CN110643740A

CN110643740A - 帕利亚姆血清群病毒的实时荧光定量rt-pcr检测引物、探针及检测试剂盒

Info

Publication number: CN110643740A
Application number: CN201910979852.2A
Authority: CN
Inventors: 李卓然; 李占鸿; 廖德芳; 杨振兴; 杨恒; 肖雷; 李华春
Original assignee: Yunnan Animal Science and Veterinary Institute
Current assignee: Yunnan Animal Science and Veterinary Institute
Priority date: 2019-10-15
Filing date: 2019-10-15
Publication date: 2020-01-03
Anticipated expiration: 2039-10-15
Also published as: CN110643740B

Abstract

本发明涉及帕利亚姆血清群病毒的实时荧光定量RT‑PCR检测引物、探针及检测试剂盒，属于动物病毒分子生物检测技术领域。该试剂盒包括上游引物、下游引物、与引物配合使用的探针、阴性对照模板、阳性对照模板、标准品模板和PCR扩增试剂。采用试剂盒进行检测，反应速度快，整个扩增过程不到1个小时；且只需要提取病毒RNA，无需进行反转录，操作步骤少且简便，能够有效地避免RNA降解和污染；同时，在qRT‑PCR扩增完成后，无需琼脂糖凝胶电泳即可直接判断待检样品是否有PALV RNA的存在；并且配合利用标准品模板建立的标准曲线能够对临床样本内PALV RNA进行定量检测，大大提高工作效率，降低了检测成本。

Description

帕利亚姆血清群病毒的实时荧光定量RT-PCR检测引物、探针及检测试剂盒

技术领域

本发明属于动物病毒分子生物学检测技术领域，具体涉及应用TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术对中国流行的帕利亚姆血清群病毒进行快速检测的扩增引物、TaqMan探针及组装的检测试剂盒。

背景技术

帕利亚姆血清群病毒(Palyamserogroup virus,PALV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)成员，广泛流行于北纬49°至南纬35°之间的热带以及亚热带地区。PALV主要通过雌性吸血昆虫库蠓(Culicoides)对动物的吸血性叮咬传播，感染牛羊等反刍动物，导致妊娠动物的生产异常，主要表现为流产、早产、死产或产无脑畸形胎。1985年至1986年，帕利亚姆病毒疫情在曾在日本爆发，其临床症状为新生牛先天性异常，并伴有水脑畸形和小脑发育不良综合征，给畜牧业生产带来了巨大的经济损失。

PALV基因组由10个双链RNA节段(Seg1～Seg10)构成，共编码7个结构蛋白(VP1～VP7)和4个非结构蛋白(NS1～NS3和NS3A)。PALV具有双层衣壳结构，外层衣壳由Seg-2和Seg-6编码的VP2和VP5构成，主要参与介导宿主细胞表面吸附以及细胞膜通透等生物学过程。Seg-2和Seg-5都具有高度的遗传变异性，其中，由Seg-2编码的VP2是诱导被感染动物产生中和抗体的主要抗原，对PALV血清型具有决定性作用。而Seg-3和Seg-7编码的VP3和VP7则构成内层衣壳，VP3组成内层衣壳的骨架，VP7除了参与内层衣壳的构成外，还可能介导病毒粒子对昆虫宿主细胞的感染。Seg-3和Seg-7序列保守程度较高，其中VP7是PALV血清群特异性抗原。PALV具有多种不同的血清型，由于历史原因，不同血清型的PALV往往以病毒首次分离地的地名进行命名，在亚洲存在Chuzan Virus(CHUV)、D’Aguilar Virus(DAV)和Bunyip Creek virus(BCV)三种血清型PALV的流行。

CHUV于2012年首次分离于我国云南省的哨兵牛，在随后开展的云南省、广东省和广西壮族自治区PALV监测与病毒分离工作中，除分离获得多株CHUV外，还在我国首次分离获得BCV和DAV，表明多种血清型的PALV流行于我国南方地区。我国内蒙古、新疆、山东、江苏、湖北、广西和云南等省区牛羊体内CHUV抗体的血清阳性率介于6％～48.65％之间，而海南省牛羊的血清阳性率高达57.35％；另外，甘肃省牦牛CHUV抗体的血清阳性率为7.89％。由此可见，PALV已在我国呈现广泛分布的趋势。为了掌握PALV在我国的流行及分布情况，并制定科学的防控策略，非常有必要建立PALV的快速检测方法。

