低的检测方法。
研究表明，几种类型的细胞，包括记忆性CD4 T细胞、树突状细胞、髓细胞、上皮细胞、小胶质细胞，甚至HSC，已被鉴定为携带前病毒的HIV宿主。自从引入联合抗逆转录病毒疗法（ART）来抑制病毒复制和疾病进展以来，HIV潜伏期是一个已被认识到的主要问题，接受ART治疗的潜在HIV感染患者可能含有低至一个拷贝的前病毒，该病毒被整合到宿主细胞的基因组中。然而，由于这些研究使用了定性方法，无法获得病毒载量的数据，使得实验结果不具有可靠性。
发明内容
本发明的目的在于：针对目前的检测方法检测成本高，特异性差的问题，提供了一种同时检测五种人源病毒EBV、HBV、HCV、HIV、HPV的方法、试剂盒、引物和探针及其应用，解决了单独检测操作繁琐、耗时长的问题，实现了同时且准确地获得五种人源病毒的检测结果，提升效率。
本发明的技术方案如下：
一种同时检测五种人源病毒EBV、HBV、HCV、HIV、HPV的方法，包括如下步骤：
（1）提取样本中的DNA；
（2）构建标准曲线：使用特异性扩增五种人源病毒DNA的引物和探针组合对五种人源病毒的不同给定浓度的DNA标准品进行qPCR检测，并用检测结果制作标准曲线，拟合线性方程；
（3）样品DNA检测：对样本DNA进行qPCR检测，并根据检测数据判断检测结果；
其中，检测结果的判定方式：
阳性条件为：检测通道Ct值≤29，且曲线为S形；
阴性条件为：检测结果无Ct值，或Ct值>30；
试验有效的条件：阳性对照扩增曲线为S形，且Ct值≤29；阴性对照无Ct值，且无明显的扩增曲线；
其中，引物的序列如SEQ ID No.1- SEQ ID No.10所示，探针序列如SEQ IDNo.11- SEQ ID No.15所示。
优选地，所述检测方法能够应用于除诊断和治疗之外的领域中，如可以用于确定生物制品，例如细胞是否受到五种人源病毒污染。
根据一种优选的实施方式，反应体系包括：9.25μLTaq酶、1μL五种人源病毒混合引物、0.4μL五种人源病毒混合探针、34.35μL无DNase/RNase水、4μL待测样本。
根据一种优选的实施方式，扩增程序为：95℃反应2min，然后95℃，30sec、52℃反应1min和72℃反应30sec、经40次循环扩增模板DNA，最后72℃延伸反应2min。
根据一种优选的实施方式，所述阳性对照为分别包含五种人源病毒EBV、HBV、HCV、HIV和HPV的扩增靶序列的质粒，与真实病毒更加相似。
根据一种优选的实施方式，所述阳性对照的质粒浓度为1×102copy，线性好，不容易形成二聚体。
本申请还提供一种同时检测五种人源病毒EBV、HBV、HCV、HIV、HPV的试剂盒，包括Taq酶、五种人源病毒混合引物、五种人源病毒混合探针、无DNase/RNase水、阳性对照和阴性对照；
其中，五种人源病毒混合引物的序列如SEQ ID No.1- SEQ ID No.10所示，五种人源病毒混合探针如SEQ ID No.11- SEQ ID No.15所示。
根据一种优选的实施方式，所述阳性对照为分别包含五种人源病毒EBV、HBV、HCV、HIV和HPV的扩增靶序列的质粒，所述阳性对照的质粒浓度为1×102copy。
本申请还提供如前所述的一种同时检测五种人源病毒EBV、HBV、HCV、HIV、HPV的试剂盒在检测EBV、HBV、HCV、HIV和HPV中的一种或多种中的应用。
本申请还提供一种同时检测五种人源病毒EBV、HBV、HCV、HIV、HPV中的一个或多个的引物和探针组，引物序列如SEQ ID No.1- SEQ ID No.10所示；探针序列如SEQ IDNo.11- SEQ ID No.15所示。能够应用于非疾病的诊断和治疗领域中。
本申请还提供一种同时检测五种人源病毒EBV、HBV、HCV、HIV、HPV中的一个或多个的阳性对照，所述阳性对照为分别带有如SEQ ID No.16- SEQ ID No.20所示的EBV、HBV、HCV、HIV、HPV扩增靶序列的质粒。
