CN108034761A

CN108034761A - 一种用于fmdv和sva鉴别的试剂、方法及应用

Info

Publication number: CN108034761A
Application number: CN201711339422.1A
Authority: CN
Inventors: 花群义; 林彦星; 花群俊; 曹琛福; 杨俊兴; 黄超华; 曾少灵; 阮周曦; 张彩虹; 林庆燕
Original assignee: Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Current assignee: Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority date: 2017-12-14
Filing date: 2017-12-14
Publication date: 2018-05-15

Abstract

本申请公开了一种用于FMDV和SVA鉴别的试剂、方法及应用。本申请的试剂包括FMDV引物探针组和SVA引物探针组；FMDV引物探针组的上下游引物分别为Seq ID No.1和2所示序列，探针为Seq ID No.3或其反向互补序列；SVA引物探针的上下游引物分别为Seq ID No.4和5所示序列，探针为Seq IDNo.6或其反向互补序列。本申请的试剂，能同时对FMDV和SVA进行检测和鉴别，特异性强、灵敏度高，为口蹄疫病毒和猪A型塞内卡病毒的鉴别检测提供了一种高效技术手段。本申请的试剂，适用于两种疫病的快速鉴别检测。

Description

一种用于FMDV和SVA鉴别的试剂、方法及应用

技术领域

本申请涉及口蹄疫病毒和猪A型塞内卡病毒检测鉴别领域，特别是涉及一种用于FMDV和SVA鉴别的试剂、方法及应用。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-mouth disease,缩写FMD)是由口蹄疫病毒 (Foot-and-mouthdisease virus,缩写FMDV)引起的一种感染猪、牛、羊等偶蹄动物的急性、热性、接触传染性动物疫病，染病动物出现高热，临床症状以口腔黏膜、乳头皮肤及蹄冠部皮肤出现水泡及糜烂为主要特征，幼畜出现出血性胃肠炎和心肌炎。世界动物卫生组织(OIE)将口蹄疫列为法定报告疫病，我国将其列为一类动物疫病。

猪A型塞内卡病毒(Senecavirus A,缩写SVA)与FMDV、猪水泡病病毒 (缩写SVDV)同属小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)。在2007年之前，SVA 主要作为溶瘤细胞被研究，用于治疗某些神经内分泌肿瘤，一直被认为是一种非致病性病毒。但是，之后的研究显示，猪鼻镜出现水泡，蹄部冠状带溃烂等类似水疱病症状，这些样品通过PCR检测确定为SVA阳性。事实表明，SVA并不是非致病性病毒，SVA曾在巴西大规模爆发，导致仔猪死亡，造成严重的经济损失。并且，我国部分地区也相继出现猪场感染SVA的情况，因此有必要研发相应的检测、鉴别试剂或方法。

由于SVA是一种新发现的动物传染病，染病猪临床症状主要表现为鼻镜及蹄部冠状带处出现水泡、溃烂创面等水泡性病变，与FMDV造成的口蹄疫极为相似，若未能及时作出准确的鉴别诊断，将会导致防控措施采取不当，进而造成严重的后果。因此，亟需建立能够同时鉴别检测FMDV和SVA的方法或试剂盒，以便于科学合理应对FMDV和SVA的疫病防控。

发明内容

本申请的目的是提供一种用于FMDV和SVA鉴别的试剂、方法及应用。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种用于FMDV和SVA鉴别的试剂，该试剂包括可以进行双重实时荧光RT-PCR检测FMDV和SVA的FMDV引物探针组和SVA 引物探针组；FMDV引物探针组由FMDV特异性引物对和FMDV特异性探针组成，FMDV特异性引物对的上游引物为Seq IDNo.1所示序列，下游引物为Seq ID No.2所示序列，FMDV特异性探针为Seq ID No.3所示序列或者Seq ID No.3所示序列的反向互补序列；SVA引物探针组由SVA特异性引物对和SVA特异性探针组成，SVA特异性引物对的上游引物为Seq ID No.4所示序列，下游引物为 Seq IDNo.5所示序列，SVA特异性探针为Seq ID No.6所示序列或者Seq ID No.6 所示序列的反向互补序列；FMDV特异性探针和SVA特异性探针，两者具有不同的荧光基团，具有相同或不同的荧光淬灭基团。其中，由于两条探针是用于双重实时荧光RT-PCR检测，所以，两条探针具有不同的荧光基团；至于荧光淬灭基团可以相同也可以不同，在此不做具体限定。

