CN107034287A

CN107034287A - 用于异烟肼个体化用药一次性检出NAT2常见SNPs的Sanger测序法

Info

Publication number: CN107034287A
Application number: CN201710361321.8A
Authority: CN
Inventors: 陈尧; 张伟; 肖坚; 赵青
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2017-05-22
Filing date: 2017-05-22
Publication date: 2017-08-11

Abstract

用于异烟肼个体化用药一次性检出NAT2常见功能SNPs的Sanger测序法：生物信息学分析；锚定并标记NAT2常见突变SNPs在待测分析序列上的位置；设计待测区域特异性引物；扩增引物特异性验证：对普通PCR反应体系参数进行确定，对普通PCR循环体系参数进行优化，并通过琼脂糖凝胶电泳进行结果检测；测序PCR反应，产物纯化，样品上机测序分析，结果判读分析，技术方法测试应用。

Description

用于异烟肼个体化用药一次性检出NAT2常见SNPs的 Sanger 测序法

技术领域

本发明属于异烟肼应用药理领域，特别涉及一种基于Sanger测序原理一次性检出NAT2影响抗结核药物异烟肼疗效及毒副作用常见功能突变位点的技术方法及配套的试剂。

背景技术

异烟肼(isoniazid，INH)又名雷米封(rimifon)。异烟肼对结核杆菌有高度选择性，抗菌力强，在试管中0.025～0.05mg/L的浓度即可抑菌，较高浓度对繁殖期细菌有杀菌作用。单用时结核杆菌易产生耐药性，但与其他抗结核药无交叉耐药性，如与其他抗结核病联用，则能延缓耐药性的发生并增强疗效。抗菌机制可能是抑制分枝菌酸 (mycolicacid)的合成，使细菌丧失耐酸性、疏水性和增殖力而死亡。此酸是结核杆菌细胞所特有的重要成分，因此异烟肼对其他细菌无作用。

异烟肼在肝细胞内有多条代谢通路，其一是经由NAT2代谢为乙酰异烟肼，随后被水解为无毒的二乙酰肼；其二是经由NAT2代谢为乙酰异烟肼或单乙酰肼后，再由细胞色素P450氧化酶2E1(CYP2E1) 氧化为乙酰二氮烯，乙酰基离子，或乙酰基烯酮等细胞毒性代谢产物。这些水解代谢产物通过谷胱甘肽-S转移酶(GSTM1)，与甘氨酸结合并解毒后，再经由肾脏排出体外。

不同个体同一条染色体上同一位点的核苷酸序列绝大多数是一致的，当单个核苷酸碱基不同而导致核酸序列呈包括置换、缺失和插入等多态性时，称单核苷酸多态性，即SNP。SNP现象在生物体内广泛存在，它是生物遗传变异的表现之一，因而SNP对研究人类遗传和进化具有重要意义。药物基因组学研究发现，编码异烟肼体内代谢酶的基因如果发生功能性变异SNP，将会引起个体对异烟肼的反应产生差异，这也是异烟肼抗结核疗效和毒副反应差异的根本原因。其中，NAT2基因序列中拥有许多功能性变异SNP，这些基因变异导致NAT2代谢酶的酶活性在人群中呈现三种状态，即快速乙酰化个体，中速乙酰化个体和慢速乙酰化个体。NAT2常见的7个功能性SNPs 如下表1。

