CN114457191A - 基于Cas13a无扩增检测H7亚型禽流感病毒方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas13a无扩增直接检测H7亚型禽流感病毒方法，包括以下步骤：（1）提取样品RNA；（2）配制CRISPR‑Cas13a检测分析体系；（3）在检测分析体系中加入待测样品RNA；（4）在37度等温条件下反应30‑60分钟，实时检测CRISPR‑Cas13a附带切割释放的荧光信号。本研究发明了一种利用CRISPR‑Cas13a检测系统，无需病毒基因组的预扩增、直接快速检测H7亚型禽流感病毒RNA的方法。与以往的CRISPR检测方法相比，本发明方法敏感性好、特异性强，操作更为简便，大幅缩短反应时间，可对H7亚型禽流感病毒进行快速、准确和低成本的筛查。
Description
本发明涉及一套用于病毒快速检测的实时检测方法，尤其涉及一套基于CRISPR-Cas13a无扩增直接检测H7亚型禽流感病毒的方法，属于H7亚型禽流感病毒检测领域。
背景技术
禽流感（Avian influenza）是一种由甲型流感病毒引起的禽类急性、热性、败血性的传染病，属法定的一类传染病。根据禽流感病毒（AIV）对禽类致病性的不同，AIV可以分为低致病性禽流感病毒（LPAIV）和高致病性禽流感病毒（HPAIV）。高致病性禽流感对禽类具有高度致死性，是严重危害养禽业的烈性传染病。该病极易在禽鸟间散播，可引致家禽大量死亡，对家禽业带来不可估量的破坏，发生之时会造成巨大的经济损失。由于病毒基因变异后能够感染人类，所以禽流感是一种人兽共患的烈性传染病。人感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高。此病可通过消化道、呼吸道、皮肤损伤和眼结膜等多种途径传播。
近年来，引起家禽爆发禽流感的高致病性和低致病性H7亚型禽流感病毒株包括H7N1、H7N2、H7N3、H7N4 和H7N7 亚型，导致7500万只家禽被扑杀。受到禽类H7亚型病毒影响的国家包括中国、巴基斯坦、澳大利亚、爱尔兰、意大利、加拿大、德国、智利、荷兰、墨西哥、英国和美国等，其中中国、加拿大、美国、荷兰、意大利、墨西哥和英国都有人的感染病例，从某种程度上说这些亚型的病毒给全球公共卫生带来巨大风险。特别是自2013年3月以来我国爆发的人感染H7N9禽流感，截至2019 年6 月24 日，已造成1568人感染，其中615人死亡。由于H7亚型具有高致病性，又由于感染人的H7亚型病毒存在极大的多样性，因此对禽类H7亚型禽流感病毒的检测，以及对H7亚型禽流感病毒暴露人群，包括农场工人、参与家禽捕杀者及其家属以及处理H7病毒疫情的相关医务人员进行主动监测是十分必要的。
目前，禽流感病毒的临床诊断方法主要包括病毒分离方法（Viral isolation）、血清学检测方法（H7N9 Serologic testing）和分子生物学方法三大类。其中，临床应用的分子生物学方法主要指实时荧光定量PCR（Real-time reverse-transcriptase-polymerase-chain-reaction (RT-PCR) assay）核酸分子诊断方法，也是诊断杭州型H7N9甲型禽流感病毒最常用的方法。然而传统的PCR反应对温度具有一定的依赖性，需要精准的温度循环变化设备作为技术保障，不仅增加了检测时间，也增加了检测的成本。
成簇规律间隔短回文重复序列及其相关基因（Clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats/CRISPR associated gene，CRISPR/Cas）系统是存在于细菌和古菌中的一种适应性免疫系统，能在单链向导RNA（Single guide RNA，sgRNA）指引下将Cas核酸酶与靶序列相结合并对其进行切割。该系统中的CRISPR/Cas13是目前CRISPR/Cas家族中唯一只靶向单链RNA（Single-stranded RNA，ssRNA）的系统，自2016年6月报道以来，CRISPR/Cas13系统就备受全球研究人员的关注和重视，这不仅因为它是一种只靶向RNA的新型CRISPR系统，更重要的是其具有特异性切割和“附带切割”（collateralcleavage）能力。高的靶向效率和优异的酶切能力使CRISPR/Cas13系统在核酸检测方面具有广阔的应用前景。
