CN110872620B - 一种用于产前无创诊断双侧杯状耳畸形的引物探针组件、试剂盒及其应用 - Google Patents

一种用于产前无创诊断双侧杯状耳畸形的引物探针组件、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于产前无创诊断双侧杯状耳畸形的引物探针组件、试剂盒及其应用，该引物探针组件包括含有4条引物的引物组和4条探针的探针组，该试剂盒包括所述引物探针组件、酶系和反应试剂；该试剂盒可用于产前无创诊断双侧杯状耳畸形。本发明首次研发了能够在产前诊断胎儿双侧杯状耳畸形的方法，其特异性好，并具有高分辨率、高灵敏度、准确、快速的特点，该方法技术操作步骤简便，无创伤，具有重要的应用价值。

Description

一种用于产前无创诊断双侧杯状耳畸形的引物探针组件、试 剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及基因技术领域，具体涉及一种用于产前无创诊断双侧杯状耳畸形的引物探针组件、试剂盒及其应用。
背景技术
先天性耳部畸形是影响耳廓位置和形态的一种常见的出生缺陷，耳部软骨发育的异常多累及耳的外形和正常功能。流行病学调查显示，人群中约有5％的样本有不同程度的先天性耳部发育畸形，主要包括招风耳、杯状耳畸形和先天性小耳(或无耳)畸形等。
杯状耳畸形是先天性耳畸形中的一种，是介于招风耳和小耳之间的先天性畸形疾患，其主要的临床表型为：耳廓上半部的耳轮紧缩，耳轮及耳廓软骨卷曲和粘着，耳轮脚向下移位，对耳轮及其后脚扁平甚至消失，耳舟变宽，耳轮缘弯向耳甲艇，耳廓呈杯形，严重者耳廓卷曲几乎成管状。杯状耳畸形约占各种先天性耳部畸形的10％；区别于其他常见的耳部畸形，杯状耳畸形多双侧发生，同时具有明显的遗传倾向。
尽管杯状耳畸形一般不伴随严重的中耳、内耳畸形或其他器官畸形，但由于不同的严重程度所导致的外观缺损和其明显的遗传倾向，往往会给患者造成巨大的心理压力和负担。因此基于杯状耳畸形的家系鉴定易感基因，具有重要的科学价值和社会意义。
从发育生物学的角度看，人的面部形成主要受头部神经嵴细胞的影响，神经嵴细胞起源于预置神经板的外侧边缘，在神经管闭合时位于闭合处，随后离开闭合处向特定部位迁移。外耳和中耳由第一、第二鳃弓和神经嵴细胞细胞迁移衍化而来。胚胎第6周时，第一鳃沟周围的间充质增生，形成6个结节状的耳丘围绕外耳道口，逐渐演变为耳廓；而中耳则主要由神经嵴的间叶组织分化而来。外耳和中耳的发生是神经嵴细胞迁移及软骨分化、多种细胞相互作用的结果，并且受多种结构和调控蛋白及信号通路的影响。
传统方法对双侧杯状耳畸形诊断，并无特殊的产前检测方法，只能等出生后进行手术治疗，给患者带来了精神和身体上的双重痛苦。因此，寻找一种高灵敏度的无创产前诊断双侧杯状耳畸形遗传病的方法是非常必要的。
我们针对前期研究结果，收集怀的外周血，提取孕妇外周血中胎儿的游离DNA，采用特异性引物或探针对进行扩增检测，并进行双侧杯状耳畸形生育风险评估，为患儿和父母提供更多的选择和预警，为优生优育提供有力工具。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种用于产前无创诊断双侧杯状耳畸形的引物探针组件、试剂盒及其应用，以解决现有技术中提到的不足。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
一种用于产前无创诊断双侧杯状耳畸形的试剂盒，所述的试剂盒包括引物探针组件以及酶系和反应试剂；
所述引物探针组件包括检测引物组和检测探针组，该检测引物组和检测探针组包括以下(1)-(4)中的任意一组：
(1)引物组1和探针组1；
所述的引物组1包括以下2条引物：①引物F1：其核苷酸序列为CACAAGTTCAAAAGGCACCC；②引物R1：其核苷酸序列为TTAATGCGATCCGTGTCTCG；