表1.NAT2基因7个常见慢乙酰化突变位点

表注：以上所有数据来自PharmGKB，MAF(Minimum allele frequency)，为1000genomes数据库CHB中的MAF。

在中国人群中快速乙酰化个体的比例约为35％，中速乙酰化个体约为47％，慢速乙酰化个体约为18％。这一数据在欧美白种人群中分别为6％，37％和57％。NAT2代谢酶活性状态呈现了明显的种族差异和个体差异。根据过去多项临床实验以及荟萃分析研究，慢速乙酰化个体由于无法迅速将异烟肼代谢为无活性代谢产物，从而面临较高的肝脏损害风险。同时，在使用相同药物剂量时，快速乙酰化个体较中速及慢速乙酰化个体更容易出现治疗无效。根据这些研究结果，美国FDA在异烟肼的药物说明书中，明确指出了NAT2遗传变异与异烟肼引发的肝脏毒性的相关性，要求临床医生在使用该药物前，需先了解NAT2基因变异情况。此外，CYP2E1，GSTM1基因突变也将改变患者体内异烟肼毒性代谢产物的浓度，但荟萃分析研究并未得出相关遗传变异与异烟肼肝脏毒性的显著相关性。因此，NAT2慢速乙酰化个体仍然是异烟肼肝脏毒性的高风险人群。

根据NAT2以上SNPs的检测，则可以判断出NAT2的乙酰化类型，帮助临床医生异烟肼个体化给药。快捷、方便、全面和准确检测出NAT2常见突变位点的方法可为异烟肼个体化用药提供便利，然而目前尚未建立符合这些特点的检测技术，本项技术发明为首创。

综合比较目前SNP检测方法有以下一些技术，具体应用时则需要根据所要检测的位点数和样本数来选择和建立相应的技术方法。

1、Sanger测序法

Sanger测序法是每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP) 使之扩增，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)使之终止。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3’-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几个至千以上个，相差一个碱基一系列片断。它们具有共同的起始点，但终止在不同的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

优点:(1)测序金标准，读长长，目前Sanger遗传分析仪测序读长可达到950bp及以上。(2)精准：流程细致，质控环节多，污染低，结果直观可视，假性结果极低。(3)可进行个性化位点检测，可以任意选择单项测序，Sanger测序个性化基因检测有价格优势。由于临床测序特点是：目标明确、结果精准、通量小，Sanger测序非常适用于临床。

缺点：通量低，成本高，鉴于测序本身方法的局限，测序引物后 10bp～40bp无法保证准确。

2、Taqman探针法

Taqman探针法的核心就是特异性的修饰基团(Minor Groove Binder，MGB)探针技术，已证实的Taqman探针，3’-端结合MGB 技术，能更好的进行等位基因的区分。MGB分子结合到DNA螺旋小沟，通过稳定MGB探针/模板联合体提高杂交的检验。这种超强的稳定性可使短至13个碱基的探针提高错配的辨别力，并为困难多变的序列设计提供更高的灵活性。所有的MGB探针都包括一个不发荧光的猝灭基团(NFQ)，它能真正消除传统猝灭基团产生的背景荧光，提高信噪比，从而提高-检测灵敏性。Taqman探针法可用于基因荧光定量分析、甲基化检测、SNP分型、miRNA定量分析等等，但Taqman 探针法的缺点就是探针购买太贵，适于大样本量，少量SNP位点分析。

3、Beckman SNP genome stream技术

Beckman技术的特点就是单碱基延伸法，设计时每个位点共设计 3条引物，2条是扩增引物，1条为单碱基延伸引物(这个引物也可理解为探针)。Beckman的技术比较适合恰好有12个位点，48个位点检测，只有几个位点，或者恰巧不是12或48的倍数时，就不合算。另外标本量不能太低，Beckman检测采用384板，适于大样本量。

4、SNaPshot法

SNaPshot法由美国应用生物公司(ABI)开发，是基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术，也称小测序，主要针对中等通量的SNP 分型项目。在一个含有测序酶、四种荧光标记ddNTP、紧临多态位点 5’-端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止，经ABI测序仪检测后，根据峰的移动位置确定该延伸产物对应的SNP位点，根据峰的颜色可得知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型。对于PCR产物模板可通过多重PCR反应体系来获得。通常用于10-30个SNP位点分析。SNapshot法操作简单、经济，可以在多种遗传分析仪上进行快速、准确地基因分型，实现了SNP分析的自动化，可以方便高效地用于高通量的SNP验证及中通量的SNP筛选。

