CN110804658A - 检测ptpn11基因突变的方法、引物和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测Noonan综合征相关的PTPN11基因突变的方法、引物和试剂盒，所述引物、试剂盒均包括针对PTPN11基因全外显子的扩增引物和测序引物。基于PCR扩增和Sanger测序，本发明可快速地检测Noonan综合征相关的PTPN11基因突变位点的突变情况。
Description
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测Noonan综合征相关的PTPN11基因突变的方法、引物和试剂盒。
背景技术
Noonan综合征(NS)是一种先天遗传性疾病，为常染色体显性遗传病，呈完全外显率，但表现度不一，而且大多数的病例属散发类型。该病由Noonan在1968年首次报道，存活的新生儿中发病率约为1/25001～1/1000，男女均可发病。该病的主要特征包括特殊面容、身材矮小、胸部畸形，并且会伴有先天性心脏病等。Noonan综合征的病理生理机制还不明确，但是目前已经确定该病与RAS/RAF/MEK/ERK信号转导通路上的部分基因突变相关，RAS/RAF/MEK/ERK信号转导通路是细胞生长的重要调控因素。其中约50％的患者出现PTPN11基因突变，10％～13％患者出现SOS1突变，另外RAF1、RIT1、RAS、NRAS、BRAF等基因突变也有出现，但患者数量较少。因此对于Noonan综合征的筛查工作可以从检测PTPN11基因的突变做起。
PTPN11基因定位于人的12号染色体q24.1，编码的蛋白产物非受体蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2在心脏瓣膜的胚胎发育过程中起关键作用。该基因由15个外显子和14个内含子组成，编码的蛋白产物为593个氨基酸长度的蛋白前体。SHP-2在集体的各种组织和细胞中表达，参与细胞增殖、分化、迁移、凋亡等许多重要细胞生命活动的调控。SHP-2的N-末端含有两个前后排列的SH2结构：N-SH2和C-SH2，C-末端含有1个具有催化活性的PTP结构域及富含脯氨酸基团和2个酪氨酸磷酸化位点的尾端，N-SH2和PTP相互作用使SHP-2处于非活性性状态。PTPN11基因突变以错义突变为主，已报到的热点突变有N308D、D61N、G60del和D61del等。
发明内容
本发明采用Sanger测序法检测Noonan综合征相关的PTPN11基因突变，并且设计的引物分别扩增包含基因PTPN11全外显子上的DNA片段，通过测序结果的分析，可以很直观地了解Noonan综合征相关的PTPN11基因突变位点的突变情况，扩增引物设计时加上了M13接头，并使用M13作为测序引物，简化操作步骤和节约了检测成本。
本发明提供了检测PTPN11基因突变的引物，其特征在于，包括用于扩增PTPN11基因的扩增引物和一对测序引物M13F和M13R，所述扩增引物为：PTPN11-E1-F/PTPN11-E1-R，PTPN11-E2-F/PTPN11-E2-R，PTPN11-E3-F/PTPN11-E3-R，PTPN11-E4-F/PTPN11-E4-R，PTPN11-E5-F/PTPN11-E5-F，PTPN11-E6-F/PTPN11-E6-R，PTPN11-E7-F/PTPN11-E7-R，PTPN11-E8-F/PTPN11-E8-R，PTPN11-E9-F/PTPN11-E9-R，PTPN11-E10-F/PTPN11-E10-R，PTPN11-E11-F/PTPN11-E11-R，PTPN11-E12-F/PTPN11-E12-R，PTPN11-E13-F/PTPN11-E13-R，PTPN11-E14-F/PTPN11-E14-R和PTPN11-E15-F/PTPN11-E15-R，其碱基序列为：
PTPN11-E1-F：AAGGATGCTTTGGACACTGTGTGTAAAACGACGGCCAGT
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M13R：AACAGCTATGACCATG。
进一步地，所述突变选自N308D、D61N、G60del和D61del等常见突变。
本发明还提供了一种检测检测样品中PTPN11基因突变的方法，其包括如下步骤：
(1)提取样品DNA；
(2)利用扩增引物对(1)中的DNA进行扩增，获得扩增产物，所述扩增引物为：PTPN11-E1-F/PTPN11-E1-R，PTPN11-E2-F/PTPN11-E2-R，PTPN11-E3-F/PTPN11-E3-R，PTPN11-E4-F/PTPN11-E4-R，PTPN11-E5-F/PTPN11-E5-F，PTPN11-E6-F/PTPN11-E6-R，PTPN11-E7-F/PTPN11-E7-R，PTPN11-E8-F/PTPN11-E8-R，PTPN11-E9-F/PTPN11-E9-R，PTPN11-E10-F/PTPN11-E10-R，PTPN11-E11-F/PTPN11-E11-R，PTPN11-E12-F/PTPN11-E12-R，PTPN11-E13-F/PTPN11-E13-R，PTPN11-E14-F/PTPN11-E14-R和PTPN11-E15-F/PTPN11-E15-R；
(3)利用测序引物M13F与M13R对(2)中的扩增产物分别进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因序列；
(4)将(3)中的基因序列与野生型PTPN11基因序列进行比较，确定PTPN11基因是否发生突变；
其中所述扩增引物和测序引物的碱基序列为：
PTPN11-E1-F：AAGGATGCTTTGGACACTGTGTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E1-R：GGGAGGCAGGAAATGAATGAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E2-F：TCTACTCTGCTCATAATGCGTCTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E2-R：CTCTTCTGCTAAATGTCCAGGAAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E3-F：CCTTTGTGTTGAGTTGGTTGTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E3-R：GAGCAGCAGACTTTGTGGTAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E4-F：CTGTCTCAGGTGGGATTGATTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E4-R：GTGTTTGTCCTCTTCCAGCAAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E5-F：CACCCAGCCTATTATCTGTCTTTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E5-F：GCTTTCCAATCTGCTCACCAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E6-F：TCCTATGAACCCTCTGTCCGTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