CN109402234A - 检测DMD A827T、DMD A5741T和DMD 6436 insC位点突变的引物和方法 - Google Patents
检测DMD A827T、DMD A5741T和DMD 6436 insC位点突变的引物和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了检测DMD A827T、DMD A5741T和DMD 6436insC碱基突变的引物，其特征在于，包括扩增DMD A827T、DMD A5741T和DMD 6436insC位点的引物；采用Sanger测序技术，可用于快速检测假性肥大型肌营养不良(Duchenne/Becker milscular dystrophy，DMD/BMD)患者体内DMD A827T、DMD A5741T和DMD 6436insC位点突变情况。利用本发明完成的检测结果准确，对DMD/BMD的临床鉴别诊断有重要的参考意义。
Description
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测DMD A827T、DMD A5741T和DMD6436 insC位点突变的引物，采用普通PCR结合Sanger测序技术，可用于快速检测DMD/BMD患者体内DMD A827T、DMD A5741T和DMD 6436 insC位点的突变情况。
背景技术
假性肥大型肌营养不良(Duchenne/Becker milscular dystrophy，DMD/BMD)是常见的X-连锁隐性遗传性肌肉疾病，由DMD基因突变所致。DMD在活产男婴中的发病率为1/3500，多于5岁前发病，病程进展快，12岁前失去独立行走能力，20 岁左右死于心力衰竭或呼吸衰竭。BMD起病年龄较DMD晚，病程进展缓慢，一般于16岁后失去独立行走能力。由于本病发病率与致残率高，给患者家庭带来沉重的精神和经济负担，目前临床上尚无有效的治疗方法，所以准确、快速的DMD 致病基因检测，优质的遗传咨询及准确的产前诊断对防止患儿的出生显得尤为重要。
肌萎缩蛋白基因(dystrophin gene，DMD)是人类最大的基因之一，位于 Xp21.2，长2.4Mb，约占人类基因组的0.1％，含79个外显子，其mRNA序列长14Kb，编码3685个氨基酸，组成抗肌萎缩蛋白(dystrophin)。DMD基因突变导致肌细胞内缺乏dystrophin蛋白，造成肌细胞膜不稳定，无法在收缩时保持完整，出现钙内流，最终导致肌细胞坏死和功能缺失，肌肉组织纤维化，表现为假性肥大肌营养不良。Sanger测序法是基因检测的主要手段之一，也是基因检测的金标准。通过测序法对DMD基因突变进行检测可发现DMD基因已知和未知的全部类型的异常，为DMD/BMD的诊断提供依据。本发明中发现DMDA827T、 DMD A5741T和DMD6436 insC三个位点的突变在中国人群中普遍存在。因此，临床在利用DMD基因突变辅助诊断DMD/BMD时需格外谨慎，加以区别。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测DMD A827T、DMD A5741T和DMD 6436 insC位点突变的引物，采用PCR技术，可用于快速检测DMD/BMD患者体内 DMD A827T、DMD A5741T和DMD6436 insC位点的突变情况。所述检测DMD A827T、DMD A5741T和DMD 6436 insC位点突变情况的引物，其特征在于，包括：
扩增DMD A827T、DMD A5741T和DMD 6436 insC位点的引物，其碱基序列为：
DMD A827T-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATGTTCTGTTTTCTACCATGTTG
DMD A827T-R：AACAGCTATGACCATGTCAATAACAAAGCAGAATCACAT
DMD A5741T-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTAGCTTCCTATACATGGGTC
DMD A5741T-R：AACAGCTATGACCATGTTTACCAGAAAACACATCACA
DMD6436insC-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTTTGTATTTCTTTCTTTGCCAG
DMD6436insC-R：AACAGCTATGACCATGTTCTTTAATGTTAGTGCCTTTCA。
进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：
M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R：AACAGCTATGACCATG
进一步地，引物序列DMD A827T-F和DMD A827T-R是扩增DMD基因第 827位碱基的引物；引物序列DMD A5741T-F和DMD A5741T-R是扩增DMD基因第5741位碱基的引物；引物序列DMD 6436 insC-F和DMD 6436 insC-R是扩增DMD基因第6436位碱基的引物。
本发明还提供了检测DMD A827T、DMD A5741T和DMD 6436 insC位点突变情况的方法，包括以下步骤：
1.抽提外周血或肌肉组织中的基因组DNA；
2.用PCR扩增步骤1中提取的DNA；
3.对步骤2中的扩增产物进行测序；
4.对测序结果进行判断，确定DMD A827T、DMD A5741T和DMD 6436 insC 位点是否发生突变；
其中PCR扩增引物为：
扩增DMD A827T、DMD A5741T和DMD 6436 insC位点的引物，其碱基序列为：
DMD A827T-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATGTTCTGTTTTCTACCATGTTG
DMD A827T-R：AACAGCTATGACCATGTCAATAACAAAGCAGAATCACAT
DMD A5741T-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTAGCTTCCTATACATGGGTC
DMD A5741T-R：AACAGCTATGACCATGTTTACCAGAAAACACATCACA
DMD6436insC-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTTTGTATTTCTTTCTTTGCCAG
DMD6436insC-R：AACAGCTATGACCATGTTCTTTAATGTTAGTGCCTTTCA。
进一步地，测序引物碱基序列为：
M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R：AACAGCTATGACCATG。
本发明还提供了一种检测DMD A827T、DMD A5741T和DMD 6436 insC位点突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(i)血液/组织DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR扩增反应液：包括扩增DMD A827T、DMD A5741T和 DMD 6436insC位点的引物，其碱基序列为：
DMD A827T-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATGTTCTGTTTTCTACCATGTTG
DMD A827T-R：AACAGCTATGACCATGTCAATAACAAAGCAGAATCACAT
