CN106636391A - 检测先天性角化不良症wrap53基因的方法和引物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测与先天性角化不良症(dskeratosiseongenita，DC)有关的基因WRAP53发生突变的引物和方法，其包括扩增基因WRAP53全外显子序列的13对引物和和测序引物。本发明采用Sanger测序技术可快速地将WRAP53全外显子及相关的突变检测出来。利用本发明完成的检测结果准确，对先天性角化不良症的早期诊断，减少误诊、漏诊，并进行治疗具有重要的参考意义。
Description
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测与先天性角化不良症有关的基因突变的引物和方法。
背景技术
先天性角化不良症(dskeratosiseongenita，DC)是一种具有遗传异质性的骨髓衰竭综合征，发病率约为1/100万。典型的DC患者约80％～90％具有皮肤黏膜异常三联征，表现为皮肤网状色素沉着、指(趾)甲萎缩、口腔黏膜白斑。目前文献报道可引起DC的突变基因主要有CTC1，DKC1，TERC，TERT，TINF2，NHP2，NOP10及WRAP53。文献报道，这些基因有3种遗传方式，分别为X-连锁隐性遗传、常染色体隐性遗传、常染色体显性遗传。但目前仍约50％患者遗传特征不明确。X-连锁隐性遗传包括DKC1，常染色体显性遗传包括TERC及TINF2，常染色体隐性遗传包括CTC1，WRAP53，NHP2，NOP10，既可以作为常染色体显性遗传又可以作为隐性遗传的有TERT。
端粒酶卡扎尔体蛋白1(telomerase cajal body protein 1，TCAB1又名WRAP53、WDR79)是2009年新发现的端粒酶关键核心蛋白组分，其主要存在于卡扎尔体蛋白中。WRAP53基因定位于染色体17p13上，共有10个外显子，与P53基因重叠，是P53的反义转录基因，它不仅能调节p53基因的表达还能调节端粒的合成。WRAP53表达的缺失不会影响端粒酶活性及TERC水平，但可在细胞的S期阻止端粒酶与端粒结合，最终导致端粒变短。Zhong等发现WRAP53的突变阻止了端粒酶定位于卡扎尔体蛋白，导致了先天性角化不良症的发生。近年来，通过全基因组测序，发现WRAP53基因突变在先天性角化不良症患者中非常常见。目前文献报道在两个先天性角化不良症的家族中发现WRAP53基因存在4个突变点，分别为F164L(第2外显子)、H376Y(第7外显子)、R398W(第8外显子)、G435R(第9外显子)。目前国内文献报道的DC病例绝大多数为30岁左右皮肤受累的临床病例，病例数较少，且较少进行基因检测。因此有必要进行相关基因的突变检测，有必要先对患者进行WRAP53基因进行全外显子突变筛选，有助于对先天性角化不良症的早期诊断，减少误诊、漏诊，并进行治疗。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测遗传性WRAP53基因多态突变热点的引物，采用PCR技术，可用于快速检测先天性角化不良症患者体内WRAP53基因多态位点的突变情况。所述检测WRAP53基因多态热点突变情况的引物，包括：
扩增WRAP53基因的引物，其碱基序列为：
WRAP53-Exon1A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA
WRAP53-Exon1A-R：AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC
WRAP53-Exon1B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC
WRAP53-Exon1B-R：AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT
WRAP53-Exon1C-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC
WRAP53-Exon1C-R：AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG
WRAP53-Exon2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA
WRAP53-Exon2-R：AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA
WRAP53-Exon3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG
WRAP53-Exon3-R：AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC
WRAP53-Exon4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA
WRAP53-Exon4-R：AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA
WRAP53-Exon5-F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT
WRAP53-Exon5-R：AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC
WRAP53-Exon6-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA
WRAP53-Exon6-R：AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC
WRAP53-Exon7A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG
WRAP53-Exon7A-R：AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC
WRAP53-Exon7B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG
WRAP53-Exon7B-R：AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC
WRAP53-Exon8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC
WRAP53-Exon8-R：AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG
WRAP53-Exon9-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC
WRAP53-Exon9-R：AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC
WRAP53-Exon10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA
WRAP53-Exon10-R：AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA
进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：
检测WRAP53基因的测序引物碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG
进一步地，引物序列WRAP53-Exon1A-F、WRAP53-Exon1A-R、WRAP53-Exon1B-F、WRAP53-Exon1B-R、WRAP53-Exon1C-R以及WRAP53-Exon1C-F是扩增WRAP53基因第1外显子序列的引物，引物序列WRAP53-Exon2-F和WRAP53-Exon2-R是扩增WRAP53基因第2外显子序列的引物，以此类推，引物序列WRAP53-Exon10-F和WRAP53-Exon10-R是扩增WRAP53基因第10外显子序列的引物。
本发明还提供了检测WRAP53基因全外显子突变情况的方法，包括以下步骤：
1.抽提外周血中的基因组DNA；
2.用PCR扩增步骤1中提取的DNA；
3.对步骤2中的扩增产物进行测序；
4.对测序结果进行判断，确定WRAP53基因是否发生突变；
其中PCR扩增引物为：
