CN109576363A

CN109576363A - 一种人abcc2基因多态性检测的引物设计方法及试剂盒

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Publication number: CN109576363A
Application number: CN201910110953.6A
Authority: CN
Inventors: 陈利达; 马亮; 曹永彤; 李金明; 刘倩; 杨辉; 刘媛媛; 芦宏凯; 姜蕾; 王璐璐
Original assignee: China Japan Friendship Hospital
Current assignee: China Japan Friendship Hospital
Priority date: 2019-02-11
Filing date: 2019-02-11
Publication date: 2019-04-05
Anticipated expiration: 2039-02-11
Also published as: CN109576363B

Abstract

本发明公开了一种人ABCC2基因多态性检测的引物设计方法及试剂盒，属于临床检验学和分子生物学技术领域。一种基因多态性检测的引物设计方法，满足下述条件：(1)使基因多态性位点位于中间位置，以包括该位点的前后共400bp长度的基因序列设计上下游引物；(2)在PCR反应体系中，引物终浓度为1～3μM；(3)每个产物的总长度≤160bp；(4)退火温度Tm为58～62℃；(5)对合成的引物序列进行HPLC纯化；(6)体系中Mg²⁺的终浓度为2.0～2.5mM。本发明优点是：引物设计方法避免了高分辨熔解曲线技术检测基因多态性的干扰；ABCC2基因试剂盒扩增同时直接分型，高通量，速度快，准确性、特异性高，可用于寻找个体化差异的新靶点，为临床个体化用药决策提供依据。

Description

一种人ABCC2基因多态性检测的引物设计方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种人ABCC2基因多态性检测的引物设计方法及试剂盒，尤指一种利用HRM技术检测人ABCC2基因多态性的引物设计方法和以此方法建立的人ABCC2基因多态性检测试剂盒，属于临床检验学和分子生物学技术领域。

背景技术

精准医学的时代已经来临。基因多态性对不同患者药物的反应性有很大影响，人们发现越来越多的药物需要在基因的指导下进行，因而基因检测对个体化治疗有重要意义。

ABCC2为多药耐药相关蛋白2(multidrug resistance protein 2，MRP2)的编码基因，位于染色体10q24区，基因长度约45kbp，包含32个外显子。肝细胞中MRP2膜蛋白参与肝脏能量代谢、内外源毒性物质的转运、通过蛋白激酶C信号通路调节肝脏细胞的凋亡等，保护机体和肝细胞免受毒性物质伤害。

ABCC2的基因多态性对药物和各种具有潜在危害物质的吸收和代谢至关重要，也直接影响个体化治疗的决策和用药。-24C＞T(rs717620)、1249G＞A(rs2273697)以及3972C＞T(rs3740066)是亚洲人最常见的三个SNPs位点。其中-24C＞T能够降低ABCC2蛋白的表达，与各种药物(如甲氨蝶呤、辛伐他汀、抗癫痫药、双氯芬酸、替米沙坦等)的药代动力学特性的改变相关。本发明相关研究也有指出，-24C＞T位点多态性与心肌梗死PCI术后患者氯吡格雷抗血小板治疗的反应性有明显相关性，该位点的CC野生型患者与CT型杂合突变和TT型纯合突变患者相比，对氯吡格雷的反应性(ADP％)反而更差，差异具有统计学意义(P＜0.0001)，ABCC2-24C＞T有望成为氯吡格雷个体化用药前检测的新靶点。1249G＞A的基因多态性改变了MRP2转运蛋白的ATP酶活性，从而影响了多靶向抗肿瘤药物索拉菲尼的外排转运。3972C＞T可能增加携带此突变的人罹患阿尔茨海默症的风险，逻辑回归分析结果认为携带ABCC2 3972C＞T与阿尔茨海默症的风险呈正相关，针对此突变设计药物进行预防干预或治疗可能是未来药物预防治疗癌症的一个方向。综上所述，检测ABCC2基因多态性对临床个体化治疗和用药有重要意义。

传统基因多态性检测方法虽然可以进行基因分型，但有诸多不足之处。如：1)直接测序法，虽然是金标准，但测序周期长，还需要复杂的后续分析。2)基因芯片法，虽然通量高，但需要已知靶探针的杂交，芯片要求高，仪器成本高，无法检测未知突变。3)实时荧光PCR，其中SYBR不饱和染料法的熔解曲线无法分辨单一位点突变；Taqman探针法需要需要特殊的荧光探针、成本高、设备要求高。4)单链构象多态性、变性高效液相色谱、变性梯度凝胶电泳等，操作繁杂，自动化程度低，效率低。

是否有一种方法，能够克服以上大部分问题？高分辨率熔解曲线分析(highresolution melting analysis，HRM)方法。HRM是在PCR反应前，加入一种饱和荧光染料，单核苷酸多态性(SNP)位点因不匹配会使双链DNA在升温过程中先解开，饱和荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，不同SNP位点、杂合子与纯合子等就会产生不同的熔解曲线的峰形，从而将不同SNP位点与不同基因型有效地区分开。

