CN116287467A - 基于CRISPR/Cas的电化学生物传感器及其在核酸检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于CRISPR/Cas的电化学生物传感器及其在核酸检测中的应用。本发明属于生物检测领域，具体涉及基于CRISPR/Cas的电化学生物传感器及其在核酸检测中的应用。本发明所要解决的技术问题是如何制备无需探针固定和/或电极免修饰的均相CRISPR电化学生物传感平台。本发明以两边分别修饰有亚甲基蓝(MB)和生物素(Biotin)的单链RNA为报告分子，利用包被有链霉亲和素的磁珠分离报告RNA‑B的方法，在无目标RNA扩增时，最低检出限就能达到10pM，结合RT‑RAA等温扩增后，可以检测到1copy/μL的新型冠状病毒RNA，可开发成通用的现场分子检测方法。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及基于CRISPR/Cas的电化学生物传感器及其在核酸检测中的应用。
背景技术
准确的现场快速检测技术(POCT)对病原体的早期发现和传染病的防控起着重要作用。荧光定量PCR具有较高的灵敏度和特异性，是目前应用最为广泛的核酸检测方法，已成为实验室检测的金标准，但它通常需依赖大型昂贵仪器，限制了其作为即时检测方法的能力。寻找一种简单、快速、准确的核酸快检测方法已经成为当前临床诊断和病原体检测领域的一种趋势。
近年来，CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats)和相关的Cas蛋白(如Cas9、Cas12a和Cas13a)利用CRISPR/Cas系统的反式裂解活性在核酸(RNA/DNA)检测方面取得了很大的进展，CRISPR/Cas系统可以不加区别地切割报道的RNA/DNA周围。结合等温扩增技术(如RCA、LAMP、RAA)、易读的方法和小加热器，CRISPR的所有检测步骤都可以在任何地方进行，在POCT领域显示出巨大的潜力。研究人员做了大量工作来提高E-CRISPR(基于CRISPR的电化学生物传感器)对致病或癌症相关核酸的检测性能，并取得了非常灵敏、准确的检测结果。然而，大多数这些生物传感器需要将电化学探针固定在电极表面。这种固定过程是一个复杂和耗时的过程，可能会引起空间位阻效应，导致在非均质表面上的切割效率和选择性降低，限制了POCT的使用。其他一些电化学CRISPR生物传感器利用特殊制备的电极，如氧化石墨烯修饰电极、纳米复合材料和金纳米，以提高电极捕获的探针数量，从而获得更好的电化学信号。但这类电极需要精心优化制造工艺和技术配方，制造成本和复杂性无法满足分析的重复性和POCT的要求。其余的电化学CRISPR生物传感器灵敏度有限，远不能用于POCT领域。因此，有必要开发一种无需探针固定、电极免修饰和操作简单的均相CRISPR电化学生物传感平台来克服上述限制。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何制备无需探针固定和/或电极免修饰的均相CRISPR电化学生物传感平台。
为了解决上述问题，本发明提供了一种用于生物检测的电化学生物传感组合物，所述电化学生物传感组合物包括：报告RNA-B、表面包被链霉亲和素的磁珠或微珠、Cas13a蛋白、特异于待检测生物的crRNA，所述报告RNA-B的一端标记生物素，另一端标记亚甲基蓝。
所述电化学生物传感组合物包括对新型冠状病毒进行RT-RAA的试剂。
所述RT-RAA的试剂包括RT-RAA扩增引物和进行RT-RAA检测的试剂。
所述电化学生物传感组合物为基于CRISPR的电化学生物传感器的组合物。
所述报告RNA-B的核苷酸序列可为序列表中的序列5。
上述电化学生物传感组合物在制备电化学生物传感器的工作液或电化学生物传感器中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了一种电化学生物传感器的工作液。
本发明提供的传感液，包括上述电化学生物传感组合物以及可接受的辅料或助剂。
本发明还提供了上述电化学生物传感器的工作液在制备电化学生物传感器中的应用。
本发明还提供了一种电化学生物传感器，包括上述电化学生物传感组合物或电化学生物传感器的工作液，以及电极系统。
上述电化学生物传感器中，所述电极系统包括参考电极、辅助电极和工作电极；
本发明还提供了上述电化学生物传感器在制备生物核酸检测产品中的应用。
本发明还提供了上述电化学生物传感器在环境污染监测、食品安全检测或疾病诊断的装置中的应用。
上述应用中，所述疾病可为各种能够实施核酸检测的传染病病原、遗传病、其他基因相关疾病。