5、HRM法

高分辨率熔解曲线分析(HRM)是近几年兴起的SNP研究工具，它通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，来判断是否存在SNP，而且不同SNP位点、是否是杂合子等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM分析能够有效区分不同SNP 位点与不同基因型。这种检测方法不受突变碱基位点与类型的局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨率熔解，即可完成对样品基因型的分析。该方法无需设计探针，操作简便、快速，成本低，结果准确，并且实现了真正的闭管操作。

运用HRM技术可以进行样本中已知突变位点的检测、未知新突变位点的鉴定，已知多态位点如SNPs、短串联重复序列、微卫星、条形码序列等的检测等。HRM技术已经在人类和动植物遗传疾病的分子诊断、动植物各类多态位点的鉴定与检测、动物生产繁殖数量性状位点的鉴定与检测等研究领域获得了应用，并取得了很多新的研究进展。

6、SNP芯片法

DNA芯片技术是一种DNA序列变异检测工具。DNA芯片(DNA chip)，也称生物芯片(biochip)，其大小与计算机上的CPU芯片相似，约1cm2或更大些，以玻璃、硅、聚丙烯等作为载体基片，芯片上铺了一层肉眼看不见的DNA纤维“地毯”，即具有特定碱基序列的探针。待测基因经提取后，被切成长短不一的片段，经荧光化学物质标记后，注射到嵌有芯片的载片上。由于DNA和探针杂交的程度与荧光强度相关，因此通过激光扫描，即可根据荧光强弱测出被检测序列的变异。成本昂贵，适用于多基因大量SNPs检测服务。

7、MassArray法

MassArray分子量阵列技术是Sequenom公司推出的世界上领先的基因分析工具，通过引物延伸或切割反应与灵敏、可靠的 MALDI-TOF-MS技术相结合，实现基因分型检测。基于MassArray 平台的iPLEX GOLD技术可以设计最高达40重的PCR反应和基因型检测，实验设计灵活，分型结果准确性高。根据应用需要，对数十到数百个SNP位点进行数百至数千份样本检测时，MassArray具有最佳的性价比，特别适合于对全基因组研究发现的结果进行验证，或者是有限数量的研究位点已经确定的情况。

8、Illumina Bead Xpress法

采用Illumina公司的Bead Xpress系统进行批量SNP位点检测，可以同时检测1-384个SNP位点，往往用于基因组芯片结果确认，适合高通量检测。微珠芯片具有高密度、高重复性、高灵敏度、低上样量、定制灵活等特点，极高的集成密度，从而获得极高的检测筛选速度，在高通量筛选时可显著降低成本。

我们的待测目标基因NAT2全长含有9969bp碱基，但仅有两个外显子，1号外显子SNP突变情况十分罕见，而NAT2这些基因突变几乎全部落在2号外显子1296bp区间内，并且这些SNPs物理位置上相连，前后两头跨度667bp。本项目技术主要是根据以上SNP检测技术的特点及应用范围，结合本项目的一些自身特点而选择建立。比较分析表明，Taqman探针法、Beckman SNP genome stream技术、 MassArray法、Illumina Bead Xpress法和SNP芯片法比较适合高通量测序，样本量小的情况下则成本较高；HRM法适应未知突变SNP的鉴定，尤其是难辨SNP的区分时则具有其优势，适合少量SNPs及大样本量的应用；而SNaPshot法在某种程度而言，是Sanger测序法的一种特殊应用，Sanger测序法是目前判断SNP的金标准，读长长，结果精准，质控环节多，污染低，结果直观可视，假性结果极低；可进行个性化位点检测，可以任意选择单项测序；Sanger测序个性化基因检测有价格优势，技术应用成熟，一般实验室均有相应仪器配备；此外，Sanger测序适应于临床应用测序特点：目标明确、结果精准、通量小。与以上其他技术，通常的比较上而言，Sanger测序有一些缺点：如通量低，成本高，鉴于测序本身方法的局限，测序引物后10bp～ 40bp无法保证准确。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的是建立一种一次性检出NAT2常见功能SNPs的Sanger测序法，同时可能发现新的 SNPs。发明包括特异性扩增NAT2目的区间全长片段引物的设计及验证；最佳普通PCR及测序PCR反应各试剂浓度及参数的确定和验证；NAT2基因突变检测各试剂指标及参数的确立及验证；NAT2基因突变检测方法的测试应用。可快捷、方便、全面和准确检测出NAT2 常见突变位点，为异烟肼个体化用药提供便利，本技术发明具有首创性。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