所述的探针组1包括以下1条探针：①探针P1：其核苷酸序列为AGAATGTTCCAGATAGCCCCGAGC，其5’端标记有荧光基团，其3’端标记有淬灭基团；
(2)引物组2和探针组2；
所述的引物组2包括以下2条引物：①引物F2：其核苷酸序列为CTCCAGCTCCCTTTGATGTATAC；②引物R2：其核苷酸序列为GCCTTTCTCAGAGTTCTCCTG；
所述的探针组2包括以下1条探针：①探针P2：其核苷酸序列为ACGTGAAACCCTTTGAGCCTAGGAG，其5’端标记有荧光基团，其3’端标记有的淬灭基团；
(3)引物组3和探针组3；
所述的引物组3包括以下2条引物：①引物F3：其核苷酸序列为GGGTATTAGAAACGAATTGCCTG；②引物R3：其核苷酸序列为TTAGTTGCCACCGAGAAGTATC；
所述的探针组1包括以下1条探针：①探针P3：其核苷酸序列为TTTAGATGAAGGCGAGCCACACAGAG，其5’端标记有荧光基团，其3’端标记有淬灭基团；
(4)引物组4和探针组4；
所述的引物组4包括以下2条引物：①引物F4：其核苷酸序列为CCTTCAAAGCCACCTCTCATC；②引物R4：其核苷酸序列为TGTTGGAGAAATGGATCCCAG；
所述的探针组4包括以下1条探针：①探针P4：其核苷酸序列为CCCTCCACCTCTGCCTCTGTCT，其5’端标记有荧光基团，其3’端标记有的淬灭基团。
进一步地，在上述(1)～(4)中，探针P1、探针P2、探针P3和探针P4中的5’端所标记的荧光基团均为FAM、HEX、VIC、CY5和TET中的任意一种，且3’端所标记的淬灭基团均为TAMRA、MGB和BHQ中的任意一种。
进一步地，在上述(1)～(4)中，每组中的引物组和探针组的体积比为1∶1，且在每组中的两条引物的体积比为1∶1。
进一步地，所述的酶系包括Tfl DNA聚合酶和Stoffel片段的酶混合液。
进一步地，所述酶系为Tfl DNA聚合酶、MMLV反转录酶和Stoffel片段的酶混合液。
进一步地，所述的反应试剂包括：Tris-硫酸、(2)MOPS缓冲液、柠檬酸钠、(NH4)2SO4；(5)MgSO4和、乙酰化BSA。
进一步地，所述的试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品；所述的阴性对照品为生理盐水；所述的阳性对照品为采用检测引物组对无创产前检测双侧杯状耳畸形基因组扩增所获得的扩增片段。
进一步地，所述的试剂盒还包括消化液、裂解液和洗涤液。
进一步地，所述试剂盒中各种成分的体积份数为：300～800nM的检测引物组0.5份、100～300nM的检测探针组0.5份、0.5-1unit的TflDNA聚合酶0.5份、0.5-1unit的Stoffel片段0.5份、20-50mM的pH8.5的Tris-硫酸1份、10-20mM的pH7.9的MOPS缓冲液1份、2-5mM的柠檬酸钠1份、10-20mM的(NH4)2SO41份、5-10mM的MgSO41份和0.1mg/ml的乙酰化BSA1份；若述酶系中含有MMLV反转录酶，则该MMLV反转录酶的浓度和体积为：0.5-1unit的MMLV反转录酶0.5份。
一种用于产前无创诊断双侧杯状耳畸形的引物探针组件，所述引物探针组件为以上所述的引物探针组件。
一种上述的试剂盒的应用，该试剂盒在产前无创诊断双侧杯状耳畸形中的应用。
本发明至少具有以下有益效果：
本发明首次研发了一种能够在产前诊断胎儿双侧杯状耳畸形的方法，其可快速筛查双侧杯状耳畸形相关基因的变异，并将双侧杯状耳畸形的诊断提高到基因水平上；且该方法特异性好，具有高分辨率、高灵敏度、准确、快速的特点，其准确率基本可达到100％，速度较快，2小时左右便可获知结果，节约成本时间，减少病人痛苦，该方法技术操作步骤简便，无创伤，只需要获取血液便可进行检测；且孕妇在怀孕12周之前便能够采用本试剂盒进行检测，最早于4～6周便可进行，相当于刚发现怀孕便能够进行检测；故该方法能够实现生育风险评估，为患儿和父母提供更多的选择和预警，为优生优育提供有力工具；该方法也使得产前预防、纠正、治疗能够得以实现。其避免了传统方法中没有特殊的产前检测方法，只能等出生后进行手术治疗，给患者带来了精神和身体上的双重痛苦的不足。
