CN104862312A - 哺乳类实验动物snp标记筛查的引物对及其应用 - Google Patents

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杜红丽
王菊芳
柳明玉
赵毅
黄黎珍
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Abstract

本发明公开一种哺乳类实验动物SNP标记筛查的引物对及其应用。提供的引物对共30对，序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:60所示；每对引物都能够在同样条件下扩增狗、猪、大鼠、小鼠、恒河猴和兔这些实验动物的基因组序列，序列如SEQ ID NO:61～SEQ ID NO:240所示。且同一对引物扩增出的序列物种间都有差异。引物对的应用可大大降低哺乳实验动物遗传标记筛查成本和简化操作，促进实验动物遗传质量监测标准化。

Description

哺乳类实验动物SNP标记筛查的引物对及其应用
技术领域
本发明涉及利用全基因组生物信息分析技术优势，并用PCR扩增及sanger测序验证引物对的方法开发出一套能用于哺乳类实验动物SNP标记筛查的引物对及其应用。
背景技术
目前国内生物医药产业迅猛发展，实验动物作为生物医药产业的重要支撑条件，动物质量标准化尤其遗传质量的标准化将直接影响生物医药的研发水平。但因为缺乏统一的、标准化的遗传质量控制标准，实验动物的遗传质量监控也渐渐成为其生产应用中较突出的问题。而实验动物遗传质量监测的技术瓶颈是如何筛查到有效的遗传标记以及所筛选到的遗传标记是否受到国际认可。
目前，我国实验动物遗传监测主要推行国家标准(GB 14923-2010)，主要采取形态学(毛色基因测试法)、数量遗传学(下颌骨测定法)、免疫标记基因检测法(皮肤移植法)以及生化标记基因检测法等。但随着实验动物科学和分子生物学的飞速发展，新品系实验动物不断产生，这些传统的检测方法，手段落后，假阳性较高，评价标准局限，已不能完全适应多种品系实验动物的遗传监测工作。虽然国内各实验室开辟微卫星DNA标记、RAPD遗传标记检测法等，但不同实验室和不同研究者所选位点不尽相同，而且缺乏一系列同一的评估指标，与实际应用还有一定的距离，至今尚无形成标准检测方法和判定标准。
实际上，关于遗传质量监测国际上也没有通用的标准，国外大多数实验动物相关机构基本都是根据实验室自己建立的标准或者参考著名实验室的标准进行监测。如Jackson实验室的遗传质量监测方法是表型加基因型的方式。表型监测主要包括毛色及其他异常性状(体型、体重、骨骼结构、行为、肿瘤等)，基因型检测主要参考Petkov等建立了近交系小鼠SNP数据库。SNP标记是继生化标记和RAPD遗传标记之后的第三代DNA分子标记。相比于目前先进的分子检测技术及国际同行的领先程度，我国的遗传监测标准有待改进，且刻不容缓。
目前实验动物遗传标记开发尚无统一标准，单个哺乳实验动物遗传标记的开发往往需要进行大量的前期筛查工作(如基因组测序、单个物种引物设计和常规测序等)，工作繁琐且成本投入大。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一套适用于哺乳类实验动物SNP标记筛查的引物对。提供的引物对共30对；每对引物都能够在同样条件下扩增狗、猪、大鼠、小鼠、恒河猴和兔这些常见实验动物的基因组序列。且同一对引物扩增出的序列物种间都有差异。引物的应用可以加速哺乳类实验动物遗传检测的快速化和标准化。
本发明的另一目的在于提供所述的引物对的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明首先对狗、猪、大鼠、小鼠、恒河猴和兔这六个物种的基因组做了比对，筛选出了同源性大于70％且小于100％、长度大于300bp的区域。为了设计引物，从这些区域中过滤掉完全连续同源区域小于17bp且完全同源区域个数小于2个的序区域。然后从这些同源区域中设计引物，要求一对引物能扩增出各个物种，且各个物种的序列存在一定差异。用设计的30对引物PCR扩增狗、猪、大鼠、小鼠、恒河猴和兔这六个物种的基因组序列，琼脂糖凝胶电泳确定成功扩增出序列，然后sanger测序，得到DNA片段序列。分析各物种扩增出的序列与原物种基因组序列一致性。
本发明的简化引物对可应用于哺乳类实验动物遗传标记的筛查，并加速实验动物遗传监测的标准化。本发明的创新在于目前还没查询到一对引物可以同时扩增以上6个物种，并且保证物种之间的序列有差异。
所述的引物对在辅助实验动物品系鉴定的遗传标记筛选中的应用。
所述的引物对在辅助实验动物封闭群遗传标记筛选或鉴定中的应用。
所述的引物对在制备试剂盒或检测方法中的应用；所述试剂盒或检测方法的用途为实验动物品系鉴定或物种鉴定。
所述的DNA片段在辅助进行实验动物品系鉴定或物种鉴定中的应用。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
本发明采用生物信息技术优势开发出能用于多种哺乳实验动物遗传标记筛选的引物对，即1对引物可以扩增出6个物种的目的片段，引物对的应用可大大降低哺乳实验动物遗传标记筛查成本和简化操作，促进实验动物遗传质量监测标准化。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
1、实验动物样本
狗(dog)、猪(pig)、兔(rabbit)、大鼠(rat)、小鼠(mouse)、恒河猴(rhesus)的组织。
2、动物基因组来源
六个动物样本的基因组数据在Genebank上下载的该物种最新版本的基因组，基因组数据来源如表1。
表1基因组数据来源
物种 基因组网址
狗 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/85
