CN109913591A - 基于TaqMan探针法的A型塞尼卡病毒荧光定量RT-PCR检测方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于TaqMan探针法的A型塞尼卡病毒荧光定量RT‑PCR检测方法和试剂盒，本发明荧光定量RT‑PCR检测方法所用引物的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，探针序列如SEQ ID NO.5所示。本发明的引物和探针是根据NCBI GenBank数据库中已发表的我国2015年以来流行的41株SVA的VP1基因序列，通过序列比对分析，在其保守的区域设计获得，引物和探针序列在所分析的毒株之间具有高度的保守性。本发明的荧光定量RT‑PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和稳定性，可以成功用于临床SVA感染的鉴别诊断，为我国猪群中水泡病的快速鉴别诊断提供了良好的技术支撑。

Description

基于TaqMan探针法的A型塞尼卡病毒荧光定量RT-PCR检测方 法和试剂盒

技术领域

本发明涉及基于TaqMan探针法的A型塞尼卡病毒荧光定量PCR检测引物、探针及其检测方法和试剂盒，属于生物工程技术领域。

背景技术

塞尼卡谷病毒(Seneca Valley virus，SVV)，又称为A型塞尼卡病毒(SenecavirusA，SVA)，最初作为人胚肾细胞(PER.C6)培养过程中的污染物，于2002年被首次发现鉴定。现有研究表明，SVA也是引起猪原发性水泡病(porcine idiopathic vesicular disease，PIVD)的重要致病病原之一，并且可导致仔猪较高的死亡率。SVA属于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)，塞尼卡病毒属(Senecavirus)，病毒粒子无囊膜结构，为单股正链RNA病毒，基因组大小约7.3kb，包括两端的非翻译区(Untranslated regions，UTRs)和一个大的开放阅读框(Open reading frame，ORF)，编码四个结构蛋白(VP1-VP4)和八个非结构蛋白(Lpro，2A-2C，3A-3D)。

目前，美国、加拿大、巴西、中国、柬埔寨和泰国等多个国家报道了SVA在猪群中的流行。自2015年以来，我国广东、福建、湖北、河南和黑龙江等多个省份也相继报道了SVA的感染和流行。SVA感染与口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)、水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)和猪水泡病病毒(Swine vesicular diseasevirus，SVDV)感染引起的猪水泡性疾病均表现为口鼻部出现水泡、跛行、发热、厌食和精神沉郁等症状，在临床症状上难以区分。因此，对SVA引起的水泡性疫病进行快速、准确诊断对于该病的防控具有重要意义。此外，和其它小核糖核酸病毒科成员一样，SVA基因组在复制过程中具有很高的突变率，这为建立基于SVA核酸分子的临床检测诊断带来一定挑战。

SVA虽然早在2002年就被分离鉴定出来，但是一直以来对其致病性的研究却很有限。2014年以前，在NCBI GenBank的数据库中仅有3株SVA的全基因组序列信息，随着2015年以来SVA的感染和流行，SVA受到越来越多关注。目前实验室SVA病原学诊断技术主要包括病毒的分离鉴定、间接免疫荧光、RT-PCR和qRT-PCR等技术。qRT-PCR因其快速、高灵敏性和高特异性，在疫病的临床诊断中有越来越多的应用。我国现有的qRT-PCR检测方法多是根据美国2002年最早分离株SVV-001的基因组序列建立，且缺少针对临床样品检测的数据支撑，对当前新型流行毒株的检测效果并不确定。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供基于TaqMan探针法的A型塞尼卡病毒荧光定量PCR检测引物、探针及RT-PCR检测方法和试剂盒。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

基于TaqMan探针法的A型塞尼卡病毒荧光定量PCR检测引物和探针，引物包括上游引物VP1-qFor和下游引物VP1-qRev，探针为VP1-Probe；各引物和探针的序列如下：

VP1-qFor：5’-CTCTGTCTCWTCCGTGCTTC-3’