Seq ID No.1：5’-CAGGATGATGATTGGCAGAT-3’

Seq ID No.2：5’-ATCTTTGCCAATCAACATCA-3’

Seq ID No.3：5’-TGCACTCAAACAACGGACCGC-3’

Seq ID No.4：5’-CCAACAAGGGTTCCGTCTTC-3’

Seq ID No.5：5’-TTGGACGAATTTGCGTTTTAGA-3’

Seq ID No.6：5’-CTCCGACTTCCTCTCTCTCCGATGCTGT-3’

需要说明的是，本申请的试剂特别设计了FMDV和SVA双重实时荧光 RT-PCR引物和探针，一方面，FMDV特异性引物对和SVA特异性引物对，两组引物对能够在一个反应体系中进行反应，而不相互干扰，能够各自保持其特异性扩增；另一方面，FMDV特异性探针和SVA特异性探针，两条探针也能够特异性的结合到各自的靶标上，而不会出现特异性结合或者干扰另一条探针的特异性结合。本申请的一种实现方式中，针对FMDV靶标设计了3条特异性上游引物、3条特异性下游引物和2条特异性探针；针对SVA靶标设计了三组特异性引物和探针，并且第三组特异性引物和探针中设计了3条特异性上游引物、 3条特异性下游引物和2条特异性探针；对以上引物和探针进行试验筛选，最终筛选出适用于双重实时荧光RT-PCR检测FMDV和SVA的FMDV引物探针组和SVA引物探针组，即Seq ID No.1所示序列至Seq IDNo.6所示序列的特异性引物和特异性探针。

本申请的试剂能够同时特异性的检测FMDV和SVA，并能够有效区分鉴别 FMDV和SVA，为口蹄疫或猪A型塞内卡病毒引起的疫病的准确鉴别诊断提供了科学依据，对两者的有效防控具有重要意义。

优选的，FMDV特异性探针的5’端具有HEX荧光基团，3’端具有BHQ2荧光淬灭基团。

优选的，SVA特异性探针的5’端具有FAM荧光基团，3’端具有BHQ1荧光淬灭基团。

本申请的另一方面公开了本申请的试剂在FMDV和/或SVA的检测中的应用。

本申请的另一方面公开了本申请的试剂在制备FMDV和/或SVA的检测试剂盒或设备中的应用。

本申请的另一方面公开了一种同时检测FMDV和SVA的试剂盒，该试剂盒中包括本申请的试剂。

优选的，试剂盒中还包括用于实时荧光RT-PCR的反应液和酶。

本申请的再一方面公开了一种同时检测FMDV和SVA的方法，包括采用本申请的试剂，或者本申请的试剂盒，对待测对象的核酸进行双重实时荧光RT-PCR扩增。

需要说明的是，本申请的检测方法或试剂盒，都是基于本申请的FMDV和 SVA鉴别试剂而构建的，因此，可以用于单独的对FMDV或SVA进行检测鉴别，也可以用于对两者进行同时检测或鉴别，具体根据使用需求而定。此外，本申请的试剂中，虽然FMDV引物探针组和SVA引物探针组可以进行双重实时荧光 RT-PCR检测；但是，由于各引物探针组都具有很强的特异性，在不同的使用需求下也可以单独使用。进一步的，FMDV特异性引物对或SVA特异性引物对也同样具有很强的特异性，也可以单独或者组合使用对FMDV和/或SVA进行检测鉴别；可以理解，如果不是进行实时荧光RT-PCR检测，两组引物可以进行双重常规PCR扩增，然后再对扩增产物进行检测即可，而不需要采用特异性探针。相同的，FMDV特异性探针和SVA特异性探针，同样具有很强的特异性，能够单独使用，而不借助于特异性引物对；并且，如果不是进行实时荧光RT-PCR检测，两条探针甚至可以不用设置荧光基团和荧光淬灭基团，两条探针序列可以根据所采用的检测方法，在序列两端进行相应的修饰，在此不做具体限定。

