CN106916910A - 塞尼卡谷病毒TaqMan‑MGB荧光定量PCR检测引物、探针及检测方法 - Google Patents

塞尼卡谷病毒TaqMan‑MGB荧光定量PCR检测引物、探针及检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106916910A
CN106916910A CN201710327691.XA CN201710327691A CN106916910A CN 106916910 A CN106916910 A CN 106916910A CN 201710327691 A CN201710327691 A CN 201710327691A CN 106916910 A CN106916910 A CN 106916910A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mgb
taqman
virus
nika paddy
sai nika
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710327691.XA
Other languages
English (en)
Inventor
曾喜多
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Wens Foodstuff Group Co Ltd
Original Assignee
Guangdong Wens Foodstuff Group Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong Wens Foodstuff Group Co Ltd filed Critical Guangdong Wens Foodstuff Group Co Ltd
Priority to CN201710327691.XA priority Critical patent/CN106916910A/zh
Publication of CN106916910A publication Critical patent/CN106916910A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体涉及一种塞尼卡谷病毒TaqMan‑MGB荧光定量PCR检测特异性引物(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)、探针(SEQ ID NO:3)及检测方法，所述方法包括：绘制标准曲线；提取样本病毒RNA；逆转录样本病毒RNA；逆转录产物的TaqMan‑MGB荧光定量PCR反应及结果判读。本发明引物具有更好的特异性、灵敏性；本发明MGB探针更短，有利于探针设计，且提高了配对与非配对模板间的Tm值差异，使实验结果更稳定和精确；本发明方法具有简单快速、易操作、结果直观、灵敏度高、稳定性好、实时定量等优点，且缩短反应时间。