E6-R：TTGCTCCGTGTCAATCAATGAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E7-F：ACCTCAGCCTCCCAAAGTGTTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E7-R：ACCAACCACAGACAAAGCCAAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E8-F：AGACATCAGGCAGTGTTCACTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E8-R：GATTTACCTTTCCTCTCTCCACAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E9-F：TCCAGGACTTATGTGACCGTTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E9-R：CAACAAATCCCAAGCAGAAAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E10-F：CTAACAGATGCGAAACAGGCTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E10-R：CCAAAGTGCTGGGATTACAGAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E11-F：AAGGAGACGAGTTCTGGGATGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E11-R：AATGGCAGTGCTGTAGGGTAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E12-F：GCTGACTCCAAAGCCCTATGCTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E12-R：CCCAGACTGTTTTCGTGAGCACAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E13-F：GCCACCTGACCTTGTTTACATGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E13-R：GAGTTTGTTTCCCATTCCGAAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E14-F：AAACAGGGACATTTGGTTCGTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E14-R：CACAGATACACTAACAGTAGGGCAAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E15-F：ATGCCCAGCGTTATTTCACTTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E15-R：TACCACCAGTATCAGCCATTTCAACAGCTATGACCATG；
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；
M13R：AACAGCTATGACCATG。
本发明还提供了一种检测样品中PTPN11基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括扩增体系PCR反应液和测序体系反应液，其中扩增体系PCR反应液包括扩增引物，测序体系反应液包括一对测序引物M13F和M13R，所述扩增引物为：PTPN11-E1-F/PTPN11-E1-R，PTPN11-E2-F/PTPN11-E2-R，PTPN11-E3-F/PTPN11-E3-R，PTPN11-E4-F/PTPN11-E4-R，PTPN11-E5-F/PTPN11-E5-F，PTPN11-E6-F/PTPN11-E6-R，PTPN11-E7-F/PTPN11-E7-R，PTPN11-E8-F/PTPN11-E8-R，PTPN11-E9-F/PTPN11-E9-R，PTPN11-E10-F/PTPN11-E10-R，PTPN11-E11-F/PTPN11-E11-R，PTPN11-E12-F/PTPN11-E12-R，PTPN11-E13-F/PTPN11-E13-R，PTPN11-E14-F/PTPN11-E14-R和PTPN11-E15-F/PTPN11-E15-R，所述扩增引物和测序引物的碱基序列为：
PTPN11-E1-F：AAGGATGCTTTGGACACTGTGTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E1-R：GGGAGGCAGGAAATGAATGAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E2-F：TCTACTCTGCTCATAATGCGTCTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E2-R：CTCTTCTGCTAAATGTCCAGGAAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E3-F：CCTTTGTGTTGAGTTGGTTGTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E3-R：GAGCAGCAGACTTTGTGGTAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E4-F：CTGTCTCAGGTGGGATTGATTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E4-R：GTGTTTGTCCTCTTCCAGCAAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E5-F：CACCCAGCCTATTATCTGTCTTTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E5-F：GCTTTCCAATCTGCTCACCAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E6-F：TCCTATGAACCCTCTGTCCGTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E6-R：TTGCTCCGTGTCAATCAATGAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E7-F：ACCTCAGCCTCCCAAAGTGTTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E7-R：ACCAACCACAGACAAAGCCAAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E8-F：AGACATCAGGCAGTGTTCACTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E8-R：GATTTACCTTTCCTCTCTCCACAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E9-F：TCCAGGACTTATGTGACCGTTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E9-R：CAACAAATCCCAAGCAGAAAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E10-F：CTAACAGATGCGAAACAGGCTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E10-R：CCAAAGTGCTGGGATTACAGAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E11-F：AAGGAGACGAGTTCTGGGATGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E11-R：AATGGCAGTGCTGTAGGGTAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E12-F：GCTGACTCCAAAGCCCTATGCTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E12-R：CCCAGACTGTTTTCGTGAGCACAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E13-F：GCCACCTGACCTTGTTTACATGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E13-R：GAGTTTGTTTCCCATTCCGAAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E14-F：AAACAGGGACATTTGGTTCGTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E14-R：CACAGATACACTAACAGTAGGGCAAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E15-F：ATGCCCAGCGTTATTTCACTTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E15-R：TACCACCAGTATCAGCCATTTCAACAGCTATGACCATG；
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；
M13R：AACAGCTATGACCATG。
进一步地，所述扩增体系PCR反应液还包括2×PCR Buffer、dNTPs和KOD FX DNA聚合酶。
进一步地，所述测序体系反应液还包括测序纯化液、EDTA、无水乙醇、75％乙醇、HIDI和Bigdye Terminator V3.1。
进一步地，所述测序纯化液包括核酸外切酶I和牛小肠碱性磷酸酶。
进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。
进一步地，所述突变选自N308D、D61N、G60del和D61del等常见突变。
有益效果：(1)本发明设计了扩增基因PTPN11全外显子的正、反向引物，并创新性地在PCR扩增上游引物前端和下游引物前端分别加了一段长18bp的的M13F引物序列和长16bp的M13R引物序列，这样扩增以后的产物两端都会带上所引入的M13F及M13R引物序列，随后进行测序反应的时候，所有的扩增产物可以使用统一的M13F和M13R引物就可以进行正反向测序了，而不用针对每个扩增产物都设计一对测序引物，这样就可以显著地降低检测成本；(2)对送检样本进行PCR扩增，过调整正反向引物的浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳，随后采用Sanger测序法，对PCR产物进行正反向测序反应扩增、纯化后变性、直接测序可以全面地检测基因PTPN11全外显子突变位点的突变情况；(5)利用本发明所述扩增引物和测序引物，可以扩增基因PTPN11全外显子，通过测序结果的分析，可以很直观的了解基因PTPN11全外显子突变位点基因突变情况，并不受基因突变多样化的影响，可覆盖待检测的所有突变位点；(6)采用本发明的扩增引物对目的基因进行扩增并利用Sanger测序法检测基因PTPN11的热点突变，具有有很高的特异性、准确性和灵敏度，以及操作简单、成本低等优点。
附图说明
图1为外显子1测序截图。
图2为外显子2测序截图。
图3为外显子3测序截图。
图4为外显子4测序截图。
图5为外显子5测序截图。
图6为外显子6测序截图。
图7为外显子7测序截图。
图8为外显子8测序截图。
图9为外显子9测序截图。
图10为外显子10测序截图。
图11为外显子11测序截图。
图12为外显子12测序截图。
图13为外显子13测序截图。
图14为外显子14测序截图。
图15为外显子15测序截图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
检测基因PTPN11突变位点的试剂盒，包括：组织DNA抽提试剂盒(例如使用天根生物的DNA提取试剂盒)；无水乙醇；扩增体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中
扩增体系PCR反应液包括：2×PCR Buffer；2mMdNTPs；KOD FX DNA Polymerase(1U/μl)；扩增引物用于扩增基因PTPN11，扩增引物为：
PTPN11-E1-F/PTPN11-E1-R，PTPN11-E2-F/PTPN11-E2-R，
PTPN11-E3-F/PTPN11-E3-R，PTPN11-E4-F/PTPN11-E4-R，
PTPN11-E5-F/PTPN11-E5-F，PTPN11-E6-F/PTPN11-E6-R，
PTPN11-E7-F/PTPN11-E7-R，PTPN11-E8-F/PTPN11-E8-R，
PTPN11-E9-F/PTPN11-E9-R，PTPN11-E10-F/PTPN11-E10-R，
PTPN11-E11-F/PTPN11-E11-R，PTPN11-E12-F/PTPN11-E12-R，
PTPN11-E13-F/PTPN11-E13-R，PTPN11-E14-F/PTPN11-E14-R和
PTPN11-E15-F/PTPN11-E15-R，其碱基序列为：
