CN106399567A - 检测wrap53基因突变的引物及其应用 - Google Patents

检测wrap53基因突变的引物及其应用 Download PDF

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CN106399567A CN201611050641.3A CN201611050641A CN106399567A CN 106399567 A CN106399567 A CN 106399567A CN 201611050641 A CN201611050641 A CN 201611050641A CN 106399567 A CN106399567 A CN 106399567A
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单战
陈奕磊
徐建成
刘岩琦
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Hangzhou Asus Medical Laboratory Co Ltd
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Abstract

本发明公开了一种检测先天性角化不良症患者WRAP53基因突变的引物及其应用。检测WRAP53基因突变情况的引物包括扩增WRAP53基因全外显子序列的引物和检测WRAP53基因的测序引物。利用本发明的引物可快速地将先天性角化不良症患者体内WRAP53基因全外显子的突变检测出来。利用本发明完成的检测结果准确，可快速检测先天性角化不良症患者体内WRAP53基因全外显子序列的突变情况，对早期干预及早期治疗有重要的参考意义。

Description

检测WRAP53基因突变的引物及其应用
技术领域
本发明涉及生命科学和生物技术领域，具体涉及检测WRAP53基因突变的引物及其应用。
背景技术
先天性角化不良症(dyskeratosis eongenita，DC)是一种具有遗传异质性的骨髓衰竭综合征，发病率约为1/100万。典型的DC患者约80％～90％具有皮肤黏膜异常三联征，表现为皮肤网状色素沉着、指(趾)甲萎缩、口腔黏膜白斑。目前文献报道可引起DC的突变基因主要有CTC1，DKC1，TERC，TERT，TINF2，NHP2，NOP10及WRAP53。文献报道，这些基因有3种遗传方式，分别为X-连锁隐性遗传、常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传。但目前仍约50％患者遗传特征不明确。X-连锁隐性遗传包括DKC1，常染色体显性遗传包括TERC及TINF2，常染色体隐性遗传包括CTC1，WRAP53，NHP2，NOP10，既可以作为常染色体显性遗传又可以作为隐性遗传的有TERT。
端粒酶卡扎尔体蛋白1(telomerase cajal body protein 1，TCAB1又名WRAP53、WDR79)是2009年新发现的端粒酶关键核心蛋白组分，其主要存在于卡扎尔体蛋白中。WRAP53基因定位于染色体17p13上，与P53基因重叠，是P53的反义转录基因，它不仅能调节p53基因的表达还能调节端粒的合成。WRAP53表达的缺失不会影响端粒酶活性及TERC水平，但可在细胞的S期阻止端粒酶与端粒结合，最终导致端粒变短。有研究者发现WRAP53的突变阻止了端粒酶定位于卡扎尔体蛋白，导致了先天性角化不良症的发生。近年来，通过全基因组测序，发现WRAP53基因突变在先天性角化不良症患者中非常常见。目前文献报道在两个先天性角化不良症的家族中发现WRAP53基因存在突变点较多。目前国内文献报道的DC病例绝大多数为30岁左右皮肤受累的临床病例，病例数较少，且较少进行基因检测。因此有必要进行相关基因的突变检测，有必要先对患者进行WRAP53基因进行全外显子突变筛选，有助于对先天性角化不良症的早期诊断，减少误诊、漏诊，并进行治疗。
发明内容
本发明目的是提供一种检测WRAP53基因突变的引物及其应用，所述引物可快速检测先天性角化不良症患者体内WRAP53基因多态位点的突变情况。
本发明采用以下技术方案：
本发明第一方面，提供了检测WRAP53基因突变情况的引物，包括：
扩增WRAP53基因的引物，其碱基序列为：
WRAP53-1a F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA
WRAP53-1a R：AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC
WRAP53-1b F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC
WRAP53-1b R：AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT
WRAP53-1c F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC
WRAP53-1c R：AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG
WRAP53-2F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA
WRAP53-2R：AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA
WRAP53-3F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG
WRAP53-3R：AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC
WRAP53-4F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA
WRAP53-4R：AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA
WRAP53-5F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT
WRAP53-5R：AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC
WRAP53-6F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA
WRAP53-6R：AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC
WRAP53-7a F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG
WRAP53-7a R：AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC
WRAP53-7b F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG
WRAP53-7b R：AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC
WRAP53-8F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC
WRAP53-8R：AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG
WRAP53-9F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC
WRAP53-9R：AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC
WRAP53-10F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA
WRAP53-10R：AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA。
进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：
检测WRAP53基因的测序引物碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG。
进一步地，引物序列WRAP53-1a F、WRAP53-1b F、WRAP53-1c F和WRAP53-1a R、WRAP53-1b R、WRAP53-1c R是扩增WRAP53基因第1外显子序列的引物，引物序列WRAP53-2F和WRAP53-2R是扩增WRAP53基因第2外显子序列的引物，引物序列WRAP53-3F和WRAP53-3R是扩增WRAP53基因第3外显子序列的引物，引物序列WRAP53-4F和WRAP53-4R是扩增WRAP53基因第4外显子序列的引物，引物序列WRAP53-5F和WRAP53-5R是扩增WRAP53基因第5外显子序列的引物，引物序列WRAP53-6F和WRAP53-6R是扩增WRAP53基因第6外显子序列的引物，引物序列WRAP53-7a F、WRAP53-7b F和WRAP53-7a R、WRAP53-7b R是扩增WRAP53基因第7外显子序列的引物，引物序列WRAP53-8F和WRAP53-8R是扩增WRAP53基因第8外显子序列的引物，引物序列WRAP53-9F和WRAP53-9R是扩增WRAP53基因第9外显子序列的引物，引物序列WRAP53-10F和WRAP53-10R是扩增WRAP53基因第10外显子序列的引物。
进一步地，引物序列M13-F和M13-R是测序WRAP53基因扩增产物全外显子序列的引物。
本发明第二方面，提供了上述检测WRAP53基因突变情况的引物在制备检测WRAP53基因突变情况的诊断试剂或药物中的应用。
本发明第三方面，提供了一种检测WRAP53基因突变情况的试剂盒，包括：
(i)血液DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR扩增反应液；
(iii)测序体系试剂；
其中PCR扩增反应液引物为：
扩增WRAP53基因的引物，其碱基序列为：
WRAP53-1a F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA
WRAP53-1a R：AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC
WRAP53-1b F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC
WRAP53-1b R：AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT
WRAP53-1c F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC
WRAP53-1c R：AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG
WRAP53-2F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA
WRAP53-2R：AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA
WRAP53-3F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG
WRAP53-3R：AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC
WRAP53-4F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA
WRAP53-4R：AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA
WRAP53-5F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT
WRAP53-5R：AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC
WRAP53-6F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA
WRAP53-6R：AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC
WRAP53-7a F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG
WRAP53-7a R：AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC
WRAP53-7b F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG
WRAP53-7b R：AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC
WRAP53-8F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC
WRAP53-8R：AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG
WRAP53-9F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC
WRAP53-9R：AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC
WRAP53-10F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA
WRAP53-10R：AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA。
进一步地，测序体系试剂中测序引物，其碱基序列为：
检测WRAP53基因的测序引物碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG。
本发明第四方面，提供了一种检测WRAP53基因突变情况的方法，包括以下步骤：
(5)抽提血液中的基因组DNA；
(6)用PCR扩增步骤1中提取的DNA；
(7)对步骤2中的扩增产物进行测序；
(8)对测序结果进行判断，确定WRAP53基因是否发生突变；
其中PCR扩增引物为：
WRAP53-1a F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA
WRAP53-1a R：AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC
WRAP53-1b F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC
WRAP53-1b R：AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT
WRAP53-1c F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC
WRAP53-1c R：AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG
WRAP53-2F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA
WRAP53-2R：AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA
WRAP53-3F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG
WRAP53-3R：AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC
WRAP53-4F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA
WRAP53-4R：AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA
WRAP53-5F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT
WRAP53-5R：AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC
WRAP53-6F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA
WRAP53-6R：AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC
WRAP53-7a F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG
WRAP53-7a R：AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC
WRAP53-7b F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG
WRAP53-7b R：AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC
WRAP53-8F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC
WRAP53-8R：AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG
WRAP53-9F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC
WRAP53-9R：AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC
WRAP53-10F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA
WRAP53-10R：AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA。
进一步地，测序引物碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG。
本发明的有益效果：本发明设计了扩增WRAP53全部10个外显子序列的引物。通过加接头，使所有13对引物的PCR产物均可以用一种测序引物进行测序。采用PCR技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。本发明所述引物既能将所述WRAP53全外显子序列都扩增出来，也保证无论这些外显子的何处位置发生突变，都不会出现漏检的情况。相比较荧光定量PCR法降低了检测的成本和难度。荧光定量PCR法要针对不同的突变类型设计多个探针，成本高，检测难度大。利用本发明的引物可快速地将先天性角化不良症患者体内WRAP53基因全外显子的突变检测出来。利用本发明完成的检测结果准确，可快速检测先天性角化不良症患者体内WRAP53基因全外显子序列的突变情况，对早期干预及早期治疗有重要的参考意义。
附图说明
图1为WRAP53基因在染色体上定位图。
图2为WRAP53-1a F/R、WRAP53-1b F/R、WRAP53-1c F/R、WRAP53-2F/R、WRAP53-3F/R、WRAP53-4F/R、WRAP53-5F/R、WRAP53-6F/R、WRAP53-7a F/R、WRAP53-7b F/R的电泳图，M为Marker DL 2000，1-20为送检的血液样本。
图3为WRAP53-8F/R、WRAP53-9F/R、WRAP53-10F/R的电泳图，M为Marker DL 2000，21-26为送检的血液样本。
图4为样本1的WRAP53第1号外显子野生型测序截图。
图5为样本1的WRAP53第2号外显子野生型测序截图。
图6为样本1的WRAP53第3号外显子野生型测序截图。
图7为样本1的WRAP53第4号外显子野生型测序截图。
图8为样本1的WRAP53第5号外显子野生型测序截图。
图9为样本1的WRAP53第6号外显子野生型测序截图。
图10为样本1的WRAP53第7号外显子野生型测序截图。
图11为样本1的WRAP53第8号外显子野生型测序截图。
图12为样本1的WRAP53第9号外显子野生型测序截图。
图13为样本1的WRAP53第10号外显子野生型测序截图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
一种检测WRAP53基因突变情况的引物，包括：
扩增WRAP53基因全外显子序列的引物，其碱基序列为：
WRAP53-1a F如SEQ ID NO：1所示：
TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA
WRAP53-1a R如SEQ ID NO：2所示：
AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC
WRAP53-1b F如SEQ ID NO：3所示：
TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC
WRAP53-1b R如SEQ ID NO：4所示：
AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT
WRAP53-1c F如SEQ ID NO：5所示：
TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC
WRAP53-1c R如SEQ ID NO：6所示：
AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG
WRAP53-2F如SEQ ID NO：7所示：
TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA
WRAP53-2R如SEQ ID NO：8所示：
AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA
WRAP53-3F如SEQ ID NO：9所示：
TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG
WRAP53-3R如SEQ ID NO：10所示：
AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC
WRAP53-4F如SEQ ID NO：11所示：
TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA
WRAP53-4R如SEQ ID NO：12所示：
AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA
WRAP53-5F如SEQ ID NO：13所示：
TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT
WRAP53-5R如SEQ ID NO：14所示：
AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC
WRAP53-6F如SEQ ID NO：15所示：
TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA
WRAP53-6R如SEQ ID NO：16所示：
AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC
WRAP53-7a F如SEQ ID NO：17所示：
TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG
WRAP53-7a R如SEQ ID NO：18所示：
AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC
WRAP53-7b F如SEQ ID NO：19所示：
TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG
WRAP53-7b R如SEQ ID NO：20所示：
AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC
WRAP53-8F如SEQ ID NO：21所示：
TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC
WRAP53-8R如SEQ ID NO：22所示：
AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG
WRAP53-9F如SEQ ID NO：23所示：
TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC
WRAP53-9R如SEQ ID NO：24所示：
AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC
WRAP53-10F如SEQ ID NO：25所示：
TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA
WRAP53-10R如SEQ ID NO：26所示：
AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA。
引物序列WRAP53-1a F、WRAP53-1b F、WRAP53-1c F和WRAP53-1a R、WRAP53-1b R、WRAP53-1c R是扩增WRAP53基因第1外显子序列的引物，引物序列WRAP53-2F和WRAP53-2R是扩增WRAP53基因第2外显子序列的引物，引物序列WRAP53-3F和WRAP53-3R是扩增WRAP53基因第3外显子序列的引物，引物序列WRAP53-4F和WRAP53-4R是扩增WRAP53基因第4外显子序列的引物，引物序列WRAP53-5F和WRAP53-5R是扩增WRAP53基因第5外显子序列的引物，引物序列WRAP53-6F和WRAP53-6R是扩增WRAP53基因第6外显子序列的引物，引物序列WRAP53-7aF、WRAP53-7b F和WRAP53-7a R、WRAP53-7b R是扩增WRAP53基因第7外显子序列的引物，引物序列WRAP53-8F和WRAP53-8R是扩增WRAP53基因第8外显子序列的引物，引物序列WRAP53-9F和WRAP53-9R是扩增WRAP53基因第9外显子序列的引物，引物序列WRAP53-10F和WRAP53-10R是扩增WRAP53基因第10外显子序列的引物。
还包括测序引物，其碱基序列为：
检测WRAP53基因的测序引物碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG。
引物序列M13-F和M13-R是测序WRAP53基因扩增产物全外显子序列的引物。
一种检测WRAP53基因突变情况的试剂盒，包括
(i)血液DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR反应液；
(iii)测序体系试剂；
其中，血液DNA抽提试剂可购自天根DNA抽提试剂盒等商品化试剂。
检测体系PCR扩增反应液包括：2×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNAPolymerase(1U/μl)；WRAP53基因12个外显子序列的上、下游引物WRAP53-1a F(10μM)、WRAP53-1a R(10μM)、WRAP53-1b F(10μM)、WRAP53-1b R(10μM)、WRAP53-1c F(10μM)、WRAP53-1c R(10μM)、WRAP53-2F(10μM)、WRAP53-2R(10μM)、WRAP53-3F(10μM)、WRAP53-3R(10μM)、WRAP53-4F(10μM)、WRAP53-4R(10μM)、WRAP53-5F(10μM)、WRAP53-5R(10μM)、WRAP53-6F(10μM)、WRAP53-6R(10μM)、WRAP53-7a F(10μM)、WRAP53-7a R(10μM)、WRAP53-7bF(10μM)、WRAP53-7b R(10μM)、WRAP53-8F(10μM)、WRAP53-8R(10μM)、WRAP53-9F(10μM)、WRAP53-9R(10μM)、WRAP53-10F(10μM)、WRAP53-10R(10μM)。
测序体系试剂包括：测序纯化液(ExoI:0.6U，CIP:1.2U)、EDTA(125mmol)、无水乙醇、70％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物：检测WRAP53基因全外显子序列的上、下游引物分别为M13-F(3.2μm)、M13-R(3.2μm)，以及Bigdye Terminator V3.1(购买自美国Applied Biosystems公司)。
实施例2
血液/细胞/组织基因组DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：
(1)抽提血液中的基因组DNA：1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉废液。9)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份19μl分装：
X＝19μl反应液×(n份标本+1份空白对照)
n为检测标本数。
(3)加样：检测体系PCR反应液中加入1μl DNA；空白对照加1μl生理盐水或不加任何物质。
(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件如下：
PCR扩增体系试剂配制方法如下：
其中，引物序列为：
(5)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，110V，25min，凝胶成像系统观察。
如图2和3所示，即为2例血液样本以WRAP53-1a F/R、WRAP53-1b F/R、WRAP53-1cF/R、WRAP53-2F/R、WRAP53-3F/R、WRAP53-4F/R、WRAP53-5F/R、WRAP53-6F/R、WRAP53-7aF/R、WRAP53-7bF/R、WRAP53-8F/R、WRAP53-9F/R、WRAP53-10F/R为引物扩增后所得产物的电泳图谱。本发明扩增的片段长度分别为371bp、351bp、311bp、304bp、414bp、357bp、393bp、411bp、363bp、383bp、259bp、351bp、438bp，通过电泳图的分析表明本发明所述WRAP53-1a F/R、WRAP53-1b F/R、WRAP53-1c F/R、WRAP53-2F/R、WRAP53-3F/R、WRAP53-4F/R、WRAP53-5F/R、WRAP53-6F/R、WRAP53-7aF/R、WRAP53-7bF/R、WRAP53-8F/R、WRAP53-9F/R、WRAP53-10F/R扩增有效，且条带单一。
(6)Sanger测序：
取9μl PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：
将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：
测序反应程序：
沉淀环节：