Description

塞尼卡谷病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR检测引物、探针及检测 方法
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域的检测方法，具体涉及一种塞尼卡谷病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR检测特异性引物、探针及检测方法。
背景技术
塞尼卡谷病毒(Seneca Valley virus，SVV)为单股正链RNA病毒，属于小核糖核酸病毒科(picornaviridae)Senecavirus病毒属。SVV最初是2002年在PER.C6细胞培养物中被发现，2007年认定SVV为导致美国一批屠宰场中的猪群出现水疱症状的致病原，直到2015年才出现新的报道，巴西和美国均爆发了多起SVV疫情，多个阶段的猪只均能感染，鼻镜、唇部和蹄部等部位出现水疱，并导致小天龄仔猪死亡，造成较大的损失。随后有报道显示国内也出现了塞尼卡谷病毒，由于之前国内从来没有出现过，因而没有现成的检测方法，直至目前国内仍少见塞尼卡谷病毒的检测方法，主要原因是该病为新病，相关研究较少，已有的RT-PCR检测方法只能进行定性检测不能做精确定量分析，且扩增后需要经过电泳判断结果，每次检测的样品数量较少、对低含量的样品分辨率不足等缺点。
由此可见，现有技术还有待改进。
发明内容
鉴于此，有必要针对上述问题提供一种塞尼卡谷病毒的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测引物、探针及检测方法，具有实时、快速、灵敏度高、特异性和稳定性好等优点，有利于较大规模的定量检测分析。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种塞尼卡谷病毒的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测引物，其核苷酸序列为：
上游引物：5’-TTATAGAATTTGGAAGCCATGCT-3’(SEQ ID NO:1)
下游引物：5’-ATCAGAATGCAGCTTCTCGAGTAG-3’(SEQ ID NO:2)。
一种塞尼卡谷病毒的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测探针，其核苷酸序列为：
5’-CCTACTTCAAACCAGGAAC-3’(SEQ ID NO:3)。
进一步的，所述探针的5’端标记荧光报告基团(FAM)；所述探针的3’端标记小沟结合物(MGB)和荧光淬灭基团(NFQ)。
一种塞尼卡谷病毒的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法：
(1)制定塞尼卡谷病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR标准曲线；
(2)提取样品中的病毒RNA，-20℃～-80℃冷冻保存备用；
(3)将(2)中的样品病毒RNA进行逆转录，所得逆转录cDNA产物-20℃～-80℃冷冻保存备用；
(4)将(3)所得的样本cDNA产物作为模板进行TaqMan-MGB荧光定量PCR反应；
(5)结合步骤(1)中的标准曲线，判读检测结果。
进一步的，所述TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法步骤(1)中，塞尼卡谷病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR标准曲线制定步骤是：
(1)在上述引物(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)两侧的基因组序列上，设计一对新的克隆引物pSV1U和pSV1D，其扩增片段长度为371bp，涵盖了荧光定量引物扩增片段(69bp)的全部，该对克隆引物的引物序列如下：
pSV1U：5’-ATCGCCAACGGTGACGA-3’(SEQ ID NO:4)；
pSV1D：5’-TGCTGGTACTCGTGACTC-3’(SEQ ID NO:5)，
(2)以塞尼卡谷病毒阳性样品RNA(即命名为CH-01-2015株(KT321458)的病毒病料)为模板，利用(1)中所得引物，进行一步法RT-PCR扩增，获得用于构建标准质粒的目的DNA片段；其中50μL反应体系为：PrimeScript 1Step Enzyme Mix：2μL，2×OneStepBuffer：25μL，SEQ ID NO:4(10μM)：2μL，SEQ ID NO:5(10μM)：2μL，模板RNA：1μL，无核酸酶蒸馏水：补足至50μL。反应程序为：50℃，30min；94℃，2min；(94℃，30s；55℃，30s；72℃，30s)30个循环；72℃，10min；4℃降温；
(3)将(2)中所得DNA片段与pMD19-T载体连接，转化大肠杆菌JM109感受态，挑取阳性克隆，进行测序鉴定后将重组菌扩大培养并抽提重组质粒；将提取的重组质粒按1010～101拷贝数/μL的浓度梯度稀释成标准质粒样品，分装成小管后-20℃～-80℃冷冻保存备用；
(4)将(3)所得的样本标准质粒作为模板，各浓度梯度样品分别进行TaqMan-MGB荧光定量PCR反应；
(5)根据步骤(4)的反应结果绘制塞尼卡谷病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR标准曲线。