本发明还提供了生物核酸的检测方法，包括如下步骤：取待测核酸与所述电化学生物传感组合物或电化学生物传感器的工作液混合，滴涂在所述电化学生物传感器的工作电极，对生物核酸进行检测。
所述待测核酸可为从样品中提取的核酸，也可为样品的RT-RAA产物。
所述生物可为微生物。所述微生物可为真菌、细菌和/或病毒等。
上述应用或方法为非疾病诊断的应用或方法。上述应用或方法不以获得有生命的人体或动物体的疾病诊断结果或健康状况为直接目的。
上述应用或方法为非疾病治疗目的的应用或方法。上述应用或方法不以使有生命的人体或者动物体恢复或获得健康或减少痛苦为目的。
所述待测样品可为痰液样品、血液样品、组织样品、环境样品(如空气)、衣物或毛巾或作为食品的动物组织和/或器官等。
上述应用的待测样品可为来自非有生命的人体或动物体的样品，如环境样品(如空气)、食品(如冷冻食品或新鲜食品)。
相比于常规的电化学生物传感器，本发明中的基于CRISPR/Cas13a的均相电化学生物传感器用于核酸的检测具有以下优点：1)基于CRISPR/Cas13a的均相电化学生物传感器具有RT-RAA等温扩增、T7转录和Cas蛋白三级信号放大体系，能够检测到少量的目标RNA，具有较高的选择性和灵敏度；2)Cas蛋白剪切报告RNA过程在均相溶液中进行，提升了Cas蛋白的剪切效率；3)直接采用商业电极进行测试，避免了复杂的电极表面修饰过程，降低了电极成本。
附图说明
图1是本发明提供的基于RT-RAA等温扩增和CRISPR/Cas13a电化学传感器检测新型冠状病毒的原理图。
图2是制备CRISPR/Cas13a电化学传感器可行性验证图。A.电化学活性验证和链霉亲和素磁珠分离报告分子验证；B.荧光法验证Cas13a蛋白体外切割活性；C和D方波伏安法验证Cas13a蛋白体外切割活性。
图3是制备CRISPR/Cas13a电化学传感器条件优化。A.磁珠分离时间；B.镁离子浓度；C.Cas13a蛋白浓度；D.Cas13a蛋白剪切时间。
图4是制备CRISPR/Cas13a电化学传感器性能评价。A.灵敏度测试的方波伏安图；B.灵敏度测试的柱状图；C.SARS-CoV-2HV69-70del突变株检测；D.SARS-CoV-2D614G突变株检测；E.D614G突变位点的cDNA序列；F.HV69-70del突变位点的cDNA序列。
图5是基于RT-RAA等温扩增和CRISPR/Cas13a电化学传感器核酸检测方法的验证。A.RT-RAA等温扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果；B.基于RT-RAA等温扩增和CRISPR/Cas13a电化学传感器核酸检测方法的方波伏安法测试结果。
图6是基于RT-RAA等温扩增和CRISPR/Cas13a电化学传感器核酸检测方法的性能评价。A.基于RT-RAA等温扩增和CRISPR/Cas13a电化学传感器核酸检测方法的灵敏度测试；B.RT-qPCR灵敏度测试；C.荧光法CRISPR核酸检测方法的灵敏度测试；D.基于RT-RAA等温扩增和CRISPR/Cas13a电化学传感器核酸检测方法的特异性测试。
图7是利用基于RT-RAA等温扩增和CRISPR/Cas13a电化学传感器核酸检测方法检测SARS-CoV-2临床样本的结果。A.7例健康人的检测结果和阳性“阈值线”设置；B.利用基于RT-RAA等温扩增和CRISPR/Cas13a电化学传感器核酸检测方法和RT-qPCR的方法检测39例临床样本的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中涉及的试剂来源如下：rNTP mix(NEB，N0466S)，T7 RNA聚合酶(NEB，M0251S)，新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(杭州众测，自研)，MgCl2溶液(赛默飞，00963557)，NaCl溶液(国药集团，7647-14-5)，HEPES缓冲液(赛默飞，2185833)，DynabeadsTMM-280Streptavidin(赛默飞，11206D)，亚甲基蓝(SIGMA-ALDRICH，MKCH6365)，RNase Alert v2(Invitrogen，30315288)。
下述实施例中的Cas13a蛋白为LwaCas13a蛋白(南京金斯瑞，Z03486)。