HRM与以上传统的检测基因多态性的方法相比，具有很多优势，比如：操作简便、无需序列特异性探针、PCR产物无需后处理(如酶切、电泳等)、无需测序、也不受突变碱基位点与类型的局限。在仪器上直接通过高分辨率熔解曲线分析，即可完成对样品基因型的判断。简化了操作时间和步骤，大大降低了使用成本。全程闭管操作，避免交叉污染。不消耗PCR产物，不损伤DNA，HRM分析之后可以直接用于其他分子生物学实验。快速、高通量，可快速完成整板样品(96/384)检测。灵敏度高、特异性好、重复性好。应用范围广，如SNP筛查、HLA配型、等位基因频率分析、物种鉴定、甲基化研究、法医学鉴定等。

HRM具有的优势可以克服传统基因多态性检测方法的诸多不足，但HRM本身有一个缺点，就是对引物设计的要求高。如果用普通的引物设计方法，可能会导致HRM不同基因型区分不佳，或引物二聚体影响分型结果。因此急需一种新的引物设计策略。

发明内容

本发明在基因多态性检测中，利用了HRM技术，且提出一种新的检测基因多态性的引物设计策略。使得本发明的基因多态性的检测方法既具有快速、简便、准确、高通量、低成本的优点，又克服了现有HRM常规引物设计的缺陷。并依据此策略开发了一种ABCC2基因多态性检测试剂盒，通过检测患者的ABCC2基因多态性，快速、准确地为临床个体化治疗和用药提供支持。

本发明要解决的第一个技术问题是：建立一种利用HRM技术检测基因多态性的新的引物设计方法及其应用。

本发明要解决的第二个技术问题是：提供一组检测人ABCC2基因的-24、1249、3972位点基因突变的核苷酸序列及其应用。

本发明要解决的第三个技术问题是：提供一种人ABCC2基因突变HRM-PCR检测试剂盒，及该试剂盒的应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

首先，本发明提供一种基因多态性检测的引物设计方法，同时满足下述条件：

(1)使基因多态性位点位于中间位置，以包括该位点的前后共400bp长度的基因序列设计上下游引物；

(2)在PCR反应体系中，引物终浓度为1～3μM；引物设计可使用primer 5.0软件，引物浓度不能过高，以防干扰结果；

(3)每个产物的总长度≤160bp；因为产物短，一个碱基的变化对解链温度的影响就更大，使敏感性提高。

(4)退火温度Tm为58～62℃；

(5)对合成的引物序列进行HPLC纯化；

(6)体系中Mg²⁺的终浓度为2.0～2.5mM。Mg²⁺的浓度对引物和扩增有很大影响，浓度不能过高。

在本发明以人ABCC2基因为例说明上述方法的如何应用与设计检测基因多态性位点的基因型的核苷酸序列和试剂盒。以上方法的6个条件适合于人ABCC2基因以外的基因多态性检测中基因。

本发明中，所述基因为人ABCC2基因。ABCC2的基因多态性对药物和各种具有潜在危害物质的吸收和代谢至关重要，也直接影响个体化治疗的决策和用药。

所述位点为人ABCC2基因的-24、1249、3972位点。-24C＞T(rs717620)、1249G＞A(rs2273697)以及3972C＞T(rs3740066)是亚洲人最常见的三个SNPs位点。其中-24C＞T能够降低ABCC2蛋白的表达，与各种药物(如甲氨蝶呤、辛伐他汀、抗癫痫药、双氯芬酸、替米沙坦等)的药代动力学特性的改变相关。

第二方面，本发明提供一组检测人ABCC2基因的-24、1249、3972位点基因突变的序列，由检测-24C＞T位点、1249G＞A位点和3972C＞T位点的引物序列和检测-24C＞T位点、1249G＞A位点和3972C＞T位点的阳性序列组成，其中引物序列为序列表SEQ ID No：1～SEQID No：6所示的核苷酸序列；阳性序列为序列表SEQ ID No：7～SEQ ID No：12所示的核苷酸序列及其中特定的核苷酸序列两两混合组成的混合核苷酸序列。

所述检测-24C＞T位点的引物序列为序列表SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示核苷酸序列；检测-24C＞T位点的阳性序列包括野生型CC阳性序列、纯合突变型TT阳性序列和杂合突变型CT阳性序列，野生型CC阳性序列为SEQ ID No：7所示的核苷酸序列，纯合突变型TT阳性序列为序列表SEQ ID No：8所示的核苷酸序列；杂合突变型CT阳性序列为序列表SEQID No：7所示的核苷酸序列与序列表SEQ ID No：8所示的核苷酸序列以1∶1等体积比(体积比100μL∶100μL)混合得到的混合物。