进一步的，所述TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法步骤(3)中，
10μL逆转录体系为：5×Primer RT Master Mix:2μL，样品RNA:1～4μL，RNaseFree dH2O:补足至10μL；
逆转录程序为：37℃，15min；85℃，5s；4℃或16℃降温。
进一步的，所述TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法步骤(4)或塞尼卡谷病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR标准曲线制定方法步骤(4)中的TaqMan-MGB荧光定量PCR反应，
20μL反应体系为：
组分 用量(μL)
2×Premix Ex Taq(Probe qPCR) 10
上游引物SEQ ID NO:1(10μM) 1.2
下游引物SEQ ID NO:2(10μM) 1.6
MGB探针SEQ ID NO:3(10μM) 0.6
50×ROX Reference DyeII 0.4
标准质粒样品或样品cDNA模板 1.0
无核酸酶蒸馏水 补足至20μL
上表所述模板为样本RNA逆转录所得的cDNA产物或各浓度梯度的标准质粒；
反应程序为：95℃，30s；(95℃，5s；60℃，34s)40个循环。
本发明有益效果：
TaqMan-MGB探针法荧光定量PCR技术相比于目前的普通RT-PCR技术，具有简单快速、易操作、结果直观、灵敏度高、稳定性好、实时定量等优点，与SYBR等染料法荧光定量PCR技术相比，具有更好的特异性，并能缩短反应时间，而与TaqMan-TAMRA探针法荧光定量PCR技术相比，由于本发明引物序列在现有已报道的塞尼卡谷病毒中保守性好，与其它物种基因相似性低，特异性好,扩增片段长度短，扩增速度快；且使用了MGB，能提高Tm值，从而缩短探针长度，有利于探针设计，且提高了配对与非配对模板间的Tm值差异，使实验结果更稳定和精确。
附图说明
图1塞尼卡谷病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR标准曲线：从左至右分别对应浓度103～108copies/μL的标准质粒样品。
图2塞尼卡谷病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR方法特异性实验结果：图中S曲线为SVV阳性样品的扩增曲线。
图3塞尼卡谷病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR方法敏感性实验：从左至右的8条曲线分别对应浓度108～101copies/μL的标准质粒样品。
具体实施方式
为了更好地说明本发明所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果，现结合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是，本发明内容包含但不限于以下实施例及其组合实施方式。
实施例一
1.引物和TaqMan-MGB探针设计
从GenBank中检索获得塞尼卡谷病毒全基因组序列(GenBank登录号为NC_011349，KC667560和KT321458)，通过DNAstar软件进行序列比对，找出塞尼卡谷病毒基因组特异性的保守序列，然后BLAST进一步确定其保守性。
通过Oligo 6.0引物设计软件对该保守序列进行引物设计，得到一对特异性引物和一条MGB探针，引物和探针位于单一ORF的3’端附近(7021～7089位)，目的扩增片段为69bp。
上游引物：5’-TTATAGAATTTGGAAGCCATGCT-3’(SEQ ID NO:1)
下游引物：5’-ATCAGAATGCAGCTTCTCGAGTAG-3’(SEQ ID NO:2)
探针：FAM-5’-CCTACTTCAAACCAGGAAC-3’-MGB-NFQ(SEQ ID NO:3)
2.定量标准质粒的构建和制备
在上述引物(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)两侧的基因组序列上，设计一对新的克隆引物pSV1U和pSV1D，其扩增片段长度为371bp，涵盖了荧光定量引物扩增片段(69bp)的全部，该对克隆引物的引物序列如下：
pSV1U：5’-ATCGCCAACGGTGACGA-3’(SEQ ID NO:4)
pSV1D：5’-TGCTGGTACTCGTGACTC-3’(SEQ ID NO:5)；
以本实验室检测阳性并经测序鉴定过的塞尼卡谷病毒阳性样品(即命名为CH-01-2015株(KT321458)的病毒病料)RNA为模板，利用上述引物(SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5)，按照TaKaRa公司PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒说明书进行一步法RT-PCR扩增，其中50μL反应体系为：PrimeScript 1Step EnzymeMix：2μL，2×One StepBuffer：25μL，SEQ ID NO:4(10μM)：2μL，SEQ ID NO:5(10μM)：2μL，模板RNA：1μL，无核酸酶蒸馏水：补足至50μL。反应程序为：50℃，30min；94℃，2min；(94℃，30s；55℃，30s；72℃，30s)30个循环；72℃，10min；4℃降温。产物进行琼脂糖凝胶电泳后进一步进行胶回收，获得用于构建标准质粒的目的DNA片段。将此DNA片段与pMD19-T载体(购自TaKaRa公司)连接，转化大肠杆菌JM109感受态(购自TaKaRa公司)，挑取阳性克隆，并进行测序鉴定，鉴定后将重组菌扩大培养并抽提重组质粒。
