CN109628563A

CN109628563A - 检测piga基因启动子区域4972a>g突变位点的引物、试剂盒和方法

Info

Publication number: CN109628563A
Application number: CN201910001452.4A
Authority: CN
Inventors: 刘赵玲; 吴鹏飞; 王淑; 王淑一
Original assignee: Nanchang Adicon Clinical Laboratories Ltd
Current assignee: Nanchang Adicon Clinical Laboratories Ltd
Priority date: 2019-01-02
Filing date: 2019-01-02
Publication date: 2019-04-16

Abstract

本发明公开了一种检测PIGA基因启动子区4972A>G位点突变的引物，其碱基序列为：PIGA‑4972‑F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCAGCGCCTCTTTGTGAT；PIGA‑4972‑R：AACAGCTATGACCATGACCCTCCGACCCAACTTC。本发明采用Sanger测序技术，可快速发现该突变位点，检测结果准确，可以辅助检查该区域的突变情况，对疾病的病因探究的具有参考意义。

Description

检测PIGA基因启动子区域4972A＞G突变位点的引物、试剂盒和方法

技术领域

本发明属于分子检测领域，特别涉及一种检测PIGA基因启动子区4972A＞G 突变位点的引物、试剂盒和检测方法。

背景技术

PIG-A基因位于染色体Xp22.1上。全长约l7kb，编码含484个氢基酸的蛋白产物。编码区由1452bp组成。共有6个外显子(如图1所示)。其中外显子1 含5’非翻译区的一部分。外显子2含5’非翻译区的剩余部分和大约一半的编码区，3’非翻译区位于第6外显子的3’端(约2.1kb)，外显子1至其上游583bP之间为启动子区，其中有4个CAAT盒，2个AP-2序列，以及1个顺式调控元件。这些序列对PIG-A基因的表达非常重要。

PIG-A基因参与了GPI生物合成的第一步：GIcNAc-PI(N-乙酰葡糖胺-磷脂酰肌醇)和GIcN-PI(葡糖胺-磷脂酰肌醇)的合成。GPI是在内质网中合成的。首先是GIcNAc(N-乙酰葡糖胺)从UDP-GIcNAe转移至PI，生成GIcNAc-Pl，脱乙酰基后生成GIcN-PI，再加甘露糖，然后再加磷酸乙醇胺，最后经过修饰而成。在整个合成过程中至少有10个基因参与。其中第一步还有另外2个基因PIG-C、 PIG-H。其它步骤中有PIG-B、PIG-G、PIG-F等。

阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)是一种获得性克隆性造血干细胞疾病，临床表现多样，以持续性血管内溶血，阵发性加重为主要特征。PNH与再生障碍性贫血(AA)、骨髓增生异常综合征关系密切且错综复杂，常常难以正确鉴别诊断。目前的研究表明，在所有已检测的PNH患者血细胞中，都发现有PIG-A基因突变而导致GPI锚连蛋白的部分或全部缺失，说明PIG-A基因突变在PNH发病中有重要作用。实际上，参与GPI合成的基因很多，包括PIG-B、PIG-C、PIG-F、 PIG-H等，但它们均位于常染色体上，一次突变不足以引起PNH表型。PIG-A基因位于X染色体上，由于人类在胚胎发育中，两条X染色体的一条发生了随机灭活，故PIG-A基因一次突变即可导致PNH表型，这也可能是检测到PNH 突变基因均为PIG-A的原因。

另外，PIG-A蛋白仅作为催化剂参与GPI的合成，故PIG-A蛋白仅有部分活性就可产生大量的GPI，因此，许多PIG-A基因的错义突变并不能产生PNH 表型。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测PIGA基因启动子区4972A＞G突变位点的引物，采用PCR技术，可用于快速检测患者体内PIGA基因启动子区域4972A＞G 位点的突变情况。

检测PIGA基因启动子区4972A＞G突变位点的引物，其特征在于，其碱基序列为：

PIGA-4972-F：TGTAAAACGACGGCCAGT CTCAGCGCCTCTTTGTGAT

PIGA-4972-R：AACAGCTATGACCATG ACCCTCCGACCCAACTTC。

进一步地，所述引物还包括测序引物，其碱基序列为：

M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13 R：AACAGCTATGACCATG。

扩增引物PIGA-4972-F和PIGA-4972-R是扩增PIGA基因启动子区序列的引物。

本发明还提供了检测PIGA基因启动子区4972A＞G突变位点的试剂盒，其特征在于包括：

(i)血液DNA抽提试剂；

(ii)检测体系PCR扩增反应液；包括扩增PIGA基因启动子区的引物，其碱基序列为：

PIGA-4972-F：TGTAAAACGACGGCCAGT CTCAGCGCCTCTTTGTGAT

PIGA-4972-R：AACAGCTATGACCATG ACCCTCCGACCCAACTTC；

(iii)测序体系试剂，包括测序引物，其碱基序列为：

M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13 R：AACAGCTATGACCATG。

本发明最后提供了检测PIGA基因启动子区4972A＞G突变位点的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)抽提血液中的组织DNA；

(2)PCR扩增步骤(1)中提取的DNA，得扩增产物；其中PCR扩增引物为：

PIGA-4972-F：TGTAAAACGACGGCCAGT CTCAGCGCCTCTTTGTGAT

PIGA-4972-R：AACAGCTATGACCATG ACCCTCCGACCCAACTTC；

(3)对步骤(2)的扩增产物进行测序；其中测序引物碱基序列为：

M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13 R：AACAGCTATGACCATG；

(4)对测序结果进行判断，确定4972A＞G位点是否发生突变。

有益效果：本发明设计了扩增PIGA基因启动子区域4972A＞G位点的引物。采用PCR技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。本发明利用测序技术检测PIGA基因启动子区域 4972A＞G位点突变的方法，可以准确得将PIGA基因启动子区域4972A＞G的突变检测出来，相比较荧光定量PCR法降低了检测的成本和难度。荧光定量PCR 法要针对不同的突变类型设计多个探针，成本高，检测难度大。