本申请的有益效果在于：

本申请用于FMDV和SVA鉴别的试剂，其中包括可以进行双重实时荧光 RT-PCR检测FMDV和SVA的FMDV引物探针组和SVA引物探针组，能够同时对FMDV和SVA进行检测和区分鉴别，并且，特异性强、灵敏度高，为口蹄疫和猪A型塞内卡病毒的鉴别检测提供了一种高效的技术手段。本申请的试剂，为两种疫病的治疗和预防提供了重要的科学依据，这对于两种疫病的快速防控，减少经济损失，最大限度的保障生产安全具有重大意义。

附图说明

图1是本申请实施例中用于FMDV和SVA鉴别的试剂对FMDV和SVA的特异性检测结果；

图2是本申请实施例中用于FMDV和SVA鉴别的试剂对FMDV的灵敏度检测结果；

图3是本申请实施例中用于FMDV和SVA鉴别的试剂对SVA的灵敏度检测结果。

具体实施方式

FMDV和SVA同属于小核糖核酸病毒科，并且，两者引发的疫病相似性极高，因此，无论是病征症状区分，还是一般的病毒检测手段，都很难将两者区分。本申请在对FMDV和SVA进行长期的研究过程中发现，针对两者的3D基因序列可以设计出适用于双重实时荧光RT-PCR检测的特异性引物和探针，从而提出本申请。

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

一、材料与方法

1.供试核酸

本例使用的口蹄疫病毒(FMDV)、猪A型塞内卡病毒(SVA)、伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪水泡病病毒(SVDV)、印第安纳型水泡性口炎病毒(VSV-IN)和新泽西型水泡性口炎病毒(VSV-NJ)等灭活毒株均由深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心(下称“深圳检验检疫局动植中心”) 提供和保藏。

2.主要的试剂和仪器

病毒RNA抽提试剂盒MagMAXTM-96Viral RNA Isolation Kit(AM1836)为美国Thermo公司产品。AgPath-ID^TM One-Step RT-PCR kit为ABI公司产品。

Thermo全自动磁珠提取纯化系统，BioDrop超微量核酸蛋白浓度分析仪，ABI 7500荧光定量PCR仪，Eppendorf 5415R型高速离心机等。

3.核酸的提取

使用Thermo病毒RNA抽提试剂盒MagMAXTM-96Viral RNA Isolation Kit(AM1836)及磁珠纯化系统提取病毒核酸，具体操作方法按照核酸抽提试剂盒和全自动磁珠提取纯化系统说明书进行。分别从各灭活毒株中提取核酸，保存于-80℃，备用。

4.引物和探针的设计与筛选

本例根据口蹄疫病毒3D基因序列、猪A型塞内卡病毒3D基因序列分别设计了多条引物和探针。设计好引物和探针后，通过BLAST比较确定其特异性，然后再用于后续试验。用于口蹄疫病毒的引物和探针具体序列如表1所示，用于猪A型塞内卡病毒的引物和探针具体序列如表2所示。本例所有的引物和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成与修饰。

表1 FMDV供试引物和探针

引物或探针名称	序列(5’→3’)	SEQ ID No.
			F&M-F1	TGATGATTGGCAGATTTTGT	7
F&M-F2	CAGGATGATGATTGGCAGAT	1
			F&M-F3	TCTTTACACCAGGATGATGAT	8
F&M-R1	ATCTTTGCCAATCAACATCA	2
			F&M-R2	TGCCAATCAACATCAGGRT	9
F&M-R3	ACACGTTTCTGTACTGAGCAA	10
			F&M-P1	TGCACTCAAACAACGGACCGC	3
F&M-P2	CAACGGACCGCAAATTGGCTCG	11