下述实施例中的HV69-70del SARS-CoV-2和D614G突变株已记载于Niu M,Han Y,Dong X,Yang L,Li F,Zhang Y,Hu Q,Xia X,Li H,Sun Y.Highly Sensitive DetectionMethod for HV69-70del in SARS-CoV-2Alpha and Omicron Variants Based onCRISPR/Cas13a.Front Bioeng Biotechnol.2022Apr12；10:831332.doi:10.3389/fbioe.2022.831332.PMID:35497364；PMCID:PMC9039052.公众可以从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。
本发明使用的报告RNA(Biotin-ssRNA-MB)由Takara Biotech Co.合成；引物、crRNA和目标RNA由天一辉远生物科技有限公司(北京)合成；新型冠状病毒核酸标准物质(GBW(E)091089)购于国家计量研究院。RNase-free水由Takara Biotech Co.提供，所有的核酸链可以用RNase-free水稀释。
所有电化学信号均由CHI 660E电化学工作站(辰华，中国上海)测量。丝网印刷碳电极购自雷特美特(中国)有限公司，电极系统包括Ag/AgCl电极、碳电极和碳电极极分别作为参比电极、辅助电极和工作电极。
以下实施例中的定量试验，均设置5次或3次重复实验，结果取平均值。
实施例1、基于CRISPR/Cas13a的均相电化学生物传感器的可行性验证和制备
本研究选择了SARS-CoV-2的N基因为靶点，其靶序列为序列表中的序列1。通过实时荧光监测和电化学测量对CRISPR/Cas13a系统反式切割报告RNA(包括报告RNA-Y和报告RNA-B)的能力进行了验证。
1.用于本发明的crRNA和RT-RAA引物由天一辉远生物科技有限公司(北京)公司合成)。具体序列见表1。
报告RNA-B(生物素-20U-亚甲基蓝)的核苷酸序列为序列表中的序列5，其5'端标记生物素，3'端标记亚甲基蓝，以下表1中的其他核酸序列均由天一辉远生物科技有限公司(北京)合成。
表1用于本研究的核酸序列
注：MB为亚甲基蓝(Methylene blue)，Biotin为生物素，BHQ1为淬灭基团，6-FAM为荧光基团。
2.Cas13a蛋白体外切割荧光报告RNA-Y实验
Cas13a蛋白体外切割荧光报告RNA-Y实验具体操作步骤如下：反应体系见表2。反应条件：置于荧光定量PCR仪器中，温度37℃，每2分钟采集一次FAM荧光，采集30次。
表2Cas13a蛋白体外切割荧光报告RNA-Y反应体系
3.CRISPR/Cas13a电化学生物传感器制备
1)Cas13a蛋白体外切割电化学报告RNA-B的实验
Cas13a蛋白体外切割电化学报告RNA-B实验具体操作步骤如下：反应体系见表3。反应条件：置于37℃的金属浴中，反应30min。
表3Cas13a蛋白体外切割电化学报告RNA-B反应体系
2)磁珠分离报告RNA-B
a.磁珠去缓冲液
将DynabeadsTMM-280Streptavidin磁珠浑浊液试剂充分摇匀，取30μL磁珠浑浊液，置于磁力架上1min，弃上清，加入35μL RNase-free H2O，将磁珠吹吸均匀，再置于磁力架上静置1min，弃上清。
b.反应体系中报告RNA的磁性分离
将LwaCas13a体外切割后的液体加入含有磁珠的EP管中，吹吸混匀，静置1min，然后将EP管置于磁力架2min，收集上清液作为待测液。
3)方波伏安法测试
参数设置：初始电位为-0.5V,终止电位为0V，电位增量为0.006V，振幅为0.05V，频率：50HZ，静置时间：2s，电流档10E-6A。
将步骤2)得到的待测液体滴涂到丝网印刷碳电极(同时覆盖工作电极、对电极和参比电极)上，立即扫描，记录结果。
4)数据的处理与分析
将步骤3)中方波伏安法测得的曲线作“切线”处理，记录波峰位置的电流值，即IP值。
通过实时荧光监测(图2中B)和电化学测量(图2中C和D)对CRISPR/Cas13a系统反式切割报告RNA(包括报告RNA-Y和报告RNA-B)的能力进行了验证。结果如图2所示：当目标RNA存在时，便能激活LwaCas13a反式切割活性，对荧光报告RNA-Y和电化学RNA-B进行切割，经过一定步骤后可观察到显著的荧光信号和电化学特征性峰电流值。利用电化学波峰电流值的大小进行计算，发现CRISPR/Cas13a体系反裂解活性后，电化学峰电流值可达1827nA，而NC组为47nA，相差约39倍，表明该检测平台具有良好的可行性。
在反应液中对报告RNA-B进行处理后，利用磁珠分离残余完整报告RNA的原理，测试溶液中MB的电信号响应和数量，使得该传感器具有更小的背景信号和更好的电化学响应。
实施例2、基于CRISPR/Cas13a的均相电化学生物传感器检测条件的优化