DMD A5741T-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTAGCTTCCTATACATGGGTC
DMD A5741T-R：AACAGCTATGACCATGTTTACCAGAAAACACATCACA
DMD6436insC-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTTTGTATTTCTTTCTTTGCCAG
DMD6436insC-R：AACAGCTATGACCATGTTCTTTAATGTTAGTGCCTTTCA；
(iii)测序体系试剂：包括测序引物，其碱基序列为：
M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R：AACAGCTATGACCATG；
(iv)阳性对照品和阴性对照品。
有益效果：本发明设计了扩增DMD A827T、DMD A5741T和DMD 6436 insC 的引物。采用PCR技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。本发明利用测序技术检测患者DMD A827T、DMD A5741T和DMD 6436 insC突变热点的方法，可以将DMD基因DMD A827T、DMD A5741T和DMD 6436 insC的突变检测出来，相比较荧光定量PCR法降低了检测的成本和难度。荧光定量PCR法要针对不同的突变类型设计3个探针，成本高，检测难度大。
附图说明
图1为3对扩增引物的琼脂糖凝胶电泳图，M为Marker DL 2000，1和2为血液样本1和样本2，经3对引物扩增后，引物扩增有效，且目的条带清晰，产物大小正确。
图2为样本2检测DMD A827T位点的阳性测序截图结果。
图3为样本2检测DMD A5741T位点的阳性测序截图结果。
图4为样本2检测DMD 6436 insC位点的阳性测序截图结果。
具体实施方式
实施例1
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
一种检测DMD A827T、DMD A5741T和DMD 6436 insC位点突变的引物，该引物的设计是针对DMD A827T、DMD A5741T和DMD 6436 insC突变位点所设计的特异性扩增引物，包括：
扩增DMD基因第827位、5741位和6436位碱基的引物，其碱基序列为：
DMD A827T-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATGTTCTGTTTTCTACCATGTTG
DMD A827T-R：AACAGCTATGACCATGTCAATAACAAAGCAGAATCACAT
DMD A5741T-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTAGCTTCCTATACATGGGTC
DMD A5741T-R：AACAGCTATGACCATGTTTACCAGAAAACACATCACA
DMD6436insC-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTTTGTATTTCTTTCTTTGCCAG
DMD6436insC-R：AACAGCTATGACCATGTTCTTTAATGTTAGTGCCTTTCA
一种检测DMD A827T、DMD A5741T和DMD 6436 insC位点突变的试剂盒，包括
(i)血液/组织DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR反应液；
(iii)测序体系试剂；
(iv)阳性对照品和阴性对照品。
其中，血液/组织DNA抽提试剂可购自天根DNA抽提试剂盒等商品化试剂。
检测体系PCR扩增反应液包括：2×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNAPolymerase(1U/μl)；DMD A827T、DMD A5741T和DMD 6436 insC位点上、下游引物(10μM)。
测序体系试剂包括：测序纯化液(ExoI:0.6U，CIP:1.2U)、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物：检测DMD A827 T、DMD A5741T和DMD6436 insC的上、下游引物(3.2μm)。
实施例2
血液/细胞/组织基因组DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：
(1)抽提血液中的组织DNA：1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12,000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。2)加入20μl 蛋白酶K溶液，混匀。3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。 5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12， 000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。8)向吸附柱CB3中加入500 μl漂洗液PW，12，000rpm离心30秒，倒掉废液。9)将吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12， 000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份18μl 分装：
X＝18μl反应液×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)
n为检测标本数。
(3)加样：加入检测体系PCR反应液中2μl DNA；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。
(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件如下：
PCR扩增体系试剂配制方法如下：
其中，引物序列为：
注：F为上游引物，R为下游引物
(5)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，110V，35min，凝胶成像系统观察。
如图1所示，即为2例血液样本以相应的引物扩增后所得产物的电泳图谱。通过电泳图的分析表明本发明所述扩增有效，且条带清晰。
(6)Sanger测序：
取9PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：
将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：
测序反应程序：
沉淀环节：
向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15 μl无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50ml70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl CBL后进行变性5min，最后-20℃2min上测序仪(ABI3730)测序。
(7)结果判断：分别将测序结果与DMD(DMD Dp427m:004006.2)阴性参考序列进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
实施例3