附图说明

图1为引物PIGA-4972-F/R的电泳图，M为Marker DL 2000。

图2为样本1、2PIGA基因启动子区4972A＞G位点突变型测序截图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。

实施例1

检测PIGA基因启动子区4972A＞G位点突变的引物，该引物的设计是针对 PIGA基因启动子区4972A＞G位点设计的扩增引物，包括：

扩增PIGA基因启动子区4972A＞G位点的引物，其碱基序列为：

PIGA-4972-F：TGTAAAACGACGGCCAGT CTCAGCGCCTCTTTGTGAT

PIGA-4972-R：AACAGCTATGACCATG ACCCTCCGACCCAACTTC。

检测PIGA基因启动子区4972A＞G位点突变的试剂盒，包括

(i)血液DNA抽提试剂；

(ii)检测体系PCR反应液；

(iii)测序体系试剂；

其中，组织DNA抽提试剂可购自天根DNA抽提试剂盒等商品化试剂。

检测体系PCR扩增反应液包括：2×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNAPolymerase(1U/μl)；扩增PIGA基因启动子区域4972A＞G位点序列的上、下游引物PIGA-4972-F/R引物浓度均为10μM。

测序体系试剂包括：测序纯化液(ExoI:0.6U，CIP:1.2U)、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物：检测PIGA基因启动子区域4972A＞G位点的上、下游引物分别为M13-F(3.2μm)、M13-R(3.2μm), 以及Bigdye Terminator V3.1(购买自美国Applied Biosystems公司)。

实施例2

血液/细胞/组织基因组DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：

(1)抽提血液中的组织DNA：1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12，000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。2)加入20μl 蛋白酶K溶液，混匀。3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。 5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12， 000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。8)向吸附柱CB3中加入500 μl漂洗液PW，12，000rpm离心30秒，倒掉废液。9)将吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12， 000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份19μl 分装：

X＝19μl反应液×(n份标本+1份空白对照)

n为检测标本数。

(3)加样：加入检测体系PCR反应液中1μl DNA；空白对照加1μl生理盐水或不加任何物质。

(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件如下：

PCR扩增体系试剂配制方法如下：

其中，引物序列为：

PIGA-4972-F：TGTAAAACGACGGCCAGT CTCAGCGCCTCTTTGTGAT

PIGA-4972-R：AACAGCTATGACCATG ACCCTCCGACCCAACTTC。

(5)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，110V，25min，凝胶成像系统观察。

如图2所示，即血液样本以PIGA-4972-F/R为引物扩增后所得产物的电泳图谱。本发明扩增的片段长度为280bp，通过电泳图的分析表明本发明所述引物 PIGA-4972-F/R扩增有效，且条带单一。

(6)Sanger测序：

取9μl PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：

将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：

反应程序：

沉淀环节：

向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15μl 无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50μl 70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl Hi-Di后进行变性试验。

变性程序结束后，上测序仪(ABI3730)测序。

(7)结果判断：分别将测序结果与PIGA野生型参考序列(Genbank： NG_009786.1)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。

实施例3

取2例的临床样本按实施例1和2的试剂和方法提取基因组、配制试剂、扩增和测序。每份检测体系PCR反应液中加入样本1μl。电泳结果如图1所示，表明本发明所述引物PIGA-4972-F/R对血液样本能有效扩增，且条带单一。

样本1、2的检测结果如2所示：

图2显示是样本1、2的PIGA基因启动子区4972A＞G位点突变型测序截图，说明样本1发生4972A＞G突变。

从检测结果可以看出，本发明所述引物能够扩增出PIGA基因启动子区 4972A＞G位点序列，并且测序结果完全准确，无论是野生型还是突变型。

序列表

<110> 南昌艾迪康医学检验实验室有限公司

<120> 检测PIGA基因启动子区域4972A>G突变位点的引物、试剂盒和方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgtaaaacga cggccagtct cagcgcctct ttgtgat 37

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aacagctatg accatgaccc tccgacccaa cttc 34

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aacagctatg accatg 16

Claims

1.检测PIGA基因启动子区4972A>G突变位点的引物，其特征在于，其碱基序列为：

PIGA-4972-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTCAGCGCCTCTTTGTGAT

PIGA-4972-R：AACAGCTATGACCATGACCCTCCGACCCAACTTC。

2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物还包括测序引物，其碱基序列为：

M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13 R：AACAGCTATGACCATG。

3.检测PIGA基因启动子区4972A>G突变位点的试剂盒，其特征在于包括：

(i)血液DNA抽提试剂；

PIGA-4972-F：TGTAAAACGACGGCCAGT CTCAGCGCCTCTTTGTGAT

PIGA-4972-R：AACAGCTATGACCATG ACCCTCCGACCCAACTTC；

(iii)测序体系试剂，包括测序引物，其碱基序列为：

M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13 R：AACAGCTATGACCATG。

4.检测PIGA基因启动子区4972A>G突变位点的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)抽提血液中的组织DNA；

(2)PCR扩增步骤(1)中提取的DNA，得扩增产物；其中PCR扩增引物为：PIGA-4972-F：TGTAAAACGACGGCCAGT CTCAGCGCCTCTTTGTGAT

PIGA-4972-R：AACAGCTATGACCATG ACCCTCCGACCCAACTTC；

M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13 R：AACAGCTATGACCATG；

(4)对测序结果进行判断，确定4972A>G位点是否发生突变。