所述检测1249G＞A位点的引物序列为序列表SEQ ID No：3和SEQ ID No：4所示核苷酸序列；检测1249G＞A位点的阳性序列包括野生型GG阳性序列、纯合突变型AA阳性序列和杂合突变型GA阳性序列，野生型GG阳性序列为SEQ ID No：9所示的核苷酸序列，纯合突变型AA阳性序列为序列表SEQ ID No：10所示的核苷酸序列；杂合突变型GA阳性序列为序列表SEQ ID No：9所示的核苷酸序列与序列表SEQ ID No：10所示的核苷酸序列以1∶1等体积比(体积比100μL∶100μL)混合得到的混合物。

所述检测3972C＞T位点的引物序列为序列表SEQ ID No：5和SEQ ID No：6所示核苷酸序列；检测3972C＞T位点的阳性序列包括野生型CC阳性序列、纯合突变型TT阳性序列和杂合突变型CT阳性序列，野生型CC阳性序列为SEQ ID No：11所示的核苷酸序列，纯合突变型TT阳性序列为序列表SEQ ID No：12所示的核苷酸序列；杂合突变型CT阳性序列为序列表SEQ ID No：11所示的核苷酸序列与序列表SEQ ID No：12所示的核苷酸序列以1∶1等体积比(体积比100μL∶100μL)混合得到的混合物。

第三方面，本发明提供一种人ABCC2基因突变HRM-PCR检测试剂盒，由以下试剂组成：

(1)人ABCC2 DNA提取试剂，该试剂为现有技术；

(2)HRM检测试剂，每种试剂分别分装；

1)HRM-PCR主反应混合液(FastStart Taq DNA Polymerase，PCR buffer，dNTPmix，High Resolution Melting Dye)，1mL；

2)MgCl₂ 25mM，500μL；

3)-24位点正向引物，为序列表SEQ IDNo：1所示核苷酸序列，100μM，50μL；

4)-24位点反向引物，为序列表SEQ ID No：2所示核苷酸序列，100μM，50μL；

5)1249位点正向引物，为序列表SEQ ID No：3所示核苷酸序列，100μM，50μL；

6)1249位点反向引物，为序列表SEQ ID No：4所示核苷酸序列，100μM，50μL；

7)3972位点正向引物，为序列表SEQ ID No：5所示核苷酸序列，100μM，50μL；

8)3972位点反向引物，为序列表SEQ ID No：6所示核苷酸序列，100μM，50μL；

(3)对照品

1)阴性对照：RNase free water；

2)-24C＞T位点阳性对照：每种对照品分别分装；

野生型CC：含有人ABCC2-24野生型CC位点的体外合成DNA序列，为序列表SEQ IDNo：7所示核苷酸序列，10ng/μL，200μL；

纯合突变型TT：含有人ABCC2-24纯合突变型TT位点的体外合成DNA序列，为序列表SEQ ID No：8所示核苷酸序列，10ng/μL，200μL；

杂合突变型CT：野生型和纯合突变型等比例混合的体外合成DNA序列，为序列表SEQ ID No：7和SEQ ID No：8所示核苷酸序列混合物，10ng/μL，200μL；

3)1249G＞A位点阳性对照：每种对照品分别分装；

野生型GG：含有人ABCC2 1249野生型GG位点的体外合成DNA序列，为序列表SEQ IDNo：9所示核苷酸序列，10ng/μL，200μL；

纯合突变型AA：含有人ABCC2 1249纯合突变型AA位点的体外合成DNA序列，为序列表SEQ ID No：10所示核苷酸序列，10ng/μL，200μL；

杂合突变型GA：野生型和纯合突变型等比例混合的体外合成DNA序列，为序列表SEQ ID No：9和SEQ ID No：10所示核苷酸序列混合物，10ng/μL，200μL；

4)3972C＞T位点阳性对照：每种对照品分别分装；

野生型CC：含有人ABCC2 3972位点野生型的体外合成DNA序列，为序列表SEQ IDNo：11所示核苷酸序列，10ng/μL，200μL；

纯合突变型TT：含有人ABCC2 3972位点纯合突变型的体外合成DNA序列，为序列表SEQ ID No：12所示核苷酸序列，10ng/μL，200μL；

杂合突变型CT：野生型和纯合突变型等比例混合的体外合成DNA序列，为序列表SEQ ID No：11和SEQ ID No：12所示核苷酸序列混合物，10ng/μL，200μL；

上述人ABCC2基因突变HRM-PCR检测试剂盒中(1)人ABCC2基因DNA提取试剂由以下试剂组成，该试剂为现有技术，可以但不限于购于天根生化科技(北京)有限公司的DP318-02血液基因组DNA提取试剂盒：

1)裂解液：含异硫氰酸胍的溶液(购于天根DP318-02血液基因组DNA提取试剂盒)；

2)去蛋白液：含有异丙醇的溶液，(购于天根DP318-02血液基因组DNA提取试剂盒)；

3)蛋白酶K：40unit/mg，100mg(Solarbio，购于北京索莱宝科技有限公司)；

4)漂洗液：体积百分比浓度为75％的乙醇溶液200mL；

5)洗脱液：去离子水，200mL；

6)吸附柱：天根DP318-02血液基因组DNA提取试剂盒中的吸附柱CB3。

本发明所涉及的一种基因多态性检测的引物设计方法、一组检测人ABCC2基因的-24、1249、3972位点基因突变的序列、一种人ABCC2基因突变HRM-PCR检测试剂盒具有广泛的应用，包括并不限于如下应用：