完整的报告RNA-B磁珠分离和CRISPR/Cas13a系统的对报告RNA-B的反式切割活性是产生有效信号转导的关键。
(1)磁珠分离报告RNA-B的时间优化
首先，本研究评估了链霉亲和素的磁珠去除报告RNA-B的能力
具体筛选步骤如下：
1)溶液配制
将报告RNA-B溶于1.7M的NaCl溶液中，报告RNA-B的终浓度为1μM。
2)磁珠分离报告RNA-B
a.磁珠去缓冲液
将DynabeadsTMM-280Streptavidin磁珠浑浊液试剂充分摇匀，取30μL磁珠浑浊液，置于磁力架上1min，弃上清，加入35μL RNase-free H2O，将磁珠吹吸均匀，再置于磁力架上静置1min，弃上清。
b.溶液中报告RNA的磁性分离
取步骤1)中溶有报告RNA-B的溶液40μL加入含有磁珠的EP管中，吹吸混匀，分别静置0.5min、1min、2min、3min，然后将EP管置于磁力架2min，收集上清液作为待测液。
3)方波伏安法测试
参数设置：初始电位为-0.5V,终止电位为0V，电位增量为0.006V，振幅为0.05V，频率：50HZ，静置时间：2s，电流档10E-6A。
将步骤2)得到的待测液体滴涂到丝网印刷碳电极(同时覆盖工作电极、对电极和参比电极)上，立即扫描，记录结果。
4)数据的处理与分析
将步骤3)中方波伏安法测得的曲线作“切线”处理，记录波峰位置的电流值，即IP值。
实验结果显示(图3中A)，用链霉亲和素包被的磁珠清除溶液中的报告RNA-B的效率非常高，二者仅仅混匀室温孵育1min后几乎就不能观察到特征性电化学信号，因此采用磁珠和报告RNA-B孵育1min的参数。
(2)镁离子浓度优化
Mg离子、Cas13a和T7 RNA聚合酶的浓度对CRISPR/Cas13a系统反式切割活性有着重要影响。通过分别设置这三种组分不同工作浓度，测定CRISPR/Cas13a的电化学生物传感器的电化学峰电流值来筛选最佳浓度。
本研究设置了7个镁离子浓度，即0mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM和30mM。具体筛选步骤如下：反应体系见表4。反应条件：置于37℃的金属浴中，反应时间分别为30min。
表4镁离子浓度优化反应体系
2)磁珠分离报告RNA-B
a.磁珠去缓冲液
将DynabeadsTMM-280Streptavidin磁珠浑浊液试剂充分摇匀，取30μL磁珠浑浊液，置于磁力架上1min，弃上清，加入35μL RNase-free H2O，将磁珠吹吸均匀，再置于磁力架上静置1min，弃上清。
b.反应体系中报告RNA的磁性分离
将LwaCas13a体外切割后的液体加入含有磁珠的EP管中，吹吸混匀，静置1min，然后将EP管置于磁力架2min，收集上清液作为待测液。
3)方波伏安法测试
参数设置：初始电位为-0.5V,终止电位为0V，电位增量为0.006V，振幅为0.05V，频率：50HZ，静置时间：2s，电流档10E-6A。
将步骤2)得到的待测液体滴涂到丝网印刷碳电极(同时覆盖工作电极、对电极和参比电极)上，立即扫描，记录结果。
4)数据的处理与分析
将步骤3)中方波伏安法测得的曲线作“切线”处理，记录波峰位置的电流值，即IP值。
二价镁离子不仅在RT-RAA等温扩增过程中催化DNA聚合酶发挥重要作用，而且还影响Cas13a蛋白的裂解活性。实验发现，镁离子浓度为25mM时检测性能最佳(图3中B)。因此，选择25mM镁离子浓度进行后续实验。
(3)Cas13a蛋白浓度优化
本研究对Cas13a蛋白的浓度进行了优化，在电化学CRISPR生物传感器中引入多个不同浓度的Cas13a蛋白，即25nM、50nM、75nM、100nM、125nM和150nM，然后进行电化学检测分析。具体筛选步骤如下：反应体系见表5。反应条件：置于37℃的金属浴中，反应时间分别为30min。
表5Cas13a蛋白浓度优化反应体系
2)磁珠分离报告RNA-B
a.磁珠去缓冲液
将DynabeadsTMM-280Streptavidin磁珠浑浊液试剂充分摇匀，取30μL磁珠浑浊液，置于磁力架上1min，弃上清，加入35μL RNase-free H2O，将磁珠吹吸均匀，再置于磁力架上静置1min，弃上清。
b.反应体系中报告RNA的磁性分离
将LwaCas13a体外切割后的液体加入含有磁珠的EP管中，吹吸混匀，静置1min，然后将EP管置于磁力架2min，收集上清液作为待测液。
3)方波伏安法测试
参数设置：初始电位为-0.5V,终止电位为0V，电位增量为0.006V，振幅为0.05V，频率：50HZ，静置时间：2s，电流档10E-6A。
将步骤2)得到的待测液体滴涂到丝网印刷碳电极(同时覆盖工作电极、对电极和参比电极)上，立即扫描，记录结果。