扩增WRAP53基因的引物，其碱基序列为：
WRAP53-Exon1A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA
WRAP53-Exon1A-R：AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC
WRAP53-Exon1B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC
WRAP53-Exon1B-R：AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT
WRAP53-Exon1C-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC
WRAP53-Exon1C-R：AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG
WRAP53-Exon2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA
WRAP53-Exon2-R：AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA
WRAP53-Exon3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG
WRAP53-Exon3-R：AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC
WRAP53-Exon4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA
WRAP53-Exon4-R：AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA
WRAP53-Exon5-F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT
WRAP53-Exon5-R：AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC
WRAP53-Exon6-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA
WRAP53-Exon6-R：AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC
WRAP53-Exon7A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG
WRAP53-Exon7A-R：AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC
WRAP53-Exon7B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG
WRAP53-Exon7B-R：AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC
WRAP53-Exon8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC
WRAP53-Exon8-R：AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG
WRAP53-Exon9-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC
WRAP53-Exon9-R：AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC
WRAP53-Exon10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA
WRAP53-Exon10-R：AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA
进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：
检测WRAP53基因的测序引物碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG
本发明还提供了一种检测WRAP53基因多态突变位点的试剂盒，包括：
(i)全血基因组DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR扩增反应液；
(iii)测序体系试剂；
其中PCR扩增反应液引物为：
扩增WRAP53基因的引物，其碱基序列为：
WRAP53-Exon1A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA
WRAP53-Exon1A-R：AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC
WRAP53-Exon1B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC
WRAP53-Exon1B-R：AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT
WRAP53-Exon1C-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC
WRAP53-Exon1C-R：AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG
WRAP53-Exon2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA
WRAP53-Exon2-R：AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA
WRAP53-Exon3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG
WRAP53-Exon3-R：AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC
WRAP53-Exon4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA
WRAP53-Exon4-R：AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA
WRAP53-Exon5-F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT
WRAP53-Exon5-R：AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC
WRAP53-Exon6-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA
WRAP53-Exon6-R：AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC
WRAP53-Exon7A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG
WRAP53-Exon7A-R：AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC
WRAP53-Exon7B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG
WRAP53-Exon7B-R：AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC
WRAP53-Exon8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC
WRAP53-Exon8-R：AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG
WRAP53-Exon9-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC
WRAP53-Exon9-R：AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC
WRAP53-Exon10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA
WRAP53-Exon10-R：AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA
进一步地，测序引物碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG
有益效果：本发明设计了扩增WRAP5310个外显子序列的引物。通过加接头，使所有13对引物的PCR产物均可以用一种测序引物进行测序。采用PCR技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。WRAP53基因的突变类型种类多且遍布整个基因，因此本发明所述引物既能将所述WRAP53全部外显子序列都扩增出来，也保证无论这些外显子的何处位置发生突变，都不会出现漏检的情况。相比较荧光定量PCR法降低了检测的成本和难度。荧光定量PCR法要针对不同的突变类型设计多个探针，成本高，检测难度大。本发明的13对引物涵盖了WRAP53基因全部外显子区域，使得后续测序时的上下游引物均能测出目的片段，一定程度上保证了测序的准确性。
附图说明
图1为WRAP53基因在染色体上定位图。
图2和图3为WRAP53基因经13对引物扩增后所得产物的电泳图谱，每对引物的扩增均设有一个重复，M为Marker DL 2000，如图2和图3所示，引物扩增有效，且条带单一。
图4为样本4WRAP53基因第2号外显子引物扩增后的产物正反向测序图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
一种检测WRAP53基因多态突变位点的引物，该引物的设计是针对WRAP53全外显子设计的扩增引物，包括：
扩增WRAP53基因全外显子序列的引物，其碱基序列为：
WRAP53-Exon1A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA
WRAP53-Exon1A-R：AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC
WRAP53-Exon1B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC
WRAP53-Exon1B-R：AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT
WRAP53-Exon1C-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC
WRAP53-Exon1C-R：AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG
WRAP53-Exon2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA
WRAP53-Exon2-R：AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA
WRAP53-Exon3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG
WRAP53-Exon3-R：AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC
WRAP53-Exon4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA
WRAP53-Exon4-R：AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA
WRAP53-Exon5-F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT
WRAP53-Exon5-R：AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC
WRAP53-Exon6-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA
WRAP53-Exon6-R：AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC
WRAP53-Exon7A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG
WRAP53-Exon7A-R：AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC
WRAP53-Exon7B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG
WRAP53-Exon7B-R：AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC
WRAP53-Exon8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC
WRAP53-Exon8-R：AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG
WRAP53-Exon9-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC
WRAP53-Exon9-R：AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC
WRAP53-Exon10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA
WRAP53-Exon10-R：AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA
一种检测WRAP53基因多态突变位点的试剂盒，包括
(i)全血基因组DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR反应液；
(iii)测序体系试剂；
其中，外周血基因组DNA提取所用试剂盒由天根生物科技有限公司提供。
检测体系PCR扩增反应液包括：
测序体系试剂包括：
实施例2
血液/细胞/组织基因组DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：
(1)全血基因组DNA提取
1)于1.5ml离心管底部加入20μl QIAGEN Protease(或proteinase K)。.
2)离心管中加入200μl血浆。
3)加入200μl Buffer AL，振荡15s。(注意：不可将QIAGEN Protease或proteinaseK直接加入到Buffer AL中。若样本量较大，则QIAGEN Protease和Buffer AL按比例增加。)
4)56℃水浴10min，之后短暂离心，以除去离心管盖内沿的液体。
5)加入200μl乙醇(96％-100％)，振荡15s，短暂离心，以去除离心管盖内沿液体。
6)小心将以上所得混合液(包括沉淀物)小心加入到QIAamp微型离心柱中(不要润湿离心柱边缘)将离心柱放入2ml收集管中，盖紧离心管盖，以6000×g(8000rpm)离心1min。将离心柱取出，放入一支洁净的2ml收集管中(试剂盒提供)。丢弃收集管及其中液体。
7)小心加入500μl Buffer AW1到QIAamp微型离心柱中(不要润湿离心柱边缘)。盖紧离心管盖，以6000×g(8000rpm)离心1min。将离心柱取出，放入一支洁净的2ml收集管中(试剂盒提供)。丢弃收集管及其中液体。
8)小心加入500μl Buffer AW2到QIAamp微型离心柱中(不要润湿离心柱边缘)。盖紧离心管盖，以20000×g(14000rpm)离心3min。
9)将QIAamp微型离心柱置入一支新的2ml收集管中(自备)，丢弃收集管及其中液体。全速离心1min。
10)将QIAamp微型离心柱置入一支洁净1.5ml收集管中(自备)，丢弃收集管及其中液体。小心在QIAamp微型离心柱中加入100μl Buffer AE或蒸馏水。室温下(15-25℃)静置1min，6000×g(8000rpm)离心1min。将收集管盖好，保存于-20℃。
(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份19μl分装：