向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15μl无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50μl70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl Hi-Di后进行变性试验。变性程序：
变性程序结束后，上测序仪(ABI3730)测序。
(7)结果判断：分别将测序结果与WRAP53野生型参考序列(Genbank accn：NC_000023.11)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
实施例3
取2例临床样本按实施例1和2的试剂和方法提取基因组、配制试剂、扩增和测序。电泳结果如图2和3所示，表明本发明所述引物WRAP53-1a F/R、WRAP53-1b F/R、WRAP53-1cF/R、WRAP53-2F/R、WRAP53-3F/R、WRAP53-4F/R、WRAP53-5F/R、WRAP53-6F/R、WRAP53-7aF/R、WRAP53-7bF/R、WRAP53-8F/R、WRAP53-9F/R、WRAP53-10F/R对血液样本能有效扩增，且条带单一。
样本1的检测结果如图4-13所示：
图4显示是样本1的WRAP53 1号外显子野生型测序截图，说明样本1的1号外显子未发生突变。
图5显示是样本1的WRAP53 2号外显子野生型测序截图，说明样本1的2号外显子未发生突变。
图6显示是样本1的WRAP53 3号外显子野生型测序截图，说明样本1的3号外显子未发生突变。
图7显示是样本1的WRAP53 4号外显子野生型测序截图，说明样本1的4号外显子未发生突变。
图8显示是样本1的WRAP53 5号外显子野生型测序截图，说明样本1的5号外显子未发生突变。
图9显示是样本1的WRAP53 6号外显子野生型测序截图，说明样本1的6号外显子未发生突变。
图10显示是样本1的WRAP53 7号外显子野生型测序截图，说明样本1的7号外显子未发生突变。
图11显示是样本1的WRAP53 8号外显子野生型测序截图，说明样本1的8号外显子未发生突变。
图12显示是样本1的WRAP53 9号外显子野生型测序截图，说明样本1的9号外显子未发生突变。
图13显示是样本1的WRAP53 10号外显子野生型测序截图，说明样本1的10号外显子未发生突变。
从检测结果可以看出，本发明所述引物已经把外显子序列包括在内了，能够扩展出WRAP53基因全部10个外显子，并且测序结果完全准确。本发明所述引物可以准确的扩展出WRAP53基因全外显子，无论是野生型还是突变型。。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州华硕医学检验所有限公司
<120> 检测WRAP53基因突变的引物及其应用
<130>
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgtaaaacga cggccagtgg gaacgggaaa ccttctaa 38
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aacagctatg accatggaca gcagtccgga gctaac 36
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgtaaaacga cggccagtct aatctccgct gtgcttcc 38
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aacagctatg accatgtctt ctgcaggaag gcttgt 36
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgtaaaacga cggccagtgg gacccagttt ctctctcc 38
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aacagctatg accatgctgg agaagtgggt ctcagg 36
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tgtaaaacga cggccagtgt ggagtctggg gagatgaa 38
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aacagctatg accatggggc atccctctcc tagaaa 36
<210> 9
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgtaaaacga cggccagtca gccctagccc tacacttg 38
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
aacagctatg accatgtgct gccacaagaa attcac 36
<210> 11
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tgtaaaacga cggccagttc tgagctcacc cttgaaca 38
<210> 12
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
aacagctatg accatgctga ccagcccctc tgataa 36
<210> 13
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tgtaaaacga cggccagtac acccagcctc atttttgt 38
<210> 14
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aacagctatg accatgggaa ggaaagggct gaaaac 36
<210> 15
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tgtaaaacga cggccagttc atatctggga cgcattca 38
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
aacagctatg accatggtac agaggacggc gtgaac 36
<210> 17
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tgtaaaacga cggccagtgc ttgtgacaga cagcatgg 38
<210> 18
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
aacagctatg accatgtctc agggtgtgac ccctac 36
<210> 19
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tgtaaaacga cggccagttc tgtatgcctg ggatgatg 38
<210> 20
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
aacagctatg accatgattg gtggtcacct ctcgac 36
<210> 21
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
tgtaaaacga cggccagtct gaaggagtgc ctggagac 38
<210> 22
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
aacagctatg accatgaccc tacagctggg ctctg 35
<210> 23
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