鉴定好的重组质粒用核酸浓度测定仪测定质粒浓度，并换算为质粒拷贝数。质粒拷贝数(copies/μL)＝[质粒浓度(ng/μL)×6.02×1023]/[质粒分子量(g/mol)×109]。将重组质粒稀释成1010～101copies/μL的标准质粒浓度梯度，分装成小管后-70℃冻存备用。
3.样品中病毒RNA的提取
使用AxyGen的DNA/RNA小量提取试剂盒，按照使用说明书提取样品病毒RNA，-70℃保存。
4.样品中病毒RNA的逆转录
按照TaKaRa公司PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒说明书逆转录合成cDNA，10μL逆转录体系如下：5×Primer RT Master Mix:2μL，RNase Free dH2O:4μL，样品RNA:4μL。将各试剂混合均匀，置PCR仪中按以下程序进行：37℃15min，85℃5sec，4℃降温结束，反应结束后的cDNA产物-20℃保存用于荧光定量PCR检测。
5.TaqMan-MGB荧光定量PCR反应条件的优化
参照TAKARA Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)试剂盒使用说明书，通过对反应体系中不同的引物浓度、MGB探针浓度、退火温度等实验条件进行比较，选择反应灵敏度高、本底荧光信号低、具有典型S型扩增荧光信号曲线、扩增效率接近1的反应条件。经优化后的20μL反应体系如下表：
组分 用量(μL)
2×Premix Ex Taq(Probe qPCR) 10
上游引物(10μM) 1.2
下游引物(10μM) 1.6
MGB探针(10μM) 0.6
50×ROX Reference Dye II 0.4
标准质粒样品或样品cDNA模板 1.0
RNase Free dH2O 5.2
优化后的反应条件为：95℃30s；(95℃5s，60℃34s)40个循环。实时观察记录标准质粒样品或样品cDNA模板的试验结果。
将各浓度梯度的标准质粒样品分别经上述TaqMan-MGB荧光定量PCR反应，根据其结果绘制塞尼卡谷病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR标准曲线，如图1所示，得到的标准曲线线性关系良好，相关系数R2＝1.000，扩增效率为100.5％。
6.检测结果的判定
经检测，若待检样品中含有塞尼卡谷病毒基因则显示阳性扩增曲线，若待检样品中不含有塞尼卡谷病毒基因则无扩增信号。阳性样品中的塞尼卡谷病毒基因浓度可以通过标准曲线进行定量，即在标准曲线上找到某个样品所对应的Ct值，就能对应得到该样品的具体浓度。
实施例二 塞尼卡谷病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR方法特异性实验
分别以SVV阳性样品、PRV阳性样品、PCV2阳性样品、PRRSV阳性样品、FMDV阳性样品、PEDV阳性样品、RV阳性样品、CSFV阳性样品、PDCoV阳性样品为模板，以蒸馏水为阴性对照按实施例一中TaqMan-MGB荧光定量PCR反应的操作方法分别进行反应，实时观察并记录各样品反应结果，如图2所示，只有SVV阳性样品出现良好的S型曲线，其余样品均未出现扩增曲线，说明该方法特异性良好。
实施例三 塞尼卡谷病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR方法敏感性实验
以实施例一中制备的浓度梯度为101～108copies/μL的标准质粒样品作为模板，分别按照实施例一中TaqMan-MGB荧光定量PCR反应的操作方法分别进行反应，实时观察并记录各样品反应结果，如图3所示，所有浓度的样品均表现出良好的扩增曲线，说明该方法灵敏度好。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
<110> 广东温氏食品集团股份有限公司
<120> 塞尼卡谷病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR检测引物、探针及检
测方法
<160> 5
<170> Oligo 6.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttatagaatt tggaagccat gct 23
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atcagaatgc agcttctcga gtag 24
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cctacttcaa accaggaac 19
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atcgccaacg gtgacga 17
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgctggtact cgtgactc 18