4)数据的处理与分析
将步骤3)中方波伏安法测得的曲线作“切线”处理，记录波峰位置的电流值，即IP值。
实验结果显示，当Cas13a蛋白浓度为75nM时，出现最明显的电化学峰电流信号，当Cas13a蛋白浓度低于和高于75nM时，电化学峰电流信号均有所降低(图3中C)，可能由于增加Cas13a蛋白浓度可增加CRISPR/Cas13a系统对报告RNA-B的反式切割活性，但加入过多的Cas13a蛋白，可能引入了过量的蛋白保存液和Cas13a蛋白本身，对电化学测试有一定负面影响。所以，综合考虑以上情况，最终选择了75nM的Cas13a蛋白浓度进行后续实验。
(4)CRISPR/Cas13a系统对报告RNA-B的反式切割时间优化
本研究还对CRISPR/Cas13a系统对报告RNA-B的反式切割时间进行了测试，磁珠分离报告RNA的时间为1min、Mg离子浓度为25mM和Cas13a蛋白的浓度75nM，目标RNA的浓度为100nM。具体筛选步骤如下：反应体系见表6。反应条件：置于37℃的金属浴中，反应时间分别设置1min、5min、10min、20min、30min和60min。
表6CRISPR/Cas13a系统对报告RNA-B的反式切割时间优化反应体系
2)磁珠分离报告RNA-B
a.磁珠去缓冲液
将DynabeadsTMM-280Streptavidin磁珠浑浊液试剂充分摇匀，取30μL磁珠浑浊液，置于磁力架上1min，弃上清，加入35μL RNase-free H2O，将磁珠吹吸均匀，再置于磁力架上静置1min，弃上清。
b.反应体系中报告RNA的磁性分离
将LwaCas13a体外切割后的液体加入含有磁珠的EP管中，吹吸混匀，静置1min，然后将EP管置于磁力架2min，收集上清液作为待测液。
3)方波伏安法测试
参数设置：初始电位为-0.5V,终止电位为0V，电位增量为0.006V，振幅为0.05V，频率：50HZ，静置时间：2s，电流档10E-6A。
将步骤2)得到的待测液体滴涂到丝网印刷碳电极(同时覆盖工作电极、对电极和参比电极)上，立即扫描，记录结果。
4)数据的处理与分析
将步骤3)中方波伏安法测得的曲线作“切线”处理，记录波峰位置的电流值，即IP值。
实验结果显示，当Cas13a/crRNA复合体识别目标RNA时，反式切割报告RNA-B1min便能产生非常强的电化学峰电流信号(图3中D)，进一步验证了Cas13a/crRNA系统在识别目标RNA后对ssRNA的RNase反式切割活性。
实施例3、基于CRISPR/Cas13a的均相电化学生物传感器检测灵敏度和特异性分析
1.无扩增的CRISPR/Cas13a电化学生物传感器灵敏度测试
在优化的实验条件下，本研究对无目标RNA扩增的电化学CRISPR生物传感器的检测灵敏度和动态范围进行了测试。
具体步骤如下：
1)将目标RNA用ddH2O按照10倍稀释成10000pM、1000pM、100pM、10pM、1pM和0.1pM；得到实验组；
2)取20μL稀释后的RNA按照实施例1第3部分的方法基于CRISPR/Cas13a系统检测目的核酸，同时设置ddH2O为模板的扩增产物作为阴性对照。
根据空白对照组结果设置了该传感器的检出阈值(阴性实验组均值+3倍标准差)为44.4nA，当电化学CRISPR生物传感器的峰电流值大于44.4nA即为可检出，当电化学CRISPR生物传感器的峰电流值小于或等于44.4nA即认为不能检出。
结果如图4所示，灵敏度测试的方波伏安图为图4中A，当目标RNA浓度大于和等于10pM时，电化学CRISPR生物传感器峰电流值均大于检出阈值44.4nA，并且目标RNA在10pM到1nM范围逐渐增加时，电化学CRISPR生物传感器的峰电流值也呈递增趋势，表现出良好的相关性(图4中B)。与其他不需要目标RNA扩增的电化学CRISPR生物传感器相比，我们所建立的生物传感器的检测限提高了接近10倍。该生物传感器无需RNA扩增和复杂操作，检测限可达10pM，在病原核酸检测方面显示了的巨大潜力。
(2)CRISPR/Cas13a电化学生物传感器特异性测试
本研究还通过设计HV69-70del和D614G两个不同的SARS-CoV-2变异位点，验证了CRISPR/Cas13a电化学生物传感器的特异性。
HV69-70del SARS-CoV-2突变株与野生株相比，缺失6个碱基(如图4中F)，D614GSARS-CoV-2突变株为单碱基交换(如图4中E)。
具体步骤如下：
(1)将SARS-CoV-2HV69-70位点野生株和突变株RNA模板用ddH2O稀释成100pM的浓度；将SARS-CoV-2D614G位点野生株和突变株RNA模板用ddH2O稀释成100pM的浓度；得到实验组；
