CN106350611B - 用于h5n8禽流感病毒检测的试剂、检测方法及应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了用于H5N8禽流感病毒检测的试剂、检测方法及应用。本申请用于H5N8禽流感病毒检测的试剂，包括引物对和探针，探针在引物对扩增靶标区域内，引物对上游引物为Seq ID No.1所示序列，下游引物为Seq ID No.2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列或Seq ID No.3所示序列的反向互补序列。本申请的H5N8禽流感病毒检测试剂，对禽流感亚种H5N8具有很强特异性，能够准确灵敏的从众多禽流感病毒中特异性检出H5N8。基于本申请试剂的H5N8禽流感病毒检测方法，耗时短，可很快作出判定结果，对于控制流感流行，减少经济损失，最大限度保护社会人群健康和生命具有很大意义。

Description

用于H5N8禽流感病毒检测的试剂、检测方法及应用

技术领域

本申请涉及禽流感病毒检测领域，特别是涉及一种用于H5N8禽流感病毒检测的试剂、检测方法及应用。

背景技术

禽流感是禽流行性感冒的简称，它是由甲型流感病毒的一种亚型(也称禽流感病毒)引起的一种急性传染病，也能感染人类，被国际兽疫局定为甲类传染病。人感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高，通常人感染禽流感死亡率约为33％。此病可通过消化道、呼吸道、皮肤损伤和眼结膜等多种途径传播。流感病毒属正黏病毒科,由8条单股负链RNA构成基因组。流感病毒根据核心蛋白(NP)及基质(M)的抗原性不同，可分为A、B、C三型,其中致病性最强、在世界上流行最广的是A型流感病毒。A型流感病毒根据表面糖蛋白凝血素(HA)的不同,可以分为15个亚型，H1-H15，根据表面糖蛋白神经氨酸酶(NA)的不同可以分为9个亚型N1-N9，因此理论上共有135种亚型组合。H5N8禽流感病毒是禽流感病毒的一种亚型。

流感危害极大，变异极强，宿主范围极广，是传播性极强的传染病和人兽共患病，是WHO、FDA、OIE等国际组织联合倡导全球共同防控的重大疫病。流感病毒有抗原漂移和抗原转变的要求，变异性极大，不断涌现新的病毒，近年来新型病毒出现的频率明显加大。1997年香港首次报道H5N1、H9N2感染人，2004年出现H5N1全球性流行，2013年3月在我国首先出现了H7N9型禽流感，2014年12月20日和2015年1月27新增83起人感染甲型H7N9禽流感病毒。H5N2禽流感在东亚多国──主要在越南、韩国、泰国──严重爆发，并造成越南多名病人丧生，中国河北省保定市首次发生H5N2禽流感疫情。2016年前后，广东肇庆和深圳接连出现H5N6流感病例，深圳2例病例中，一人已经死亡。自2014年8月以来，中国境内广东、湖南等12个省份家禽共发生新型H5N6高致病性禽流感25起，我国周边日本、韩国、俄罗斯也均有H5N6发生流行，新出现的H5N6逐步代替H5N1而成为家禽和人群中的优势流行毒株。2014年开始，H5N8开始在欧洲、亚洲和俄罗斯家禽中大规模流行，由于家禽与人的接触关系密切，H5N8必然会传染给人类。

基于时效性和准确性上的优势，实时荧光RT-PCR技术已经在疫病检测的很多项目上逐步取代了一般RT-PCR方法，成为疫病检测领域最常用的分子生物学方法。但是到目前为止，我国目前尚没有比较有效的H5N8禽流感病毒的检测试剂和方法的报道。

发明内容

本申请的目的是提供一种用于H5N8禽流感病毒检测的试剂、检测方法及应用。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种用于H5N8禽流感病毒检测的试剂，该试剂包括引物对和探针，探针在引物对的扩增靶标区域内，引物对的上游引物为Seq ID No.2所示序列，引物对的下游引物为Seq ID No.3所示序列，探针为Seq ID No.1所示序列或者Seq ID No.1所示序列的反向互补序列；

Seq ID No.1：5’-CTGCACATAAATACCCAACYCTGTA-3’

Seq ID No.2：5’-TGAGGAATGTTCTTGTTATCCAAATGA-3’

Seq ID No.3：5’-CCACTGTATCCCGACCAATT-3’

