CN110564827A - 检测dnmt3a基因突变的引物、试剂盒和方法 - Google Patents

检测dnmt3a基因突变的引物、试剂盒和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于检测编码DNA甲基转移酶相关基因DNMT3A的热点突变的引物，包括扩增DNMT3A的c.2645位点的引物；采用Sanger测序技术，可用于快速检测AML患者体内DNMT3A的c.2645位点突变情况。利用本发明完成的检测结果准确，对AML患者的治疗和预后有重要的参考意义。

Description

检测DNMT3A基因突变的引物、试剂盒和方法
技术领域
本发明属于生命科学和生物技术领域，特别涉及检测DNMT3A基因c.2645位点突变的引物、方法和试剂盒。
背景技术
急性髓系白血病(AML)是造血系统常见的恶性肿瘤之一，以髓系原始细胞在骨髓中增殖失控、分化阻滞和凋亡受抑制为主要的生物学特点。
DNMT3A主要编码甲基转移酶，催化甲基至CpG岛的胞嘧啶残基，引起下游基因的表达减少。DNMT3A的突变会导致DNA的异常甲基化，而DNA异常的甲基化将通过影响染色体结构稳定性和DNA复制、重组与修复，从而促发肿瘤恶性克隆的发生与快速扩增。有研究表明，在成人AML患者中，存在大约11-35％的DNMT3A基因突变，是急性髓系白血病中突变最频繁的前三个基因之一，且大部分突变是位于R882，也就是c.2645位点的错义突变。DNMT3A的这一突变会导致正常细胞接收了错误的遗传指令而形成可以后期转变为AML细胞的不成熟的的前体细胞。Lu等研究发现DNMT3A突变是急性白血病形成的必要条件，虽然这一突变自身不足以引起癌症，但是它可以与RAS基因缺陷共同作用驱动癌症。
目前对于具有DNMT3A突变表达的AML患者的治疗主要在于化疗，但近年来有报告称具有DNMT3A突变的AML细胞对特异的DOT1L药物抑制剂敏感。DOT1L是一种细胞酶，参与调节基因的表达活性，目前有一些DOT1L抑制剂正在接受临床评估。这一研究表明了对于携带DNMT3A突变的AML患者可能有潜在的个体化诊疗策略。
另外，Ley等研究发现DNMT3A突变主要发生在AML的M4和M5两种亚型中。在正常核型的AML患者中DNMT3A基因突变率在19.2％-75％，异常核型的患者突变率低或无突变，这表明在正常核型的AML患者中DNMT3A基因更易发生突变，并且可能与预后密切相关。
综上，研究DNMT3A基因的突变情况，可以有效的对AML患者的预后进行判断，为后期治疗提供有效的建议。本发明所述的方法可以及早检测是待检样本中是否存在DNMT3A最主要的突变位点c.2645位点的突变情况，从而帮助医生判读患者属于AML的哪种分型，更精准得判断患者的预后，给与患者合理的治疗建议，甚至可以给出个体化的治疗策略，延长患者生命周期。
发明内容
本发明的目的在于提供检测编码DNA甲基转移酶相关基因DNMT3A的突变的引物，其特征在于，DNMT3A基因突变位点是c.2645位点，所述引物包括：扩增DNMT3A基因c.2645位点的扩增引物DNMT3A-F、DNMT3A-R和测序引物M13F、M13R，其碱基序列为：
DNMT3A-F:TGTAAAACGACGGCCAGTTTCGGCAGAACTAAGCAG
DNMT3A-R:AACAGCTATGACCATGGTCCCTTACACACACGCA
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG。
本发明的第二个目的是提供检测DNMT3A基因c.2645位点突变情况的方法，包括以下步骤：
(1)抽提外周血或肌肉组织中的基因组DNA；
(2)利用扩增引物DNMT3A-F、DNMT3A-R对步骤(1)中提取的DNA进行扩增，获得扩增产物；
DNMT3A-F:TGTAAAACGACGGCCAGTTTCGGCAGAACTAAGCAG
DNMT3A-R:AACAGCTATGACCATGGTCCCTTACACACACGCA
(3)利用测序引物M13F、M13R对步骤(2)中的扩增产物进行测序；
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG
(4)对测序结果进行判断，通过判读DNMT3A基因c.2645位点的测序图中是否有双峰来判断DNMT3A基因是否发生突变。
本发明的第三个目的是提供一种检测DNMT3A基因c.2645位点突变情况的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系PCR扩增反应液、测序体系反应液，其特征在于，所述检测体系PCR扩增反应液包括一对扩增引物DNMT3A-F、DNMT3A-R，所述测序体系反应液包括一对测序引物M13F、M13R，其序列为：
DNMT3A-F:TGTAAAACGACGGCCAGTTTCGGCAGAACTAAGCAG
DNMT3A-R:AACAGCTATGACCATGGTCCCTTACACACACGCA；
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG。
进一步地，所述检测体系PCR扩增反应液还包括2×PCR Buffer、dNTPs和KOD FXDNA聚合酶。
进一步地，所述测序体系反应液还包括EDTA、无水乙醇、75％乙醇、HIDI和BigdyeTerminator V3.1。
进一步地，所述测序体系反应液还包括测序纯化液，所述测序纯化液包括核酸外切酶I和牛小肠碱性磷酸酶。
进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。
有益效果：本发明设计了扩增DNMT3A基因c.2645位点的引物，采用PCR技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳；总之本发明所述的引物、方法可以极大地降低样本和试剂使用量，从而显著地降低检测成本；相比较于PCR-RFLP法，本方法具有省时省力的优点，相比较于荧光定量PCR法则降低了检测的成本和难度。
说明书附图
图1是采用本发明试剂盒检测样本1c.2645位点的测序图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
检测DNMT3A基因c.2645位点突变情况的引物，该引物是特异性针对DNMT3A基因c.2645位点所设计的扩增引物：
检测DNMT3A基因c.2645位点突变情况的试剂盒，包括
(i)血液/组织DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR反应液；
(iii)测序体系试剂；
(iv)阳性对照品和阴性对照品。
其中，血液/组织DNA抽提试剂可购自天根DNA抽提试剂盒等商品化试剂。
检测体系PCR扩增反应液包括：2×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNAPolymerase(1U/μl)；DNMT3A-F(10μM),DNMT3A-R(10μM)。
DNMT3A-F:TGTAAAACGACGGCCAGTTTCGGCAGAACTAAGCAG
DNMT3A-R:AACAGCTATGACCATGGTCCCTTACACACACGCA；
测序体系试剂包括：测序纯化液(ExoI:0.6U，CIP:1.2U)；EDTA(125mmol)、无水乙醇；75％乙醇；HIDI(高度去离子甲酰胺)；测序引物：M13F(3.2μm)、M13R(3.2μm)。
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG。
实施例2
血液/细胞/组织基因组DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：
(1)抽提血液中的组织DNA：
1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12，000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。
2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。
3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12，000rpm离心30秒，倒掉废液。
9)将吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12，000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份18μl分装：
X＝18μl反应液×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)
n为检测标本数。
(3)加样：加入检测体系PCR反应液中2μl DNA；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。
(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件如下：
PCR扩增体系试剂配制方法如下：
其中，Primer-F/Primer-R分别为DNMT3A-F，DNMT3A-R，其碱基序列如下所示：
(5)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，110V，35min，凝胶成像系统观察。
(6)Sanger测序：
取9μl PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：
将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：
测序反应程序：
沉淀环节：
向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15μl无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50ml70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl HIDI后进行变性5min，最后-20℃2min上测序仪(ABI3730)测序。
(7)结果判断：分别将测序结果与DNMT3A(NC_000002.12)参考序列进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
实施例3
采用本发明核酸检测试剂盒检测样本1，按实施例2所述方法提取基因组DNA、配制试剂并检测。
样本DNA在检测体系PCR反应液中的加入量为2ul。
样品1的检测结果图如图1所示，经由与标准序列的比对可知样本1的DNMT3A的c.2645位点无突变。
序列表
<110> 合肥艾迪康临床检验所有限公司
<120> 检测DNMT3A基因突变的引物、试剂盒和方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtaaaacga cggccagttt cggcagaact aagcag 36
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aacagctatg accatggtcc cttacacaca cgca 34
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aacagctatg accatg 16