PTPN11-E1-F：AAGGATGCTTTGGACACTGTGTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E1-R：GGGAGGCAGGAAATGAATGAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E2-F：TCTACTCTGCTCATAATGCGTCTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E2-R：CTCTTCTGCTAAATGTCCAGGAAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E3-F：CCTTTGTGTTGAGTTGGTTGTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E3-R：GAGCAGCAGACTTTGTGGTAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E4-F：CTGTCTCAGGTGGGATTGATTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E4-R：GTGTTTGTCCTCTTCCAGCAAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E5-F：CACCCAGCCTATTATCTGTCTTTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E5-F：GCTTTCCAATCTGCTCACCAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E6-F：TCCTATGAACCCTCTGTCCGTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E6-R：TTGCTCCGTGTCAATCAATGAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E7-F：ACCTCAGCCTCCCAAAGTGTTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E7-R：ACCAACCACAGACAAAGCCAAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E8-F：AGACATCAGGCAGTGTTCACTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E8-R：GATTTACCTTTCCTCTCTCCACAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E9-F：TCCAGGACTTATGTGACCGTTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E9-R：CAACAAATCCCAAGCAGAAAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E10-F：CTAACAGATGCGAAACAGGCTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E10-R：CCAAAGTGCTGGGATTACAGAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E11-F：AAGGAGACGAGTTCTGGGATGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E11-R：AATGGCAGTGCTGTAGGGTAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E12-F：GCTGACTCCAAAGCCCTATGCTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E12-R：CCCAGACTGTTTTCGTGAGCACAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E13-F：GCCACCTGACCTTGTTTACATGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E13-R：GAGTTTGTTTCCCATTCCGAAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E14-F：AAACAGGGACATTTGGTTCGTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E14-R：CACAGATACACTAACAGTAGGGCAAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E15-F：ATGCCCAGCGTTATTTCACTTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E15-R：TACCACCAGTATCAGCCATTTCAACAGCTATGACCATG。
测序体系包括：测序纯化液、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物：M13F(3.2μm)与M13R(3.2μm)，以及Bigdye Terminator V3.1(购买自美国Applied Biosystems公司)，其中测序纯化液包括虾碱性磷酸酶(SAP)0.6U和核酸外切酶I(EXONI)1.2U，所述测序引物的碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；
M13R：AACAGCTATGACCATG。
扩增体系PCR反应液配制如下：
其中，PrimerF/Primer为PTPN11-E1-F/PTPN11-E1-R，PTPN11-E2-F/PTPN11-E2-R，PTPN11-E3-F/PTPN11-E3-R，PTPN11-E4-F/PTPN11-E4-R，PTPN11-E5-F/PTPN11-E5-F，PTPN11-E6-F/PTPN11-E6-R，PTPN11-E7-F/PTPN11-E7-R，PTPN11-E8-F/PTPN11-E8-R，PTPN11-E9-F/PTPN11-E9-R，PTPN11-E10-F/PTPN11-E10-R，PTPN11-E11-F/PTPN11-E11-R，PTPN11-E12-F/PTPN11-E12-R，PTPN11-E13-F/PTPN11-E13-R，PTPN11-E14-F/PTPN11-E14-R和PTPN11-E15-F/PTPN11-E15-R。
阳性对照品：含有PTPN11序列的溶液。
阴性对照品：无PTPN11序列的溶液。
空白对照品：2μl生理盐水或不加任何物质。
实施例2血液样本DNA检测流程
(1)抽提血液中的基因组DNA：
1)抽取500uL血液加入1000uL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次，接着3000rpm离心5min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200uL缓冲液GA，振荡至彻底混匀；
2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀；
3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm(13，400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；
6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm(13，400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm(13，400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12，000rpm(13，400×g)离心30秒，倒掉废液；
9)将吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm(13，400×g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2～5分钟，12，000rpm(13，400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中，从而获得血液样本DNA溶液。