具体地，1、本发明首次研发出了检测引物组和检测探针组，通过设计该独特序列以及特异性修饰的引物探针组，该引物探针组对于与双侧杯状耳畸形相关的致病基因扩增的特异性强，能够有效地提高检测准确性、特异性以及灵敏性。
2、本发明首次研发了能够诊断双侧杯状耳畸形的试剂盒，该试剂盒通过特定的检测引物组和检测探针组以及酶系和相应的反应实现了效果极佳的基因检测，并可直接获知是否患有双侧杯状耳畸形。而且在该试剂盒中，引入了Stoffel片段和Tfl DNA聚合酶的双聚合酶的扩增方法；其中Stoffel片段为去除5’-3’外切酶活性结构域的Taq DNA聚合酶，去除5’-3’外切酶活性的同时，恢复了少量3’-5’外切酶的校正活性，弥补了Tfl DNA聚合酶特异性不足的缺陷。且Stoffel片段和Tfl DNA聚合酶结合使用，使其耐抑制剂能力增强，使得根据本发明构建的实时定量荧光q-PCR试剂盒中可以加入更多的模版，从而可以用于提升灵敏度。
3、本发明能够实现双侧杯状耳畸形的检测，该方法通过对孕妇血液中游离的胎儿DNA中可能存在的致病基因进行扩增，实现双侧杯状耳畸形生育风险评估，为患儿和父母提供更多的选择和预警，为优生优育提供有力的指导。此外，在该方法中，与传统的实时荧光定量PCR不同，本发明采用多个循环程序，并提高引物退火温度，使检测方法达到极高的灵敏度及特异性。
总之，本发明在基因学、医学领域等均具有极其重要的里程碑式的意义和价值。其适合在各级疾控单位和医院进行推广，具有广泛的应用前景。
附图说明
通过以下参照附图对本发明实施例的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优点将更为清楚，在附图中：
图1是本发明实施例所述的用于产前无创诊断双侧杯状耳畸形的试剂盒的外观示意图；
图2是本发明实施例所述的小鼠双侧杯状耳畸形的示意图。
具体实施方式
以下基于实施例对本发明进行描述，但是本发明并不仅仅限于这些实施例。
实施例1
一种用于产前无创诊断双侧杯状耳畸形的引物探针组件，其包括以下引物组和探针组(1)～(4)中的任意一组；
(1)引物组1和探针组1；
所述的引物组1包括以下2条引物：①引物F1：其核苷酸序列为CACAAGTTCAAAAGGCACCC；②引物R1：其核苷酸序列为TTAATGCGATCCGTGTCTCG；
所述的探针组1包括以下1条探针：①探针P1：其核苷酸序列为AGAATGTTCCAGATAGCCCCGAGC，其5’端标记有荧光基团，其3’端标记有淬灭基团；
其中，引物组1和探针组1的体积比为1∶1，且在引物组1中，引物F1和引物R1的质量比为1∶1。
(2)引物组2和探针组2；
所述的引物组2包括以下2条引物：①引物F2：其核苷酸序列为CTCCAGCTCCCTTTGATGTATAC；②引物R2：其核苷酸序列为GCCTTTCTCAGAGTTCTCCTG
所述的探针组2包括以下1条探针：①探针P2：其核苷酸序列为ACGTGAAACCCTTTGAGCCTAGGAG，其5’端标记有荧光基团，其3’端标记有的淬灭基团；
其中，引物组2和探针组2的体积比为1∶1，且在引物组2中，引物F2和引物R2的质量比为1∶1。
(3)引物组3和探针组3；
所述的引物组3包括以下2条引物：①引物F3：其核苷酸序列为GGGTATTAGAAACGAATTGCCTG；②引物R3：其核苷酸序列为TTAGTTGCCACCGAGAAGTATC；
所述的探针组1包括以下1条探针：①探针P3：其核苷酸序列为TTTAGATGAAGGCGAGCCACACAGAG，其5’端标记有荧光基团，其3’端标记有淬灭基团；
其中，引物组3和探针组3的体积比为1∶1，且在引物组3中，引物F3和引物R3的质量比为1∶1。
(4)引物组4和探针组4；