(1)在人类基因多态性位点检测基因分型中的应用；

(2)在人类ABCC2基因-24C＞T、1249G＞A、3972C＞T位点的基因分型中的应用；

(3)在药物与基因多态性位点分型相关性的研究中的应用；

(4)在药物与人ABCC2基因多态性位点基因型相关性研究中的应用；所述药物包括但不限于甲氨蝶呤、辛伐他汀、抗癫痫药、双氯芬酸、替米沙坦、氯吡格雷、索拉菲尼；

(5)在患者对药物的个体化差异性与人ABCC2基因多态性有关时，ABCC2基因多态性检测的应用。所述药物包括但不限于甲氨蝶呤、辛伐他汀、抗癫痫药、双氯芬酸、替米沙坦、氯吡格雷、索拉菲尼。

目前人们对氯吡格雷抗血小板治疗的个体化差异研究最多的是CYP2C19基因多态性，而通过此途径加以利用的氯吡格雷仅占总量的15％，而85％是通过ATP结合盒亚家族C(ATP-Binding Cassette，Subfamily C，ABCC)的外排泵途径排出体外，其中ABCC2是该家族的关键成员，而目前国内外鲜有人将ABCC2的基因多态性对氯吡格雷的个体化差异的影响展开研究。事实证明，CYP2C19并不能解释所有氯吡格雷个体化差异的现象。本发明前期实验发现，100例同是CYP2C19*1/*1型的心肌梗死患者，PCI术后服用氯吡格雷，氯吡格雷的反应性仍然有个体差异。而用本试剂盒检测出ABCC2-24、3972、1249多态性中，发现-24C＞T位点多态性与心肌梗死PCI术后患者氯吡格雷抗血小板治疗的反应性有明显相关性，该位点的CC野生型患者与CT型杂合突变和TT型纯合突变患者相比，对氯吡格雷的反应性(ADP％)反而更差，差异具有统计学意义(P＜0.0001)。ABCC2基因多态性对氯吡格雷反应性的个体化差异的影响在国内外鲜有报道，是CYP2C19之外的全新思路，ABCC2的基因多态性有望成为反映氯吡格雷个体化差异的新靶点。

应用ABCC2基因多态性试剂盒检测氯吡格雷反应性的个体化差异，不局限于脑梗死、心肌梗死PCI术后患者，还可应用于所有应用氯吡格雷抗血小板治疗的患者。

ABCC2的基因多态性检测试剂盒，不局限于氯吡格雷个体化差异的基因检测，可用于其他受ABCC2基因多态性影响的药物的个体化差异的基因检测。

本发明试剂盒的简要检测程序为：

(1)提取患者全血DNA；

(2)配制HRM-PCR主反应混合液(内含饱和染料，作为ABCC2多态性分型工具)；

(3)分别加入正向、反向引物；

(4)设定程序并扩增；

(5)得到结果和结果分析。

本发明的优点如下：

(1)建立了一种新的引物设计策略，克服了常规引物设计方法对高分辨熔解曲线技术检测基因多态性带来的干扰。该方法可以推广到ABCC2以外的引物设计中。

(2)本试剂盒操作简单，扩增同时直接分型，无需后续电泳或测序步骤，全程闭管操作，避免污染，高通量，速度快，准确性、特异性高，更经济。

(3)建立了一个新的ABCC2基因多态性检测试剂盒。且不拘泥与当今研究较热的药物利用途径的CYP2C19，而是在药物外排途径另辟蹊径，通过检测该途径关键基因ABCC2多态性，寻找影响氯吡格雷个体化差异的新靶点。也可以推广到患者由于ABCC2基因多态性导致对其他药物个体化差异的检测中，为临床个体化用药决策提供依据。

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行说明，以使公众更好地理解本发明内容及应用，并不以任何方式造成对本发明的限定。凡依照本发明公开内容所做的任何等同替换，均属本发明保护范围。

附图说明

图1A至图1C示出本试剂盒检测的ABCC2的-24C＞T，1249G＞A，3972C＞T位点的HRM分型熔解标准曲线图，本试剂盒HRM分型与测序结果100％吻合。说明本试剂盒成功建立且准确性高。

图2A至图2C示出临床大样本ABCC2的-24C＞T，1249G＞A，3972C＞T位点的HRM分型熔解差异曲线图，说明本试剂盒灵敏度、特异性、重复性好，可用于临床样本的检测。

图3A至图3C示出本试剂盒在临床个体化治疗和用药中的应用。100例同为CYP2C19*1/*1型的PCI术后患者对氯吡格雷反应性仍然存在个体化差异，而本试剂盒检测的100例上述患者的ABCC2基因多态性很好地解释了这种个体化差异，ABCC2有望成为指导氯吡格雷个体化用药的新靶点。