Seq ID No.1所示序列中，Y为C或者T碱基。

需要说明的是，Seq ID No.1所示序列中Y为简并碱基，其可以为C或者T碱基。本申请中，探针为Seq ID No.1所示序列或者Seq ID No.1所示序列的反向互补序列，可以理解，在实时荧光检测中，探针是特异性的结合到双链的其中一条链的，只要PCR扩增的时候，将结合的探针破坏，即可产生荧光信号，因此，可以采用Seq ID No.1所示序列的探针结合到其中一条链上，也可以采用Seq ID No.1所示序列的反向互补序列作为探针结合到另一条链上。

优选的，探针的5’端标记有HEX荧光基因，3’端标记有BHQ淬灭基团。

本申请的另一面公开了本申请的用于H5N8禽流感病毒检测的试剂在H5N8禽流感病毒检测中的应用。

本申请的另一面公开了本申请的用于H5N8禽流感病毒检测的试剂在制备H5N8禽流感病毒检测试剂盒或设备中的应用。

可以理解，本申请的试剂，实际上就针对H5N8禽流感病毒设计的特异性探针和引物，当然可以用于H5N8禽流感病毒的检测，或者用于H5N8禽流感病毒检测的试剂盒或设备。

本申请的另一面公开了一种用于H5N8禽流感病毒检测的试剂盒，该试剂盒中含有本申请的用于H5N8禽流感病毒检测的试剂。

本申请的另一面公开了一种用于H5N8禽流感病毒检测的试剂盒，该试剂盒中含有至少一组混合试剂，每组混合试剂由12.5μL 2×real time PCR Buffer、1μL 25×enzymemix、终浓度0.4μM/L的引物对和终浓度0.2μM/L的探针组成；引物对的上游引物为Seq IDNo.2所示序列，引物对的下游引物为Seq ID No.3所示序列，探针为Seq ID No.1所示序列或者Seq ID No.1所示序列的反向互补序列。

需要说明的是，本申请的试剂实际上是针对H5N8禽流感病毒逆转录实时荧光PCR检测而设计的，为了方便使用，本申请将反应体系中使用的buffer、酶、引物和探针统一配制成混合试剂，每一组混合试剂就是一个反应体系，直接向其中加入RNA样品就可以进行检测，使用简单方便，不仅避免了配制反应体系的繁琐步骤，而且避免了配制反应体系过程造成的污染。

本申请的再一面还公开了一种H5N8禽流感病毒的逆转录实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样品的基因组RNA；

(2)采用权利要求6所述的试剂盒，向所述混合试剂中加入步骤(1)提取的基因组RNA，配制成反应溶液；

(3)将步骤(2)配制的反应溶液，在45℃反转录30min、95℃热启动10min，然后进入40个循环：95℃15s、60℃45s，在循环过程中于60℃时采集荧光。

优选的，基因组RNA的提取采用RNA提取试剂盒，或者Trizol核酸抽提法。

本申请的有益效果在于：

本申请的用于H5N8禽流感病毒检测的试剂，对禽流感亚种H5N8具有很强的特异性，能够准确灵敏的从众多禽流感病毒中特异性的检测出H5N8，为新型H5N8禽病毒的检测或监控提供了一种有效的方法和途径。此外，基于本申请的试剂的H5N8禽流感病毒检测方法，其耗时短，可以很快作出结果判定，这对于控制流感的流行，减少经济损失，最大限度的保护全社会人群的健康和生命具有很大的意义。

附图说明

图1是本申请实施例中H5N8禽流感病毒逆转录实时荧光PCR检测的特异性检测结果；

图2是本申请实施例中H5N8禽流感病毒逆转录实时荧光PCR检测的灵敏度检测结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

一、反应体系的建立和优化

利用人工合成的H5N8禽流感病毒的病毒质粒作为阳性标准品，其它供试样本则利用商品化RNA提取试剂盒或Trizol核酸抽提试剂的提取方法提取病毒基因组RNA，分装后置-20℃保存备用。其它供试样本包括：H5N8灭活毒株、H5N1、H5N2、H9N2、新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、猪流感经典型H1N1毒株、猪流感经典型H3N2毒株和禽流感H7、H9标准检测抗原。本例针对H5N8禽流感病毒的基因组RNA设计了其特异性检测引物和探针，引物和探针具体序列如表1所示。

表1引物和探针序列

名称	序列(5’→3’)	Seq ID No.
			H5N8-NA-Probe	CTGCACATAAATACCCAACYCTGTA	1
H5N8-NA-FP	TGAGGAATGTTCTTGTTATCCAAATGA	2
			H5N8-NA-RP	CCACTGTATCCCGACCAATT	3