所述的引物组4包括以下2条引物：①引物F4：其核苷酸序列为CCTTCAAAGCCACCTCTCATC；②引物R4：其核苷酸序列为TGTTGGAGAAATGGATCCCAG；
所述的探针组4包括以下1条探针：①探针P4：其核苷酸序列为CCCTCCACCTCTGCCTCTGTCT，其5’端标记有荧光基团，其3’端标记有的淬灭基团；
其中，引物组4和探针组4的体积比为1∶1，且在引物组4中，引物F4和引物R4的质量比为1∶1。
在上述(1)～(4)中，探针P1、探针P2、探针P3和探针P4中的5’端所标记的荧光基团均为FAM、HEX、VIC、CY5和TET中的任意一种，且3’端所标记的淬灭基团均为TAMRA、MGB和BHQ中的任意一种。
实施例2：试剂盒
一种用于产前无创诊断双侧杯状耳畸形的试剂盒，所述的试剂盒包括引物探针组、酶系和反应试剂。
所述引物探针组包括(1)～(4)中的任意一项中的引物组和探针组，如可选择(1)中的引物组1和探针组1，或(2)中的引物组2和探针组2，或(3)中的引物组3和探针组3，或(4)中的引物组4和探针组4。
所述的酶系包括：Tfl DNA聚合酶和Stoffel片段(购买厂家：Cetus公司)优选该酶系为Tfl DNA聚合酶和Stoffel片段的酶混合液；更优选地，该酶系还包括MMLV反转录酶，即酶系为Tfl DNA聚合酶、Stoffel片段和MMLV反转录酶的酶混合液。
所述的反应试剂包括：(1)Tris-硫酸；(2)MOPS缓冲液；(3)柠檬酸钠；(4)(NH4)2SO4；(5)MgSO4；(6)乙酰化BSA。
所述试剂盒中各种成分的量为：300～800nM的引物组0.5ml、100～300nM的探针组0.5ml、酶混合液、20-50mM的pH8.5的Tris-硫酸1ml、10-20mM的pH7.9的MOPS缓冲液1ml、2-5mM的柠檬酸钠1ml、10-20mM的(NH4)2SO41ml、5-10mM的MgSO41ml和0.1mg/ml的乙酰化BSA1ml；其中，酶混合液是由0.5-1unit(浓度)的Tfl DNA聚合酶0.5ml和0.5-1unit(浓度)的Stoffel片段0.5ml混合而成，或者酶混合液是由0.5-1unit(浓度)的Tfl DNA聚合酶0.5ml、0.5-1unit(浓度)的Stoffel片段0.5ml、0.5-1unit(浓度)的MMLV反转录酶0.5ml混合而成。
优选地，所述Tris-硫酸的pH为8.5，MOPS缓冲液的pH为7.9，聚氧乙烯月桂醚的浓度为0.10％(W/V)，乙酰化BSA的浓度为0.1mg/ml。
作为进一步优选的实施方式，所述的试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品；所述的阴性对照品为生理盐水；所述的阳性对照品为采用检测引物组对无创产前检测双侧杯状耳畸形基因组扩增所获得的扩增片段，该扩增片段的长度为约为100-200bp。其加量一般为：阴性对照品：200ng/ul浓度的0.5ml，阳性对照品：200ng/ul浓度的0.5ml。
本发明中的试剂盒外观可参见图1。
实施例3：试剂盒的制备方法
一种用于产前无创诊断双侧杯状耳畸形的试剂盒的制备：将实施例2中所述的各种成分按其浓度与所需要的量进行包装，需要注意的是，所述酶系为将①0.5ml浓度为0.5-1unit的Tfl DNA聚合酶和0.5ml浓度为0.5-1unit的Stoffel片段进行混合，或者②0.5ml浓度为0.5-1unit的Tfl DNA聚合酶、0.5ml浓度为0.5-1unit的Stoffel片段和0.5ml浓度为0.5-1unit的MMLV反转录酶进行混合，混合均匀，再包装便可。这几种特定种类的酶的混合使整个体系的耐抑制剂能力增强，使得根据本发明构建的荧光realtime-PCR试剂盒中可以加入更多的模版，从而可以用于提升灵敏度。
实施例4：检测方法
采用将实施例2中所述的试剂盒进行产前无创诊断双侧杯状耳畸形的方法：具体步骤如下所示。