猪 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/84
兔 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term＝rabbit
大鼠 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/73
小鼠 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/52
恒河猴 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/215
3、动物组织来源：华南农业大学动物遗传实验室
4、目标序列筛选
本发明采用lastz作为比对软件来比对和分析基因组。
比对策略：以兔(rabbit)的基因组作为参考基因组，分别和狗、猪、小鼠、大鼠、恒河猴的基因组作比对。
在linux上运行比对程序，比对参数设置如表2，以兔和狗的基因组比对为例。
表2lastz比对参数
基因组比对总共得到5个比对结果文件，分别为兔与狗、猪、大鼠、小鼠、恒河猴的比对结果。由于5个物种都是以兔的基因组做为参考序列来进行的比对，所以可以得到每个物种和兔基因组的同源区域。根据这5个物种和兔同源区域的重叠，进而筛选出狗、猪、大鼠、小鼠、恒河猴和兔这6个物种同源的区域以及基因组序列。部分结果如表3所示。表3为一组同源区域的详细信息，列出了6个物种同源区域的染色体位置和同源序列长度和同源碱基序列。
表3物种同源序列信息
物种 染色体 同源位置 序列长(bp) 正负链 染色体长度 序列
兔 chr1 342206 394 + 194850757 CTAAGCATA**
狗 chr11 6945210 394 - 74389097 CTAAGCATA**
猪 chr1 30799443 394 - 315321322 CTAAGCATA**
小鼠 chr4 94315895 394 - 156508116 CTAAGCATA**
大鼠 chr5 94523884 394 - 173096209 CTAAGCATA**
猴 chr15 23018889 394 + 112192347 CTAAGCATA**
总共筛选出六个物种共有的同源性大于70％且同源区域长度大于200bp的序列90560组。设计引物需要连续相同的序列超过18bp，因此，进一步过滤了这90560组序列，得到了可以用来设计引物的1874组同源序列。
为了保证序列可以区分出物种的差异，选取物种间差异度较大的序列来设计PCR引物。
5、引物设计
目标片段筛选完成后，利用引物设计软件Priemer 5.0进行引物设计。选取能够完全涵盖目标片段的引物，引物长度在18～24bp之间，退火温度52℃～60℃。共设计30对引物，引物序列如表4，序列表中序列编号为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:60。所有引物设计完成后委托北京华大基因公司合成。
表4引物序列信息
6、目标片段PCR扩增
用设计的30对引物扩增兔、狗、猪、大鼠、小鼠和猴的基因序列。
基因组DNA提取参照普博欣生物科技有限公司生产制造的动物基因组DNA提取试剂盒(离心柱法)的说明书进行操作。引物由上海生物工程有限公司合成。合成引物进行短暂离心，加入无菌去离子水充分溶解到浓度为10μM，室温静置30分钟，4℃保存。
以每个动物样本的基因组DNA作为模板进行PCR反应，PCR反应体系(20μL)如表5。
表5PRC反应体系
名称 浓度 体积
基因组DNA 10ng/μL 5μL
上游引物 10μM 0.8μL
下游引物 10μM 0.8μL
PCR kit(2×) 10μL
ddH2O 3.4μL
混匀后短暂离心，放置至PCR仪上，设置循环程序为：
上述PCR反应产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
称取0.5g琼脂糖加到50mL TAE反应液中加热溶解，待温度降至60℃时，加入溴化乙锭类似物3μL混匀，倒入插有2mm梳子的电泳槽内，等待凝固后使用。每孔加5μL PCR产物，采用121V恒压，电泳15min后在紫外线透射仪下观察结果，目标条带全部单一明亮。
所有扩增成功的PCR产物以4℃保存，直接进行DNA测序，全部测序工作由北京华大基因公司测序部完成。
7、测序序列分析
7.1测序序列拼接
由于Sanger测序的序列起始端测序质量较低，准确性相对较差，采用正向引物和反向引物分别进行测序，根据测序峰图，序列相互补充，拼接成完整的测序序列。详细序列信息见序列表SEQ ID NO:61～SEQID NO:240所示。
7.2PCR序列鉴定
把测序得到的序列与原基因组上序列比对，通过与原始序列的Identity(同源性)来确定用该引物PCR扩增得到的序列是否是目标序列，结果见表6。
表6是30对引物PCR产物测序结果与原始基因组序列的比对结果，表中序列全部很好的比对会对应的基因组序列。表明设计的引物确实可以准确的在目标区域扩增出这6个物种的基因组序列。
表6 30对引物PCR序列与原始序列相似度(％)
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.哺乳类实验动物SNP标记筛查的引物对，其特征在于：包括引物对1F/R、引物对4F/R、引物对5F/R、引物对8F/R、引物对14F/R、引物对17F/R、引物对18F/R、引物对21F/R、引物对23F/R、引物对24F/R、引物对26F/R、引物对27F/R、引物对29F/R、引物对31F/R、引物对32F/R、引物对34F/R、引物对35F/R、引物对36F/R、引物对37F/R、引物对39F/R、引物对40F/R、引物对41F/R、引物对42F/R、引物对43F/R、引物对44F/R、引物对49F/R、引物对52F/R、引物对53F/R、引物对54F/R和引物对55F/R中的至少一对；
