CN110846387A - 检测新生儿糖尿病相关基因ABCC8 c.1686C>CT位点突变的引物和方法 - Google Patents
检测新生儿糖尿病相关基因ABCC8 c.1686C>CT位点突变的引物和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了检测新生儿糖尿病相关基因ABCC8 c.1686C>CT碱基突变的引物，其特征在于，包括扩增ABCC8 c.1686C>CT位点的引物；采用Sanger测序技术，可用于快速检测新生儿糖尿病ABCC8 c.1686C>CT位点突变情况。利用本发明完成的检测结果准确，对ABCC8 c.1686C>CT的临床鉴别诊断有重要的参考意义。
Description
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测ABCC8位点突变的引物，采用普通PCR结合Sanger测序技术，可用于快速检测ABCC8患者体内ABCC8 位点的突变情况。
背景技术
ABCC8编码ATP敏感性K+(KATP)通道的SUR1亚基，KATP作为代谢传感器的功能的核心是其在胰腺β细胞摄取葡萄糖后细胞内ATP浓度增加的抑制作用，因此胰腺β细胞K-ATP通道对于控制释放胰岛素至关重要。ABCC8基因发生突变通过对基因表达，蛋白质合成，蛋白质成熟或膜运输的影响或通过削弱SUR1调节通道的能力导致质膜上K-ATP通道的丧失而引起先天性高胰岛素血症(CHI)。相反，功能获得性突变通过降低ATP抑制通道活性(在Kir6.2) 或增强Mg-核苷酸刺激通道活性的能力(在SUR1)则可以引起新生儿糖尿病(NDM)。隐性遗传的K-ATP通道突变在先天性高胰岛素血症患者中最常见，而显性突变是新生儿糖尿病的最常见的原因。因为ABCC8基因突变患者的临床表现较为多样，甚至同一个家系的突变患者临床表现都不相同。因此在确诊 ABCC8基因突变患者的家族成员中进行该基因的筛查是十分有必要的。编码 SUR1的ABCC8基因有39个外显子，到目前为止，ABCC8中已报道超过150 种突变，突变范围广，在不同外显子区域均有发生突变的记录。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测新生儿糖尿病相关基因ABCC8位点突变的引物，采用PCR技术，可用于快速检测ABCC8患者体内ABCC8位点的突变情况。
检测新生儿糖尿病相关基因ABCC8 c.1686C>CT位点突变情况的引物，其特征在于，包括：扩增ABCC8 c.1686C>CT位点的引物，其碱基序列为：
ABCC8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAGCGTTTCCAGTGTGG
ABCC8-R：AACAGCTATGACCATGAAGCCTTGAGGCTGACACAG。
进一步地，所述引物还包括测序引物，其碱基序列为：
M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R：AACAGCTATGACCATG。
进一步地，所述引物序列ABCC8-F和ABCC8-R是扩增ABCC8基因第1686 位碱基的引物。
本发明还提供了检测ABCC8位点突变情况的方法，包括以下步骤：
(1)抽提外周血或肌肉组织中的基因组DNA；
(2)用PCR扩增步骤1中提取的DNA；
其中PCR扩增引物为：
ABCC8-F TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAGCGTTTCCAGTGTGG
ABCC8-R AACAGCTATGACCATGAAGCCTTGAGGCTGACACAG；
(3)对步骤2中的扩增产物进行测序；
测序引物碱基序列为：
M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R：AACAGCTATGACCATG
(4)对测序结果进行判断，确定ABCC8位点是否发生突变。
本发明还提供了一种检测新生儿糖尿病相关基因ABCC8 c.1686C>CT位点突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(i)血液/组织DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR扩增反应液：包括扩增ABCC8位点的引物，其碱基序列为：
ABCC8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAGCGTTTCCAGTGTGG
ABCC8-R：AACAGCTATGACCATGAAGCCTTGAGGCTGACACAG；
(iii)测序体系试剂：包括测序引物，其碱基序列为：
M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R：AACAGCTATGACCATG；
(iv)阳性对照品和阴性对照品。
有益效果：本发明设计了扩增ABCC8的引物。采用PCR技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。本发明利用测序技术检测患者ABCC8突变热点的方法，可以将ABCC8基因ABCC8的突变检测出来，相比较荧光定量PCR法降低了检测的成本和难度。荧光定量PCR法要针对不同的突变类型设计不同探针，成本高，检测难度大。
附图说明
图1为扩增引物的琼脂糖凝胶电泳图，M为Marker DL 2000，1-20为血液样本1-20，经引物扩增有效，且目的条带清晰，产物大小正确。
图2为样本2检测ABCC8 c.1686C>CT位点的阳性测序截图结果。
具体实施方式
实施例1
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
检测ABCC8位点突变的引物，该引物的设计是针对ABCC8突变位点所设计的特异性扩增引物，包括：
ABCC8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAGCGTTTCCAGTGTGG
ABCC8-R：AACAGCTATGACCATGAAGCCTTGAGGCTGACACAG。
一种检测ABCC8位点突变的试剂盒，包括