(2)试剂配置：按检测人份数配置扩增体系PCR反应液各Xμl，每人份18μl分装：
X＝18μl反应液×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)
n为检测标本数。
(3)加样：将2μl步骤(1)中获得的DNA加入到检测体系PCR反应液中；对阳性对照而言，直接加2μl阳性对照品；对阴性对照实验而言，直接加2μl阴性对照品；对空白对照实验而言，加2μl生理盐水或不加任何物质。
(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，获得扩增产物，可用仪器包括ABI veriti(美国Applied Biosystems公司)等。扩增反应条件如表1所示。
表1.扩增反应条件
(5)Sanger测序：
取9μl(4)中的PCR扩增产物与2μl测序纯化反应液。按照如表2所示的程序进行纯化，获得纯化产物。
表2
将1μl纯化产物分别与测序引物M13F(3.2μm)、M13R(3.2μm)按照如表3、表4所示的体系进行混合。
表3
表4
测序反应程序如表5所示。
表5
沉淀环节：
向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15ml无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50ml70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl HiDi后进行变性试验。变性程序如表6所示。
表6
变性程序结束后，上测序仪(ABI3500)测序。
(6)结果判断：将测序结果与野生型参考序列进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
实施例3
取临床全血样本3份，检测每份样本Noonan综合征相关的PTPN11基因全外显子突变情况。按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。对每份样品而言，将2μl提取出的基因组DNA，加入到扩增体系PCR反应液中，同时做阳性、阴性、空白对照实验各一次。一台96孔的普通PCR仪可同时检测46份样品，每份样品2次重复，一份阳性对照，一份阴性对照和一份空白对照。检测时间为160分钟。
另外，样本3的测序结果如图1-15所示，均为野生型。样本1和2的测序结果也均为野生型。
从检测结果可以看出，本发明所述引物已经把想要检测的PTPN11基因全外显子都包括在内了，能够扩增出PTPN11基因的这些外显子，并且测序结果完全准确。本发明所述引物可以准确地扩增出PTPN11基因全外显子，无论是野生型还是突变型。
序列表
<110> 北京艾迪康医学检验实验室有限公司
<120> 检测PTPN11基因突变的方法、引物和试剂盒
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaggatgctt tggacactgt gtgtaaaacg acggccagt 39
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggaggcagg aaatgaatga acagctatga ccatg 35
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tctactctgc tcataatgcg tctgtaaaac gacggccagt 40
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctcttctgct aaatgtccag gaaacagcta tgaccatg 38
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cctttgtgtt gagttggttg tgtaaaacga cggccagt 38
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gagcagcaga ctttgtggta acagctatga ccatg 35
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctgtctcagg tgggattgat tgtaaaacga cggccagt 38
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtgtttgtcc tcttccagca aacagctatg accatg 36
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cacccagcct attatctgtc tttgtaaaac gacggccagt 40
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gctttccaat ctgctcacca acagctatga ccatg 35
<210> 11
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcctatgaac cctctgtccg tgtaaaacga cggccagt 38
<210> 12
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttgctccgtg tcaatcaatg aacagctatg accatg 36
<210> 13
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
acctcagcct cccaaagtgt tgtaaaacga cggccagt 38
<210> 14
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
accaaccaca gacaaagcca aacagctatg accatg 36
<210> 15
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agacatcagg cagtgttcac tgtaaaacga cggccagt 38
<210> 16
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gatttacctt tcctctctcc acaacagcta tgaccatg 38
<210> 17
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tccaggactt atgtgaccgt tgtaaaacga cggccagt 38
<210> 18
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
caacaaatcc caagcagaaa acagctatga ccatg 35
<210> 19
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ctaacagatg cgaaacaggc tgtaaaacga cggccagt 38
<210> 20
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ccaaagtgct gggattacag aacagctatg accatg 36