取30例临床外周血样品，按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。每份样品加入检测体系PCR反应液中2μl。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。测序后发现DMDA827位点基因突变情况为样本1无突变，其余样本全部突变； DMD A5741位点样本全部突变；DMD A6436位点样本全部突变。样本1和样本2 的琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，阳性测序图如图2-图4所示。
序列表
<110> 杭州艾迪康医学检验中心有限公司
<120> 检测DMDA827T、DMDA5741T和DMD6436insC位点突变的引物
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtaaaacga cggccagtat gttctgtttt ctaccatgtt g 41
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aacagctatg accatgtcaa taacaaagca gaatcacat 39
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgtaaaacga cggccagttt agcttcctat acatgggtc 39
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aacagctatg accatgttta ccagaaaaca catcaca 37
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgtaaaacga cggccagttt ttgtatttct ttctttgcca g 41
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aacagctatg accatgttct ttaatgttag tgcctttca 39
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aacagctatg accatg 16
Claims (6)
1.检测DMD A827T、DMD A5741T和DMD 6436insC位点突变情况的引物，其特征在于，包括：
扩增DMD A827T、DMD A5741T和DMD 6436insC位点的引物，其碱基序列为：
DMD A827T-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATGTTCTGTTTTCTACCATGTTG
DMD A827T-R：AACAGCTATGACCATGTCAATAACAAAGCAGAATCACAT
DMD A5741T-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTAGCTTCCTATACATGGGTC
DMD A5741T-R：AACAGCTATGACCATGTTTACCAGAAAACACATCACA
DMD6436insC-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTTTGTATTTCTTTCTTTGCCAG
DMD6436insC-R：AACAGCTATGACCATGTTCTTTAATGTTAGTGCCTTTCA。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，还包括测序引物，其碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG。
3.如权利要求1所述的引物，其特征在于，引物序列DMD A827T-F和DMD A827T-R是扩增DMD基因第827位碱基的引物；引物序列DMD A5741T-F和DMD A5741T-R是扩增DMD基因第5741位碱基的引物；引物序列DMD 6436insC-F和DMD 6436insC-R是扩增DMD基因第6436位碱基的引物。
4.检测DMD A827T、DMD A5741T和DMD 6436insC位点突变情况的方法，包括以下步骤：
(1)抽提外周血或肌肉组织中的基因组DNA；
(2)用PCR扩增步骤1中提取的DNA；
(3)对步骤2中的扩增产物进行测序；
(4)对测序结果进行判断，确定DMD A827T、DMD A5741T和DMD 6436insC位点是否发生突变；
其中PCR扩增引物为：
DMD A827T-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATGTTCTGTTTTCTACCATGTTG
DMD A827T-R：AACAGCTATGACCATGTCAATAACAAAGCAGAATCACAT
DMD A5741T-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTAGCTTCCTATACATGGGTC
DMD A5741T-R：AACAGCTATGACCATGTTTACCAGAAAACACATCACA
DMD6436insC-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTTTGTATTTCTTTCTTTGCCAG
DMD6436insC-R：AACAGCTATGACCATGTTCTTTAATGTTAGTGCCTTTCA。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，测序引物碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG。
6.一种检测DMD A827T、DMD A5741T和DMD 6436insC位点突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(i)血液/组织DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR扩增反应液：包括扩增DMD A827T、DMD A5741T和DMD 6436insC位点的引物，其碱基序列为：
DMD A827T-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATGTTCTGTTTTCTACCATGTTG
DMD A827T-R：AACAGCTATGACCATGTCAATAACAAAGCAGAATCACAT
DMD A5741T-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTAGCTTCCTATACATGGGTC
DMD A5741T-R：AACAGCTATGACCATGTTTACCAGAAAACACATCACA
DMD6436insC-F：TGTAAAACGACGGCCAGTTTTTGTATTTCTTTCTTTGCCAG
DMD6436insC-R：AACAGCTATGACCATGTTCTTTAATGTTAGTGCCTTTCA；
(iii)测序体系试剂：包括测序引物，其碱基序列为：
M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R：AACAGCTATGACCATG；
(iv)阳性对照品和阴性对照品。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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