(2)完成步骤(1)后，取20μL的SARS-CoV-2HV69-70位点野生株和突变株RNA模板，使用HV69-70del-crRNA的反应体系按照实施例1第3部分的方法基于CRISPR/Cas13a系统检测目的核酸，同时设置ddH2O为模板的扩增产物作为阴性对照。同样，取20μL的SARS-CoV-2D614G位点野生株和突变株RNA模板，使用D614G-crRNA的反应体系按照实施例1第3部分的方法基于CRISPR/Cas13a系统检测目的核酸，同时设置ddH2O为模板的扩增产物作为阴性对照。
结果如图4中C和D所示，具有相应crRNA的突变型SARS-CoV-2能诱导产生特异性的电化学反应，突变型SARS-CoV-2菌株的crRNA与野生菌株序列结合时，不产生电化学信号。这些结果表明，本研究的CRISPR/Cas13a生物传感器能够检测具有高特异性的目标RNA，同时，由于crRNA的可编辑性，电化学CRISPR生物传感器可以通过改变crRNA引导区序列，开发用于任何其他目标RNA的通用生物传感平台。
实施例4、基于RT-RAA的CRISPR/Cas13a均相电化学核酸检测方法的建立
1.基于RT-RAA的CRISPR/Cas13a电化学传感器检测新型冠状病毒的原理
图1中A表示提取SARS-CoV-2的RNA，经过RT-RAA等温扩增和T7转录后进行Cas13a反式切割反应。Cas13a/crRNA复合体结合目标SARS-CoV-2的RNA(197nt)后并激活反式切割酶活性，两端分别修饰有生物素(Biotin)和亚甲基蓝(MB)的报告基因ssRNA将被切割，裂解后的报告分子可用于电化学检测。
图1中B表示电化学CRISPR生物传感器的主要过程。将目标RNA加入反应管中，能与Cas13a/crRNA复合体结合并激活Cas13a的反式切割酶活性，对报告RNA(Biotin-ssRNA-MB)进行切割，然后将其与表面修饰有链亲和素的磁珠充分混合孵育，再经磁力分离，可去除未被切割的报告RNA和生物素-寡核苷酸基团，最后将残留有亚甲基蓝(MB)基团的上清液滴在丝网印刷碳电极(SPCE)上，然后通过电化学方法测量MB的氧化还原峰信号，会出现较强烈的特征性波峰信号。反之，当反应管中不存在目标RNA时，Cas13a蛋白的反式切割活性不能被激活，报告RNA-B(生物素-ssRNA-MB)便不被切割，完整的报告RNA会被修饰有链霉亲和素的磁珠吸附清除，将未残留或者少量残留亚甲基蓝(MB)基团的上清液滴在丝网印刷碳电极(SPCE)上，通过电化学方法测量MB的氧化还原峰信号，便几乎不会出现明显的特征性波峰信号。
2.基于RT-RAA的CRISPR/Cas13a均相电化学核酸检测方法
基于RT-RAA的CRISPR/Cas13a均相电化学核酸检测方法包括RT-RAA等温扩增30min、T7转录和Cas13a切割30min，磁珠去除多余的报告RNA 1min和方波伏安法测量电化学信号2min，整个操作过程不超过63分钟，是一种有潜力应用于POCT的电化学CRISPR核酸检测方法。
检测方法具体步骤如下：
(1)RT-RAA等温扩增
利用新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(CRISPR免疫层析法)(杭州众测)，按照说明书进行等温扩增，具体操作如下：
表7 RT-RAA等温扩增反应体系
| 名称 | 体积 |
| A Buffer | 17.5μL |
| RNA模板 | 30.0μL |
| B Buffer | 2.5μL |
| 总体积 | 50.0μL |
a.向装有干粉酶制剂的检测单元管中加入17.5μL A Buffer；
b.向检测单元管中分别加入30.0μL靶标RNA；阴性对照组中加入30.0μL的ddH2O。
c.再向检测单元管盖上加入2.5μL的B Buffer，盖上管盖，上下颠倒充分混匀5-6次，低速离心10秒钟。
d.将检测单元管放入42℃恒温金属浴中，孵育30min。
e.每组实验重复5次。
f.配置1.5％琼脂糖凝胶，电压U＝150V，电流I＝150mA，时间T＝30min，取一部分RT-RAA扩增产物进行电泳检测，观察电泳条带。
结果如图5中A所示：通道3为目标RNA扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果，在165bp处具有明显的条带，与预期相符，说明RT-RAA对目标RNA的扩增成功。
(2)取步骤(1)中f获得的RT-RAA扩增产物用于LwaCas13a对报告RNA-B的体外切割反应，体系配制见表8。反应条件：置于37℃的金属浴中，反应30min。
表8 LwaCas13a对报告RNA-B的体外切割反应体系