引物对1F/R的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；
引物对4F/R的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；
引物对5F/R的序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；
引物对8F/R的序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；
引物对14F/R的序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；
引物对17F/R的序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；
引物对18F/R的序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；
引物对21F/R的序列如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示；
引物对23F/R的序列如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示；
引物对24F/R的序列如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示；
引物对26F/R的序列如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示；
引物对27F/R的序列如SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示；
引物对29F/R的序列如SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26所示；
引物对31F/R的序列如SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示；
引物对32F/R的序列如SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30所示；
引物对34F/R的序列如SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32所示；
引物对35F/R的序列如SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34所示；
引物对36F/R的序列如SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36所示；
引物对37F/R的序列如SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38所示；
引物对39F/R的序列如SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40所示；
引物对40F/R的序列如SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42所示；
引物对41F/R的序列如SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44所示；
引物对42F/R的序列如SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46所示；
引物对43F/R的序列如SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48所示；
引物对44F/R的序列如SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50所示；
引物对49F/R的序列如SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52所示；
引物对52F/R的序列如SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54所示；
引物对53F/R的序列如SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56所示；
引物对54F/R的序列如SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58所示；
引物对55F/R的序列如SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60所示；
所述的哺乳类实验动物为兔、狗、猪、大鼠、小鼠和恒河猴。
2.利用权利要求1所述的引物对扩增得到的DNA序列，其特征在于：所述的DNA序列如SEQ ID NO:61～SEQ ID NO:240所示。
3.权利要求1所述的引物对在辅助实验动物品系鉴定的遗传标记筛选中的应用。
4.权利要求1所述的引物对在辅助实验动物封闭群遗传标记筛选或鉴定中的应用。
5.权利要求1所述的引物对在制备试剂盒中的应用，其特征在于：所述的试剂盒的用途为实验动物品系鉴定或物种鉴定。
6.权利要求1所述的引物对在检测方法中的应用，其特征在于：所述的检测方法的用途为实验动物品系鉴定或物种鉴定。
7.权利要求2所述的DNA序列在辅助进行实验动物品系鉴定或物种鉴定中的应用。
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