用于异烟肼个体化用药一次性检出NAT2常见功能SNPs的 Sanger测序法，包括如下步骤：

步骤一、生物信息学分析：进入Pubmed数据库 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)网站，从Nucleotide数据库中，查找NAT2基因序列，位于8号染色体，基因全长9969bp,总共两个外显子，并且CDS区域全部位于2号外显子；获得2号外显子序列，物理位置为：18399851-18401110，共1296bp；

步骤二、锚定并标记NAT2常见突变SNPs在待测分析序列上的位置：rs1801280、rs1799929、rs1208、rs1799930、rs1041983、rs1799931 和rs1801279分别为7个碱基为NAT2常见突变SNPs所分布的位置，前后总共667bp；

步骤三、设计待测区域特异性引物，针对NAT2基因7个常见功能SNPs，设计特异性引物，要求扩增包含这些突变位点NAT2目的区间全长片段，并具有特异性。针对NAT2第2号外显子，利用Pubmed 数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)自带Primer-BLAST 工具，设计扩增引物，考虑到目前Sanger测序读长限制，设定＜1000bp 的扩增区间，并保证SNP位点均需落于扩增片段区间；所设计的引物为：

1、Primer F：GATCATGGACATTGAAGCATAT；Primer R： TCAAAATAACGTGAGGGTAGAG；

2、Primer F：CGGGCTGTTCCCTTTGA；Primer R： TTAGTGAGTTGGGTGATA。

步骤四、扩增引物特异性验证：对普通PCR反应体系及参数进行确定，对普通PCR循环体系参数进行优化，并通过琼脂糖凝胶电泳进行结果检测；

步骤五、测序PCR反应，产物纯化，样品上机测序分析，结果判读分析，

步骤六、技术方法测试应用，待测样本随机选取，普通PCR反应，测序PCR反应，测试结果对比分析。

进一步的，所述步骤四中，NAT2普通PCR反应体系为：

进一步的，普通PCR初步循环参数摸索条件：在94℃预变性5 min,接着35个循环,每个循环的程序包括94℃变性45s,Tm (55-65℃)退火45s,72℃延伸45s,循环结束后在72℃延伸10min；

PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测：琼脂糖胶的制备：取0.75g琼脂糖，加入TAE50ml，微波(100s)加热溶解，将溶液倒入，使其没过样孔板。点样：loading buffer(Gelred):2.0ul，PCR产物:3.0ul， Maker(500-2000bp):5.0ul。电泳条件：电压：110V,t＝40min方向：负极向正极。

进一步的，所述步骤四中，PCR缓冲体系及PCR循环参数，得出引物1和2最佳的温度分别为61℃和60℃。

进一步的，该方法在异烟肼个体化用药一次性检出NAT2常见SNPs中的应用。

进一步的，引物1和引物2在异烟肼个体化用药一次性检出NAT2 常见SNPs中的应用。

进一步的，一种异烟肼个体化用药一次性检出NAT2常见SNPs 的试剂盒，该试剂盒中含有引物1和引物2序列。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明中NAT2基因SNP的数量及物理分布特点，Sanger测序可以降低约1/7的成本，相对于其他技术更有价格优势；项目通过精确设置引物，使待测SNPs避开Sanger测序引物后10bp～40bp区段不能判读的位置，因此本发明方法建立的Sanger法测序技术，可以通过单次测序反应，同时全面检测多个SNPs，因此可以充分发挥 Sanger测序一次性全面检出NAT2已知突变位点的能力，甚至包括未知新的突变位点的发现。

本发明为首次研发出一次性检出NAT2目的突变位点的Sanger 法测序方法，可用于临床及科研，大小样本均能灵活适用，为异烟肼的个体化精准用药提供全面准确的NAT2遗传信息；