Claims (8)

1.一种塞尼卡谷病毒的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测引物，其特征在于，所示引物核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
2.一种塞尼卡谷病毒的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测探针，其特征在于，所示探针核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针序列3’端的标记基团包括MGB基团。
4.一种塞尼卡谷病毒的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所示方法包括以下步骤：
(1)制定塞尼卡谷病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR标准曲线；
(2)提取样品中的病毒RNA，-20℃～-80℃冷冻保存备用；
(3)将(2)中的样品病毒RNA进行逆转录，所得逆转录cDNA产物-20℃～-80℃冷冻保存备用；
(4)将(3)所得的样本cDNA产物作为模板进行TaqMan-MGB荧光定量PCR反应；
(5)结合步骤(1)中的标准曲线，判读检测结果。
5.根据权利要求4所述的塞尼卡谷病毒的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，塞尼卡谷病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR标准曲线制定步骤包括：
(1)设计一对RT-PCR引物，序列分别如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示；
(2)以塞尼卡谷病毒阳性样品RNA为模板，利用(1)中所得引物，进行一步法RT-PCR扩增，获得用于构建标准质粒的目的DNA片段；
(3)将(2)中所得DNA片段与pMD19-T载体连接，转化大肠杆菌JM109感受态，挑取阳性克隆，进行测序鉴定后将重组菌扩大培养并抽提重组质粒；将提取的重组质粒按1010～101拷贝数/μL的浓度梯度稀释成标准质粒样品，分装成小管后-20℃～-80℃冷冻保存备用；
(4)将(3)所得的样本标准质粒作为模板，各浓度梯度样品分别进行TaqMan-MGB荧光定量PCR反应；
(5)根据步骤(4)的反应结果绘制塞尼卡谷病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR标准曲线。
6.根据权利要求4所述的塞尼卡谷病毒的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，
逆转录体系为：5×Primer RT Master Mix:2μL，样品RNA:1～4μL，RNase Free dH2O:补足至10μL；
逆转录程序为：37℃，15min；85℃，5s；4℃或16℃降温。
7.根据权利要求4所述的塞尼卡谷病毒的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述的TaqMan-MGB荧光定量PCR反应中，反应体系为：
反应程序为：95℃，30s；(95℃，5s；60℃，34s)40个循环。
8.根据权利要求5所述的塞尼卡谷病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR标准曲线制定方法，其特征在于，所述的TaqMan-MGB荧光定量PCR反应中，反应体系为：
反应程序为：95℃，30s；(95℃，5s；60℃，34s)40个循环。
CN201710327691.XA 2017-05-10 2017-05-10 塞尼卡谷病毒TaqMan‑MGB荧光定量PCR检测引物、探针及检测方法 Pending CN106916910A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710327691.XA CN106916910A (zh) 2017-05-10 2017-05-10 塞尼卡谷病毒TaqMan‑MGB荧光定量PCR检测引物、探针及检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710327691.XA CN106916910A (zh) 2017-05-10 2017-05-10 塞尼卡谷病毒TaqMan‑MGB荧光定量PCR检测引物、探针及检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106916910A true CN106916910A (zh) 2017-07-04

Family

ID=59568484

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710327691.XA Pending CN106916910A (zh) 2017-05-10 2017-05-10 塞尼卡谷病毒TaqMan‑MGB荧光定量PCR检测引物、探针及检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106916910A (zh)