| 试剂 | 初始浓度 | 工作浓度 | 体积(μL) |
| NTP MIX | 25mM | 2.5mM | 4 |
| T7 RNA聚合酶 | 10U/μL | 1U/μL | 4 |
| HEPES缓冲液 | 1M | 25mM | 1 |
| Cas13a蛋白 | 1μM | 75nM | 3 |
| crRNA | 2μM | 50nM | 1 |
| 报告RNA-B | 20μM | 1μM | 2 |
| MgCl2 | 1M | 25mM | 1 |
| ddH2O | / | / | 22 |
| RT-RAA扩增产物 | / | / | 2 |
| 总体积(μL) | 40 |
(3)磁珠分离报告RNA-B
1)磁珠去缓冲液
将DynabeadsTMM-280Streptavidin磁珠与缓冲液充分摇匀，取30μL磁珠，置于磁力架上1min，弃上清，加入35μL RNase-free H2O，将磁珠吹吸均匀，再置于磁力架上静置1min，弃上清。
2)反应体系中报告RNA的磁性分离
将LwaCas13a体外切割后的液体加入含有磁珠的EP管中，吹吸混匀，静置1min,然后将EP管置于磁力架2min，收集上清，待检。
(4)方波伏安法测试
参数设置：初始电位为-0.5V,终止电位为0V，电位增量为0.006V，振幅为0.05V，频率：50HZ，静置时间：2s，电流档10E-6A。
将之前的待测液体滴上丝网印刷碳电极(同时覆盖工作电极、对电极和参比电极)，立即扫描，记录结果。
(5)数据的处理与分析
将步骤(4)中方波伏安法测得的曲线作“切线”处理，记录波峰位置的电流值，即IP值。
结果如图5中B所示：当目标RNA存在时，电化学检测出现明显的波峰电流信号，当无目标RNA存在时，电化学检测仅出现微弱的波峰电流信号(背景值)，说明基于RT-RAA的CRISPR/Cas13a均相电化学核酸检测方法能有效识别目标RNA是否存在，该检测方法构建成功。
实施例5、等温扩增结合CRISPR/Cas13a的均相电化学核酸检测方法灵敏度分析和特异性分析
1.灵敏度测试
研究了基于RT-RAA的CRISPR/Cas13a均相电化学核酸检测方法对不同浓度新型冠状病毒SARS-CoV-2N基因核酸标准品的检测灵敏度，并与荧光法CRISPR和RT-qPCR法的检测灵敏度进行了对比。
1)基于RT-RAA的CRISPR/Cas13a均相电化学核酸检测方法的具体步骤同实施例4。
2)荧光法CRISPR的具体操作步骤如下：
(1)RT-RAA等温扩增(同实施例4)；
(2)LwaCas13a对报告RNA-Y的体外切割反应体系见表9。反应条件：置于荧光定量PCR仪器中，温度37℃，每2分钟采集一次FAM荧光，采集30次。
表9LwaCas13a对报告RNA-Y的体外切割的反应体系
3)RT-qPCR的具体操作步骤如下：
根据达安新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR)说明书进行操作。反应体系如表10所示，反应条件如表11所示。
表10荧光PCR反应体系
| 试剂 | 体积(μL) |
| A buffer | 17 |
| B buffer | 3 |
| Target RNA | 5 |
表11荧光PCR反应程序
结果如图6所示，基于RT-RAA的CRISPR/Cas13a均相电化学核酸检测方法的检出限(LOD)可达1copies/μL(图6中A)，而作为目前公认“金标准”的实时荧光PCR对新冠标准核酸物质的N基因的检测限仅为10copies/μL(图6中B)。目前比较成熟的荧光法CRISPR也只能检测到10copies/μL新冠标准核酸物质N基因(图6中C)。由此可知，基于RT-RAA的CRISPR/Cas13a均相电化学核酸检测方法的灵敏度优于RT-qPCR和荧光CRISPR方法，因此该方法显示了SARS-Cov-2检测的巨大潜力。
(2)特异性测试
在本实施例中，除了crRNA的灵活可编程性和Cas13a的有效信号放大效率外，Cas13a/crRNA系统的高选择性是另一个重要优势。基于Cas13a/crRNA的直接核酸检测系统具有单碱基分辨率。RT-RAA方法的引入不仅可以提高灵敏度，而且通过对目标RNA序列的精确鉴定，有助于确保特异性。
本研究采用基于RT-RAA的CRISPR/Cas13a均相电化学核酸检测方法检测6种不同病原体的核酸物质SARS-CoV-2(中国计量院，GBW(E)091089)、HIV-1(GenBank:K03455.1)、HBV(GenBank ID:NC_003977.2)、H1N1(GenBank ID:NC 002023.1)、DEV4(GenBank ID:NC_002640.1)和CB(GenBank ID:NZ_CP040059.1))浓度均为104copies/μL)，以测试该方法的特异性。