以五种人源病毒基因组高度保守的基因为靶序列设计并合成的质粒既可以准确反映体系中的五种人源病毒的拷贝数，又与实际样本中提到的人源病毒DNA类似，可以准确反映本发明的检测灵敏度。
本申请还提供带有如SEQ ID No.16- SEQ ID No.20所示的其中一个或多个靶序列的质粒及其在检测EBV、HBV、HCV、HIV和HPV中的一种或多种中的应用。
与现有的技术相比本发明的有益效果是：
1、一种同时检测五种人源病毒EBV、HBV、HCV、HIV、HPV的方法、试剂盒、引物和探针及其应用，本发明设计的引物、探针和优化的引物、探针浓度使得其对五种人源病毒DNA混合检测时的检测特异性无负面影响。采用本发明混合检测方法，降低了引物浓度，解决了DNA结合荧光染料qPCR用于五种人源病毒存在的非特异信号扩增和二聚体形成等问题，不会影响五种人源病毒混合检测结果的准确性；
2、一种同时检测五种人源病毒EBV、HBV、HCV、HIV、HPV的方法、试剂盒、引物和探针及其应用，定量检测五种病毒DNA的方法是阐明五种病毒在流行病学和临床中作用的可靠工具，本发明的五种病毒检测技术可以在2h内高效地检出五种病毒的载量；
3、一种同时检测五种人源病毒EBV、HBV、HCV、HIV、HPV的方法、试剂盒、引物和探针及其应用，本发明优化五种人源病毒qPCR检测条件使得其对五种人源病毒DNA检测特异性无负面影响。采用本发明混合检测方法，统一了检测五种人源病毒的Tm值为52℃，简化了程序设置，使得操作更便捷，不会影响检测的灵敏度，最低检测限度为1copy。
4、一种同时检测五种人源病毒EBV、HBV、HCV、HIV、HPV的方法、试剂盒、引物和探针及其应用，本发明优化的qPCR检测反应体系使得其对五种人源病毒DNA检测特异性无负面影响。采用本发明的混合检测方法，与单一人源病毒检测相比，五种人源病毒混合检测适用范围更广，检测种类更多，满足细胞建库检测需求，操作更简洁高效，降低Taq DNA 聚合酶的用量，不会影响五种人源病毒混合检测结果的准确性，降低了成本。
5、一种同时检测五种人源病毒EBV、HBV、HCV、HIV、HPV的方法、试剂盒、引物和探针及其应用，本发明对环境及操作的要求相对常规qPCR较低，在各种常见轻微污染的情况下，仍然可以准确检测出目标五种人源病毒。
6、一种同时检测五种人源病毒EBV、HBV、HCV、HIV、HPV的方法、试剂盒、引物和探针及其应用，本发明适用于同时检测五种人源病毒，并为判断其是否处于激活状态提供指标；并可以广泛地检测全血、血浆、唾液或其它疑似五种人源病毒感染的组织中的病毒。
7、本发明不仅制备过程简单、耗时少，而且对待测样本的处理也方便，检测的灵敏性高、准确度好。本发明的引物、探针和检测方法可以在五种人源病毒检验中发挥重要作用。
附图说明
图1是HIV病毒DNA标准品阴性和阳性对照验证扩增曲线图；
图2是HBV病毒DNA标准品阴性和阳性对照验证扩增曲线图；
图3是HCV病毒DNA标准品阴性和阳性对照验证扩增曲线图；
图4是HPV病毒DNA标准品阴性和阳性对照验证扩增曲线图；
图5是EBV病毒DNA标准品阴性和阳性对照验证扩增曲线图；
图6是HIV病毒DNA标准品扩增曲线图及标准曲线图；
图7是HBV病毒DNA标准品扩增曲线图及标准曲线图；
图8是HCV病毒DNA标准品扩增曲线图及标准曲线图；
图9是HPV病毒DNA标准品扩增曲线图及标准曲线图；
图10是EBV病毒DNA标准品扩增曲线图及标准曲线图；
图11是5种人源病毒混合检测中HIV病毒DNA标准品扩增曲线图；
图12是5种人源病毒混合检测中HBV病毒DNA标准品扩增曲线图；
图13是5种人源病毒混合检测中HCV病毒DNA标准品扩增曲线图；
图14是5种人源病毒混合检测中HPV病毒DNA标准品扩增曲线图；
图15是5种人源病毒混合检测中EBV病毒DNA标准品扩增曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的特征和性能作进一步地详细描述。若未特别指明，本发明实施例中所用的实验试剂和材料等均可市售获得。