(1)采集孕妇血液，提取血液中的胎儿cf-DNA
S1：准备洗涤液(购买厂家为常州百代生物科技有限公司)，配制洗涤液A和洗涤液B；
a)洗涤液A：取21ml洗涤液则加入9ml无水乙醇；若取42ml洗涤液则加入18ml无水乙醇。
b)洗涤液B：取9ml洗涤液则加入21ml无水乙醇；若取18ml洗涤液则加入42ml无水乙醇。
S2：取1.5ml离心管，加入200μl所采集的孕妇血液样本，4μl DNA Carrier(DNA载体，购买厂家：常州百代生物科技有限公司)混合均匀，加入300μl裂解液(购买厂家：常州百代生物科技有限公司)及20μl消化液(购买厂家：常州百代生物科技有限公司)，振荡混匀，56℃水浴10分钟。
S3：向S2中的离心管中加入1000μl无水乙醇，轻轻颠倒混匀，如有半透明悬浮物，不影响DNA的提取与后续实验；
S4：将吸附柱放入收集管内，将760μl步骤S3中所得到的溶液转入吸附柱内，静置2分钟，将含有收集管的吸附柱在12,000rpm 4℃离心1分钟，拿出吸附柱，弃收集管内的废液，并将吸附柱重新放回收集管内，将剩余760μl溶液转移至吸附柱内，重复一次该步骤；
S5：将重复步骤中收集管内所得到的液体除去，并将吸附柱再放回收集管内，加500μl洗涤液A至吸附柱内，12,000rpm 4℃离心1分钟，弃收集管内废液，将吸附柱放回收集管内；
S6：加500μl洗涤液B至吸附柱内，12,000rpm 4℃离心1分钟，弃收集管内废液，并将吸附柱放回收集管内，12,000rpm 4℃离心2分钟，离去残留的洗涤液；
S7：取出吸附柱，放入新的1.5ml离心管内，加入30-50μl洗脱液，静置3分钟，12,000rpm 4℃离心2分钟，收集DNA溶液。提取的DNA即可用于下一步实验或-20℃保存。
(2)实时荧光定量q-PCR反应
实时荧光定量RT-PCR反应体系为：500nM的引物组0.5ul、500nM的探针组0.5ul、酶混合液1.5ul、30mM的pH8.5的Tris-硫酸1ul、15mM的pH7.9的MOPS缓冲液1ul、4mM的柠檬酸钠1ul、15mM的(NH4)2SO41ul、7mM的MgSO41ul和0.1mg/ml的乙酰化BSA 1ul；RNAase-freeddH2O补至50μl；其中，引物组为引物组1和探针组1；酶混合液为0.5-1unit(浓度)的TflDNA聚合酶0.5ul、0.5-1unit(浓度)的Stoffel片段0.5ul和0.5-1unit(浓度)的MMLV反转录酶0.5ul混合而成。
实时荧光定量RT-PCR反应程序为：第一步：45℃，20～45分钟；94～96℃，2分钟；第二步：94～95℃，15～30秒；65～69℃，30～75秒；68～72℃，30～40秒；6～9个循环；第三步：93～95℃，15～20秒；60℃，30秒；68～72℃，30秒；8个循环；第四步：93～95℃，15秒；52～55℃，30～60秒；40个循环；55℃时收集荧光；
(3)结果判定：1)阳性：检测样本Ct值小于35.0，曲线有明显的指数增长期，且经换算比值(RATIO)大于等于1.2；2)可疑：检测样本Ct值大于等于35.0且小于40.0，重复一次实验，如果Ct值小于40.0，曲线有明显的指数增长期，且经换算比值(RATIO)大于等于1.2，为阳性，否则为阴性；3)阴性：检测不到样本Ct值或Ct值为40，且经换算比值(RATIO)小于1.2。
在上述步骤(1)中，对于孕妇，最早于怀孕4-6周便可进行该疾病的筛查，即通过本发明的试剂盒，使得采集怀孕4-5周孕妇的外周血便能精确判断胎儿是否含有双侧杯状耳畸形疾病，若含有该疾病，检测结果为阳性，则胎儿具有双侧杯状耳畸形，若为阴性，则无该方面的疾病。
在上述步骤(2)中，引物组和探针组可为实施例2中(1)中的引物探针组或(2)中的引物探针组或(3)中的引物探针组或(4)中的引物探针组。采用四组中的任意一组，其效率或准确率都是一样的。