X＝19μl反应液×(n份标本+1份空白对照)
n为检测标本数。
(3)加样：在分装好的PCR反应管中加入DNA，空白对照加等量生理盐水或不加任何物质。加样要求如下：
(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件如下：
PCR扩增体系试剂配制方法如下：
其中，引物序列为：
WRAP53-Exon1A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA
WRAP53-Exon1A-R：AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC
WRAP53-Exon1B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC
WRAP53-Exon1B-R：AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT
WRAP53-Exon1C-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC
WRAP53-Exon1C-R：AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG
WRAP53-Exon2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA
WRAP53-Exon2-R：AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA
WRAP53-Exon3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG
WRAP53-Exon3-R：AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC
WRAP53-Exon4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA
WRAP53-Exon4-R：AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA
WRAP53-Exon5-F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT
WRAP53-Exon5-R：AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC
WRAP53-Exon6-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA
WRAP53-Exon6-R：AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC
WRAP53-Exon7A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG
WRAP53-Exon7A-R：AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC
WRAP53-Exon7B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG
WRAP53-Exon7B-R：AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC
WRAP53-Exon8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC
WRAP53-Exon8-R：AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG
WRAP53-Exon9-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC
WRAP53-Exon9-R：AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC
WRAP53-Exon10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA
WRAP53-Exon10-R：AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA
(5)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，110V，25min，凝胶成像系统观察。
如图2和图3所示，即为引物扩增后所得产物的电泳图谱。图2中1-A为WRAP53-Exon1A-F和WRAP53-Exon1A-R引物扩增后的片段Exon1A，1-B为WRAP53-Exon1B-F和WRAP53-Exon1B-R引物扩增后的片段Exon1B，1-C为WRAP53-Exon1C-F和WRAP53-Exon1C-R引物扩增后的片段Exon1C，2为WRAP53-Exon2-F和WRAP53-Exon2-R引物扩增后的片段Exon2，以此类推，图3中10为WRAP53-Exon10-F和WRAP53-Exon10-R引物扩增后的片段Exon10。通过电泳图的分析表明本发明所述扩增有效，且条带单一。
(6)Sanger测序：
取9μl PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：
将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：
测序反应程序：
沉淀环节：
向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15：l无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50μl l70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl Hi-Di后进行变性试验。变性程序：
变性程序结束后，上测序仪(ABI3730)测序。
(7)结果判断：分别将测序结果与WRAP53基因参考序列(Genbankaccn：AC_000184.1)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
实施例3
为了验证引物和整个检测系统的可行性，取13例临床样本(每对引物设两个重复，每组按引物编号为1-13)按实施例1和2的试剂和方法提取基因组、配制试剂、扩增和测序。取其中样本4加入引物扩增，电泳结果如图2和图3所示，表明本发明所述引物对血液样本能有效扩增，且条带单一。测序结果如下表所示。
图4显示是样本4的WRAP53第2号外显子野生型正反测序截图，说明测序结果峰值清晰无杂峰和重峰等影响结果的干扰。
从检测结果可以看出，本发明所述引物已经把外显子序列包括在内了，能够扩展出WRAP53基因全部外显子，并且测序结果完全准确。本发明所述引物可以准确的扩展出WRAP53基因全外显子，通过结果表明本发明所述引物和方法及试剂盒能够检测出WRAP53基因所有外显子。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州艾迪康医学检验所有限公司
<120> 检测先天性角化不良症WRAP53基因的方法和引物
<130>
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgtaaaacga cggccagtgg gaacgggaaa ccttctaa 38
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aacagctatg accatggaca gcagtccgga gctaac 36
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgtaaaacga cggccagtct aatctccgct gtgcttcc 38
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aacagctatg accatgtctt ctgcaggaag gcttgt 36
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgtaaaacga cggccagtgg gacccagttt ctctctcc 38