可以在一次性单样本测序中完成几乎所有NAT2常见SNP突变的检测，实现单样本单次检测多个SNPs的功能，大幅度降低单个SNP 检测成本，同时方法不仅适用于小、中样本量检测，也适用于大样本量的检测，能灵活应用于临床及研究领域，实现省时、经济和高效的结合，用于临床及科研，为异烟肼的个体化精准用药提供全面准确的遗传信息。

附图说明

图1.Pubmed数据库查找NAT2核苷酸序列；

图2.获取NAT2第2号2外显子；

图3.NAT2第2号外显子序列区间；

图4.NAT2常见7个突变SNPs在序列上的锚定；

图5.Primer-BLAST工具对NAT2进行引物设计参数设置1；

图6.Primer-BLAST工具对NAT2进行引物设计参数设置2；

图7.Primer-BLAST工具对NAT2进行引物设计参数设置3；

图8.引物1特异性扩增出976bp片段PCR结果；

图9.引物1特异性扩增出825bp片段PCR结果；

图10.引物1扩增976bp序列原始电泳图；

图11.引物2扩增825bp序列原始电泳图；

图12.引物1和引物2正、反向测序扩增子图；

图13.引物1和引物2正、反向测序结果发现比较摘要报告；

图14.引物1正、反向测序结果显示结果具有一致性；

图15.引物2正、反向测序结果显示结果具有一致性；

图16.引物1和引物2正、反向测序结果在NAT2序列上位置锚定重合示意图；

图17.技术研发流程图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：

如图1所示，

第一部分：

一、生物信息学分析：进入Pubmed数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)网站，从Nucleotide数据库中，查找NAT2基因序列，位于8号染色体，基因全长9969bp,总共两个外显子，并且CDS区域全部位于2号外显子；获得2号外显子序列，共1296bp，物理位置为：18399851-18401110，总共1296bp，序列具体如图1-3：

二、锚定并标记NAT2常见突变SNPs在待测分析序列上的位置：如图批注所指示的7个碱基为NAT2常见突变SNPs(rs1801280、 rs1799929、rs1208、rs1799930、rs1041983、rs1799931和rs1801279) 所分布的位置，前后总共667bp，如图4。

三、设计待测区域特异性的引物：

针对NAT2基因7个常见慢乙酰化突变位点，设计特异性引物，要求扩增包含这些突变位点NAT2目的区间全长片段，并具有特异性。针对NAT2第2号外显子，利用Pubmed数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)自带Primer-BLAST工具，设计扩增引物，考虑到目前Sanger测序读长限制，设定＜1000bp的扩增区间，并保证SNP位点均需落于扩增片段区间，引物设计步骤如图5-7：

挑选的引物如下表2，分别对应待测序列图4中的绿色和粉色区域，扩增的片段长度分别为976和825bp。

表2.选取的Primer-BLAST工具设计的引物

四、扩增引物特异性验证

1、PCR缓冲体系确定和优化，包含ddH2O、10×Buffer、dNTP、 TaqDNA聚合酶、模板DNA、Primer F和Primer R浓度和体积优化。

NAT2普通PCR反应初步体系如下表3：

表3.NAT2普通PCR反应体系

2、PCR循环参数确定和优化；

普通PCR初步循环参数摸索条件：在94℃预变性5min,接着 35个循环,每个循环的程序包括94℃变性45s,Tm(55-65℃)退火 45s,72℃延伸45s,循环结束后在72℃延伸10min。

3、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测；

4、电泳紫外成像结果：Maker，PCR产物(左→右)点样，如出现特异性扩增条带，对应的引物则为理想引物。

5、结果：

5.1引物1扩增结果：能特异性扩增出976bp大小的目的条带。且经过PCR循环温度摸索初步发现7-9泳道区间的扩增循环温度比较适宜，扩增条带特异性高，无其他杂带和引物二聚体出现，见图 8。

5.2引物2扩增结果：能特异性扩增出825bp大小的目的条带。且经过PCR循环温度摸索初步发现9-12泳道区间的扩增循环温度比较适宜，扩增条带特异性高，无其他杂带和引物二聚体出现，见图 9。