2017年，Liu等与Knott等分别解析了Cas13a单蛋白、Cas13a-crRNA二元复合物、Cas13a-crRNA及靶RNA三元复合物晶体结构，并指出Cas13a是一种RNA介导的具有RNase活性的Cas效应蛋白，通过其2个HEPN结构域内的保守氨基酸可以有效地降解ssRNA。同年，张峰研究团队设计研发出基于CRISPR/Cas13系统的特异性高灵敏度酶报告解锁（Specifichigh-sensitivity enzymatic reporter unlocking，SHERLOCK）技术。该技术首先对靶DNA或RNA进行重组酶聚合酶扩增（Recombinase polymerase amplification，RPA）扩增，扩增后的DNA产物用T7核糖核酸聚合酶转录为RNA，然后在crRNA（CRISPR RNA）引导下激活Cas13a，激活的Cas13a切割RNA荧光报告分子从而能检测到荧光信号。
本研究发明了一种利用CRISPR-Cas13a检测系统，无需病毒基因组的预扩增、直接快速检测H7亚型禽流感病毒RNA的方法。与以往的CRISPR检测方法不同，本发明通过直接检测病毒RNA而不需要额外扩增的操作，可对H7 亚型禽流感病毒进行快速、准确和低成本的筛查。
发明内容
本发明的主要目的是提供一套基于CRISPR-Cas13a系统无扩增直接检测H7亚型禽流感病毒的快速检测方法。
本发明采用的检测原理如图1所示，当靶RNA（H7亚型禽流感病毒RNA）出现时，靶RNA在crRNA引导下激活Cas13a，激活的Cas13a除了进行靶RNA特异性切割外，还“附带切割”RNA荧光报告分子，随着连接荧光基团和淬灭基团之间的RNA链断裂RNA荧光报告分子发出荧光，而通过检测荧光信号即可进行靶RNA（H7亚型禽流感病毒RNA）的核酸检测。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：
基于CRISPR-Cas13a无扩增直接检测H7亚型禽流感病毒方法，包括以下步骤：
（1）提取样品RNA；
（2）配制CRISPR-Cas13a检测分析体系；
（3）在检测分析体系中加入待测样品RNA；
（4）在37度等温条件下反应30-60分钟，实时检测CRISPR-Cas13a附带切割释放的荧光信号。
其中，检测分析体系包括反应缓冲液、适量CRISPR-Cas13a（LwaCas13a）基因编辑蛋白、H7-AIV特异性srRNA及荧光报告分子。反应缓冲液的组分包括：10mM Tris-HCl (pH8.3), 50mM KCl, 1.5mM MgCl2。H7特异性crRNA核酸序列为：
GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCAUCACACUUGUGAAAUAUUUCAAAGCA。
本发明的方法采用CRISPR-Cas13a基因编辑蛋白无扩增直接检测H7亚型禽流感病毒，对比基于重组酶聚合酶扩增后CRISPR-Cas13a基因编辑蛋白检测的SHERLOCK技术，方法操作更为简便，大幅缩短反应时间，更为适用于对H7亚型禽流感病毒的现场快速检测。
附图说明
图1 为本发明的基于CRISPR-Cas13a无扩增直接检测H7亚型禽流感病毒方法的原理图；
图2为阳性、阴性样品实时检测荧光信号对比结果（H7-P检测对象为H7 AIV RNA，H7-N检测对象为去离子水）；
图3为CRISPR-Cas13a优化条件结果。
图4为荧光报告分子优化条件结果。
图5为H7-crRNA优化条件结果。
图6为特异性实验结果。
图7为敏感性实验结果。
具体实施方法
本实施例所用仪器与试剂具体如下：
仪器：
伯乐实时荧光定量PCR仪（Chromo4 Real-Time PCR Detector）。
试剂：
CRISPR-Cas13a(Lwa)基因编辑蛋白，Cas13a检测系统用荧光双标记探针，H7模板ssRNA及H7特异性crRNA，病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒。
其中，H7特异性crRNA核酸序列为：
GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCAUCACACUUGUGAAAUAUUUCAAAGCA。
反应缓冲液：10mM Tris-HCl (pH 8.3), 50mM KCl, 1.5mM MgCl2。
基于CRISPR-Cas13a无扩增直接检测H7亚型禽流感病毒方法，包括以下步骤：
（1）提取样品RNA
使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒，按照使用流程提取样品中病毒基因组RNA，直接进行检测，或-80度保存备用。
（2）配制检测分析体系
经优化后反应体系20µL中包括2µL反应缓冲液（终浓度：10mM Tris-HCl (pH8.3), 50mM KCl, 1.5mM MgCl2）、2µL 1µM CRISPR-Cas13a（LwaCas13a）基因编辑蛋白、1µL40µM Cas13a检测系统用荧光双标记探针及1µL 1µM H7-AIV特异性srRNA。