本例对引物浓度、探针浓度进行了优化，具体如下：

将反应体系设定为25μL，筛选引物、探针的最佳浓度。引物浓度由0.25μmol/L～0.6μmol/L以0.05μmol/L递增，探针浓度由0.1μmol/L～0.45μmol/L以0.05μmol/L递增。每次试验采用等量模板和只设一个变量，以Ct值、荧光增量和平台期等因素为考察依据，重复实验3次，若结果稳定，确定为最佳浓度值。

以优化好的反应体系研究RT-PCR最佳反应条件，在“95℃1～12min，35～45个循环的95℃15～30s和50～60℃35～60s”的范围内反复进行试验，每次试验采用同管等量模板，每个反应条件重复试验3次，以Ct值、荧光增量、平台期和耗时等因素为考察依据，分别确定最佳反应条件。

经优化，H5N8流感病毒一步法实时荧光RT-PCR采用25μL体积反应体系，包括：12.5μL 2×real time PCR Buffer、1μL 25×enzyme mix、终浓度0.4μM/L的引物、终浓度0.2μM/L的探针、5μL模板，用水补足至25μL。

在ABI 7500型荧光定量PCR仪中，按下列反应参数进行：50℃反转录30min；95℃预变性10min；95℃变性15s，55℃45s，扩增45个循环，55℃时设置采集荧光。

仪器检测通道的选择：

进行RT-PCR设置反应荧光信号时，选择的荧光检测通道与探针所标记的荧光报告基团一致，报告荧光设定为HEX，淬灭荧光设定为BHQ，校准荧光设定为None。具体设置方法因仪器而异，应参照仪器使用说明书。程序设置好后，点击运行，进行PCR反应，反应结束后保存文件，打开分析软件，分析实验结果，给出△Rn与循环数图像。其中，△Rn即第n个循环时的荧光增加值。

结果分析和判定：

(1)结果分析条件设定

根据扩增曲线的荧光素种类，直接读取检测结果。

基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点为准。

(2)质控标准

阴性对照无Ct值，且无扩增曲线，基本为一水平线。

阳性对照的Ct值应小于35.0，并出现典型的扩增曲线，2个阳性对照管的相应源性成分的扩增曲线基本重合，特别是在荧光临界值(英文Threshold)附近。否则，此次实验视为无效。

(3)结果描述及判定

阴性：Ct值应大于38.0或无扩增曲线，表示样品中H5N8流感病毒核酸阳性。

阳性：代表HEX的扩增曲线Ct值小于或等于35.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中H5N8流感病毒核酸阳性。

有效原则：根据对大量样品的检测研究，发现扩增曲线的Ct值处于35.0～38.0之间的样品为可疑样品，建议重做。重做结果Ct值大于38.0或无扩增曲线者为阴性，否则为阳性。

二、禽流感病毒检测

试验1H5N8禽流感病毒检测

本试验，提取H5N8禽流感病毒基因组RNA进行试验，H5N8禽流感病毒基因组RNA提取方法与其它供试样本相同，本例具体采用的是Trizol核酸抽提试剂的提取方法。

分别以提取的H5N8基因组RNA、H5N8阳性标准品为模板进行实时荧光RT-PCR反应，并设置一个水空白对照。

反应体系为：12.5μL 2×real time PCR Buffer、1μL 25×enzyme mix、终浓度0.4μM/L的引物、终浓度0.2μM/L的探针、5μL模板，用水补足至25μL。

反应条件为：50℃30min；95℃10min；然后进入45个循环：95℃15s，55℃45s，并于55℃时采集荧光。

结果显示，本例提取的H5N8基因组RNA与H5N8阳性标准品一样能够检测出荧光信号，且Ct值都小于35.0；而水空白对照则无荧光信号。

试验2特异性试验

本试验以提取自H5N8的基因组RNA为阳性模板，以提取自用H3N2、H5N1、H5N2、H9N2、甲型H1N1、新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒等的RNA样本为阴性模板，进行逆转录实时荧光PCR检测，反应体系和反应条件与试验1相同，同时设置一个水空白对照。

检测结果如图1所示，仅H5N8的基因组RNA有扩增曲线，而其它供试样本和水空白对照都没有扩增曲线，说明本例的引物和探针能够对H5N8进行特异性检测。

试验3灵敏度试验

将提取自H5N8的基因组RNA测定浓度后，作7个10倍系列稀释，进行逆转录实时荧光PCR检测。分别以原始的没有稀释的H5N8阳性标准品(即10^-0)、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7稀释的H5N8阳性标准品为模板进行逆转录实时荧光PCR检测，同时设置一个水空白对照。反应体系和反应条件与试验1相同。

检测结果如图2所示，结果显示，水空白对照没有荧光信号，而10^-0、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4五个样品均有荧光信号，10^-5、10^-6、10^-7和水空白对照没有荧光信号；可见，本例的H5N8禽流感病毒检测引物和探针对H5N8禽流感病毒的检测灵敏度为10^-4稀释度，约相当于15个病毒拷贝。

试验4稳定性和重复性试验

选择H5N8禽流感病毒阳性样品的三个梯度稀释液，采用建立的实时荧光PCR方法进行重复性试验。每次试验每个模板浓度设置8个平行检测，记录每次试验每个检测的Ct值，计算标准差(即SD值)和批内变异系数(即CV值)。连续10天对上述同样模板液，以相同的反应体系和反应条件，分别重复进行10次试验，记录并统计10天Ct值数据，计算批间CV值。

结果显示，三个梯度模板液检测所得Ct值的平均值分别为16.11±0.185，21.85±0.186和28.32±0.172，相应的变异系数CV为1.14％、0.85％和0.61％，即批内CV值≤0.61％。以相同的反应体系和反应条件，连续10天对上述同样模板液，分别重复进行10次试验，根据所记录的Ct值计算可得三个梯度模板液检测的批间CV值分别为1.37％、2.67％和3.14％，均小于10％。可见，本例的H5N8禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法的稳定性良好。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市检验检疫科学研究院

深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心

清华大学深圳研究生院

<120> 用于H5N8禽流感病毒检测的试剂、检测方法及应用

<130> 16I23448

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> y

<222> (20)..(20)

<223> y is c or t

<400> 1

ctgcacataa atacccaacy ctgta 25

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgaggaatgt tcttgttatc caaatga 27

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccactgtatc ccgaccaatt 20

Claims (8)

1.一种用于H5N8禽流感病毒检测的试剂，其特征在于：所述试剂包括引物对和探针，所述探针在引物对的扩增靶标区域内，所述引物对的上游引物为Seq ID No.2所示序列，所述引物对的下游引物为Seq ID No.3所示序列，所述探针为Seq ID No.1所示序列或者Seq IDNo.1所示序列的反向互补序列；

Seq ID No.1：5’-CTGCACATAAATACCCAACYCTGTA-3’

Seq ID No.2：5’-TGAGGAATGTTCTTGTTATCCAAATGA-3’

Seq ID No.3：5’-CCACTGTATCCCGACCAATT-3’

Seq ID No.1所示序列中，Y为C或者T碱基。

2.根据权利要求1所述的用于H5N8禽流感病毒检测的试剂，其特征在于：所述探针的5’端标记有HEX荧光基因，3’端标记有BHQ淬灭基团。

3.根据权利要求1或2所述的用于H5N8禽流感病毒检测的试剂在非诊断治疗目的的H5N8禽流感病毒检测中的应用。

4.根据权利要求1或2所述的用于H5N8禽流感病毒检测的试剂在制备H5N8禽流感病毒检测试剂盒或设备中的应用。

5.一种用于H5N8禽流感病毒检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1或2所述的用于H5N8禽流感病毒检测的试剂。

6.一种用于H5N8禽流感病毒检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有至少一组混合试剂，每组混合试剂由12.5μL 2×real time PCR Buffer、1μL 25×enzyme mix、终浓度0.4μM/L的引物对和终浓度0.2μM/L的探针组成；所述引物对的上游引物为Seq ID No.2所示序列，所述引物对的下游引物为Seq ID No.3所示序列，所述探针为Seq ID No.1所示序列或者Seq ID No.1所示序列的反向互补序列。

7.一种非诊断治疗目的的H5N8禽流感病毒的逆转录实时荧光PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)提取待测样品的基因组RNA；

(2)采用权利要求6所述的试剂盒，向所述混合试剂中加入步骤(1)提取的基因组RNA，配制成反应溶液；

(3)将步骤(2)配制的反应溶液，在50℃反转录30min、95℃热启动10min，然后进入45个循环：95℃15s、55℃45s，在循环过程中于55℃时采集荧光。

8.根据权利要求7所述的H5N8禽流感病毒的逆转录实时荧光PCR检测方法，其特征在于：所述基因组RNA的提取采用RNA提取试剂盒，或者Trizol核酸抽提法。

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