具体实施方式

以下为实施例中的主要材料和试剂：

去蛋白液，天根生化，中国；

蛋白酶K，Solarbio，美国；

漂洗液，国药集团，中国；

去离子水，康为世纪，中国；

DNA吸附柱，天根生化，中国；

HRM-PCR主反应混合液，Roche，德国；

FastStart Taq DNA Polymerase，Roche，德国；

PCR buffer，Roche，德国；

dNTP mix，Roche，德国；

High Resolution Melting Dye，Roche，德国；

Template DNA，从患者全血标本中提取的DNA；

上、下游引物(序列表SEQ ID No：1～SEQ ID No：12)均委托北京擎科新业生物技术有限公司合成，且上、下游引物均经过高效液相色谱纯化。

阳性对照委托北京擎科新业生物技术有限公司合成。

引物合成仪：Dr.Oligo192，Biolytic，美国。

高效液相色谱仪：1220Infinity LC，Agilent，美国。

实施例1.合成人ABCC2基因多态性检测的引物

使用primer 5.0软件，以人ABCC2基因的-24C＞T、1249G＞A、3972C＞T位点为检测位点，按照如下设计方法设计上下游引物序列，同时满足以下6个原则：

(2)在PCR反应体系中，引物终浓度为1～3μM；

(3)每个产物的总长度≤160bp；

(4)退火温度Tm为58～62℃；

(5)对合成的引物序列进行HPLC纯化；

(6)体系中Mg²⁺的终浓度为2.0～2.5mM。

人ABCC2基因的-24C＞T、1249G＞A、3972C＞T位点的序列来源为NCBI公开的SNP序列，序列编号为rs717620、rs2273697和rs3740066。

设计得到如下序列，见表1。

表1：人ABCC2基因多态性检测的引物

委托北京擎科新业生物技术有限公司合成引物序列，并对上、下游引物进行高效液相色谱纯化。

委托合成的引物都要经过HPLC纯化，要求通过HPLC纯化，去除PCR抑制剂，增加引物纯度至＞90％。由于本发明中高分辨率熔解曲线技术(HRM)的灵敏度很高，为避免PCR抑制剂对反应造成影响，需要使用高纯度的引物。HPLC纯化级别的引物，引物可以达到很高的纯度和灵敏度，特别适合于HRM技术。

实施例2.合成人ABCC2基因多态性检测的阳性对照序列

设计人ABCC2基因多态性检测的阳性对照序列。阳性序列是按照野生型、突变型的基因序列使用DNA序列合成仪直接合成。委托北京擎科新业生物技术有限公司合成阳性对照序列，见表2

表2：人ABCC2基因多态性检测的阳性对照，下划线碱基为突变位点

实施例3.检测ABCC2基因多态性的试剂盒

利用本发明的引物设计方法，利用HRM技术，制备检测ABCC2基因多态性的试剂盒

一、试剂盒的组成

1.患者全血ABCC2基因DNA提取试剂，包括单独分装的如下试剂：

1)裂解液：含异硫氰酸胍的溶液(天根DP318-02血液基因组DNA提取试剂盒)；

2)去蛋白液：含有异丙醇的溶液(天根DP318-02血液基因组DNA提取试剂盒)；3)蛋白酶K，40unit/mg，100mg(Solarbio，购于北京索莱宝科技有限公司)；

4)漂洗液：体积百分比浓度为75％的乙醇溶液200mL；

5)洗脱液：去离子水200mL；

6)吸附柱：根DP318-02血液基因组DNA提取试剂盒中的吸附柱CB3。

2.HRM-PCR检测试剂，包括单独分装的如下试剂：

1)HRM-PCR主反应混合液1mL，下称Master Mix(FastStart Taq DNA Polymerase，

PCR buffer，dNTP mix，High Resolution Melting Dye)；

2)MgCl₂25mM，500μL；

3)-24正向引物Forward(-24-F)(序列表SEQ ID No：1)，100μM，50μL；

4)-24反向引物Reverse(-24-R)(序列表SEQ ID No：2)，100μM，50μL；

5)1249正向引物Forward(1249-F)(序列表SEQ ID No：3)，100μM，50μL；

6)1249反向引物Reverse(1249-R)(序列表SEQ ID No：4)，100μM，50μL；

7)3972正向引物Forward(3972-F)(序列表SEQ ID No：5)，100μM，50μL；

8)3972反向引物Reverse(3972-R)(序列表SEQ IDNo：6)，100μM，50μL；

3.对照品，包括单独分装的如下试剂：

1)阴性对照：RNase free water；

2)-24C＞T位点阳性对照，包括单独分装的如下试剂：

野生型CC：含有人ABCC2-24野生型CC位点的体外合成DNA序列，10ng/μL，200μL(序列表SEQ ID No：7)。

纯合突变型TT：含有人ABCC2-24纯合突变型TT位点的体外合成DNA序列，10ng/μL，200μL(序列表SEQ ID No：8)。

杂合突变型CT：野生型和纯合突变型以1∶1等体积比混合的体外合成DNA序列，10ng/μL，200μL(100μL序列表SEQ ID No.7阳性序列+100μL序列表SEQ ID No.8阳性序列)。