6、针对筛选出的特异性引物，反复验证优化PCR缓冲体系及 PCR循环参数，得出引物1和2最佳的Tm分别为61℃和60℃：

五、PCR产物纯化

采用柱纯化：

(一)试剂盒采用离心吸附柱纯化酶切、PCR等反应溶液中的 DNA片段，同时除去蛋白质、其它有机化合物、无机盐离子及寡核苷酸引物等杂质，回收100bp-10kb DNA片段，回收率可达80％以上，每个离心吸附柱每次可吸附的DNA量为10μg。

(二)材料与方法

1.材料：PCR产物

2.仪器、用具：恒温孵育器(65℃)、离心机、移液器、1.5ml离心管

3.试剂：天根生化科技(北京)有限公司生产的普通DNA产物纯化试剂盒(DP204)

4.步骤(参照产品说明书执行)：使用前请先在漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。

(1)柱平衡步骤：向吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液BL，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2重新放回收集管中。(请使用当天处理过的柱子)

(2)估计PCR反应液或酶切反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀(无需去除石蜡油或矿物油)。注意：如 PCR反应体系为50μl(不包括石蜡油体积),则加入250μl结合液 PB。

(3)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。注意：吸附柱容积为800μl，若样品体积大于800μl可分批加入。

(4)向吸附柱CB2中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。注意：如果纯化的 DNA是用于盐敏感的实验，例如平末端连接实验或直接测序，建议 PW加入后静置2-5min再离心。

(5)重复操作步骤4。

(6)将吸附柱CB2放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心 2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱CB2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。

(7)将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30-50μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min。12,000rpm (～13,400×g)离心2min收集DNA溶液。注意：洗脱液的体积不应少于30μl，体积过少会影响回收的效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若后续做测序，需使用ddH2O做洗脱液，并保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA 产物应保存在-20℃，以防DNA降解。DNA也可以用缓冲液(10mMTris-Cl,pH8.0)洗脱。为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g) 离心2min，将DNA溶液收集到离心管中。

(8)取5μl样品，1％琼脂糖凝胶电泳检测纯化结果。

六、测序PCR反应

(一)实验试剂：已经纯化好的PCR产物，测序引物， Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit，ddH2O，POP-7^TM Polymer， ANODE BUFFER CONTAINER 3500SERIES(AB公司)，CATHODE BUFFER CONTAINER 3500SERIES(AB公司)，Hi-Di(去离子甲酰胺)

(二)实验耗材：96孔板，0.2mL EP管，移液枪，125mM EDTA(pH＝8)，3M NaAc(pH＝5.2)，无水乙醇，计时器，记号笔

(三)实验操作具体步骤：

1.PCR产物测序反应体系摸索：包含PCR产物、引物、 Terminator v3.1、Sequence Buffer和ddH2O浓度和体积优化。

将引物和扩增DNA产物进行了测序PCR反应，NAT2初步测序 PCR反应体系配置参照下表4：

表4.测序PCR反应体系配置参照表

2.测序PCR循环条件：

96℃1min→(96℃10sec→50℃5sec→60℃4min)×25循环→4℃保温。

七、测序产物纯化(酒精/EDTA/NaAc法)：

每管加入2mL 125mM EDTA(pH＝8)，2mL3M NaAc(pH＝5.2)，加到管底；加入50mL100％酒精，封严，震荡4 次，室温放置15min；3000x g 4℃离心30min，马上倒置96孔板，185×g离心1min；加入70mL 70％酒精，3000x g 4℃离心15min，马上倒置96孔板，185×g离心1min；70％酒精重复洗涤1次或2 次；让残余的酒精在室温挥发干。

八、样品变性，上机测序分析

酒精完全挥发后，加入10mL Hi-Di甲酰胺，95℃变性4min，迅速置冰上4min，上样，采用遗传分析仪3500进行测序，结果采用配套软件variant reporter 2和SeqA 6分析，并与正常NAT2进行比对分析，判断测序的结果。