(i)血液/组织DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR扩增反应液；包括扩增引物ABCC8-F和ABCC8–R；
(iii)测序体系试剂；包括测序因为M13 F和M13 R。
(iv)阳性对照品和阴性对照品。
其中，血液/组织DNA抽提试剂可购自天根DNA抽提试剂盒等商品化试剂。
检测体系PCR扩增反应液包括：2×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNAPolymerase(1U/μl)；ABCC8位点上、下游引物(10μM)。
测序体系试剂包括：测序纯化液(ExoI:0.6U，CIP:1.2U)、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物：检测ABCC8的上、下游引物(3.2μm)。
实施例2
血液/细胞/组织基因组DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：
(1)抽提血液中的组织DNA：1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12，000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。2)加入20μl 蛋白酶K溶液，混匀。3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。 5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12， 000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。8)向吸附柱CB3中加入500 μl漂洗液PW，12，000rpm离心30秒，倒掉废液。9)将吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12， 000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份18μl 分装：
X＝18μl反应液×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)
n为检测标本数。
(3)加样：加入检测体系PCR反应液中2μl DNA；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。
(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件如下：
PCR扩增体系试剂配制方法如下：
其中，引物序列为：
注：F为上游引物，R为下游引物
(5)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，110V，35min，凝胶成像系统观察。
如图1所示，即为2例血液样本以相应的引物扩增后所得产物的电泳图谱。通过电泳图的分析表明本发明所述扩增有效，且条带清晰。
(6)Sanger测序：
取9 PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：
将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：
测序反应程序：
沉淀环节：
向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15 μl无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50ml70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl CBL后进行变性5min，最后-20℃2min上测序仪(ABI3730)测序。 (7)结果判断：分别将测序结果与ABCC8(NG_008867)阴性参考序列进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
实施例3
取20例临床外周血样品，按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。每份样品加入检测体系PCR反应液中2μl。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。测序后发现ABCC8c.1686位点基因突变情况为样本3、6、8、12、15、16、18、 19无突变，其余样本全部突变；样本1-20的突变情况见下表，琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，阳性测序图如图2所示。
| c.1686C>CT | |
| 1 | + |
| 2 | + |
| 3 | - |
| 4 | + |
| 5 | + |
| 6 | - |
| 7 | + |
| 8 | - |
| 9 | + |
| 10 | + |
| 11 | + |
| 12 | - |
| 13 | + |
| 14 | + |
| 15 | - |
| 16 | - |
| 17 | + |
| 18 | - |
| 19 | - |
| 20 | + |
| 本次检测突变率 | 60％ |
| 文献报道突变率 | 45.87％ |
注：+表示阳性突变，-表示阴性突变。
序列表
<110> 北京艾迪康医学检验实验室有限公司
<120> 检测新生儿糖尿病相关基因ABCC8 c.1686C>CT位点突变的引物和方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtaaaacga cggccagtct gagcgtttcc agtgtgg 37
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aacagctatg accatgaagc cttgaggctg acacag 36
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aacagctatg accatg 16
Claims (5)