3)1249G＞A位点阳性对照，包括单独分装的如下试剂：

野生型GG：含有人ABCC2 1249野生型GG位点的体外合成DNA序列，10ng/μL，200μL(序列表SEQ ID No：9)。

纯合突变型AA：含有人ABCC2 1249纯合突变型AA位点的体外合成DNA序列，10ng/μL，200μL(序列表SEQ ID No：10)。

杂合突变型GA：野生型和纯合突变型以1∶1等体积比混合的体外合成DNA序列，10ng/μL，200μL(100μL序列表SEQ ID No：9阳性对照+100μL序列表SEQ ID No：10阳性对照)。

4)3972C＞T位点阳性对照，包括单独分装的如下试剂：

野生型CC：含有人ABCC2 3972位点野生型的体外合成DNA序列，10ng/μL，200μL(序列表SEQ ID No：11)。

纯合突变型TT：含有人ABCC2 3972位点纯合突变型的体外合成DNA序列，10ng/μL，200μL(序列表SEQ ID No：12)。

杂合突变型CT：野生型和纯合突变型以1∶1等体积比混合的体外合成DNA序列，10ng/μL，200μL(100μL序列表SEQ ID No：11阳性序列100μL+序列表SEQ ID No：

12阳性序列)。

二、人ABCC2基因多态性检测条件及方法

1.人全血DNA的提取

1)将200μL人EDTA抗凝全血与裂解液等体积颠倒混匀，10000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀；

2)加入20μL蛋白酶K充分颠倒混匀；

3)加入200μL去蛋白液，56℃放置10min，期间充分颠倒混匀数次，至溶液变清亮；

4)加入200μL无水乙醇，充分震荡混匀，此时可能出现絮状沉淀；

5)将4)中的溶液和絮状沉淀都加入DNA吸附柱中，吸附柱放入配套的收集管中，12000rpm离心30sec，倒掉收集管废液，吸附柱重新放入收集管中；

6)向吸附柱中加入600μL的漂洗液，12000rpm离心30sec，倒掉收集管废液，吸附柱重新放入收集管中；

7)12000rpm离心2min，倒掉收集管废液，吸附柱重新放入收集管中，将吸附柱敞开室温放置2min，以彻底晾干吸附材料中残余的乙醇；

8)将吸附柱转移到1.5mL离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加60μL洗脱液进行洗脱，室温放置2min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

2.HRM-PCR扩增体系，见表3。

表3

3.循环参数，见表4。

表4

4.结果获取和分析

480(Roche，德国)进行HRM-PCR后，用配套软件480SWUDF 2.0.0进行分析：Analysis-Gene Scanning一选中扩增的样品孔-在DifferencePlot界面看扩增曲线以及HRM基因分型结果。

上述ABCC2基因分型结果与测序结果一致。表明本发明提供的检测试剂盒用于人类ABCC2基因多态性检测结果可靠，与直接测序一致率达到100％，且本发明检测方法比传统测序方法操作简单快速，利于大规模推广。

参见图1A至图1C所示，本试剂盒检测的ABCC2的-24C＞T，1249G＞A，3972C＞T位点的HRM分型熔解标准曲线图。

实施例4：用上述试剂盒在临床上大样本量检测患者的ABCC2基因多态性

一、材料

1.实施例3所述试剂盒

2.全血：100例PCI术后服用氯吡格雷，且CYP2C19为*1/*1型的患者全血。遗传资源信息披露如下：患者来源为中日友好医院心脏科PCI术后住院患者。采血人：王璐璐，地址：朝阳区樱花东街2号中日友好医院，电话：84205488。

二、方法

1.全血的处理：静脉采集患者全血3ml于EDTA抗凝管(紫帽管)，采集后及时颠倒混匀。

2.样本DNA的提取：按实施例3中“人全血DNA的提取”操作。

3.提取的DNA进行扩增：按实施例3中“HRM-PCR扩增体系、循环参数、结果获取和分析”操作。

4.随机抽取患者的HRM-PCR产物进行测序验证。

三、结果

如图2A至图2C所示，临床大样本ABCC2的-24C＞T，1249G＞A，3972C＞T位点的HRM分型熔解差异曲线图，说明本试剂盒灵敏度、特异性、重复性好，可用于临床样本的检测。

实施例5：本试剂盒在指导临床氯吡格雷个体化治疗和用药中的应用

一、材料

1.实施例3所述试剂盒

二、方法

2.样本DNA的提取：按实施例3中“人全血DNA的提取”操作。

4.从医院检验之星系统提取此100位患者的对氯吡格雷的反应性(输血科用血栓弹力图的方法测的ADP％)的数据。

5.将此100位患者的ADP％与ABCC2-24、1249、3972各基因型进行统计学分析，比较各基因位点的野生型、杂合突变型、纯合突变型之间的ADP％是否有统计学差异。