VP1-qRev：5’-GTAAATRGTYCCCCAGTCAG-3’

VP1-Probe：5’-FAM-TCCAAGCTTTCTTCTGCCACGCGGGGT-BHQ1-3’。

一种基于TaqMan探针法的A型塞尼卡病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括上述引物和探针、Premix Ex Taq^TM、ROX Reference Dye II、双蒸水。

所述的检测试剂盒，还包括阳性对照质粒标准品和阴性对照水。

质粒标准品的制备方法为：以SVA cDNA为模板，利用VP1基因全长的特异性引物进行扩增，获得的目的基因片段经BamHI和SalI双酶切后连接至pE-SUMO Vector载体上，构建pE-SUMO-VP1重组质粒，经过测序鉴定后，测定其浓度并换算拷贝数，作为荧光定量RT-PCR检测的标准品。

特异性引物包括上游引物VP1-For：5’-CGGGATCCATGTCCACCGACAACGCCGAGACTGG-3’和下游引物VP1-Rev：5’-CCGCTCGAGCTATTGCATCAGCATCTTCTGCTT-3’。

一种利用A型塞尼卡病毒荧光定量RT-PCR检测方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样品的RNA，反转录得到cDNA，作为模板；

(2)利用引物和探针进行荧光定量PCR扩增，根据扩增结果，判断样品中A型塞尼卡病毒的情况。

荧光定量PCR扩增的反应体系为：Premix Ex Taq^TM12.5μl、浓度均为5μM的上下游引物各1μl、浓度为5μM的探针1μl、ROX Reference Dye II0.25μl、模板1μl，双蒸水8.25μl。

荧光定量PCR扩增的反应条件为：95℃预变性20s；95℃变性3s，60℃退火并延伸30s，40个循环。

本发明有益效果：

1、本发明选取NCBI GenBank数据库中已发表的我国2015年以来流行的41株SVA的VP1基因序列，通过序列比对分析，在其保守的区域设计了一组引物和探针，引物和探针序列在所分析的毒株之间具有高度的保守性。

2、本发明通过对引物、探针的优化，建立了基于TaqMan探针法的荧光定量RT-PCR检测方法。该方法与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、乙脑病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、塞尼卡病毒、口蹄疫病毒等均不发生交叉反应；敏感性分析显示该方法的最低检出量为278拷贝/μl，远远优于传统的RT-PCR检测方法；重复性分析显示所建立方法的组内变异系数为0.3％-1.0％，组间变异系数为0.8％-2.0％，具有良好的稳定性；临床样品检测显示该方法可以成功用于临床SVA感染的鉴别诊断，为我国猪群中水泡病的快速鉴别诊断提供了良好的技术支撑。

附图说明

图1为引物和探针序列信息。

图2为SVA TaqMan探针法荧光定量RT-PCR扩增动力学曲线(A)和标准曲线(B)。图A中1-7分别为从2.78×10⁸到2.78×10²拷贝/μl。

图3为SVA qRT-PCR特异性试验结果。

图4A为SVA qRT-PCR敏感性试验结果。图中1-9分别为从2.78×10⁹到2.78×10¹拷贝/μl，10为水。

图4B为传统的RT-PCR敏感性试验结果。图中1-9分别为2.78×10⁹到2.78×10¹拷贝/μl，10为水。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。下述实施例中使用的试验方法如无特殊说明，均为本领域的常规方法，或按照制造厂商建议的条件与步骤实施。

实施例1

1材料与方法

1.1病毒株

猪流行性腹泻病毒(PEDV)cDNA、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)cDNA、猪瘟病毒(CSFV)cDNA、乙脑病毒(JEV)cDNA、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)DNA、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)cDNA、塞尼卡病毒cDNA和含有A型、O型口蹄疫病毒(FMDV)的基因组全长的质粒由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室保存。