1.检测新生儿糖尿病相关基因ABCC8 c.1686C>CT位点突变情况的引物，其特征在于，包括：扩增ABCC8 c.1686C>CT位点的引物，其碱基序列为：
ABCC8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAGCGTTTCCAGTGTGG
ABCC8-R：AACAGCTATGACCATGAAGCCTTGAGGCTGACACAG。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物还包括测序引物，其碱基序列为：
M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R：AACAGCTATGACCATG。
3.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物序列ABCC8 -F 和ABCC8 -R是扩增ABCC8基因的第1686位碱基的引物。
4.检测新生儿糖尿病相关基因ABCC8 c.1686C>CT位点突变情况的方法，包括以下步骤：
（1）抽提外周血或肌肉组织中的基因组DNA；
（2）用PCR扩增步骤1中提取的DNA；
其中PCR扩增引物为：
ABCC8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAGCGTTTCCAGTGTGG
ABCC8-R：AACAGCTATGACCATGAAGCCTTGAGGCTGACACAG；
（3）对步骤2中的扩增产物进行测序；
其中测序引物碱基序列为：
M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R：AACAGCTATGACCATG；
（4）对测序结果进行判断，确定ABCC8位点是否发生突变。
5.一种检测新生儿糖尿病相关基因ABCC8 c.1686C>CT位点突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(i) 血液/组织DNA抽提试剂；
(ii) 检测体系PCR扩增反应液：包括扩增ABCC8 c.1686C>CT位点的引物，其碱基序列为：
ABCC8-F：TGTAAAACGACGGCCAGTCTGAGCGTTTCCAGTGTGG
ABCC8-R：AACAGCTATGACCATGAAGCCTTGAGGCTGACACAG；
(iii) 测序体系试剂：包括测序引物，其碱基序列为：
M13 F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 R：AACAGCTATGACCATG；
(iv) 阳性对照品和阴性对照品。
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|---|---|
| CN (1) | CN110846387A (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102912002A (zh) * | 2011-08-02 | 2013-02-06 | 广州益善生物技术有限公司 | 一种abcc2基因多态性检测特异性引物和液相芯片 |
| CN105316401A (zh) * | 2015-01-23 | 2016-02-10 | 复旦大学附属华山医院 | 一种测定人abcc2基因多态性的方法 |
| CN105463086A (zh) * | 2015-12-11 | 2016-04-06 | 上海新培晶医学检验所有限公司 | 一种检测Dubin-Johnson综合症的ABCC2基因的试剂盒及其检测方法 |
| CN109402234A (zh) * | 2018-11-23 | 2019-03-01 | 杭州艾迪康医学检验中心有限公司 | 检测DMD A827T、DMD A5741T和DMD 6436 insC位点突变的引物和方法 |
| CN109576363A (zh) * | 2019-02-11 | 2019-04-05 | 中日友好医院 | 一种人abcc2基因多态性检测的引物设计方法及试剂盒 |
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102912002A (zh) * | 2011-08-02 | 2013-02-06 | 广州益善生物技术有限公司 | 一种abcc2基因多态性检测特异性引物和液相芯片 |
| CN105316401A (zh) * | 2015-01-23 | 2016-02-10 | 复旦大学附属华山医院 | 一种测定人abcc2基因多态性的方法 |
| CN105463086A (zh) * | 2015-12-11 | 2016-04-06 | 上海新培晶医学检验所有限公司 | 一种检测Dubin-Johnson综合症的ABCC2基因的试剂盒及其检测方法 |
| CN109402234A (zh) * | 2018-11-23 | 2019-03-01 | 杭州艾迪康医学检验中心有限公司 | 检测DMD A827T、DMD A5741T和DMD 6436 insC位点突变的引物和方法 |
| CN109576363A (zh) * | 2019-02-11 | 2019-04-05 | 中日友好医院 | 一种人abcc2基因多态性检测的引物设计方法及试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| RUCHIRA M JHA ET AL.: "ABCC8 Single Nucleotide Polymorphisms are Associated with Cerebral Edema in Severe TBI.", 《NEUROCRIT CARE.》 * |
| ZI‐CHUAN FAN ET AL.: "Uncovering the molecular pathogenesis of congenital hyperinsulinism by panel gene sequencing in 32 Chinese patients.", 《MOLECULAR GENETICS & GENOMIC MEDICINE.》 * |
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