在本实施例中，引物组可采用引物组2和探针组2、引物组3和探针组3或引物组4和探针组4来代替上述引物组1和探针组1，效果基本一致。
实施例5
采集样本库(为了研究方便，本申请人具有大型的样本库)中的阴性样本和阳性样本各4个，分别记为样本A01～A08，按照实施例4所述的方法进行检测，其中引物探针组采用实施例1的(1)中的引物组1和探针组1，即采用引物组1中的引物F1和引物R1，其中，引物F1的碱基序列为CACAAGTTCAAAAGGCACCC；引物R1的碱基序列为TTAATGCGATCCGTGTCTCG；探针组1的碱基序列为：AGAATGTTCCAGATAGCCCCGAGC，其5’端标记有荧光基团HEX，其3’端标记有淬灭基团MGB。
其实时荧光定量RT-PCR反应体系以及实时荧光定量q-PCR反应与实施例4一致。
结果如以下表1所示。
表1 实时荧光定量RT-PCR扩增结果数据分析结果
样本编码 Ct Δ Ct LogΔCt RCON RATIO 检测结果
A01(阳性) 17.10 1.10 0.04 0.97 2.50 阳性
A02(阳性) 20.40 3.45 0.54 0.69 1.77 阳性
A03(阳性) 28.50 11.55 1.06 0.48 1.23 阳性
A04(阳性) 21.70 4.75 0.68 0.63 1.61 阳性
A05(阴性) 36.50 19.55 1.29 0.41 1.05 阴性
A06(阴性) 33.40 16.45 1.22 0.43 1.11 阴性
A07(阴性) 34.80 17.85 1.25 0.42 1.08 阴性
A08(阴性) 35.10 18.15 1.26 0.42 1.07 阴性
B01(阳性对照) 40.00 4.05 0.61 0.66 1.69 阳性
B02(阴性对照) 21.00 23.05 1.36 0.39 1.00 阴性
表1中，Ct是指受检样本reatime-PCR扩增的循环数；ΔCt是指受检样本中扩增循环数量变化的相对量；LogΔCt是换算过程中根据reatime-PCR扩增的循环数计算的对数值；RCON指受检样本中目的片段表达的相对量；RATIO是经换算得出的受检样本中致病基因表达的比例。
由上表1可知，采用A01～A04中的阳性样本，所得Ct值分别为17.1、20.4、28.5和21.7，Ct均小于30.0，reatime-PCR曲线均有明显的指数增长期，浓度均大于0.5，且经换算比值(RATIO)均大于1.2，故判断为阳性，则该结果与原样本在样本库中记录的属性完全一致。采用样本A05～A08中的阴性样本，所得Ct值分别为36.5、33.4、34.8和35.1，Ct均小于30.0，reatime-PCR曲线有明显的指数增长期，相对浓度均小于0.5，且经换算比值(RATIO)均小于1.2，故结果判断为阴性，该结果与原样本在样本库中记录的属性完全一致。
在本实施例中，上述的荧光基团HEX可用FAM、VIC、CY5和TET中的任意一种代替；上述的淬灭基团MGB可被TAMRA或BHQ代替。上述的引物组1和探针组1可被引物组2和探针组2代替，也可被引物组3和探针组3代替，当然还可被引物组4和探针组4代替。
在本发明中，由于本发明中的试剂盒是针对双侧杯状耳畸形的致病基因进行检测的，因此，该试剂盒的准确率达到了100％。对于孕妇，最早于怀孕4-6周便可通过检测外周血来精确判断胎儿是否含有双侧杯状耳畸形疾病，从而在怀孕初期便可对该疾病进行有效筛查；该试剂盒对于婴儿畸形排查具有极其重要的应用价值；其实现了生产前便得知是否患病的目的，则便可对该疾病进行及早干预或治疗等，可有效预防双侧杯状耳畸形。而且，该试剂盒的判断结果也能够给畸形大排查医生一个预警，使其进行更为有针对性的表型筛查。
实施例7
对象：采集怀孕4～5周的孕妇的外周血10ml，且所采集的孕妇均为具有双侧杯状耳畸形或其家族近亲具有双侧杯状耳畸形；
采集地点：在全国范围将近30个医院进行采集；
时间：2016.8～2017.2；