已有Imadeldin等和杨振兴等分别开发了巢式RT-PCR和竞争性ELISA(competitive ELISA,C-ELISA)方法用于PALV的检测，但是上述两种检测方法都存在不足之处。

(1)巢式RT-PCR的不足之处：需要以第一次扩增产物作为第二次扩增的模板，容易引入污染进而导致假阳性；需要利用琼脂糖凝胶电泳进行检测，耗时较长。

(2)C-ELISA的不足之处：主要对动物血液内的抗体进行检测，而从动物感染PALV到抗体产生，一般需要2～3周，因此，C-ELISA方法在抗体产生之前不能进行早期临床诊断。

综上，目前尚无兼具特异性、灵敏度和快速便捷等优点于一身的检测方法，特别是缺乏对临床样本进行早期诊断的手段。因此，建立高效、快速的PALV病原学检测方法和检测试剂盒，不仅能弥补现有技术的不足，而且能够为我国PALV的诊断和防控提供技术支持和知识储备。

荧光定量PCR技术是美国ABI公司于1996年推出的一种新型核酸定性及定量技术，该技术自发明以来，已经被广泛应用于细菌、病毒等病原体检测，具有特性强、灵敏度高、检测速度快和可进行高通量检测等优势，更为重要的是该技术可以用于临床样本检测，但是目前尚没有针对PALV的一步法实时荧光定量RT-PCR(one step quantitative real timeRT-PCR,qRT-PCR)检测方法面世。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一对用于PALV核酸检测的qRT-PCR引物和一条特异性TaqMan荧光探针及含有该引物和探针的检测试剂盒，以实现对中国流行PALV的定性和定量检测，从而弥补现有技术的不足。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

帕利亚姆血清群病毒的qRT-PCR检测引物，包括上游引物PALV_F和下游引物PALV_R；

上游引物PALV_F：catcaatggcaacaatcggtg；(SEQ ID NO.1)

下游引物PALV_R：attcagcatacctgtaattcgtac。(SEQ ID NO.2)

本发明还提供与上述引物配合使用的TaqMan探针，所述的探针核苷酸序列为：FAM-ttccatatacaacgtcggcaatgacaag-BHQ1(SEQ ID NO.3)。

本发明同时提供含有上述引物和/或上述TaqMan探针的检测试剂盒。

进一步，优选的是，还包括：阴性对照模板、阳性对照模板、标准品模板和PCR扩增试剂；

所述的阴性对照模板为RNase-free水；

所述的阳性对照模板为PALV灭活病毒；

所述的标准品模板为PALV基因节段7(Seg-7)单链RNA(single strand RNA,ssRNA)。

进一步，优选的是，PALV灭活病毒的拷贝数为2.6×10⁷拷贝/mL；PALV Seg-7ssRNA的拷贝数为2.37×10¹⁴拷贝/mL。

进一步，优选的是，所述的PCR扩增试剂包括One Step PrimeScript RT-PCR试剂(共3种)和ROX参比染料(ROX Reference DyeⅡ(50×))。

进一步，优选的是，所述的试剂盒的扩增体系为：

2×One Step RT-PCR BufferⅢ，10.0μL；

TaKaRa Ex Taq HS(5U/μL)，0.4μL；

PrimeScript RT Enzyme MixⅡ，0.4μL；

ROX Reference DyeⅡ(50×)，0.4μL；

上游引物PALV_F(10μmol/L)，1.6μL；

下游引物PALV_R(10μmol/L)，1.6μL；

探针(10μmol/L)，1.2μL；

模板，1.0μL；

RNase-free水，3.4μL；

总计20.0μL。

进一步，优选的是，所述的试剂盒的扩增程序：

反转录42℃，5min，共1个循环；预变性95℃，10s，共1个循环；变性95℃，5s，退火60℃，34s，共40个循环。

本发明提供用于对PALV进行定性和定量检测TaqMan探针的5’端以报告荧光基团标记，3’端以淬灭荧光基团标记，为防止PCR扩增时被延伸，所述探针3’端需要经过磷酸化处理。其中FAM为6-羧基荧光素报告荧光基团，BHQ1为黑洞淬灭荧光基团。