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107326100A (zh) * 2017-07-17 2017-11-07 河南省动物疫病预防控制中心 口蹄疫和塞尼卡谷病毒二重实时荧光定量pcr检测试剂盒
CN107937618A (zh) * 2017-12-29 2018-04-20 中国检验检疫科学研究院 A型塞内卡病毒的微滴数字rt‑pcr检测引物和探针及其应用
CN107937617A (zh) * 2017-12-28 2018-04-20 广州维佰生物科技有限公司 检测塞内加谷病毒的rt‑lamp引物组合物及其试剂盒和方法
CN108034761A (zh) * 2017-12-14 2018-05-15 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 一种用于fmdv和sva鉴别的试剂、方法及应用
CN108300811A (zh) * 2018-04-18 2018-07-20 滕建芬 一种猪塞尼卡谷病毒的rt-pcr检测试剂盒及其检测方法
CN108384893A (zh) * 2018-05-03 2018-08-10 中国农业科学院兰州兽医研究所 用于检测口蹄疫病毒和塞尼卡谷病毒的实时荧光定量rt-pcr试剂盒及其应用
CN108384894A (zh) * 2018-05-03 2018-08-10 中国农业科学院兰州兽医研究所 用于检测塞尼卡谷病毒的Taqman实时荧光定量RT-PCR试剂盒及其应用
CN108707697A (zh) * 2018-07-10 2018-10-26 南京农业大学 塞尼卡谷病毒的lamp检测引物对及检测方法
CN109234464A (zh) * 2018-11-23 2019-01-18 山东新希望六和集团有限公司 用于检测塞尼卡谷病毒的引物及探针、荧光定量pcr试剂盒及方法和应用
CN109913591A (zh) * 2019-04-30 2019-06-21 河南省农业科学院 基于TaqMan探针法的A型塞尼卡病毒荧光定量RT-PCR检测方法和试剂盒
CN110257554A (zh) * 2018-03-12 2019-09-20 金宇保灵生物药品有限公司 塞尼卡谷病毒的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物和TaqMan探针
CN111944881A (zh) * 2020-06-29 2020-11-17 浙江大学 一种新型快速实时荧光定量pcr方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103205512A (zh) * 2013-05-09 2013-07-17 广东温氏食品集团股份有限公司 检测猪萨佩罗病毒的引物、Taqman-MGB探针及试剂盒
CN103525944A (zh) * 2013-11-05 2014-01-22 重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心 猪源衣原体Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和检测方法
CN104388595A (zh) * 2014-12-10 2015-03-04 新疆天康畜牧生物技术股份有限公司 猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR MGB-TaqMan探针检测方法
CN106435007A (zh) * 2016-12-26 2017-02-22 广东温氏食品集团股份有限公司 一种荧光定量pcr检测猪丹毒杆菌的引物、探针、试剂盒及方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103205512A (zh) * 2013-05-09 2013-07-17 广东温氏食品集团股份有限公司 检测猪萨佩罗病毒的引物、Taqman-MGB探针及试剂盒
CN103525944A (zh) * 2013-11-05 2014-01-22 重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心 猪源衣原体Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒和检测方法
CN104388595A (zh) * 2014-12-10 2015-03-04 新疆天康畜牧生物技术股份有限公司 猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR MGB-TaqMan探针检测方法
CN106435007A (zh) * 2016-12-26 2017-02-22 广东温氏食品集团股份有限公司 一种荧光定量pcr检测猪丹毒杆菌的引物、探针、试剂盒及方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
朱水芳: "《实时荧光聚合酶链反应PCR检测技术》", 31 July 2003, 中国计量出版社 *
朴英实等: "《分子病理生物学实验技术指南》", 31 January 2015, 人民军医出版社 *
梵晓旭等: "塞尼卡谷病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立", 《中国预防兽医学报》 *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107326100A (zh) * 2017-07-17 2017-11-07 河南省动物疫病预防控制中心 口蹄疫和塞尼卡谷病毒二重实时荧光定量pcr检测试剂盒
CN108034761A (zh) * 2017-12-14 2018-05-15 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 一种用于fmdv和sva鉴别的试剂、方法及应用
CN107937617A (zh) * 2017-12-28 2018-04-20 广州维佰生物科技有限公司 检测塞内加谷病毒的rt‑lamp引物组合物及其试剂盒和方法
CN107937618A (zh) * 2017-12-29 2018-04-20 中国检验检疫科学研究院 A型塞内卡病毒的微滴数字rt‑pcr检测引物和探针及其应用