数量：180个；
方法：按照实施例4所述的方法进行检测，其中引物探针组采用实施例1的(1)中的引物组2和探针组2，即采用引物组2中的引物F2和引物R2，其中，引物F2：其核苷酸序列为CTCCAGCTCCCTTTGATGTATAC；引物R2：其核苷酸序列为GCCTTTCTCAGAGTTCTCCTG；探针组2的碱基序列为ACGTGAAACCCTTTGAGCCTAGGAG，其5’端标记有荧光基团FAM，其3’端标记有淬灭基团TAMRA。
其实时荧光定量RT-PCR反应体系以及实时荧光定量q-PCR反应与实施例4一致。
结果：其中，175例通过实时荧光定量RT-PCR反应成果的进行了扩增；6例由于胎儿发育较为缓慢等原因，导致孕妇外周血中的胎儿基因较少，故PCR不理想，因此，在这5例孕妇怀孕8周的时候进行了第二次采集，同样采用实施例4所述的方法进行检测，最后成功得到了扩增产物。
具体的RT-PCR结果以及实际的结果如下表所示，实际结果为产后跟踪观察或检测所得到的结果。
表2检测结果以及预测结果
检测结果 数量 预测结果 实际结果
阳性 49例 患有双侧杯状耳畸形 双侧杯状耳畸形
阴性 131例 未患有双侧杯状耳畸形 表型正常
由此可知，通过跟踪上述被检测的180例孕妇，结果发现，显示阳性的孕妇所生的婴儿均表现为明显的双侧杯状耳畸形，显示阴性的孕妇所生的婴儿正常，不具有双侧杯状耳畸形的外观特征。
则可进一步获知，本申请的试剂盒准确率高，预测精确，可精确到100％，使得孕妇能够及早知道胎儿情况，有助于及早进行治疗或干预，对于优生优育具有极其重要的价值。
更重要的是，在孕妇怀孕4～5周，几乎是刚发现怀孕时，97％左右的孕妇便能够进行该项目的检测，最晚8周便能检测到，从而进行较为精确的预估；当然8周以后更能检测到，但越早检测到意义越大。
在本实施例中，上述的荧光基团FAM可用HEX、VIC、CY5和TET中的任意一种代替；上述的淬灭基团TAMRA可被MGB或BHQ代替。上述的引物组2和探针组2可被引物组1和探针组1代替，也可被引物组3和探针组3代替，当然还可被引物组4和探针组4代替。
需要说明的是，本实施例中采集样本是在孕妇同意的情况下，用其产检常规所采的血液进行试验。
在本发明中，具有双侧杯状耳畸形的小鼠的表型如图2所示。本发明人课题组针对双侧杯状耳畸形家系进行研究，采用连锁定位结合目标区域捕获和二代测序技术，对双侧杯状耳畸形大家系进行致病基因的定位研究，并对找到的致病突变和基因，在小鼠、羊等动物中进行试验，在剩余的3个家系内进行验证。同时还在约500份杯状耳畸形散发病例及200份正常对照人群中进行验证，确定了致病基因对群体发病风险的贡献度。我们进一步结合动物模型实验和外耳发育相关的信号通路进行分析，鉴定出该家系的易感基因及致病突变，确认HMX1调控区域片段的拷贝数变化(CNV)与双侧杯状耳畸形家系的发生存在连锁共分离，与双侧杯状耳畸形的发生直接相关。
此类先天性双侧杯状耳畸形家系致病位点明确，症状明确，可重复性高，基于此，设计了一种基于实时荧光定量q-PCR平台的，可操作性强，简便易行的用于无创产前诊断双侧杯状耳畸形遗传病的引物组、探针组及检测试剂盒，用对针对双侧杯状耳畸形遗传病的无创产前诊断试剂盒。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域技术人员而言，本发明可以有各种改动和变化。凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种用于产前无创诊断双侧杯状耳畸形的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括引物探针组件以及酶系和反应试剂；
所述引物探针组件包括检测引物组和检测探针组，该检测引物组和检测探针组包括以下(1)-(4)中的任意一组：
(1)引物组1和探针组1；
所述的引物组1包括以下2条引物：①引物F1：其核苷酸序列为CACAAGTTCAAAAGGCACCC；②引物R1：其核苷酸序列为TTAATGCGATCCGTGTCTCG；