若未具体指明，本发明实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
如无特别说明，下述实施例中的PCR实验方法均为TaqMan qPCR方法，提及的序列均以从5’端到3’端的方式表示。
实施例1
以下实施例中的实验材料和试剂：
1.实验材料
五种人源病毒DNA靶序列、引物和探针、pMD19-T阳性质粒。
DNA靶序列的信息如下表所示：
2.酶类及其它生化试剂
TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶试剂盒（Code No.RR001A），DEPC H2O，SPARKeasy高纯度质粒小量快速提取试剂盒（Code No.AD0102）。
3.实验步骤
3.1.标准质粒的制备
对五种人源病毒扩增序列进行合成，使用LB培养基过夜培养含有目的片段的大肠杆菌DH5α细菌，提取其质粒，后通过纯化回收试剂盒对其质粒进行纯化。使用对应引物对其目的基因PCR扩增，后将PCR产物进行琼脂糖凝胶纯化回收，使用pMDTM19-T Vector试剂盒对PCR回收产物进行连接，取5μl连接产物加入至50μl的JM109感受态细胞中进行转化。通过蓝白斑筛选对其重组克隆进行挑选，同时使用对应引物对菌落进行目的片段验证。纯化后的质粒经测定浓度后作为阳性对照标准品使用。
使用无DNase/RNase水对质粒标准品进行梯度稀释后作为标准质粒，并根据质粒含量和拷贝数之间的换算关系计算拷贝数。根据质粒大小，100pg质粒DNA为3.13×107copy。用于定量PCR实验过程中样本中病毒DNA的含量；每个梯度均设置两个复孔用于平衡或计算由于其它因素导致的误差，根据实验结果，最终选定1×102copy的病毒DNA作为阳性对照模板。
制备出的阳性对照和阴性对照扩增曲线图如图1-5所示。
3.2. 样本和DNA的提取
实验中的阳性样本由标准品质粒稀释而成，阴性样本为不同人来源的组织或细胞，用于特异性验证。其中不同人来源的组织或细胞来源于正常人脐带组织，为间充质干细胞。DNA样品使用核酸提取或纯化试剂（磁珠法）按照标准操作程序进行提取。提取的DNA样品测定浓度后于80℃条件保存。
优选地，样本还能够是器官、组织、全血、血浆、细胞、唾液或体液样品或生物制品。
3.3.引物和标记探针的设计
实验的提供特异性检测HIV、HBV、HCV、HPV、EBV人源病毒的引物和探针组合，所述引物包括正向引物和反向引物，该探针的5’端标记报告荧光基团，3’端标记淬灭荧光基团。如下表所示：
在一些实施方案中，所述荧光探针的5’端标记的报告荧光基团为FAM，3’端标记的淬灭基团为NFQ-MGB或TAMRA。本领域技术人员知道其它报告荧光基因和相应的淬灭荧光基团也可以用于本发明。
在一些实施方案中，所述检测是通过qPCR检测或通过数字PCR检测。
如本领域技术人员所知，qPCR又称实时定量PCR(Real-time Quantitative PCR），是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测PCR进程，最后可以通过标准曲线对未知模板进行定量分析。在qPCR检测中，Ct值表示循环阈值，即每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。由于每个模板的Ct值与该模板的起始含量的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用连续稀释的已知起始含量的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始含量的对数，纵坐标代表Ct值，或者纵坐标代表起始含量的对数，横坐标代表Ct值。只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的含量。qPCR在本领域中属于成熟技术，利用现有的仪器进行qPCR检测时，可以直接从仪器的输出结果中获得样本的Ct值。