tgtaaaacga cggccagtcc tctgccagca aatctctc 38
<210> 24
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
aacagctatg accatgtctc tgtgggctca ggaaac 36
<210> 25
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
tgtaaaacga cggccagtag agggagcaag tgtcctca 38
<210> 26
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
aacagctatg accatggcct ggtttcagga ccaata 36

Claims (9)

1.检测WRAP53基因突变情况的引物，其特征在于，包括：
扩增WRAP53基因的引物，其碱基序列为：
WRAP53-1a F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA
WRAP53-1a R：AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC
WRAP53-1b F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC
WRAP53-1b R：AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT
WRAP53-1c F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC
WRAP53-1c R：AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG
WRAP53-2 F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA
WRAP53-2 R：AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA
WRAP53-3 F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG
WRAP53-3 R：AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC
WRAP53-4 F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA
WRAP53-4 R：AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA
WRAP53-5 F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT
WRAP53-5 R：AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC
WRAP53-6 F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA
WRAP53-6 R：AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC
WRAP53-7a F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG
WRAP53-7a R：AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC
WRAP53-7b F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG
WRAP53-7b R：AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC
WRAP53-8 F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC
WRAP53-8 R：AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG
WRAP53-9 F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC
WRAP53-9 R：AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC
WRAP53-10 F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA
WRAP53-10 R：AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA。
2.根据权利要求1所述的检测WRAP53基因突变情况的引物，其特征在于，还包括测序引物，其碱基序列为：
检测WRAP53基因的测序引物碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG。
3.根据权利要求1所述的检测WRAP53基因突变情况的引物，其特征在于，引物序列WRAP53-1a F、WRAP53-1b F、WRAP53-1c F和WRAP53-1a R、WRAP53-1b R、WRAP53-1c R是扩增WRAP53基因第1外显子序列的引物，引物序列WRAP53-2 F和WRAP53-2 R是扩增WRAP53基因第2外显子序列的引物，引物序列WRAP53-3 F和WRAP53-3 R是扩增WRAP53基因第3外显子序列的引物，引物序列WRAP53-4 F和WRAP53-4 R是扩增WRAP53基因第4外显子序列的引物，引物序列WRAP53-5 F和WRAP53-5 R是扩增WRAP53基因第5外显子序列的引物，引物序列WRAP53-6 F和WRAP53-6 R是扩增WRAP53基因第6外显子序列的引物，引物序列WRAP53-7aF、WRAP53-7b F和WRAP53-7a R、WRAP53-7b R是扩增WRAP53基因第7外显子序列的引物，引物序列WRAP53-8 F和WRAP53-8 R是扩增WRAP53基因第8外显子序列的引物，引物序列WRAP53-9 F和WRAP53-9 R是扩增WRAP53基因第9外显子序列的引物，引物序列WRAP53-10 F和WRAP53-10 R是扩增WRAP53基因第10外显子序列的引物。
4.根据权利要求2所述的检测WRAP53基因突变情况的引物，其特征在于，引物序列M13-F和M13-R是测序WRAP53基因扩增产物全外显子序列的引物。
5.权利要求1-4任一权利要求所述的检测WRAP53基因突变情况的引物在制备检测WRAP53基因突变情况的诊断试剂或药物中的应用。
6.一种检测WRAP53基因突变情况的试剂盒，其特征在于，包括：
(i)血液DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR扩增反应液；
(iii)测序体系试剂；
其中PCR扩增反应液引物为：
扩增WRAP53基因的引物，其碱基序列为：
WRAP53-1a F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA
WRAP53-1a R：AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC
WRAP53-1b F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC
WRAP53-1b R：AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT
WRAP53-1c F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC
WRAP53-1c R：AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG
WRAP53-2 F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA
WRAP53-2 R：AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA
WRAP53-3 F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG
WRAP53-3 R：AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC
WRAP53-4 F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA
WRAP53-4 R：AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA
WRAP53-5 F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT
WRAP53-5 R：AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC
WRAP53-6 F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA
WRAP53-6 R：AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC
WRAP53-7a F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG
WRAP53-7a R：AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC
WRAP53-7b F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG
WRAP53-7b R：AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC
WRAP53-8 F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC
WRAP53-8 R：AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG
WRAP53-9 F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC
WRAP53-9 R：AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC
WRAP53-10 F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA
WRAP53-10 R：AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA。
7.根据权利要求6所述的检测WRAP53基因突变情况的试剂盒，其特征在于，测序体系试剂中测序引物，其碱基序列为：
检测WRAP53基因的测序引物碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG。
8.一种检测WRAP53基因突变情况的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)抽提血液中的基因组DNA；
(2)用PCR扩增步骤1中提取的DNA；
(3)对步骤2中的扩增产物进行测序；
(4)对测序结果进行判断，确定WRAP53基因是否发生突变；
其中PCR扩增引物为：
WRAP53-1a F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA
WRAP53-1a R：AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC
WRAP53-1b F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC
WRAP53-1b R：AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT
WRAP53-1c F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC
WRAP53-1c R：AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG
WRAP53-2 F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA
WRAP53-2 R：AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA
WRAP53-3 F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG
WRAP53-3 R：AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC
WRAP53-4 F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA
WRAP53-4 R：AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA
WRAP53-5 F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT
WRAP53-5 R：AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC
WRAP53-6 F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA
WRAP53-6 R：AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC
WRAP53-7a F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG
WRAP53-7a R：AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC
WRAP53-7b F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG
WRAP53-7b R：AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC
WRAP53-8 F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC
WRAP53-8 R：AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG
WRAP53-9 F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC
WRAP53-9 R：AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC
WRAP53-10 F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA
WRAP53-10 R：AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA。
9.根据权利要求8所述的检测WRAP53基因突变情况的方法，其特征在于，测序引物碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG。
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