表1中，SEQ ID No.3所示序列的F&M-P1和SEQ ID No.11所示序列的 F&M-P2探针，5’端基修饰HEX，3’末端修饰BHQ2；SEQ ID No.9所示序列中“R”为简并碱基，代表A或G。

表2 SVA供试引物和探针

表2中，SEQ ID No.6所示序列的SVV-3D-Probe4，SEQ ID No.13所示序列的SVV-3D-Probe1，SEQ ID No.16所示序列的SVV-3D-Probe2和SEQ ID No.22 所示序列的SVV-3D-Probe3探针，5’端基修饰FAM，3’末端修饰BHQ1。

5.反应体系和反应条件

本例采用ABI AgPath-ID^TM One-Step RT-PCR kit试剂盒进行双重荧光 RT-PCR扩增。

反应体系为25μL。其中2×Buffer 12.5μL，四条浓度分别为10μM的引物各1μL，两条浓度分别为10μM的探针各0.5μL，核酸模板4μL，DEPC水补足至25μL，混匀。将上述反应管置于ABI 7500荧光定量PCR仪中，反应条件为 45℃反转录10min；95℃预变性10min；然后进行40个循环：95℃15s，60℃40s，循环过程中，在60℃时同时收集HEX和FAM两种荧光信号。

其中，四条浓度为10μM的引物是指用于扩增口蹄疫病毒核酸的上游引物和下游引物，以及用于扩增猪A型塞内卡病毒的上游引物和下游引物；两条浓度为10μM的探针是指分别用于口蹄疫病毒核酸和猪A型塞内卡病毒的特异性探针。

6.引物和探针筛选

在筛选的过程中，先采用其中一条上游引物，对下游引物进行筛选，然后再根据筛选出来的下游引物，再去筛选上游引物，以获得最佳的双重荧光 RT-PCR引物探针组合。引物和探针筛选采用“5.反应体系和反应条件”。

7.特异性试验

采用筛选的引物和探针组合，按“5.反应体系和反应条件”，对FMDV、SVA、 PRV、CSFV、SVDV、VSV-IN、VSV-NJ等7种核酸模板进行检测，每个检测孔同时收集HEX和FAM两种荧光信号。并设置一个空白水对照。

8.敏感性试验

分别将FMDV核酸和SVA核酸按10倍梯度稀释至10^-8，采用各梯度浓度的稀释核酸模板，按“5.反应体系和反应条件”进行双重荧光RT-PCR试验，试验中设置一个水空白对照，以测试引物探针的灵敏性。

二、结果和分析

1.引物和探针筛选

经过筛选，本例最终从表1的引物探针中，筛选出Seq ID No.1所示序列的上游引物F&M-F2、Seq ID No.2所示序列的下游引物F&M-R1和Seq ID No.3 所示序列的探针F&M-P，该引物和探针组合作为FMDV引物探针组，用于对 FMDV进行特异性检测；从表2的引物探针中，筛选出Seq ID No.3所示序列的上游引物SVV-3D-F5、Seq ID No.4所示序列的下游引物SVV-3D-R6和Seq ID No.5所示序列的探针SVV-3D-Probe4，该引物和探针组合作为SVA引物探针组，用于对SVA进行特异性检测。所筛选出来的FMDV引物探针组和SVA引物探针组，具有较好的特异性，并且能够适用于FMDV和SVA的双重实时荧光 RT-PCR检测。

2.特异性试验结果

特异性检测结果如图1所示，图中，曲线1为FMDV核酸的检测结果、曲线2为SVA核酸的检测结果、曲线3-8分别为PRV、CSFV、SVDV、VSV-IN、 VSV-NJ核酸和水空白对照的检测结果。可见，以FMDV核酸为模板的反应孔收集到HEX荧光信号，呈阳性；以SVA核酸为模板的反应孔收集到FAM荧光信号，呈阳性；其它核酸模板和空白对照都未出现扩增曲线，呈阴性。因此，本例的引物和探针能准确鉴别检测FMDV和SVA，并且对PRV、CSFV、SVDV、 VSV-IN和VSV-NJ核酸无交叉反应，具有良好的特异性。