在本发明qPCR检测中，可以使用荧光探针获取荧光信号。使用的是TaqMan荧光探针，其中qPCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；qPCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
3.4.TaqMan qPCR反应
反应体系包含9.25μL的TaKaRa Ex Taq 试剂盒、1μL的五种人源病毒混合引物、0.4μL五种人源病毒混合探针、34.35μL的无DNase/RNase水以及4μL的待测样本。扩增反应使用ABI Q5（Applied Biosystems）检测仪器，按照如下程序进行：95℃反应2min以彻底激活DNA聚合酶，然后95℃反应30sec、52℃反应1min和72℃反应30sec经40次循环扩增模板DNA，最后72℃延伸反应2min。
PCR扩增过程中对荧光信号实时监控，并以循环阈值（Ct值）来反映待测样本中种人源病毒的含量（或拷贝数）。对于每一个PCR反应，用稀释至1×102copy的质粒作为阳性对照，检测样本中是否含有五种人源病毒。
本实施例中的TaqMan qPCR检测均使用该反应条件进行。
3.5.特异性和精密度及准确度验证
引物的特异性首先通过NCBI的blast功能验证其是否与其它病毒、微生物和物种具有交叉反应。引物的准确度验证即将高、中、低不同拷贝数的标准品质粒由两人进行实验，每人进行2组实验，每组实验组内重复3次，经TaqMan qPCR反应检测后，将4组实验数据进行组内和组间准确度分析。
4.实验结果
4.1.TaqMan qPCR方法具有高度敏感性
由于五种病毒的普遍流行性，需要对其进行检测。我们首先通过梯度稀释标准品质粒作为阳性样本，质粒DNA以1×109copy为起始浓度，进行样品的梯度稀释，用前述实验方法部分所述的引物、探针和TaqMan qPCR反应条件进行检测，以确定五种人源病毒TaqMan方法的最低检测限。实验中可以检测到的标准品质粒最低稀释含量为1 copy，在多次重复实验中可以检出的频率为100％。但由于低含量（1 copy）的质粒检测存有变异性，因此线性度较好的1×102copy作为阳性对照。
4.2.TaqMan qPCR方法的建立
由TaKaRa Ex Taq 试剂盒、五种人源病毒混合引物、五种人源病毒混合探针、以及无DNase/RNase水建立TaqMan qPCR反应体系。操作简单便捷，优化统一熔解温度（Tm）值为52℃，体系中的五种人源病毒引物不易引起引物二聚体形成，为了防止出现不准确结果，判定结果如下：阳性对照有扩增曲线（曲线为S形），且Ct值应≤29，阴性对照无Ct值且无明显的扩增曲线（曲线非S形），视为试验有效；或者阳性：检测通道Ct值≤29，且曲线有明显的指数增长曲线（曲线为S形）。阴性：检测结果无Ct值，或Ct值>30，存在扩增曲线或无明显的指数增长曲线亦判定为有效，但需要复测，检测范围：1-1013copy。对五种人源病毒混合样本中不同病毒的检测结果分别如图11-15所示，本申请的方法能够实现单次同时准确检测五种人源病毒混合样本。
5.单种人源病毒定量检测
5.1.TaqMan qPCR方法具有高度敏感性
我们首先通过梯度稀释标准品质粒，质粒DNA以1×109copy为起始浓度进行梯度稀释，稀释后样品拷贝数分别为1 copy—1×109copy。用前述实验方法部分所述的引物、探针和TaqMan qPCR反应条件进行检测，以确定五种人源病毒检测的最低检测限。PCR扩增结束后，各稀释样本的Ct值和初始质粒的拷贝数用于绘制标准曲线，并可以反映待测样本中的病毒含量。实验中可以检测到的标准品质粒最低稀释含量为1 copy，在多次重复实验中可以检出的频率为100％。但由于低含量的质粒检测存有变异性，因此线性度较好的标准曲线可以由1×102copy检测至1×109copy。
5.2. TaqMan qPCR方法的建立