1.2引物和探针设计合成

根据NCBI GenBank数据中已发表的SVA基因组序列，选取41株我国流行毒株(表1)，利用DNAstar Megalign软件中Clustal W的方法对VP1基因序列进行比对分析，以确定该基因序列相对保守的区域。通过Primer3 Plus(http://www.primer3plus.com)软件进行引物和探针的设计，参照序列比对的信息，选择序列较为保守的引物和探针进行后续实验。本发明使用的引物(VP1-qFor/qRev)和探针(VP1-Probe)均由生工生物(上海)股份有限公司合成(表2)。引物和探针序列在所分析的毒株之间具有高度的保守性(图1)。

表1参考毒株序列信息

表2引物信息

注：W＝A或T；R＝A或G；Y＝T或C；^a参考CH-01-2015(Accession no.KT321458)序列信息。下划线是VP1基因序列，前面的碱基是酶切位点和保护性碱基。

1.3质粒标准品的制备

利用特异性引物(VP1-For/Rev)，以HeNNY-1/2018毒株(GenBank no.MK357116)的cDNA为模板，克隆VP1基因全序列，然后将获得的目的基因片段经BamHI和SalI双酶切后连接到pE-SUMO Vector载体上，构建pE-SUMO-VP1重组质粒，经过测序鉴定后，测定其DNA浓度并换算拷贝数，作为荧光定量RT-PCR检测的标准品。基因拷贝数计算公式如下：Y(拷贝/μL)＝[质粒DNA的浓度(g/μL)/(质粒DNA长度bp×660)]×6.02×10²³。结果表明，DNA浓度为278ng/μl，拷贝数为2.78×10¹⁰拷贝/μl。

1.4标准曲线的建立

使用病毒核酸提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction KitVer.5.0)提取病毒的总RNA，使用反转录试剂(PrimeScript^TM RT Master Mix)和DNA聚合酶(Max DNA Polymerase)生成互补DNA(cDNA)作为荧光定量PCR模板。经过引物和探针浓度的摸索，最终确定荧光定量PCR最佳反应体系为(25μl)：Premix Ex Taq^TM12.5μl，上下游引物(5μM)各1μl，探针(5μM)1μl，ROX Reference Dye II0.25μl，模板1μl，双蒸水8.25μl。同时设立仅加水的阴性对照组。反应条件为95℃预变性20s；95℃变性3s，60℃退火并延伸30s，40个循环，使用ABI 7500 Fast Real-Time PCR System进行荧光定量PCR检测。

以10倍倍比稀释的质粒标准品(2.78×10⁹-2.78×10¹拷贝/μl)为模板，进行荧光定量PCR检测，结果如图2所示。由图2可知，当质粒标准品浓度为2.78×10⁸-2.78×10²拷贝/μl时，标准曲线斜率(slope)为-3.014，截距为41.459，相关系数R²等于0.995，扩增效率(Efficient)为114.66％，即标准曲线Y＝-3.014x+41.459。说明可以得到良好的扩增动力学曲线和标准曲线。

1.5特异性试验

分别以经RT-PCR检测确定为SVA阳性的2份临床样品，PEDV、TGEV、CSFV、JEV和HP-PRRSV的cDNA，PRV和PCV2的DNA和含有FMDV-O、FMDV-A基因组全长的质粒为模板，同时设立仅加水的阴性对照，进行荧光定量PCR检测，以评估所建立检测方法的特异性，结果如图3所示。由图3可知，含有SVA阳性样品可以出现特异性的扩增曲线，而含有其它病原cDNA或者DNA的样品检测均为阴性，表明本发明建立的检测方法具有良好的特异性。

1.6敏感性试验

将质粒标准品按10倍倍比稀释，做9个稀释度的稀释(2.78×10⁹-2.78×10¹拷贝/μl)，分别取1μl作为所建立的荧光定量PCR检测的模板，确定所建立检测方法的最小检出量。同时设仅加水的阴性对照组。结果如图4A所示，本发明所建立的荧光定量检测方法最小检出量为278拷贝/μl，远远优于传统的RT-PCR检测方法(图4B)；对应Ct值约为32.27，根据3次实验重复的结果，最终确定当Ct≤33时，可以判定为阳性，当Ct值≥34时，判定为阴性。当33<Ct<34时，判定为可疑。