三、结果

结果如图3A至图3C所示，本试剂盒(实施例3)在临床个体化治疗和用药中的应用。同为CYP2C19*1/*1型的PCI术后患者对氯吡格雷反应性仍然存在个体化差异，而本试剂盒检测的ABCC2基因的-24位点的多态性很好地解释了这种个体化差异(P＜0.0001)，ABCC2有望成为指导氯吡格雷个体化用药的新靶点。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本申请公开、附图和权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变型和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。

序列表

<110> 中日友好医院

<120> 一种人ABCC2基因多态性检测的引物设计方法及试剂盒

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agaacttctc cagcatgatt cc 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcctgttcca ctttctttga tga 23

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctttgtcca tgggtcctaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcatgtgcat gaagttggtc 20

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cactctgtcc aattgttgtt tga 23

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tccagtttaa caactaccaa gtgc 24

<210> 7

<211> 109

<212> DNA

<213> 人属，人种(Homo sapiens)

<400> 7

agaacttctc cagcatgatt cctggactgc gtctggaacc aagactcttc tattaatatg 60

attgtgttgt ttcttcttta cttgtttcat caaagaaagt ggaacagga 109

<210> 8

<211> 109

<212> DNA

<213> 人属，人种(Homo sapiens)

<400> 8

agaacttctc cagcatgatt cctggactgc gtctggaact aagactcttc tattaatatg 60

attgtgttgt ttcttcttta cttgtttcat caaagaaagt ggaacagga 109

<210> 9

<211> 151

<212> DNA

<213> 人属，人种(Homo sapiens)

<400> 9

gctttgtcca tgggtcctaa tttcaatcct tatctttagg cattgaccct atccaacttg 60

gccaggaagg agtacaccgt tggagaaaca gtgaacctga tgtctgtgga tgcccagaag 120

ctcatggatg tgaccaactt catgcacatg c 151

<210> 10

<211> 151

<212> DNA

<213> 人属，人种(Homo sapiens)

<400> 10

gctttgtcca tgggtcctaa tttcaatcct tatctttagg cattgaccct atccaacttg 60

gccaggaagg agtacaccat tggagaaaca gtgaacctga tgtctgtgga tgcccagaag 120

ctcatggatg tgaccaactt catgcacatg c 151

<210> 11

<211> 153

<212> DNA

<213> 人属，人种(Homo sapiens)

<400> 11

cactctgtcc aattgttgtt tgatcacaag gcctcccatc caggccttcc ttcactccac 60

ctaccttctc catgctaccc atgtcacaag tgatccctct gaggaccaga tccagctcag 120

gtcggtaccg cacttggtag ttgttaaact gga 153

<210> 12

<211> 153

<212> DNA

<213> 人属，人种(Homo sapiens)

<400> 12

cactctgtcc aattgttgtt tgatcacaag gcctcccatc caggccttcc ttcactccac 60

ctaccttctc catgctacct atgtcacaag tgatccctct gaggaccaga tccagctcag 120

gtcggtaccg cacttggtag ttgttaaact gga 153

Claims

1.一种基因多态性检测的引物设计方法，其特征在于同时满足下述条件：

(2)在PCR反应体系中，引物终浓度为1～3μM；

(3)每个产物的总长度≤160bp；

(4)退火温度Tm为58～62℃；

(5)对合成的引物序列进行HPLC纯化；

(6)体系中Mg²⁺的终浓度为2.0～2.5mM。

2.根据权利要求1所述的一种基因多态性检测的引物设计方法，其特征在于，所述基因为人ABCC2基因。

3.根据权利要求2所述的一种基因多态性检测的引物设计方法，其特征在于，所述位点为人ABCC2基因的-24、1249、3972位点。

4.一组检测人ABCC2基因的-24、1249、3972位点基因突变的序列，其特征在于：由检测-24C＞T位点、1249G＞A位点和3972C＞T位点的引物序列和检测-24C＞T位点、1249G＞A位点和3972C＞T位点的阳性序列组成，其中引物序列为序列表SEQ ID No：1～SEQ ID No：6所示的核苷酸序列；阳性序列为序列表SEQ ID No：7～SEQ ID No：12所示的核苷酸序列及其中特定的核苷酸序列两两混合组成的混合核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的一组检测人ABCC2基因的-24、1249、3972位点基因突变的序列，其特征在于：所述检测-24C＞T位点的引物序列为序列表SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示核苷酸序列；检测-24C＞T位点的阳性序列包括野生型CC阳性序列、纯合突变型TT阳性序列和杂合突变型CT阳性序列，野生型CC阳性序列为SEQ ID No：7所示的核苷酸序列，纯合突变型TT阳性序列为序列表SEQ ID No：8所示的核苷酸序列；杂合突变型CT阳性序列为序列表SEQ ID No：7所示的核苷酸序列与序列表SEQ ID No：8所示的核苷酸序列以1∶1等体积比混合得到的混合物。