九、将产物测序PCR产物纯化后，在ABI基因分析仪3500(美国应用生物系统公司)上进行上机测试，将测序产物与参照序列进行比对和判读。

第二部分：

一、实验结果

1.引物1扩增976bp的测序实验结果

实验结果能准确的被仪器判读出来，序列读取区间976bp已经全部包含NAT2常见7个突变位点，检测结果的灵敏度和峰度均可初步达到要求，见图10。

2.引物2扩增825bp的测序实验结果

实验结果能准确的被仪器判读出来，序列读取区间825bp已经全部包含NAT2常见7个突变位点，检测结果的灵敏度和峰度均可初步达到要求，见图11。

二、技术应用测试

随机选择代表性的一些样本，分别同时采用引物1和引物2进行测序，并将结果对比分析，判断结果是否一致。经过分析，两对引物在随机60份样本的测试中，结果一致性达到100％，因此项目基于引物1和引物2建立的Sanger测序技术特异性和准确性均已达到应用的要求，可以为异烟肼个体化给药提供准确的NAT2遗传信息，技术应用测试代表性样本图谱如图12-16所示：

三、结论

引物1和引物2正、反向测序结果标明，NAT2检测突变位点在随机代表性样本待测序列上的标识位置重合性100％，均判读为 NAT2*6C慢乙酰化个体，结果具有高度一致性，因此本项技术具有可靠的准确性和稳定性，适合临床及科研，为异烟肼的个体化精准用药提供全面准确的遗传信息，整个技术研发流程见图17。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims

1.用于异烟肼个体化用药一次性检出NAT2常见功能SNPs的Sanger测序法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、生物信息学分析：进入Pubmed数据库，从Nucleotide数据库中，查找NAT2基因序列，位于8号染色体，基因全长9969bp,总共两个外显子，并且CDS区域全部位于2号外显子；获得2号外显子序列，物理位置为：18399851-18401110，共1296bp；

步骤二、锚定并标记NAT2常见突变SNPs在待测分析序列上的位置：rs1801280、rs1799929、rs1208、rs1799930、rs1041983、rs1799931和rs1801279分别为7个碱基为NAT2常见突变SNPs所分布的位置，前后总共667bp；

步骤三、设计待测区域特异性引物，针对NAT2基因7个常见功能SNPs，设计特异性引物，要求扩增包含这些突变位点NAT2目的区间全长片段，并具有特异性；所设计的引物序列如下：

引物1、Primer F：GATCATGGACATTGAAGCATAT；Primer R：TCAAAATAACGTGAGGGTAGAG；

引物2、Primer F：CGGGCTGTTCCCTTTGA；Primer R：TTAGTGAGTTGGGTGATA；

步骤四、扩增引物特异性验证：对普通PCR反应体系参数进行确定，对普通PCR循环体系参数进行优化，并通过琼脂糖凝胶电泳进行结果检测；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤四中，普通PCR反应体系为：

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤四中，普通PCR初步循环参数摸索条件为：在94℃预变性5min,接着35个循环,每个循环的程序包括94℃变性45s,Tm55-65℃退火45s,72℃延伸45s,循环结束后在72℃延伸10min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤四中，PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测：琼脂糖胶的制备：取0.75g琼脂糖，加入TAE 50ml，微波100s加热溶解，将溶液倒入，使其没过样孔板。点样：loading buffer(Gel red):2.0ul，PCR产物:3.0ul，500-2000bpMaker:5.0ul；电泳条件：电压：110V,t＝40min方向：负极向正极。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤四中，所述步骤四中，PCR缓冲体系及PCR循环参数，得出引物1和2最佳的温度分别为61℃和60℃。

6.权利要求1-5任一所述方法在异烟肼个体化用药一次性检出NAT2常见SNPs中的应用。

7.权利要求1所述引物1和引物2在异烟肼个体化用药一次性检出NAT2常见SNPs中的应用。

8.一种异烟肼个体化用药一次性检出NAT2常见SNPs的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中含有引物1和引物2序列。