<210> 21
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aaggagacga gttctgggat gtaaaacgac ggccagt 37
<210> 22
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aatggcagtg ctgtagggta acagctatga ccatg 35
<210> 23
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gctgactcca aagccctatg ctgtaaaacg acggccagt 39
<210> 24
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cccagactgt tttcgtgagc acaacagcta tgaccatg 38
<210> 25
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gccacctgac cttgtttaca tgtaaaacga cggccagt 38
<210> 26
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gagtttgttt cccattccga aacagctatg accatg 36
<210> 27
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
aaacagggac atttggttcg tgtaaaacga cggccagt 38
<210> 28
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cacagataca ctaacagtag ggcaaacagc tatgaccatg 40
<210> 29
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tgcccagcgt tatttcactt gtaaaacgac ggccagt 37
<210> 30
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
taccaccagt atcagccatt tcaacagcta tgaccatg 38
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 32
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
aacagctatg accatg 16
Claims (9)
1.检测PTPN11基因突变的引物，其特征在于，包括用于扩增PTPN11基因的扩增引物和一对测序引物M13F和M13R，所述扩增引物为：PTPN11-E1-F/PTPN11-E1-R、PTPN11-E2-F/PTPN11-E2-R、PTPN11-E3-F/PTPN11-E3-R、PTPN11-E4-F/PTPN11-E4-R、PTPN11-E5-F/PTPN11-E5-F、PTPN11-E6-F/PTPN11-E6-R、PTPN11-E7-F/PTPN11-E7-R、PTPN11-E8-F/PTPN11-E8-R、PTPN11-E9-F/PTPN11-E9-R、PTPN11-E10-F/PTPN11-E10-R、PTPN11-E11-F/PTPN11-E11-R、PTPN11-E12-F/PTPN11-E12-R、PTPN11-E13-F/PTPN11-E13-R、PTPN11-E14-F/PTPN11-E14-R和PTPN11-E15-F/PTPN11-E15-R，其碱基序列为：
PTPN11-E1-F：AAGGATGCTTTGGACACTGTGTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E1-R：GGGAGGCAGGAAATGAATGAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E2-F：TCTACTCTGCTCATAATGCGTCTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E2-R：CTCTTCTGCTAAATGTCCAGGAAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E3-F：CCTTTGTGTTGAGTTGGTTGTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E3-R：GAGCAGCAGACTTTGTGGTAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E4-F：CTGTCTCAGGTGGGATTGATTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E4-R：GTGTTTGTCCTCTTCCAGCAAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E5-F：CACCCAGCCTATTATCTGTCTTTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E5-F：GCTTTCCAATCTGCTCACCAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E6-F：TCCTATGAACCCTCTGTCCGTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E6-R：TTGCTCCGTGTCAATCAATGAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E7-F：ACCTCAGCCTCCCAAAGTGT TGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E7-R：ACCAACCACAGACAAAGCCAAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E8-F：AGACATCAGGCAGTGTTCACTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E8-R：GATTTACCTTTCCTCTCTCCACAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E9-F：TCCAGGACTTATGTGACCGTTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E9-R：CAACAAATCCCAAGCAGAAAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E10-F：CTAACAGATGCGAAACAGGCTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E10-R：CCAAAGTGCTGGGATTACAGAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E11-F：AAGGAGACGAGTTCTGGGATGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E11-R：AATGGCAGTGCTGTAGGGTAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E12-F：GCTGACTCCAAAGCCCTATGCTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E12-R：CCCAGACTGTTTTCGTGAGCACAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E13-F：GCCACCTGACCTTGTTTACATGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E13-R：GAGTTTGTTTCCCATTCCGAAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E14-F：AAACAGGGACATTTGGTTCGTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E14-R：CACAGATACACTAACAGTAGGGCAAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E15-F：ATGCCCAGCGTTATTTCACTTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E15-R：TACCACCAGTATCAGCCATTTCAACAGCTATGACCATG；
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；
M13R：AACAGCTATGACCATG。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述突变选自G447A、525delT13、G615R、D645E突变。
3.一种检测样品中PTPN11基因突变的方法，其特征在于，其包括如下步骤：
(1)提取样品DNA；
(2)利用扩增引物对(1)中的DNA进行扩增，获得扩增产物，其中，所述扩增引物为PTPN11-E1-F/PTPN11-E1-R，PTPN11-E2-F/PTPN11-E2-R，PTPN11-E3-F/PTPN11-E3-R，PTPN11-E4-F/PTPN11-E4-R，PTPN11-E5-F/PTPN11-E5-F，PTPN11-E6-F/PTPN11-E6-R，PTPN11-E7-F/PTPN11-E7-R，PTPN11-E8-F/PTPN11-E8-R，PTPN11-E9-F/PTPN11-E9-R，PTPN11-E10-F/PTPN11-E10-R，PTPN11-E11-F/PTPN11-E11-R，PTPN11-E12-F/PTPN11-E12-R，PTPN11-E13-F/PTPN11-E13-R，PTPN11-E14-F/PTPN11-E14-R和PTPN11-E15-F/PTPN11-E15-R；
(3)利用测序引物M13F与M13R对(2)中的扩增产物分别进行正向和反向测序，获得所述扩增产物的基因序列；
(4)将(3)中的基因序列与野生型PTPN11基因序列进行比较，确定PTPN11基因是否发生突变；
所述扩增引物和测序引物的碱基序列为：
PTPN11-E1-F：AAGGATGCTTTGGACACTGTGTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E1-R：GGGAGGCAGGAAATGAATGAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E2-F：TCTACTCTGCTCATAATGCGTCTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E2-R：CTCTTCTGCTAAATGTCCAGGAAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E3-F：CCTTTGTGTTGAGTTGGTTGTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E3-R：GAGCAGCAGACTTTGTGGTAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E4-F：CTGTCTCAGGTGGGATTGATTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E4-R：GTGTTTGTCCTCTTCCAGCAAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E5-F：CACCCAGCCTATTATCTGTCTTTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E5-F：GCTTTCCAATCTGCTCACCAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E6-F：TCCTATGAACCCTCTGTCCGTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E6-R：TTGCTCCGTGTCAATCAATGAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E7-F：ACCTCAGCCTCCCAAAGTGT TGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E7-R：ACCAACCACAGACAAAGCCAAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E8-F：AGACATCAGGCAGTGTTCACTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E8-R：GATTTACCTTTCCTCTCTCCACAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E9-F：TCCAGGACTTATGTGACCGTTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E9-R：CAACAAATCCCAAGCAGAAAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E10-F：CTAACAGATGCGAAACAGGCTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E10-R：CCAAAGTGCTGGGATTACAGAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E11-F：AAGGAGACGAGTTCTGGGATGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E11-R：AATGGCAGTGCTGTAGGGTAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E12-F：GCTGACTCCAAAGCCCTATGCTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E12-R：CCCAGACTGTTTTCGTGAGCACAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E13-F：GCCACCTGACCTTGTTTACATGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E13-R：GAGTTTGTTTCCCATTCCGAAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E14-F：AAACAGGGACATTTGGTTCGTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E14-R：CACAGATACACTAACAGTAGGGCAAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E15-F：ATGCCCAGCGTTATTTCACTTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E15-R：TACCACCAGTATCAGCCATTTCAACAGCTATGACCATG；