3.敏感性试验结果

FMDV敏感性检测结果图2所示，图中，曲线1至曲线7依序为FMDV核酸稀释度分别为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的扩增曲线，曲线8-10 依序为10^-7、10^-8和水空白对照的扩增曲线。由检测结果可知，本例中双重荧光 RT-PCR最低可以检测到所提取FMDV核酸10^-6稀释度。SVA敏感性检测结果图3所示，图中，曲线1至曲线7依序为SVA核酸稀释度分别为10⁰、10^-1、10^-2、 10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的扩增曲线，曲线8-10依序为10^-7、10^-8和水空白对照的扩增曲线。由检测结果可知，本例中双重荧光RT-PCR最低可以检测到所提取 SVA核酸10^-6稀释度。

可见，本例用于同时鉴别检测口蹄疫病毒和猪A型塞内卡病毒的双重荧光 RT-PCR方法和试剂特异性强、灵敏度高，为口蹄疫和猪A型塞内卡的鉴别检测提供一种高效的技术手段。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心

<120> 一种用于FMDV和SVA鉴别的试剂、方法及应用

<130> 17I25316

<160> 22

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caggatgatg attggcagat 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atctttgcca atcaacatca 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgcactcaaa caacggaccg c 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccaacaaggg ttccgtcttc 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttggacgaat ttgcgtttta ga 22

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctccgacttc ctctctctcc gatgctgt 28

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgatgattgg cagattttgt 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tctttacacc aggatgatga t 21

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> r

<222> (18)..(18)

<223> A or G

<400> 9

tgccaatcaa catcaggrt 19

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

acacgtttct gtactgagca a 21

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

caacggaccg caaattggct cg 22

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggctcaacat tctggaaaag aag 23

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atagattgat gcaccccttc gctgactacg 30

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cgaacaaggc cctccatctt 20

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tggaagccat gctctcctac t 21

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ccaggaacac tactcgagaa gctgcaat 28

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cttcttttcc agaatgttga gcc 23

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tgcacccctt cgctgactac 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gccaacaagg gttccgtctt 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

aatcgaacaa ggccctccat 20

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tggacgaatt tgcgttttag aa 22

<210> 22

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

taccgagtca cgagtacctg caggcaa 27

Claims

1.一种用于FMDV和SVA鉴别的试剂，其特征在于：所述试剂包括可以进行双重实时荧光RT-PCR检测FMDV和SVA的FMDV引物探针组和SVA引物探针组；

所述FMDV引物探针组由FMDV特异性引物对和FMDV特异性探针组成，FMDV特异性引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列，下游引物为Seq ID No.2所示序列，所述FMDV特异性探针为Seq ID No.3所示序列或者Seq ID No.3所示序列的反向互补序列；

所述SVA引物探针组由SVA特异性引物对和SVA特异性探针组成，SVA特异性引物对的上游引物为Seq ID No.4所示序列，下游引物为Seq ID No.5所示序列，所述SVA特异性探针为Seq ID No.6所示序列或者Seq ID No.6所示序列的反向互补序列；

所述FMDV特异性探针和SVA特异性探针，两者具有不同的荧光基团，具有相同或不同的荧光淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于：所述FMDV特异性探针的5’端具有HEX荧光基团，3’端具有BHQ2荧光淬灭基团。

3.根据权利要求1或2所述的试剂，其特征在于：所述SVA特异性探针的5’端具有FAM荧光基团，3’端具有BHQ1荧光淬灭基团。

4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂在FMDV和/或SVA的检测中的应用。

5.根据权利要求1-3任一项所述的试剂在制备FMDV和/或SVA的检测试剂盒或设备中的应用。

6.一种同时检测FMDV和SVA的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括权利要求1-3任一项所述的试剂。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括用于实时荧光RT-PCR的反应液和酶。

8.一种同时检测FMDV和SVA的方法，其特征在于：包括采用权利要求1-3任一项所述的试剂，或者权利要求6或7所述的试剂盒，对待测对象的核酸进行双重实时荧光RT-PCR扩增。