具体操作步骤同实施例4。
(1)分别以6种不同病原体(SARS-CoV-2、HIV、HBV、H1N1、DEV和CB)的核酸物质作为RNA模板，按照实施例4中步骤2的方法进行RT-RAA扩增，得到RT-RAA扩增产物。
(2)完成步骤(1)后，取2μLRT-RAA扩增产物按照实施例4中步骤2的方法基于CRISPR-Cas13a系统检测各病毒核酸，同时设置水为模板的扩增产物作为阴性对照组(ddH2O)。
实验结果表明(图6中D)，只有检测SARS-CoV-2RNA时CRISPR电化学传感器才出现明显的阳性信号，而检测其他病原体核酸时均呈现阴性结果，与空白对照组的背景信号强度相当，说明基于RT-RAA的CRISPR/Cas13a均相电化学核酸检测方法具有较好的特异性，检测过程中不存在交叉反应。
实施例6、实际样品检测
本实施例中，为了更好地进行临床诊断，本研究引入了“阳性阈值”的概念，将阳性阈值设置为高于空白的三倍标准差。
一、实验材料
收集临床标本。
2021年7月在解放军疾病预防控制中心收集健康人临床标本7份(n＝7)和可疑临床样本39份(n＝39)。
分别利用基于RT-RAA的CRISPR/Cas13a均相电化学核酸检测方法和RT-qPCR对临床样本进行SARS-CoV-2阳性和阴性检测。
本实施例中，基于RT-RAA的CRISPR/Cas13a均相电化学核酸检测方法的具体步骤同实施例4。
本实施例中，RT-qPCR的具体操作步骤同实施例5。根据达安新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR)说明书进行操作。
实验结果显示，7例健康人咽拭子检测阳性阈值为55nA，用虚线表示(图7中A)。当基于RT-RAA的CRISPR/Cas13a均相电化学核酸检测方法的电流值大于55nA时为阳性结果，当电流值小于或等于55nA时为阴性结果。
从解放军疾病预防控制中心获得39份可疑临床样本，结果如表12和图7所示。基于RT-RAA的CRISPR/Cas13a均相电化学核酸检测方法检测出19份阳性结果，20份阴性结果，而采用RT-qPCR只能检测出16分阳性结果和20份阴性结果(图7中B)，两种检测方法的检测结果基本一致，符合率为92.3％。将不相符的3份临床样本进行数字PCR检测，均显示为阳性样本，其结果和基于RT-RAA的CRISPR/Cas13a均相电化学核酸检测方法一致，进一步说明CRISPR电化学检测方法比RT-qPCR更灵敏。
表12三种方法检测临床样本的结果
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.用于核酸检测的电化学生物传感组合物，其特征在于，所述电化学生物传感组合物包括：报告RNA-B、表面包被链霉亲和素的磁珠或微珠、Cas13a蛋白、特异于待检测生物的crRNA，所述报告RNA-B的一端标记生物素，另一端标记亚甲基蓝。
2.根据权利要求1所述的电化学生物传感组合物，其特征在于：所述电化学生物传感组合物包括进行核酸扩增的试剂。
3.权利要求1或2所述的电化学生物传感组合物在制备电化学生物传感器的工作液或电化学生物传感器中的应用。
4.电化学生物传感器的工作液，其特征在于，包括如权利要求1所述的电化学生物传感组合物以及可接受的辅料或助剂。
5.根据权利要求4所述的电化学生物传感器的工作液在制备电化学生物传感器中的应用。
6.电化学生物传感器，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的电化学生物传感组合物或如权利要求4所述的电化学生物传感器的工作液，以及电极系统。
7.权利要求6所述的电化学生物传感器在制备核酸检测产品中的应用。
8.权利要求6所述的电化学生物传感器在环境污染监测、食品安全检测或疾病诊断的装置中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述疾病包括但不限于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染在内的传染病病原感染、基因变异检测、遗传病诊断等。
10.核酸的检测方法，其特征在于，取待测核酸与如权利要求1或2所述的电化学生物传感组合物或如权利要求4所述的电化学生物传感器的工作液混合，使用如权利要求5或6所述的电化学生物传感器的工作电极，对核酸进行检测。
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