所述的探针组1包括以下1条探针：①探针P1：其核苷酸序列为AGAATGTTCCAGATAGCCCCGAGC，其5’端标记有荧光基团，其3’端标记有淬灭基团；
(2)引物组2和探针组2；
所述的引物组2包括以下2条引物：①引物F2：其核苷酸序列为CTCCAGCTCCCTTTGATGTATAC；②引物R2：其核苷酸序列为GCCTTTCTCAGAGTTCTCCTG；
所述的探针组2包括以下1条探针：①探针P2：其核苷酸序列为ACGTGAAACCCTTTGAGCCTAGGAG，其5’端标记有荧光基团，其3’端标记有的淬灭基团；
(3)引物组3和探针组3；
所述的引物组3包括以下2条引物：①引物F3：其核苷酸序列为GGGTATTAGAAACGAATTGCCTG；②引物R3：其核苷酸序列为TTAGTTGCCACCGAGAAGTATC；
所述的探针组1包括以下1条探针：①探针P3：其核苷酸序列为TTTAGATGAAGGCGAGCCACACAGAG，其5’端标记有荧光基团，其3’端标记有淬灭基团；
(4)引物组4和探针组4；
所述的引物组4包括以下2条引物：①引物F4：其核苷酸序列为CCTTCAAAGCCACCTCTCATC；②引物R4：其核苷酸序列为TGTTGGAGAAATGGATCCCAG；
所述的探针组4包括以下1条探针：①探针P4：其核苷酸序列为CCCTCCACCTCTGCCTCTGTCT，其5’端标记有荧光基团，其3’端标记有的淬灭基团；
所述酶系为Tfl DNA聚合酶、MMLV反转录酶和Stoffel片段的酶混合液；
所述的反应试剂包括：Tris-硫酸、MOPS缓冲液、柠檬酸钠、(NH4)2SO4；MgSO4和乙酰化BSA。
2.根据权利要求1所述的用于产前无创诊断双侧杯状耳畸形的试剂盒，其特征在于：在上述(1)～(4)中，探针P1、探针P2、探针P3和探针P4中的5’端所标记的荧光基团均为FAM、HEX、VIC、CY5和TET中的任意一种，且探针P1、探针P2、探针P3和探针P4中的3’端所标记的淬灭基团均为TAMRA、MGB和BHQ中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的用于产前无创诊断双侧杯状耳畸形的试剂盒，其特征在于：在上述(1)～(4)中，每组中的引物组和探针组的体积比为1∶1，且在每组中的两条引物的体积比为1∶1。
4.根据权利要求1所述的用于产前无创诊断双侧杯状耳畸形的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品；所述的阴性对照品为生理盐水；所述的阳性对照品为采用检测引物组对无创产前检测双侧杯状耳畸形基因组扩增所获得的扩增片段；
所述的试剂盒还包括消化液、裂解液和洗涤液。
5.根据权利要求1所述的用于产前无创诊断双侧杯状耳畸形的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中各种成分的体积份数为：300～800nM的检测引物组0.5份、100～300nM的检测探针组0.5份、0.5-1unit的Tfl DNA聚合酶0.5份、0.5-1unit的Stoffel片段0.5份、20-50mM的pH8.5的Tris-硫酸1份、10-20mM的pH7.9的MOPS缓冲液1份、2-5mM的柠檬酸钠1份、10-20mM的(NH4)2SO41份、5-10mM的MgSO41份和0.1mg/ml的乙酰化BSA 1份；0.5-1unit的MMLV反转录酶0.5份。
6.一种用于产前无创诊断双侧杯状耳畸形的引物探针组件，其特征在于：所述引物探针组件为权利要求1或2中所述的引物探针组件。
7.一种根据权利要求1～5中任意一项所述的试剂盒在制备产前无创检测双侧杯状耳畸形的产品中的应用。
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