Claims (7)

1.检测DNMT3A基因突变的引物，其特征在于，DNMT3A基因突变位点是c.2645位点，所述引物包括：扩增DNMT3A的c.2645位点的扩增引物DNMT3A-F、DNMT3A-R和测序引物M13F、M13R，其碱基序列为：
DNMT3A-F:TGTAAAACGACGGCCAGTTTCGGCAGAACTAAGCAG
DNMT3A-R:AACAGCTATGACCATGGTCCCTTACACACACGCA
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG。
2.检测DNMT3A基因c.2645位点突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)抽提外周血中的基因组DNA；
(2)利用扩增引物DNMT3A-F、DNMT3A-R对步骤(1)中提取的DNA进行扩增，获得扩增产物；
DNMT3A-F:TGTAAAACGACGGCCAGTTTCGGCAGAACTAAGCAG
DNMT3A-R:AACAGCTATGACCATGGTCCCTTACACACACGCA
(3)利用测序引物M13F、M13R对步骤(2)中的扩增产物进行测序；
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG
(4)对测序结果进行判断，通过判读DNMT3A基因c.2645位点的测序图中是否有双峰来判断DNMT3A基因是否发生突变。
3.检测DNMT3A基因c.2645位点突变情况的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系PCR扩增反应液、测序体系反应液，其特征在于，所述检测体系PCR扩增反应液包括一对扩增引物DNMT3A-F、DNMT3A-R，所述测序体系反应液包括一对测序引物M13F、M13R，其序列为：
DNMT3A-F:TGTAAAACGACGGCCAGTTTCGGCAGAACTAAGCAG
DNMT3A-R:AACAGCTATGACCATGGTCCCTTACACACACGCA
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述检测体系PCR扩增反应液还包括2×PCR Buffer、dNTPs和KOD FX DNA聚合酶。
5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述测序体系反应液还包括EDTA、无水乙醇、75％乙醇、HIDI和Bigdye Terminator V3.1。
6.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述测序体系反应液还包括测序纯化液，所述测序纯化液包括核酸外切酶I和牛小肠碱性磷酸酶。
7.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。
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