本发明提供用于PALV进行定性和定量检测的引物、TaqMan探针以及检测试剂盒，通过提取待检样品总RNA，并结合qRT-PCR技术，可达到准确定性和定量待检样品中PALVRNA的目的。本发明所提供的引物、探针和检测试剂盒不仅可用于对PALV的临床检测，还可以用于对被感染动物中PALV RNA的定性及定量分析，将在我国PALV的防控工作中发挥重要作用。

本发明试剂盒提供RNase-free水作为阴性对照模板、已知拷贝数灭活PALV作为阳性对照模板。即当qRT-PCR扩增体系以阴性对照模板进行反应时，所述的模板为RNase-free水；当qRT-PCR扩增体系以阳性对照模板进行反应时，所述的模板为PALV灭活病毒；当qRT-PCR扩增体系以待检样品模板进行反应时，所述的模板为从疑似PALV感染的动物组织或血液中抽提的病毒RNA。利用本发明提供的引物和探针对阴性对照模板、阳性对照模板以及待检样品模板进行qRT-PCR扩增，扩增后收集每个循环的荧光信号，收集得到的待检样品模板的荧光信号与阳性对照模板的荧光信号进行比较，待检样品模板qRT-PCR扩增出现类似阳性对照模板的扩增曲线者为阳性，未出现扩增曲线者为阴性。

本发明试剂盒提供已知拷贝数PALV Seg-7 ssRNA作为标准品模板。当qRT-PCR扩增体系以标准品模板进行反应时，所述的模板为PALV Seg-7ssRNA；当qRT-PCR扩增体系以待检样品模板进行反应时，所述的模板为从疑似PALV感染的动物组织或血液中抽提的病毒RNA。利用本发明提供的引物和探针对标准品模板以及待检样品模板进行qRT-PCR扩增，扩增后收集每个循环的荧光信号。以标准品模板起始拷贝数Log10的对数值为X轴，以Ct值为Y轴进行标准曲线绘制。将待检样品模板的荧光信号与标准曲线进行比较，进而对待检样品模板内的病毒RNA进行定量检测，确定待检样品模板内PALV RNA的拷贝数。

本发明的具体原理是，针对中国流行的PALV Seg-7序列，设计用于qRT-PCR检测的特异性引物和TaqMan探针，使用FAM基团作为探针的报告荧光基团，BHQ1作为探针的淬灭荧光基团；构建包含PALV Seg-7全长序列的阳性质粒，利用限制性内切酶将该质粒线性化，并作为模板进行PALV Seg-7 ssRNA的体外转录，以纯化的ssRNA为模板优化qRT-PCR的反应体系和反应条件，并建立标准曲线；利用β-丙内酯对已知拷贝数的PALV进行灭活处理作为阳性对照模板，灭活方法如下：β-丙内酯与病毒培养液的体积比为1:4000，混合均匀后于4℃灭活24h，再于37℃水浴2h水解β-丙内酯；最终构建出适用于检测PALV的qRT-PCR引物、探针和检测试剂盒。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

(1)本发明设计了特异性强的PALVqRT-PCR扩增引物和探针，并在此基础上构建一种能够检出流行于中国的PALV RNA的qRT-PCR检测试剂盒，该试剂盒具有特异、敏感、快速和高效等优势。

(2)本发明以PALV Seg-7 ssRNA为标准品模板进行标准曲线的构建(附图1)，比利用重组质粒DNA或病毒液提取的核酸作为标准品模板所获得的数据更准确可靠，更重要的是本发明开发的PALV qRT-PCR检测试剂盒能够利用绘制的标准曲线对临床样本内PALVRNA进行定量检测；同时，本发明以灭活PALV为阳性对照模板，也更贴近现实中的检测情况。