<210> 6
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aacagctatg accatgctgg agaagtgggt ctcagg 36
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tgtaaaacga cggccagtgt ggagtctggg gagatgaa 38
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aacagctatg accatggggc atccctctcc tagaaa 36
<210> 9
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgtaaaacga cggccagtca gccctagccc tacacttg 38
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
aacagctatg accatgtgct gccacaagaa attcac 36
<210> 11
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tgtaaaacga cggccagttc tgagctcacc cttgaaca 38
<210> 12
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
aacagctatg accatgctga ccagcccctc tgataa 36
<210> 13
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tgtaaaacga cggccagtac acccagcctc atttttgt 38
<210> 14
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aacagctatg accatgggaa ggaaagggct gaaaac 36
<210> 15
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tgtaaaacga cggccagttc atatctggga cgcattca 38
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
aacagctatg accatggtac agaggacggc gtgaac 36
<210> 17
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tgtaaaacga cggccagtgc ttgtgacaga cagcatgg 38
<210> 18
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
aacagctatg accatgtctc agggtgtgac ccctac 36
<210> 19
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tgtaaaacga cggccagttc tgtatgcctg ggatgatg 38
<210> 20
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
aacagctatg accatgattg gtggtcacct ctcgac 36
<210> 21
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
tgtaaaacga cggccagtct gaaggagtgc ctggagac 38
<210> 22
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
aacagctatg accatgaccc tacagctggg ctctg 35
<210> 23
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
tgtaaaacga cggccagtcc tctgccagca aatctctc 38
<210> 24
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
aacagctatg accatgtctc tgtgggctca ggaaac 36
<210> 25
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
tgtaaaacga cggccagtag agggagcaag tgtcctca 38
<210> 26
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
aacagctatg accatggcct ggtttcagga ccaata 36
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 28
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
aacagctatg accatg 16
Claims (5)
1.检测WRAP53基因突变情况的引物，其特征在于，包括：
扩增WRAP53基因第1个外显子序列的引物：
WRAP53-Exon1A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA
WRAP53-Exon1A-R：AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC
WRAP53-Exon1B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC
WRAP53-Exon1B-R：AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT
WRAP53-Exon1C-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC
WRAP53-Exon1C-R：AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG
扩增WRAP53基因第2个外显子序列的引物：
WRAP53-Exon2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA
WRAP53-Exon2-R：AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA
扩增WRAP53基因第3个外显子序列的引物：
WRAP53-Exon3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG
WRAP53-Exon3-R：AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC
扩增WRAP53基因第4个外显子序列的引物：
WRAP53-Exon4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA
WRAP53-Exon4-R：AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA
扩增WRAP53基因第5个外显子序列的引物：
WRAP53-Exon5-F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT
WRAP53-Exon5-R：AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC
扩增WRAP53基因第6个外显子序列的引物：
WRAP53-Exon6-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA
WRAP53-Exon6-R：AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC
扩增WRAP53基因第7个外显子序列的引物：
WRAP53-Exon7A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG
WRAP53-Exon7A-R：AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC
WRAP53-Exon7B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG
WRAP53-Exon7B-R：AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC
扩增WRAP53基因第8个外显子序列的引物：
WRAP53-Exon8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC
WRAP53-Exon8-R：AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG
扩增WRAP53基因第9个外显子序列的引物：
WRAP53-Exon9-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC
WRAP53-Exon9-R：AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC
扩增WRAP53基因第10个外显子序列的引物：
WRAP53-Exon10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA
WRAP53-Exon10-R：AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，还包括测序引物，所述测序碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG。
3.根据权利要求2所述的引物，其特征在于，引物序列M13-F和M13-R是测序WRAP53基因扩增产物全外显子序列的引物。
4.检测WRAP53基因多态热点突变情况的方法，包括以下步骤：
(1)抽提外周血中的基因组DNA，
(2)用PCR扩增步骤1中提取的DNA，
(3)对步骤2中的扩增产物进行测序，
(4)对测序结果进行判断，确定WRAP53基因是否发生突变，
其中PCR扩增引物为：
扩增WRAP53基因第1个外显子序列的引物：
WRAP53-Exon1A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAACGGGAAACCTTCTAA
WRAP53-Exon1A-R：AACAGCTATGACCATGGACAGCAGTCCGGAGCTAAC
WRAP53-Exon1B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTAATCTCCGCTGTGCTTCC
WRAP53-Exon1B-R：AACAGCTATGACCATGTCTTCTGCAGGAAGGCTTGT
WRAP53-Exon1C-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGACCCAGTTTCTCTCTCC
WRAP53-Exon1C-R：AACAGCTATGACCATGCTGGAGAAGTGGGTCTCAGG
扩增WRAP53基因第2个外显子序列的引物：
WRAP53-Exon2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGGAGTCTGGGGAGATGAA
WRAP53-Exon2-R：AACAGCTATGACCATGGGGCATCCCTCTCCTAGAAA
扩增WRAP53基因第3个外显子序列的引物：
WRAP53-Exon3-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCCTAGCCCTACACTTG
WRAP53-Exon3-R：AACAGCTATGACCATGTGCTGCCACAAGAAATTCAC
扩增WRAP53基因第4个外显子序列的引物：
WRAP53-Exon4-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGAGCTCACCCTTGAACA
WRAP53-Exon4-R：AACAGCTATGACCATGCTGACCAGCCCCTCTGATAA
扩增WRAP53基因第5个外显子序列的引物：
WRAP53-Exon5-F：TGTAAAACGACGGCCAGTACACCCAGCCTCATTTTTGT
WRAP53-Exon5-R：AACAGCTATGACCATGGGAAGGAAAGGGCTGAAAAC
扩增WRAP53基因第6个外显子序列的引物：
WRAP53-Exon6-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCATATCTGGGACGCATTCA
WRAP53-Exon6-R：AACAGCTATGACCATGGTACAGAGGACGGCGTGAAC
扩增WRAP53基因第7个外显子序列的引物：
WRAP53-Exon7A-F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCTTGTGACAGACAGCATGG
WRAP53-Exon7A-R：AACAGCTATGACCATGTCTCAGGGTGTGACCCCTAC
WRAP53-Exon7B-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTCTGTATGCCTGGGATGATG
WRAP53-Exon7B-R：AACAGCTATGACCATGATTGGTGGTCACCTCTCGAC
扩增WRAP53基因第8个外显子序列的引物：
WRAP53-Exon8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAAGGAGTGCCTGGAGAC
WRAP53-Exon8-R：AACAGCTATGACCATGACCCTACAGCTGGGCTCTG
扩增WRAP53基因第9个外显子序列的引物：
WRAP53-Exon9-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCCTCTGCCAGCAAATCTCTC
WRAP53-Exon9-R：AACAGCTATGACCATGTCTCTGTGGGCTCAGGAAAC
扩增WRAP53基因第10个外显子序列的引物：
WRAP53-Exon10-F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGAGCAAGTGTCCTCA
WRAP53-Exon10-R：AACAGCTATGACCATGGCCTGGTTTCAGGACCAATA。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，测序引物碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108531575A (zh) * | 2018-04-11 | 2018-09-14 | 杭州艾迪康医学检验中心有限公司 | 检测terc基因全外显子序列突变的引物、试剂盒和方法 |
| CN113684271A (zh) * | 2021-09-01 | 2021-11-23 | 大连医科大学附属第二医院 | 一种先天性角化不良症中的融合基因psmd9-rnf34及其应用和检测试剂盒 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110097732A1 (en) * | 2009-10-26 | 2011-04-28 | Medinnova As | Novel biomarker for the prognosis of breast cancer |
| CN106399567A (zh) * | 2016-11-25 | 2017-02-15 | 杭州华硕医学检验所有限公司 | 检测wrap53基因突变的引物及其应用 |
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2016
- 2016-12-16 CN CN201611168807.1A patent/CN106636391A/zh active Pending
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|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |