CN114032303A - 检测基因abcb11新突变的寡核苷酸和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了检测ABCB11 c.1638+80C>T突变的寡核苷酸、方法及其应用；采用Sanger测序技术，可用于快速检测该位点的突变。利用本发明完成的检测结果准确，可以辅助诊断新生儿胆汁淤积症和进行性家族性肝内胆汁淤积症2型患者的基因突变情况。利用本发明所述寡核苷酸和方法便于判断和分析产生的基因突变是否会造成疾病，对疾病的临床鉴别及诊断有重要的参考意义。

Description

检测基因ABCB11新突变的寡核苷酸和方法
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及ABCB11 c.1638+80C>T基因突变的检测。
背景技术
人类ABCB11基因位于2q24—31，含有28个外显子，编码产生一种跨膜糖蛋白，即胆盐输出泵蛋白(BSEP)。BSEP主要存在于肝脏中，位于肝细胞的毛细胆管面，由l 321个氨基酸组成，属于ABC(ATP—binding cassette)转运蛋白家族成员，其作用是通过消耗ATP将肝细胞内的胆盐分泌到毛细胆管中，刺激胆盐依赖性胆汁流的形成，是影响胆汁流最重要的因素。ABCB11基因变异直接影响到BSEP的表达和功能，与多种淤胆性肝脏疾病相关，是近年来研究的热点。
进行性家族性肝内胆汁淤积症2(PFIC2)是一组异质性的常染色体隐性遗传的肝细胞源性儿童胆汁淤积症，ABCB11基因突变已经在不同人群的胆汁淤积综合征患儿中有过报道，突变与表型的关联正被深入研究。已明确PFIC2是由ABCB11基因突变引起。现已报道了该基因近100种突变可导致PFIC2的发生，这些突变均严重影响了BSEP蛋白的表达和(或)功能。另外，良性复发性肝内胆汁淤积2型(BRIC2)；妊娠期肝内胆汁淤积(ICP)；药物诱导的肝内胆汁淤积；肝癌和原发性胆汁性肝硬化(PBC)和原发性硬化性胆管炎(PSC)等疾病都和ABCB11基因的突变相关。
总之，ABCB11基因变异可能与多种淤胆性肝脏疾病相关，如已明确有的突变会导致PFIC2和BCIC2的发生，有的变异可能会增加人们对ICP和药物诱导的肝内胆汁淤积的易感性等等。今后应加强对ABCB11基因变异与疾病关系的研究，以期明确相关疾病的发病机制，并为寻找相关疾病的最佳治疗方案提供契机。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测ABCB11 c.1638+80C>T突变的寡核苷酸，采用PCR结合Sanger测序技术，可用于快速检测ABCB11 c.1638+80C>T突变情况。所述检测ABCB11c.1638+80C>T突变的寡核苷酸，包括：扩增ABCB11c.1638+80C>T突变的寡核苷酸，其碱基序列为：
SEQ-ID14-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGCCCATTGGTCAAGTATG；
SEQ-ID14-R：AACAGCTATGACCATGCTAAAACATGGCTTAAGAATTTAATG。
进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：
M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R：AACAGCTATGACCATG。
本发明提供了检测ABCB11 c.1638+80C>T突变情况的方法，包括以下步骤：
(1)抽提血液中的基因组DNA；
(2)用PCR扩增步骤1中提取的DNA；
(3)对步骤2中的扩增产物进行测序；
(4)对测序结果进行判断，确定ABCB11 c.1638+80C>T突变位点是否发生突变。
其中，所述PCR扩增步骤中采用的扩增ABCB11 c.1638+80C>T突变的寡核苷酸是：
SEQ-ID14-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGCCCATTGGTCAAGTATG；
SEQ-ID14-R：AACAGCTATGACCATGCTAAAACATGGCTTAAGAATTTAATG。
进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：
M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R：AACAGCTATGACCATG。
本发明还提供了一种检测ABCB11 c.1638+80C>T突变的试剂盒，包括
(i)血液DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR扩增反应液；
(iii)测序体系试剂。
其中所述检测体系PCR扩增反应液包括SEQ-ID14-F和SEQ-ID14-R这对寡核苷酸。
进一步地，所述检测体系PCR扩增反应液还包括2×PCR Buffer、dNTPs和KOD FXDNA Polymerase。
进一步地，所述测序体系反应液还包括M13 F和M13 R，EDTA、无水乙醇、75％乙醇、HIDI和Bigdye Terminator V3.1。
有益效果：本发明设计了扩增ABCB11 c.1638+80C>T突变的寡核苷酸。采用PCR技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。本发明利用Sanger测序技术检测到ABCB11c.1638+80C>T这个未报导的新突变，可以利用我们的寡核苷酸和方法准确快速检测出ABCB11 c.1638+80C>T突变情况，从而确定疾病和ABCB11基因变异的关系，尽快找到疾病的最佳治疗方案。另外，相比较荧光定量PCR法降低了检测的成本，因为荧光定量PCR法只能检测已知的突变，多个突变检测需要多个反应成本大大增加。
附图说明
图1为1，2，3三例样本PCR扩增后电泳演示图，M为marker,产物大小为414bp，由图显示引物扩增有效，且目的条带单一清晰，特异性好。
图2为样本1ABCB11 c.1638+80C>T的测序截图，表明完全突变为T。
图3为样本3ABCB11 c.1638+80C>C/T的测序截图，表明部分突变为T。
图4为实施例4的致病性分析图。
具体实施方式
实施例1
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
一种检测ABCB11 c.1638+80C>T位点突变的寡核苷酸和方法，该寡核苷酸是针对扩增ABCB11 c.1638+80C>T位点突变所设计的特异性扩增寡核苷酸，其碱基序列为：
SEQ-ID14-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGCCCATTGGTCAAGTATG；
SEQ-ID14-R：AACAGCTATGACCATGCTAAAACATGGCTTAAGAATTTAATG。
一种检测ABCB11 c.1638+80C>T位点突变的试剂盒，包括
(i)血液DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR反应液；
(iii)测序体系试剂；
(iv)阳性对照品和阴性对照品。
其中，血液DNA抽提试剂购自天根的商品化试剂。
检测体系PCR扩增反应液包括：2×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNAPolymerase(1U/μl)；检测ABCB11 c.1638+80C>T位点上、下游寡核苷酸SEQ-ID14-F和SEQ-ID14-R(10μM)。
测序体系试剂包括：测序纯化液(ExoI:0.6U，CIP:1.2U)、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物：M13F和M13R(3.2μM)。
实施例2
血液基因组DNA抽提(试剂购自天根生物)的操作流程：
(1)抽提血液中的基因组DNA
1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12，000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。
2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。
3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12，000rpm离心30秒，倒掉废液。
9)将吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12，000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份18μl分装：
X＝18μl反应液×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)
n为检测标本数。
(3)加样：加入检测体系PCR反应液中2μl DNA；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。
(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件如下：
Figure BDA0003387433520000051
PCR扩增体系试剂配制方法如下：
Figure BDA0003387433520000052
其中，寡核苷酸序列为：
SEQ-ID14-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGCCCATTGGTCAAGTATG；
SEQ-ID14-R：AACAGCTATGACCATGCTAAAACATGGCTTAAGAATTTAATG
(5)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，110V，35min，凝胶成像系统观察。
如图1所示，即为3例血液样本扩增后所得产物的电泳图谱。通过电泳图的分析表明本发明所述扩增有效，且条带单一清晰。
(6)Sanger测序：
取9μl PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：
Figure BDA0003387433520000061
将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：
Figure BDA0003387433520000062
测序反应程序：
Figure BDA0003387433520000063
沉淀环节：
向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15μl无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50ml70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl CBL后进行变性5min，最后-20℃2min上测序仪(ABI3730)测序。
(7)结果判断：分别将测序结果与ABCB11(NG_007374)阴性参考序列进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
实施例3
取20例相关疾病的临床样品和没有任何疾病的样本10例，按实施例1和2所述方法提取基因组DNA、配制试剂并检测。样本加入检测体系PCR反应液中1μL，同时做阴性，空白对照各一份。具体结果见下表：
Figure BDA0003387433520000071
Figure BDA0003387433520000081
其中ZM代表疾病样本，CON代表正常样本：测序后发现疾病组20例样本完全突变样本12例；部分突变样本6例；不突变样本2例；而正常样本9例未发生突变，1例部分突变。图2和图3为ABCB11 c.1638+80C>T完全和部分突变样本的测序截图。
实施例4
根据实施例3，发现了这个新的突变，我们需要知道这个ABCB11c.1638+80C>T是不是真的和疾病相关。采用www.mutationtaster.org软件来预测其致病的可能性，图4是致病性分析图。
分析提示：ABCB11 c.1638+80C>T突变是剪接位置单碱基改变，可能影响蛋白的功能从而导致疾病。因而本发明设计扩增ABCB11 c.1638+80C>T突变的寡核苷酸，方法以及试剂盒能快速检测到突变情况，从而确定疾病和ABCB11基因变异的关系，能快速找到疾病的针对性治疗方案。
序列表
<110> 杭州艾迪康医学检验中心有限公司
<120> 检测基因ABCB11新突变的寡核苷酸和方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtaaaacga cggccagtct gcccattggt caagtatg 38
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aacagctatg accatgctaa aacatggctt aagaatttaa tg 42
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aacagctatg accatg 16

Claims (5)

1.检测ABCB11 c.1638+80C>T突变的寡核苷酸，其特征在于，包括扩增ABCB11 c.1638+80C>T突变的寡核苷酸，其碱基序列为：
SEQ-ID14-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGCCCATTGGTCAAGTATG；
SEQ-ID14-R：AACAGCTATGACCATGCTAAAACATGGCTTAAGAATTTAATG。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，还包括测序引物，其碱基序列为：
M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R：AACAGCTATGACCATG。
3.检测ABCB11 c.1638+80C>T突变情况的方法，包括以下步骤：
(1)抽提血液中的基因组DNA；
(2)用PCR扩增步骤1中提取的DNA；
(3)对步骤2中的扩增产物进行测序；
(4)对测序结果进行判断，确定检测ABCB11 c.1638+80C>T位点是否发生突变。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增步骤中包括扩增ABCB11 c.1638+80C>T突变的寡核苷酸，其碱基序列为：
SEQ-ID14-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGCCCATTGGTCAAGTATG；
SEQ-ID14-R：AACAGCTATGACCATGCTAAAACATGGCTTAAGAATTTAATG。
5.如权利要求4所述的引物，其特征在于，还包括测序引物，其碱基序列为：
M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R：AACAGCTATGACCATG。
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