(3)动物感染PALV早期，其血液内病毒含量较低，而本发明开发的PALVqRT-PCR检测试剂盒具有良好的检测灵敏度，适用于早期临床样本的检测。灵敏度试验结果显示，本发明开发的PALV qRT-PCR检测试剂盒的检出下限为2.37×10¹拷贝/μL(附图2)，而普通RT-PCR的检出下限一般为10³拷贝/μL，表明本发明的检测灵敏度比普通RT-PCR高42倍。

(4)本发明开发的PALV qRT-PCR检测试剂盒特异性强。如附图3所示，本发明涉及的引物和探针只对PALV产生特异性对数扩增曲线，而未与其它种属病毒毒株发生交叉反应，包括蓝舌病病毒、非洲马瘟病毒灭活疫苗、流行性出血热病毒以及阿卡斑病毒。

(5)虽然已有Imadeldin等报道的针对PALV Seg-3设计的群特异性巢式PCR检测方法，但由于巢式PCR需要以第一次扩增产物作为第二次PCR的模板，容易引入污染，导致假阳性结果出现，而本发明开发的PALV qRT-PCR检测试剂盒只需要提取待检样品的总RNA进行一次PCR反应就能够得出检测结果，从而有效地避免了RNA降解和污染以及假阳性的出现。本发明开发的PALV qRT-PCR检测试剂盒反应速度快，整个扩增过程不到1小时即可完成，而且在qRT-PCR扩增完成后，无需琼脂糖凝胶电泳即可直接判断待检样品是否有PALV RNA的存在，比传统的电泳检测方法用时减少了1小时，大大提高了工作效率。

(6)由于PALV Seg-7序列具有高度保守性，通常被用作血清群特异性检测的靶基因，本发明针对中国流行毒株的Seg-7序列进行引物设计，之后应用实例中利用本发明开发的PALV qRT-PCR检测试剂盒对中国流行毒株进行检测，其检测结果表明本发明开发的检测试剂盒可有效地检测我国分离的全部血清型毒株，与巢式PCR的符合率为100％。

(7)本发明开发的PALV qRT-PCR检测试剂盒与C-ELISA方法相比具有灵敏度高，能够进行早期临床诊断的优点。C-ELISA方法主要对被感染动物产生的抗体进行检测，从PALV感染到产生可检测的抗体一般需要2～3周时间，但本发明开发的PALVqRT-PCR检测试剂盒能够在抗体产生之前对病毒核酸进行定性和定量检测，因此，应用实例中本发明开发的PALV qRT-PCR检测试剂盒能够比C-ELISA方法检出更多的阳性血液样本。利用PALV抗体C-ELISA试剂盒和本发明开发的PALV qRT-PCR检测试剂盒同时对120份临床血液样品进行检测，结果显示两者间的符合率为85.71％。

附图说明

图1本发明利用PALV Seg-7 ssRNA作为标准品模板建立的标准曲线；X轴为标准品模板起始拷贝数Log₁₀的对数值，Y轴为Ct值；

图2本发明开发的qRT-PCR试剂盒灵敏度试验；其中，1～5：标准品模板浓度分别为2.37×10⁵拷贝/μL～2.37×10¹拷贝/μL的PALV Seg-7 ssRNA；6：阴性对照模板；

图3本发明开发的qRT-PCR试剂盒特异性试验；其中，1：模板为PALV；2～7：模板分别为BTV、AHSV、EHDV以及AKAV。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

(1)实验材料

PALV CHUV血清型、BCV血清型和DAV血清型毒株(共计19株)记载在2012—2016年中国南方地区帕利亚姆血清群病毒的分离与序列特征分析，杨恒，肖雷，李占鸿，孟锦昕，杨振兴，吕敏娜，林栩慧，廖德芳，牛保生，李华春，《畜牧兽医学报》2018年，第49期，公众可从云南省畜牧兽医科学院获得；PALV Seg-7 ssRNA由云南省畜牧兽医科学院按本发明内标准品模板制备方法进行制备；蓝舌病病毒(Bluetongue Virus,BTV)、非洲马瘟病毒(Af ricanHorse Sickness Virus,AHSV)灭活疫苗、流行性出血热病毒(Epizoot ic HaemorrhagicDisease Virus,EHDV)以及阿卡斑病毒(Akabane Virus,A KAV)均由世界动物卫生组织(OIE)参考实验室澳大利亚麦克阿瑟.伊丽莎白农业研究所友情赠送。

(2)试剂与仪器

β-丙内酯(Sigma)；One Step PrimeScript^TMRT-PCR Kit(Perfect Real Time)试剂盒、PrimeScript^TM One Step RT-PCR Kit Ver.2和DNA Marker购自TaKaRa公司；pLB零背景快速连接试剂盒、质粒小提试剂盒、大肠杆菌DH5α感受态细胞、Universal DNA纯化回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；Xba I限制性内切酶、HiScribe^TMT7High Yield RNASynthesis Kit和Monarch RNA Cleanup Kit购自NEB公司；EasyPureVrial DNA/RNA Kit购自Transgen Biotech公司；PALV抗体C-ELISA试剂盒由云南省畜牧兽医科学院提供。

梯度PCR仪Veriti 96Well Thermal Cycler(ABI)；实时荧光定量PCR仪7500Fast(ABI)；电泳仪Power Pac Basic(BIO-RAD)；水平电泳系统DY CP-32B(北京六一)；紫外凝胶成像系统Gel Doc XR⁺(BIO-RAD)；紫外分光光度计Nano Vue Plus(GE)；干式恒温金属浴OSE-96(天根生化科技有限公司)；台式离心机1-14(Sigma)。

(3)设计引物和探针

针对中国流行的PALV Seg-7序列，设计用于qRT-PCR检测PALV的特异性引物和TaqMan探针，分别使用FAM和BHQ1作为报告荧光基团和淬灭荧光基团。引物和探针序列如表1所示。

表1 PALV qRT-PCR检测所用引物和探针序列信息

(4)标准品模板的制备

根据前期获得的中国PALV全基因组序列，设计一对特异性引物(PALV-S7-F：5’-gttaaaaatctcctcgagatgga-3’(SEQ ID NO.4)与PALV-S7-R：5’-gtaagcgtataccccctggacgtg-3’(SEQ ID NO.5)用于PALV Seg-7全长序列(1151bp)的扩增，所述通过PCR反应扩增所得核酸序列如SEQ ID NO.6所示。

使用病毒DNA/RNA抽提试剂盒“EasyPureVrial DNA/RNA Kit”(Transg enBiotech)抽提我国分离到的PALV RNA，94℃变性3min后，利用上述引物和一步法RT-PCR技术扩增我国PALV Seg-7全长序列，按照PrimeScript ^TM One Step RT-PCR Kit Ver.2(TaKaRa)使用说明进行反应获得PALV Seg-7全长DNA片段。

扩增体系：

PrimeScript 1Step Enzyme Mix，2.0μL；

2×1Step Buffer，25.0μL；

上游引物PALV-S7-F(20μmol/L)，1.0μL；

下游引物PALV-S7-R(20μmol/L)，1.0μL；

模板RNA，5.0μL；

RNase-free水，16.0μL；

总计50.0μL；

反应条件：反转录50℃，30min，1个循环；预变性94℃，3min，1个循环；[变性94℃，30s，退火55℃，30s，延伸72℃，1.5min]，30个循环；延伸72℃，5min，1个循环。

将Seg-7全长DNA片段按照“pLB零背景快速连接试剂盒”(天根生化科技有限公司)说明书与pLB平末端克隆载体进行连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(天根生化科技有限公司)，筛选阳性克隆菌进行测序鉴定。

按照“质粒小提试剂盒”(天根生化科技有限公司)说明书提取插入目的基因的质粒，并命名为pLB_PALV_S7，按照“Xba I”限制性内切酶(NEB)说明书线性化质粒，按照“Universal DNA纯化回收试剂盒”(天根生化科技有限公司)说明书对酶切产物进行胶回收纯化。以纯化后的线性化质粒DNA作为模板，按照“HiScribe^TMT7High Yield RNA SynthesisKit”(NEB)说明书进行PALV Seg-7 ssRNA的体外转录。使用RNA纯化试剂盒“Monarch RNACleanup Kit”(NEB)纯化转录产物，测定纯化后核酸浓度，并根据PA LV Seg-7 ssRNA的分子量计算拷贝数；RNA拷贝数计算公式：

拷贝数(拷贝/mL)＝RNA浓度(g/mL)×6.02×10²³(拷贝/mol)/(340×RNA碱基数)。

(5)优化qRT-PCR反应体系

通过反复试验，优化qRT-PCR的反应体系，确定采用的反应总体系为20μL，所需各组分及相应浓度、相应用量见表2。

PALV Seg-7 ssRNA的浓度为2.37×10¹⁴拷贝/mL，利用RNase-free水对P ALV Seg-7 ssRNA进行稀释，以1μL拷贝数为2.37×10²拷贝/μL的PALV S eg-7 ssRNA作为模板，分别对引物浓度(0.2、0.4、0.6、0.8和1.0μmol/L)和探针浓度(0.2、0.4、0.6和0.8μmol/L)进行优化，以20μL反应体系进行qRT-PCR，最佳扩增引物与探针终浓度分别为0.8μmol/L与0.6μmol/L。如调整反应体系，应保证体系内引物和探针的终浓度为0.8μmol/L和0.6μm ol/L，即能得到较好的扩增曲线。

表2qRT-PCR检测PALV反应体系

反应体系组分	用量(μL)	终浓度(μmol/L)
			2×One Step RT-PCR BufferⅢ	10.0
TaKaRa Ex Taq HS(5U/μL)	0.4
			PrimeScript RT Enzyme MixⅡ	0.4
PALV_F Primer(10μmol/L)	1.6	0.8
			PALV_R Primer(10μmol/L)	1.6	0.8
PALV_Probe(10μmol/L)	1.2	0.6
			ROX Reference DyeⅡ(50×)	0.4
模板	1.0
			RNase-Free水	3.4
总计	20.0

(6)优化qRT-PCR反应条件

以1μL拷贝数为2.37×10²拷贝/μL的PALV Seg-7 ssRNA作为模板，对退火温度(55～60℃)进行优化，确定最佳反应条件为：反转录42℃，5min，1个循环；预变性95℃，10s，1个循环；[变性95℃，5s，退火60℃，34s]，40个循环。

(7)利用PALV Seg-7 ssRNA建立标准曲线

分别以1μL 2.37×10⁶拷贝/μL至2.37×10²拷贝/μL5个稀释度的PALV Seg-7ssRNA作为模板进行qRT-PCR反应，建立PALV的群特异性标准曲线。以起始模板拷贝数Log₁₀的对数值为X轴，以Ct值为Y轴进行回归曲线的绘制，得到PALV的群特异性qRT-PCR检测的标准曲线。其斜率为-3.354，截距为37.93，相关系数为0.999，回归方程为y＝－3.354x+37.93(附图1)。

(8)灵敏性分析

利用本发明所涉及的PALV检测引物、探针和检测试剂盒，按优化的反应体系和反应条件，以1μL拷贝数分别为2.37×10⁵拷贝/μL、2.37×10⁴拷贝/μL、2.37×10³拷贝/μL、2.37×10²拷贝/μL和2.37×10¹拷贝/μL的PALV Seg-7 ssRNA以及阴性对照进行qRT-PCR敏感性分析，本发明涉及的PALV检测引物、探针和试剂盒的检出下限为2.37×10¹拷贝/μL(附图2)。

(9)特异性分析

利用病毒DNA/RNA抽提试剂盒“EasyPureVrial DNA/RNA Kit”(TransgenBiotech)抽提BTV、AHSV、EHDV、AKAV和PALV RNA，94℃变性3min后立即冰浴。利用本发明所涉及的PALV检测引物、探针和检测试剂盒，按优化的反应体系和反应条件，取1μL上述变性病毒RNA为模板进行qRT-PCR特异性分析，本发明涉及的PALV检测引物、探针和检测试剂盒的能够特异性检出CHUV、BCV和DAV，即附图3内，而与BTV、AHSV、EHDV以及AKAV没有交叉反应。