（3）在检测分析体系中加入待测样品RNA
在上述检测分析体系中加入待测样品RNA 1µL，使用DNase/RNase(-)去离子水将最终反应体系调整到20µL。
（4）在37度等温条件下反应30-60分钟，实时检测酶切释放的荧光信号。
使用伯乐实时荧光定量PCR仪，在37度等温条件下反应60分钟，在OpticonMonitor软件系统内，每分钟采集一次荧光信号，获得酶切反应释放荧光信号的实时检测结果。
试验结果与讨论
（1）优化CRISPR-Cas13a基因编辑蛋白用量
为选取最适的CRISPR-Cas13a（LwaCas13a）基因编辑蛋白反应用量，分别加入0.1µL、0.5µL、1µL及2µL 1µM CRISPR-Cas13a基因编辑蛋白，并分别进行阴性阳性对照试验。如图3所示，加入2µL 1µM CRISPR-Cas13a基因编辑蛋白的反应体系结果最优。
（2）优化荧光报告分子浓度
在不同反应体系分别加入1µL 10µM、20µM、30µM和40µM Cas13a检测系统用荧光双标记探针，并分别进行阴性阳性对照试验。如图4所示，加入1µL 40µM荧光双标记探针的反应体系结果最优。
（3）优化H7-AIV特异性srRNA浓度
为选取最适的H7-AIV特异性srRNA浓度，不同反应体系分别加入1µL 0.1µM、1µM、10µM和100µM H7- srRNA，并进行阴性阳性对照试验。如图5所示，加入1µL 1µM H7- srRNA的反应体系结果最优。
（4）特异性实验结果
分别以H7合成模板ssRNA、A/Shanghaiputuo/1203/2013 (H1N1)、A/Shanghaichangning/1507/2012 （H3N2）、A/Environmental/Jiangxi/21/2011（H9N2）、B/Beijing/1386/2013（Victoria, BV）、B/Chongqingyuzhong/1361/2013（Yamagata, BY）流感病毒株和NDV vaccine strain LaSota（NDV）基因组RNA提取核酸和去离子水（NC）为检测对象，按照上述优化后反应条件，在37度等温条件下反应60分钟，实时检测酶切反应释放的荧光信号结果表明，本发明建立的检测方法只检出H7亚型禽流感病毒靶标RNA，对其它相关病毒不予检出，说明本方法的特异性良好。
（5）敏感性实验结果
将H7合成模板ssRNA阳性质控品依次进行10倍梯度稀释（反应终浓度梯度为10nM、1nM、100pM、10pM、1pM），通过本方法建立的CRISPR-Cas13a实时荧光检测系统对上述各浓度RNA质控品分别检测，结果如图7所示，高浓度模板（10nM）实时荧光检测结果有强阳性检测信号，随着模板浓度降低，荧光检测信号逐步下降，最终在100pM浓度可见微弱的荧光信号，即敏感度可达到100pM H7 ssRNA水平。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (3)
1.一种基于CRISPR-Cas13a无扩增直接检测H7亚型禽流感病毒方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取样品RNA；
配制CRISPR-Cas13a检测分析体系；
在检测分析体系中加入待测样品RNA；
在37度等温条件下反应30-60分钟，实时检测CRISPR-Cas13a附带切割释放的荧光信号。
2.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas13a无扩增直接检测H7亚型禽流感病毒方法，其特征在于： CRISPR-Cas13a检测分析体系包括反应缓冲液、CRISPR-Cas13a（LwaCas13a）基因编辑蛋白、荧光报告分子及H7-AIV特异性srRNA；
经优化后20µL反应体系中包括2µL反应缓冲液（终浓度：10mM Tris-HCl (pH 8.3),50mM KCl, 1.5mM MgCl2）、2µL 1µM CRISPR-Cas13a（LwaCas13a）基因编辑蛋白、1µL 40µMCas13a检测系统用荧光双标记探针及1µL 1µM H7-AIV特异性srRNA。
3.根据权利要求2所述的基于CRISPR-Cas13a无扩增直接检测H7亚型禽流感病毒方法，其特征在于：H7特异性crRNA核酸序列为：
GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCAUCACACUUGUGAAAUAUUUCAAAGCA。
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