1.7重复性试验

本试验选取2.78×10⁷-2.78×10³copies/μl五个稀释度的质粒标准品，做了3批重复检测，每批次内每个稀释度均设3个重复，并计算批内和批间的标准差及变异系数，以评估所建立检测方法的稳定性，结果如表3所示。组内变异系数为0.3-1.0％；组间变异系数为0.8-2.0％，表明本发明所建立的荧光定量PCR检测方法具有良好的稳定性。

表3 SVA TaqMan探针法荧光定量PCR重复性试验结果

1.8临床样品检测

利用所建立的荧光定量PCR检测方法，对2018年11月份至2019年2月份之间所接收的15份疑似SVA感染的临床样品进行检测，其中包括棉拭子4份，水泡液6份，水泡皮4份，蹄甲1份，结果如表4所示。由表4可知，临床样品的SVA检测结果与RT-PCR检测结果一致，表明所建立的检测方法可以用于临床样品的检测。

表4 RT-PCR和qRT-PCR对临床样品SVA的检测结果

序列表

<110> 河南省农业科学院

<120> 基于TaqMan探针法的A型塞尼卡病毒荧光定量RT-PCR检测方法和试剂盒

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

cgggatccat gtccaccgac aacgccgaga ctgg 34

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

ccgctcgagc tattgcatca gcatcttctg ctt 33

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<220>

<221> misc_feature

<223> w=a或t

<400> 3

ctctgtctcw tccgtgcttc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<220>

<221> misc_feature

<223> r=g或a y=t或c

<400> 4

gtaaatrgty ccccagtcag 20

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

tccaagcttt cttctgccac gcggggt 27

Claims (8)

1.基于TaqMan探针法的A型塞尼卡病毒荧光定量PCR检测引物和探针，其特征在于，引物包括上游引物VP1-qFor和下游引物VP1-qRev，探针为VP1-Probe；各引物和探针的序列如下：

VP1-qFor：5’-CTCTGTCTCWTCCGTGCTTC-3’

VP1-qRev：5’-GTAAATRGTYCCCCAGTCAG-3’

VP1-Probe：5’-FAM-TCCAAGCTTTCTTCTGCCACGCGGGGT-BHQ1-3’。

2.一种基于TaqMan探针法的A型塞尼卡病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1的引物和探针、Premix Ex Taq^TM、ROX Reference Dye II、双蒸水。

3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照质粒标准品和阴性对照水。

4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，质粒标准品的制备方法为：以SVAcDNA为模板，利用VP1基因全长的特异性引物进行扩增，获得的目的基因片段经BamHI和SalI双酶切后连接至pE-SUMO Vector载体上，构建pE-SUMO-VP1重组质粒，经过测序鉴定后，测定其浓度并换算拷贝数，作为荧光定量RT-PCR检测的标准品。

5.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，特异性引物包括上游引物VP1-For：5’-CGGGATCCATGTCCACCGACAACGCCGAGACTGG-3’和下游引物VP1-Rev：5’-CCGCTCGAGCTATTGCATCAGCATCTTCTGCTT-3’。

6.一种利用权利要求1所述引物和探针的A型塞尼卡病毒荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待测样品的RNA，反转录得到cDNA，作为模板；

(2)利用引物和探针进行荧光定量PCR扩增，根据扩增结果，判断样品中A型塞尼卡病毒的情况。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，荧光定量PCR扩增的反应体系为：Premix Ex Taq^TM12.5μl、浓度均为5μM的上下游引物各1μl、浓度为5μM的探针1μl、ROXReference Dye II0.25μl、模板1μl，双蒸水8.25μl。

8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，荧光定量PCR扩增的反应条件为：95℃预变性20s；95℃变性3s，60℃退火并延伸30s，40个循环。