CN110257554A (zh) * 2018-03-12 2019-09-20 金宇保灵生物药品有限公司 塞尼卡谷病毒的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物和TaqMan探针
CN108300811A (zh) * 2018-04-18 2018-07-20 滕建芬 一种猪塞尼卡谷病毒的rt-pcr检测试剂盒及其检测方法
CN108384893A (zh) * 2018-05-03 2018-08-10 中国农业科学院兰州兽医研究所 用于检测口蹄疫病毒和塞尼卡谷病毒的实时荧光定量rt-pcr试剂盒及其应用
CN108384894A (zh) * 2018-05-03 2018-08-10 中国农业科学院兰州兽医研究所 用于检测塞尼卡谷病毒的Taqman实时荧光定量RT-PCR试剂盒及其应用
CN108707697A (zh) * 2018-07-10 2018-10-26 南京农业大学 塞尼卡谷病毒的lamp检测引物对及检测方法
CN109234464A (zh) * 2018-11-23 2019-01-18 山东新希望六和集团有限公司 用于检测塞尼卡谷病毒的引物及探针、荧光定量pcr试剂盒及方法和应用
CN109913591A (zh) * 2019-04-30 2019-06-21 河南省农业科学院 基于TaqMan探针法的A型塞尼卡病毒荧光定量RT-PCR检测方法和试剂盒
CN111944881A (zh) * 2020-06-29 2020-11-17 浙江大学 一种新型快速实时荧光定量pcr方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106916910A (zh) 塞尼卡谷病毒TaqMan‑MGB荧光定量PCR检测引物、探针及检测方法
CN107630109A (zh) 一种检测新型猪急性腹泻综合征冠状病毒的荧光定量pcr引物及试剂盒
CN103397107B (zh) 牛病毒性腹泻病毒荧光定量rt-pcr检测试剂盒
CN101775440A (zh) 一种转基因大豆检测用质粒标准分子及其构建方法
CN104195268A (zh) 检测口蹄疫A型、O型和Asia 1型病毒的试剂盒及制备方法
CN112080584A (zh) 一种检测大口黑鲈病毒的引物及探针、试剂盒和方法
CN108866244A (zh) 检测对虾虹彩病毒的rpa引物和探针、试剂盒及其方法
CN105112564A (zh) 一种运用连接酶检测高危型HPV E6/E7 mRNA的方法及试剂盒
CN110453014A (zh) 检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针组合以及试剂盒和检测方法
CN113862393A (zh) 一种快速检测格特隐球菌的方法
CN108504778A (zh) 一种同时检测猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒的试剂盒及应用
CN106636459A (zh) 一种美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光rt‑rpa特异性检测
CN103725794A (zh) 检测prrsv的荧光定量rt-pcr引物、探针及其方法
CN104673936A (zh) 猪传染性胃肠炎病毒N基因RT-qPCR检测方法及其引物和TaqMan探针
CN103740864A (zh) 一种高致病性猪蓝耳病毒荧光定量qRT-PCR检测方法及检测试剂盒
CN101294226B (zh) 一种检测汉坦病毒基因组的rt-pcr法
CN102994641A (zh) 一种猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法
CN112981007A (zh) 一种检测汉滩型汉坦病毒的试剂盒及其检测方法
CN111471802A (zh) 一种猪德尔塔冠状病毒快速检测引物、试剂盒及其应用
CN111690759A (zh) 柑橘溃疡病菌rpa检测的特异引物、试剂盒和方法
CN115976286A (zh) 一种通用型猪蓝耳病毒检测引物组合物、试剂盒及检测方法
CN105950788A (zh) 检测18种高危型hpv核酸的引物、探针及试剂盒
CN106521038B (zh) 一种高灵敏度的bhv‑2实时荧光定量pcr检测方法及试剂盒
CN113913557A (zh) 一种快速检测汉坦病毒seov-s4亚型的试剂盒及其检测方法
CN104087665B (zh) 一种检测黄曲霉及烟曲霉的通用引物及实时荧光tHDA试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Zeng Xiduo

Inventor after: Chen Junwei

Inventor after: Chen Yanshan

Inventor after: He Xiaoming

Inventor after: Ling Baoming

Inventor after: Wen Weiyi

Inventor after: Pang Shixu

Inventor after: Wei Junhe

Inventor before: Zeng Xiduo

CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: 527499 9 East Causeway North Road, Xinxing County new town, Yunfu, Guangdong

Applicant after: Winson food group Limited by Share Ltd

Address before: 527499 9 East Causeway North Road, Xinxing County new town, Yunfu, Guangdong

Applicant before: Guangdong Wens Foodstuff Group Co., Ltd.

RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170704