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；
M13R：AACAGCTATGACCATG。
4.一种检测样品中PTPN11基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括扩增体系PCR反应液和测序体系反应液，其中扩增体系PCR反应液包括扩增引物，测序体系反应液包括一对测序引物M13F和M13R，扩增引物为PTPN11-E1-F/PTPN11-E1-R，PTPN11-E2-F/PTPN11-E2-R，PTPN11-E3-F/PTPN11-E3-R，PTPN11-E4-F/PTPN11-E4-R，PTPN11-E5-F/PTPN11-E5-F，PTPN11-E6-F/PTPN11-E6-R，PTPN11-E7-F/PTPN11-E7-R，PTPN11-E8-F/PTPN11-E8-R，PTPN11-E9-F/PTPN11-E9-R，PTPN11-E10-F/PTPN11-E10-R，PTPN11-E11-F/PTPN11-E11-R，PTPN11-E12-F/PTPN11-E12-R，PTPN11-E13-F/PTPN11-E13-R，PTPN11-E14-F/PTPN11-E14-R和PTPN11-E15-F/PTPN11-E15-R，所述扩增引物和测序引物的碱基序列为：
PTPN11-E1-F：AAGGATGCTTTGGACACTGTGTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E1-R：GGGAGGCAGGAAATGAATGAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E2-F：TCTACTCTGCTCATAATGCGTCTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E2-R：CTCTTCTGCTAAATGTCCAGGAAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E3-F：CCTTTGTGTTGAGTTGGTTGTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E3-R：GAGCAGCAGACTTTGTGGTAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E4-F：CTGTCTCAGGTGGGATTGATTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E4-R：GTGTTTGTCCTCTTCCAGCAAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E5-F：CACCCAGCCTATTATCTGTCTTTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E5-F：GCTTTCCAATCTGCTCACCAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E6-F：TCCTATGAACCCTCTGTCCGTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E6-R：TTGCTCCGTGTCAATCAATGAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E7-F：ACCTCAGCCTCCCAAAGTGT TGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E7-R：ACCAACCACAGACAAAGCCAAACAGCTATGACCATG；
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PTPN11-E8-R：GATTTACCTTTCCTCTCTCCACAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E9-F：TCCAGGACTTATGTGACCGTTGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E9-R：CAACAAATCCCAAGCAGAAAACAGCTATGACCATG；
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PTPN11-E10-R：CCAAAGTGCTGGGATTACAGAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E11-F：AAGGAGACGAGTTCTGGGATGTAAAACGACGGCCAGT
PTPN11-E11-R：AATGGCAGTGCTGTAGGGTAACAGCTATGACCATG；
PTPN11-E12-F：GCTGACTCCAAAGCCCTATGCTGTAAAACGACGGCCAGT
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PTPN11-E15-R：TACCACCAGTATCAGCCATTTCAACAGCTATGACCATG；
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；
M13R：AACAGCTATGACCATG。
5.如权利要求4所述的试剂盒，所述扩增体系PCR反应液还包括2×PCR Buffer、dNTPs和KOD FX DNA聚合酶。
6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述测序体系反应液还包括测序纯化液、EDTA、无水乙醇、75％乙醇、HIDI和Bigdye Terminator V3.1。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述测序纯化液包括核酸外切酶I和牛小肠碱性磷酸酶。
8.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。
9.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述突变选自N308D、D61N、G60del和D61del突变。
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