(10)应用实例

A.利用本发明开发的qRT-PCR检测试剂盒对PALV毒株进行检测

利用本发明所涉及的PALV检测引物、探针和检测试剂盒，按优化的反应体系和反应条件，与巢式PCR方法同时对19株PALV进行检测。实施操作过程中，阴性对照模板、阳性对照模板以及待检样品模板在不同的反应孔中同时进行qRT-PCR扩增过程。本发明涉及的PALV qRT-PCR检测试剂盒能够有效地检出所有PALV毒株，Ct值范围在15.43～27.76之间，与Imadeldin等开发的巢式PCR检测结果的符合率为100％，具体见表3。

表3利用qRT-PCR试剂盒和巢式PCR方法对PALV毒株进行检测的结果

B.利用本发明开发的qRT-PCR检测试剂盒对PALV感染动物进行动态检测

采集PALV感染哨兵动物的血液样本，取该动物PALV血清抗体C-ELISA检测结果为阳性(血清学转阳)前4周和血清学转阳后4周的抗凝血各50μL，提取总RNA作为待检样品模板，利用本发明开发的PALV qRT-PCR检测试剂盒进行定量检测，设置多个浓度梯度的PALVSeg-7 ssRNA为标准品模板进行扩增反应并获得标准曲线。标准品模板和待检样品模板在不同反应孔中同时进行qRT-PCR扩增反应。qRT-PCR的反应结果以Ct值形式进行展示，阴性与阳性判定标准为：Ct值＞39.5判定为阴性，Ct值在38.5～39.5判定为可疑，Ct值＜38.5判定为阳性；再根据利用PALV Seg-7 ssRNA为标准品模板建立的标准曲线以及待检样品模板的Ct值确定阳性待检样品模板内PALV RNA的拷贝数。C-ELISA方法的结果以抑制率形式进行展示，反应结果阴性与阳性判定标准为：抑制率＞50％为阳性，抑制率＜50％为阴性。结果见表4。本发明开发的PALV qRT-PCR检测试剂盒能够在PALV抗体产生之前检测到较高水平的PALV RNA，而抗体产生之后PALV RNA水平逐渐下降；C-ELISA方法在第4周检测到PALV抗体转阳，在接下来的4周之内，PALV抗体水平一直维持在较高水平。

表4利用qRT-PCR试剂盒和C-ELISA方法对哨兵牛进行跟踪检测的结果

C.利用本发明开发的qRT-PCR试剂盒对临床血液样本进行检测

采集家畜血液样本共计120份，各取50μL血液提取总RNA，同时利用本发明涉及的qRT-PCR引物、探针和检测试剂盒以及PALV抗体C-ELISA方法对PALV进行检测。其中C-ELISA方法检出阳性样本36份，本发明涉及的引物、探针和检测试剂盒共检出阳性样本42份，符合率为85.71％。利用Imadeldin等开发的巢式PCR对上述检测结果中不符合的6份样本进行检测，检测结果均为阳性。由于C-ELISA方法主要对抗体进行检测，从PALV感染到产生可检测的抗体需要2～3周时间，而本发明开发的qRT-PCR检测试剂盒则对病原核酸进行检测，因此，在宿主被感染但还未产生抗体时，本发明开发的qRT-PCR引物、探针和检测试剂盒具有良好的敏感性和可靠性。

由本发明引物对衍生的引物序列也属于本发明的保护范围。所述衍生序列是指在SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.3的基础上经过一至十个碱基的取代、缺失或添加得到的引物序列。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 云南省畜牧兽医科学院

<120> 帕利亚姆血清群病毒的实时荧光定量RT-PCR检测引物、探针及检测试剂盒

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

catcaatggc aacaatcggt g 21

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

attcagcata cctgtaattc gtac 24

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

ttccatatac aacgtcggca atgacaag 28

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

gttaaaaatc tcctcgagat gga 23

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

gtaagcgtat accccctgga cgtg 24

<210> 6

<211> 1151

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

gttaaaaatc tcctcgagat ggatgcgatt gcggcacgcg cattatcagt tattgaagca 60

tgtacaactt tagtagattc aagggtgagc atggatccag gagttatgga gttattgggt 120

atcgctctaa atagatacaa tgctatgtca ttaagaggtg taactatgcg gccaactaca 180

caacaagaaa gaaatgatat gttctttatg tgcgtagata tgacaatagc tgcgttaggt 240

atacaaattg gaaatatatc tcaaacctat agaccatcaa tggcaacaat cggtgcatta 300

gcaacaagtg aaattccata tacaacgtcg gcaatgacaa gagttgtacg aattacaggt 360

atgctgaata catatacacc aagtaggatg tacctaccac catatatagc agcgcgtgac 420

atgcaagcgc caggaagata ttatgtgcct gcaggacgat cgagatctgc agtaacatca 480

agcaatacga ttgaaacatc aatccagcaa ggaacaatag ttcagatggg aggaacctta 540

gccccacgcc ggggcgacgc aatgatgatg tattttattt ggcaaccgat acgcgtgttc 600

tccggggcaa atggcgtaac gcaagagtct ggtgctggga ttacagtaac tgttgatggc 660

gtggagatcg ctgcagggaa tatcgccgtt tgggatactg ttgccccaat tgttgtgaca 720

aatccaagta atagggactc aatggttagg tttgaagtat tatggtatac aacttttgat 780

cgaacgccaa cacttgtgcc cgaaacatat gaaatgatga atagatgtta ctcatatata 840

tcaccacaat ggcatgcatt gcgtgcgacc ttatgtatga gggttggatt gccagcaatg 900

cacccgccta tttttgcacc cggagatcgt gaaaccctga tggctttact gttatattcg 960

gcgctagcgg acgcatgtga tgcattgaag cctgattttg atatgattgg agttgctggg 1020

gttgcaccac agaatagagc aggcgtggcg caagcgtaca gatgagcggt gttgcatggc 1080

atcgttcaca atgcatcagt cacactagat agggtattta gtgttagcac gtccaggggg 1140

tatacgctta c 1151

Claims

1.帕利亚姆血清群病毒的实时荧光定量RT-PCR检测引物，其特征在于，包括上游引物PALV_F和下游引物PALV_R；

上游引物PALV_F：catcaatggcaacaatcggtg；

下游引物PALV_R：attcagcatacctgtaattcgtac。

2.与权利要求1所述引物配合使用的探针，其特征在于，所述的探针核苷酸序列为：FAM-ttccatatacaacgtcggcaatgacaag-BHQ1。

3.含有权利要求1所述引物和/或权利要求2所述探针的试剂盒。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括：阴性对照模板、阳性对照模板、标准品模板和PCR扩增试剂；

所述的阴性对照模板为RNase-free水；

所述的阳性对照模板为PALV灭活病毒；

所述的标准品模板为PALV 基因节段7单链RNA。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，PALV灭活病毒的拷贝数为2.6×10⁷拷贝/mL；PALV Seg-7 ssRNA的拷贝数为2.37×10¹⁴拷贝/mL。

6.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR扩增试剂包括One StepPrimeScript RT-PCR试剂和ROX参比染料。

7.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，其扩增体系为：

2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ，10.0 μL；

TaKaRa Ex Taq HS（5 U/μL），0.4 μL；

PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ，0.4 μL；

ROX Reference Dye Ⅱ（50×），0.4 μL；

上游引物PALV_F（10 μmol/L），1.6 μL；

下游引物PALV_R（10 μmol/L），1.6 μL；

探针（10 μmol/L），1.2 μL；

模板，1.0 μL；

RNase-free水，3.4 μL；

总计20.0 μL。

8.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的扩增程序：

反转录42 ℃，5 min，共1个循环；预变性95 ℃，10 s，共1个循环；变性95 ℃，5s，退火60 ℃，34s，共40个循环。