由TaKaRa Ex Taq 试剂盒、五种人源病毒混合引物、五种人源病毒混合探针、以及无DNase/RNase水建立TaqMan qPCR反应体系。体系中标准曲线样本由五种人源病毒DNA标准品质粒稀释而成，根据前述4.2中的定量范围检测结果，各标准浓度点的拷贝数分别为1×102copy、1×103copy、1×104copy、1×105copy、1×106copy、1×107copy、1×108copy、1×109copy，扩增结束后数值结果以Ct值为纵坐标（Y），以拷贝数的对数为横坐标（X）拟合标准曲线（标准曲线线性图的横坐标仍以标准品原值标示），并进行待测样本中五种病毒DNA含量的计算。在实验中，以Ct值为纵坐标，以质粒拷贝数的对数为横坐标，拟合线性方程，扩增曲线和标准曲线图如图6-10所示，其线性回归方程如下表所示，拟合线性方程相关系数R2>0.90，表明标准曲线具有很好的线性度。
拟合标准曲线时，如R2和各标准品浓度的准确度不满足以上要求，可以通过重复实验，或重新制备DNA标准品，或换用不同浓度的DNA标准品，来获得满意的拟合结果。标准曲线的拟合以及获得满意拟合结果的方法属于本领域技术人员的公知技术。
判断是否出现明显扩增曲线的方法是本领域技术人员公知的，例如当ΔRn vsCycle模式下的曲线为S形时，可确定出现明显扩增曲线。
5.3.TaqMan qPCR方法具有高精密度和准确度
根据标准曲线的定量范围，我们选择了8个不同的质粒浓度，用于检测TaqManqPCR方法中的精密度与准确度。质粒浓度从高至低分别为1×102copy、1×103copy、1×104copy、1×105copy、1×106copy、1×107copy、1×108copy、1×109copy。qPCR结果发现五种人源病毒引物可以稳定并准确地检测到每个浓度梯度的样本，表明此检测方法准确可靠。
5.4.单一人源病毒定量检测结果判定标准
标准曲线R2应不低于0.90，阳性对照有扩增曲线，阳性对照Ct值应≤35，阴性对照无Ct值结果，或Ct值≥36，且无明显的扩增曲线，视为试验有效。阳性：检测通道Ct值≤35，且曲线有明显的指数增长曲线。可疑：检测通道Ct值>35，且出现典型扩增曲线的样本建议重复试验，重复试验结果出现Ct值≤35和典型扩增曲线者为阳性，否则为阴性。阴性：样本检测结果无Ct值结果，或Ct值≥36，且无明显的扩增曲线。检测线性范围：1-1013copy。检测测定值在102-109copy此范围内，直接报告所测定数值。
定量检测五种病毒DNA的方法是阐明五种病毒在流行病学和临床中作用的可靠工具，本发明的五种病毒检测技术可以在2h内高效地检出五种病毒的载量。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。
Claims (3)
1.一种同时检测五种人源病毒EBV、HBV、HCV、HIV、HPV的试剂盒，其特征在于，包括Taq酶、五种人源病毒混合引物、五种人源病毒混合探针、无DNase/RNase水、阳性对照和阴性对照；
其中，五种人源病毒混合引物的序列如SEQ ID No.1- SEQ ID No.10所示，五种人源病毒混合探针分别如SEQ ID No.11- SEQ ID No.15所示。
2.根据权利要求1所述的一种同时检测五种人源病毒EBV、HBV、HCV、HIV、HPV的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为分别包含五种人源病毒EBV、HBV、HCV、HIV和HPV的扩增靶序列的质粒，所述阳性对照为1×102 copy。
3.一种同时检测五种人源病毒EBV、HBV、HCV、HIV、HPV中的一个或多个的引物和探针组，其特征在于，引物序列如SEQ ID No.1- SEQ ID No.10所示；探针序列如SEQ ID No.11-SEQ ID No.15所示。
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Also Published As
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