6.根据权利要求4所述的一组检测人ABCC2基因的-24、1249、3972位点基因突变的序列，其特征在于：所述检测1249G＞A位点的引物序列为序列表SEQ ID No：3和SEQ ID No：4所示核苷酸序列；检测1249G＞A位点的阳性序列包括野生型GG阳性序列、纯合突变型AA阳性序列和杂合突变型GA阳性序列，野生型GG阳性序列为SEQ ID No：9所示的核苷酸序列，纯合突变型AA阳性序列为序列表SEQ ID No：10所示的核苷酸序列；杂合突变型GA阳性序列为序列表SEQ ID No：9所示的核苷酸序列与序列表SEQ ID No：10所示的核苷酸序列以1∶1等体积比混合得到的混合物。

7.根据权利要求4所述的一组检测人ABCC2基因的-24、1249、3972位点基因突变的序列，其特征在于：所述检测3972C＞T位点的引物序列为序列表SEQ ID No：5和SEQ ID No：6所示核苷酸序列；检测3972C＞T位点的阳性序列包括野生型CC阳性序列、纯合突变型TT阳性序列和杂合突变型CT阳性序列，野生型CC阳性序列为SEQ ID No：11所示的核苷酸序列，纯合突变型TT阳性序列为序列表SEQ ID No：12所示的核苷酸序列；杂合突变型CT阳性序列为序列表SEQ ID No：11所示的核苷酸序列与序列表SEQ ID No：12所示的核苷酸序列以1∶1等体积比混合得到的混合物。

8.一种人ABCC2基因突变HRM-PCR检测试剂盒，其特征在于由以下试剂组成

(1)人ABCC2基因DNA提取试剂；

(2)HRM检测试剂，每个试剂分别分装；

1)HRM-PCR主反应混合液(FastStart Taq DNA Polymerase，PCR buffer，dNTP mix，High Resolution Melting Dye)，1mL；

2)MgCl₂ 25mM，500μL；

3)-24位点正向引物，为序列表SEQ ID No：1所示核苷酸序列，100μM，50μL；

(3)对照品

1)阴性对照：RNase free water，1mL；

2)-24C＞T位点阳性对照，每种对照品分别分装；

野生型CC：含有人ABCC2-24野生型CC位点的体外合成DNA序列，为序列表SEQ ID No：7所示核苷酸序列，10ng/μL，200μL；

纯合突变型TT：含有人ABCC2-24纯合突变型TT位点的体外合成DNA序列，为序列表SEQID No：8所示核苷酸序列，10ng/μL，200μL；

杂合突变型CT：野生型和纯合突变型等比例混合的体外合成DNA序列，为序列表SEQ IDNo：7和SEQ ID No：8所示核苷酸序列混合物，10ng/μL，200μL；

3)1249G＞A位点阳性对照，每种对照品分别分装；

野生型GG：含有人ABCC21249野生型GG位点的体外合成DNA序列，为序列表SEQ ID No：9所示核苷酸序列，10ng/μL，200μL；

纯合突变型AA；含有人ABCC21249纯合突变型AA位点的体外合成DNA序列，为序列表SEQID No：10所示核苷酸序列，10ng/μL，200μL；

杂合突变型GA：野生型和纯合突变型等比例混合的体外合成DNA序列，为序列表SEQ IDNo：9和SEQ ID No：10所示核苷酸序列混合物，10ng/μL，200μL；

4)3972C＞T位点阳性对照，每种对照品分别分装；

野生型CC：含有人ABCC23972位点野生型的体外合成DNA序列，为序列表SEQ ID No：11所示核苷酸序列，10ng/μL，200μL；

纯合突变型TT：含有人ABCC23972位点纯合突变型的体外合成DNA序列，为序列表SEQID No：12所示核苷酸序列，10ng/μL，200μL；

杂合突变型CT：野生型和纯合突变型等比例混合的体外合成DNA序列，为序列表SEQ IDNo：11和SEQ ID No：12所示核苷酸序列混合物，10ng/μL，200μL。

9.根据权利要求1所述的一种人ABCC2基因突变HRM-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述(1)人ABCC2基因DNA提取试剂由以下试剂组成：

1)裂解液：含异硫氰酸胍的溶液；

2)去蛋白液：含有异丙醇的溶液；

3)蛋白酶K：40unit/mg，100mg；

4)漂洗液：体积百分比浓度为75％的乙醇溶液200mL；

5)洗脱液：去离子水200mL；

6)吸附柱。

10.权利要求1至3中任何一项所述的一种基因多态性检测的引物设计方法、或权利要求4至7中任何一项所述的一组检测人ABCC2基因的-24、1249、3972位点基因突变的序列、或权利要求8或9所述的一种人ABCC2基因突变HRM-PCR检测试剂盒的用途，其特征在于，所述用途为以下任意一种：

(1)在人类基因多态性位点检测基因分型中的应用；

(3)在药物与基因多态性位点分型相关性的研究中的应用；

(5)在患者对药物的个体化差异性与人ABCC2基因多态性有关时，ABCC2基因多态性检测的应用；所述药物包括但不限于甲氨蝶呤、辛伐他汀、抗癫痫药、双氯芬酸、替米沙坦、氯吡格雷、索拉菲尼。